一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用与流程

本发明属于有机合成及药物化学
技术领域：
，尤其涉及一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用。
背景技术：
：生物素，又称维生素h、辅酶r，是水溶性维生素，也属于维生素b族。生物素广泛存在于自然界的各种生物中，是人类和动物维持健康必不可少的要素，并因此而得名。而亲和素是一种糖蛋白，它可以与生物素特异性的结合。亲和素与生物素都可以与蛋白质、荧光素分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。柚皮苷属于二氢黄酮类化合物，是广泛存在于柑橘类水果中的一种具有生物学活性和药理作用的天然产物。具有抗氧化和清除自由基的能力，参与多种抗炎机制的调节过程，因此柚皮苷表现出良好的抗炎功效。此外，柚皮苷还具有抗癌、抗突变、抗过敏、镇痛、降血压及防治心脑血管疾病的功能，在食品、医药及化妆品领域具有广泛的应用。药物靶标是药物发挥治疗作用，实现其临床疗效的生物大分子或特有的生物大分子结构域。它能使药物发挥其预期的生物活性，蛋白质就是其中最重要的药物作用靶标，同时也是生命活动的执行者。因此，药物靶标的鉴定是药物研发的关键科学问题，也是化学生物学，特别是化学基因组学中最具有挑战性的前沿科学问题，并由此催生出了以小分子化合物为中心的化学蛋白质谱技术(cccp)。cccp技术应用于药物靶标蛋白鉴定时，药物分子通过化学修饰与荧光基团或生物素分子联接，构建能直接与潜在靶蛋白共价结合的化学探针。化学探针与细胞裂解液或全蛋白提取液孵育后，与探针共价结合的蛋白质复合物通过凝胶电泳或亲和色谱技术分离富集后进行鉴定。目前，柚皮苷良好的抗炎功能已被广泛关注，但是柚皮苷的药物靶标仍不清楚，作为抗炎药物鲜有报道。为了进一步找到柚皮苷的抗炎药物靶标，弄清楚柚皮苷的抗炎机制，制备一种含有生物素的柚皮苷探针分子显得尤为迫切。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用。本发明将柚皮苷结构中糖羟基作为反应位点进行缩醛化修饰，与经过羧基端修饰的生物素相连接，得到一种包含生物素与柚皮苷的化合物，且通过实验证明该化合物仍然具有抗炎活性，由此获得了一种生物素标记的柚皮苷探针分子。本发明是这样实现的，一种生物素标记的柚皮苷，其结构式见式(一)。如上所述的生物素标记的柚皮苷的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将柚皮苷分子结构中的糖羟基作为反应位点，进行缩醛化修饰，得到缩醛化修饰的柚皮苷；步骤2：将生物素分子结构中的端羧基作为反应位点，进行酯化修饰，得到含生物素片段的端基炔；步骤3：将步骤1中制备的缩醛化修饰的柚皮苷与步骤2中制备的含生物素片段的端基炔发生sonogashira偶联反应，得到如权利要求1所述的化合物。进一步，步骤1中将柚皮苷、4-甲苯磺酰胺与对溴苯甲醛缩二甲酯在有机溶剂中混合溶解，于室温反应12-24小时，减压蒸馏除去有机溶剂，残余物经重结晶，得到缩醛化修饰的柚皮苷，结构式见式(二)。进一步，步骤2中生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、3-丁炔-1-醇和4-二甲氨基吡啶在有机溶剂中混合溶解，于室温发生酯化反应36-72小时，减压蒸馏除去有机溶剂，干燥后得到含生物素片段的端基炔，结构式见式(三)。进一步，步骤3中在氮气保护下，将缩醛化修饰的柚皮苷、二氯二(三苯基膦钯)、碘化亚铜、三乙胺、含生物素片段的端基炔和四氢呋喃在有机溶剂中混合溶解，于60-80℃反应6-12小时；旋蒸除去有机溶剂，残余物用甲醇溶解，析出固体，过滤，经硅胶柱层析纯化，得到如权利要求1中的结构式所述的生物素标记的柚皮苷。进一步，步骤1中柚皮苷、4-甲苯磺酰胺和对溴苯甲醛缩二甲酯摩尔比为25-45：1：50-80；柚皮苷和有机溶剂的质量体积比为1：5-10，即每克柚皮苷对应的有机溶剂的体积为5-10毫升。进一步，步骤2中生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、3-丁炔-1-醇和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为：1：3-8：1-4：0.2-2；生物素与有机溶剂的质量体积比为1：25-40，即每克生物素对应的有机溶剂的体积为25-40毫升；硅胶柱层析采用的分离洗脱剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液，其中乙酸乙酯和甲醇的体积比为20-30：1-2。进一步，步骤3中缩醛化修饰的柚皮苷、二氯二(三苯基膦钯)、碘化亚铜和含生物素片段的端基炔的摩尔比为：1：0.01-0.08：0.05-0.12：1-2；化合物2与thf的质量体积比为1：15-20，即每克化合物2对应的thf的体积为15-20毫升。