抗非洲猪瘟P30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的急性、高度接触性传染病、病死率可高度达100％，世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒归属于双链dna病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，并且是该病毒科唯一成员。非洲猪瘟病毒p30蛋白是病毒感染早期产生的蛋白，是由cp204l基因编码的大小约为30kd的蛋白，由于其较强的免疫原性，而且p30能够诱导机体产生很强的免疫应答，通常被用做诊断抗原。

非洲猪瘟的临床症状和古典猪瘟、猪繁殖与综合征的极为相似，无法进行鉴别诊断，只能通过实验室的病原学和血清学方法进行确诊。病原学诊断包括(1)病毒的分离培养及红细胞吸附试验，红细胞吸附试验是检测非洲猪瘟的金标准；(2)基于病毒核酸的分子生物学诊断方法，主要包括pcr、qpcr、lamp等。血清学诊断方法包括间接elisa、竞争elisa、双抗夹心elisa、间接免疫荧光法、直接免疫荧光法、免疫印迹法等，但是pcr和qpcr方法对技术人员和仪器的要求较高，且很容易造成污染、出现假阳性等缺点，而elisa检测方法具有耗时短、对技术人员要求低、成本低、适合大批量检测等优点。虽然目前elisa检测非洲猪瘟病毒的方法，缺乏特异性强的抗体。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体所述单域抗体具有较强的抗原亲和性。

本发明的目的还在于提供基于双抗夹心法检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒，所述elisa试剂盒具有快速、准确且特异性强的特点。

本发明提供了抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟p30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒，包括以下组成：

包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体p30-17；

酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为seqidno.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-30；

标准阳性对照品；

血清稀释液；

底物显色液a液和tmb显色液b液；

终止液；

和浓缩洗涤液。

优选的，所述捕获抗体的包被浓度为5～7.5μg/ml。

优选的，所述包被有捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：

用包被液将捕获抗体稀释成捕获抗体溶液，添加到酶标板的微孔中，4℃包被过夜；

洗涤过夜后的酶标板，用pbst溶液洗涤3次，去除水分，加入封闭液，37℃封闭1h，洗涤酶标板，用pbst溶液洗涤3次，去除水分，得到包被有捕获抗体的酶标板。

优选的，所述封闭液为含有体积浓度5％的牛血清的ph值7.4值的pbs溶液。

优选的，所述包被液为ph值9.4的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述酶标记的检测抗体的稀释度为1:1000～2000。

优选的，所述浓缩洗涤液为25倍浓缩洗涤液，所述浓缩洗涤液为含有体积浓度0.5％吐温的ph值7.4的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述血清稀释液以500ml的蒸馏水为溶剂，包括以下含量的组