进一步，所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。如上述的生物素标记的柚皮苷在制备抗炎药物或探究柚皮苷药物靶标中的应用。综上所述，本发明的优点及积极效果为：(1)本发明提供了一种式(一)所示的一种化合物，其利用溴苯基取代的柚皮苷与含生物素片段的端基炔通过经典的sonogashira偶联反应获得，其为一种生物素标记的柚皮苷分子探针。(2)本发明提供的生物素标记的柚皮苷分子探针的制备，首先将柚皮苷结构中糖羟基作为反应位点进行缩醛化修饰，然后将生物素羧基端进行酯化修饰，获得含生物素片段的端基炔，再将缩醛化修饰后的柚皮苷和含生物素片段的端基炔发生sonogashira偶联反应制备得到。制备方法简单，经过制备型液相色谱进一步纯化，产物纯度高达95％以上。(3)通过实验证明，本发明提供的生物素标记的柚皮苷分子具有有效的抗炎作用。采用脂多糖(lps)诱导小鼠巨噬细胞产生炎症反应，通过研究环氧化酶(cox-2)在mrna水平上的表达量，证明了本发明化合物的抗炎作用。本发明的化合物不仅对lps诱导小鼠巨噬细胞产生的炎症有明显的抑制作用，而且相比于单一的柚皮苷用于炎症细胞模型上，其抗炎作用更好。(4)本发明将柚皮苷用生物素标记，一方面可作为一种研究柚皮苷抗炎药物靶点的分子探针，探究柚皮苷的作用靶点，这将有助于对柚皮苷抗炎机制更加清楚的了解，有助于找到更加安全、高效的消炎方法。另一方面，生物素标记的柚皮苷探针本身也具有抗炎作用，而且比柚皮苷的抗炎效果更好，可以开发成抗炎药物。本发明还提供了合成的生物素标记的柚皮苷的化合物的应用，其不仅可用于制备抗炎药物，由于连接亲和素以后仍然具有抗炎活性，因此其还可以用作生物素标记的柚皮苷分子探针。本发明构建的生物素标记的柚皮苷探针能够通过与其生物素特异性结合的亲和素找到直接与该探针潜在共价结合的靶蛋白，为研究柚皮苷的抗炎机制奠定了坚实的基础。附图说明图1是本发明的biotin-naringin合成的反应过程图；图2是化合物1的1hnmr图谱；图3是化合物2的1hnmr图谱；图4是生物素标记的柚皮苷的1hnmr图谱；图5是生物素标记的柚皮苷经制备型液相色谱纯化后的吸收峰图；图6是本发明实施例中合成的生物素标记的柚皮苷及柚皮苷处理下细胞中炎症因子的定量表达(a：cox-2、b：inos、c：il-1β、d：il-6)。结果数据表示为平均值±标准差；不同小写字母表示各处理间存在的显著性差异(p<0.05)，含有相同字母则表示差异不显著；图7是免疫沉淀试验流程；图8是sds-page蛋白胶银染结果；箭头标识条带即为能与柚皮苷特异性结合的蛋白。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明披露了一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用。生物素标记的柚皮苷(biotin-naringin)的合成反应过程见图1，本发明所述的室温具体温度范围为10-35℃。其原理过程为：将柚皮苷分子结构中的糖羟基作为反应位点，进行缩醛化修饰，得到缩醛化修饰的柚皮苷；将生物素分子结构中的端羧基作为反应位点，进行酯化修饰，得到含生物素片段的端基炔；令所述缩醛化修饰的柚皮苷与所述含生物素片段的端基炔发生sonogashira偶联反应，得到生物素标记的柚皮苷探针化合物。具体见下述各实施例。实施例1生物素标记的柚皮苷的制备(1)在圆底烧瓶中加入柚皮苷2.6g，4-甲苯磺酰胺(ptsa)30mg和有机溶剂n,n-二甲基甲酰胺dmf15ml，搅拌使其溶解。加入对溴苯甲醛缩二甲酯2.6g，于35℃反应12-24h，本实施例中为20h。在其他实施例的该步骤中各物质用量满足以下条件均可：柚皮苷、ptsa和对溴苯甲醛缩二甲酯摩尔比为25-45：1：50-80；柚皮苷和有机溶剂的质量体积比为1：5-10，即每克柚皮苷对应的有机溶剂的体积为5-10毫升。反应结束后，减压蒸馏除去dmf，残余物用甲醇重结晶，得到白色固体化合物1，产率40％。对得到的白色固体化合物1进行核磁分析，1hnmr图谱见图2，结构式如下：(2)在schlenk瓶中加入生物素1.0g，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)3.8g和dmf30ml，搅拌使其溶解。氮气保护下依次加入3-丁炔-1-醇0.9ml和4-二甲氨基吡啶(dmap)0.49g，于室温反应36-72h，本实施例中为48h。减压蒸除dmf，残余物用乙酸乙酯溶解，依次用1mol/l盐酸(3x20ml)、碳酸氢钠溶液(3x15ml)和饱和氯化钠溶液(2x20ml)洗涤，无水硫酸镁干燥，旋蒸除溶后经硅胶柱层析[洗脱剂：a＝v(乙酸乙酯):v(甲醇)＝25:1]纯化，得到白色固体化合物2，产率66％。对得到的白色化合物2进行核磁分析，1hnmr图谱见图3，结构式如下：在其他实施例的该步骤中各物质用量满足以下条件均可：生物素、edci、3-丁炔-1-醇和dmap的摩尔比为：1：3-8：1-4：0.2-2；生物素与dmf的质量体积比为1：25-40；即每克生物素对应的有机溶剂的体积为25-40毫升；硅胶柱层析采用的分离洗脱剂为乙酸乙酯与甲醇的混合溶液，其中乙酸乙酯和甲醇的体积比为20-30：1-2。(3)在schlenk瓶中加入0.75g化合物1，28mg二氯二(三苯基膦钯)和15mg碘化亚铜，氮气保护下加入无水dmf8ml，搅拌使之溶解。抽真空，氮气置换，迅速加入三乙胺6ml，溶液由黄色变为红棕色时再次抽真空，重复置换氮气多次。加入含有0.35g化合物2的thf溶液6ml，抽真空，重复置换氮气多次，于60-80℃反应6-12h，本实施例中为80℃反应12h。旋蒸除去三乙胺及thf；减压蒸除dmf，残余物用甲醇溶解，析出固体。过滤，滤饼用甲醇洗至tlc显色试剂显示不含产物。合并滤液与洗液，经硅胶柱层析[洗脱剂：a＝v(乙酸乙酯):v(甲醇)＝10:1]纯化，得到淡黄色固体即为生物素标记的柚皮苷(biotin-naringin)，经制备型液相色谱进一步纯化，生物素标记的柚皮苷的产率15％，纯度达到95％。进行核磁分析，1hnmr图谱见图4，结构式如下：核磁及质谱表征：1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ12.05(br,1h),9.60(s,1h),7.47-7.39(m,4h),7.34-7.31(m,2h),6.80(d,j＝7.6hz,2h),6.40(s,1h),6.33(s,1h),6.12-6.10(m,2h),6.04and5.86(s,1h),5.55-5.34(m,4h),5.24-5.11(m,2h),4.57(s,1h),4.27(t,j＝6.4hz,1h),4.21-4.18(m,3h),4.09-3.94(m,2h),3.76-3.37(m,6h),3.26-3.00(m,3h),2.80-2.73(m,4h),2.56(d,j＝12.8hz,1h),2.34(t,j＝7.2hz,2h),1.64-1.25(m,6h),1.23(d,j＝6.0hz,3h).lcms:m/z963.2[m+h]+。图5是生物素标记的柚皮苷经制备型液相色谱纯化后的吸收峰图及纯度检测。在其他实施例的该步骤中各物质用量满足以下条件均可：化合物1、二氯二(三苯基膦钯)、碘化亚铜和化合物2的摩尔比为：1：0.01-0.08：0.05-0.12：1-2；化合物2与thf的质量体积比为1：15-20，即每克化合物2对应的thf的体积为15-20毫升。实施例2生物素标记的柚皮苷抗炎药效学研究为检验生物素标记柚皮苷后，该物质是否仍然具有抗炎活性。以脂多糖(lipopolysaccharide，lps)建立小鼠巨噬细胞raw264.7细胞的炎症模型。将对数生长期的raw264.7细胞接种于24孔培养板中，经一天的贴壁生长后，设定4个不同的处理，即不含胎牛血清的rpmi-1640培养基的空白对照组；脂多糖lps(1μg/ml)处理组；50μg/ml的生物素标记的柚皮苷探针(biotin-naringin)和脂多糖lps(1μg/ml)处理组；以及柚皮苷(50μg/ml)和脂多糖lps(1μg/ml)。药物处理18h后，去掉细胞上清液后，加入trizol试剂，按照试剂盒操作提取rna，经反转录后，利用实时荧光定量pcr检测炎症因子环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenos,inos)、白细胞介素-1β(interleukin1β,il-1β)和白细胞介素-6(interleukin6,il-6)在转录水平的表达。实时荧光定量pcr体系及程序均参照试剂盒qpcrsybrgreenmastermix(lowroxplus)，引物序列如下：β-actin,f:5’-aggctgtgctgtccctgtatgc-3’,见seqidno.1；r:5’-acccaagaaggaaggctggaaa-3’，见seqidno.2；cox-2,f:5’-atctggcttcgggagcacaac-3’,见seqidno.3；r:5’-gaggcaatgcggttctgatactg-3’，见seqidno.4；inos,f:5’-gaatcttggagcgagttgtgga-3’,见seqidno.5；r:5’-gtgagggcttggctgagtgag-3’，见seqidno.6；il-1β,f:5’-gttgacggaccccaaaagat-3’,见seqidno.7；r:5’-cctcatcctggaaggtccac-3’，见seqidno.8；il-6,f:5’-acaaagccagagtccttcaga-3’,见seqidno.9；r:5’-tccttagccactccttctgt-3’，见seqidno.10。结果如图6及下表所示，数据表示为平均值±标准差。cox-2inosil-1βil-6control1.000,d1.000,c1.000,d1.000,clps29.045±1.065,a6.404±0.284,a1863.242±233.402,a818.109±120.114,alps+nar17.846±2.101,b4.814±0.306,b1164.258±287.331,b438.743±106.417,blps+bio-nar4.045±0.326,c0.649±0.065,d634.354±189.242,c17.321±0.479,c不同小写字母表示各处理间存在的显著性差异(p<0.05)，含有相同字母则表示为差异不显著。其中，control表示空白对照组，lps表示lps处理组，lps+nar表示柚皮苷和lps处理组，lps+bio-nar表示biotin-naringin和lps处理组，不同的小写字母表示不同组间的差异。结果表明，经lps处理后巨噬细胞中cox-2、inos、il-1β和il-6的mrna表达量显著高于没有经lps处理的空白对照组中各炎症因子mrna的表达量，而在lps+nar和lps+bio-nar处理组中cox-2、inos、il-1β和il-6的mrna表达量均显著低于lps处理组中各炎症因子mrna的表达量，说明柚皮苷经过生物素标记后的biotin-naringin仍具有抗炎活性，可应用于抗炎药物的制备以及作为探究柚皮苷药物靶标的探针。实施例3免疫沉淀筛选柚皮苷的结合蛋白为从小鼠巨噬细胞中筛选出与柚皮苷特异性结合的靶蛋白，以合成的生物素标记的柚皮苷作为探针，利用免疫沉淀的方法进行筛选。免疫沉淀试验流程如图7所示。分别取60μl链霉亲和素琼脂糖珠于2个1.5ml离心管，各加入500μl磷酸盐缓冲液(pbs)，离心去上清(14000g，5s)。再各加入500μlpbs以及分别加入4微升1μg/μl的biotin-naringin和biotin溶液，4℃摇晃孵育1h。孵育结束后，离心去上清(14000g，5s)。加入500μlpbs离心洗涤3次(14000g，5s)。再分别加入500μl的1μg/μl的小鼠巨噬细胞总蛋白，4℃摇晃孵育1h。孵育结束后，离心去上清(14000g，5s)。加入500μlpbs离心洗涤3次(14000g，5s)。分别加入60μl2倍的蛋白上样缓冲液60μl，置于沸水中煮5min，离心取上清(12000g，3min)，然后进行sds-page试验，sds-page蛋白胶条结果如图8所示。将差异条带切下，经质谱检测分析，鉴定到的蛋白如表1所示。表1lc-ms/ms检测到的候选柚皮苷靶点蛋白质上述实验结果表明，本发明合成的生物素标记的柚皮苷作为探针能够通过与其生物素特异性结合的亲和素找到直接与该探针潜在共价结合的靶蛋白，为研究柚皮苷的抗炎机制奠定了坚实的基础。本发明制备的生物素标记的柚皮苷探针，结构稳定，合成简单，具有抗炎活性。药理学实验表明，本发明的生物素标记的柚皮苷探针一方面具有开发抗炎药物的价值，另一方面能够作为分子探针，探究柚皮苷的药物靶标，对探究柚皮苷在炎症过程中的作用机制具有重要的意义。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华中农业大学<120>一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(β-actin-f)<400>1aggctgtgctgtccctgtatgc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(β-actin-r)<400>2acccaagaaggaaggctggaaa22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(cox-2-f)<400>3atctggcttcgggagcacaac21<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(cox-2-r)<400>4gaggcaatgcggttctgatactg23<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(inos-f)<400>5gaatcttggagcgagttgtgga22<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(inos-r)<400>6gtgagggcttggctgagtgag21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(il-1β-f)<400>7gttgacggaccccaaaagat20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(il-1β-r)<400>8cctcatcctggaaggtccac20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(il-6-f)<400>9acaaagccagagtccttcaga21<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(il-6-r)<400>10tccttagccactccttctgt20当前第1页1 2 3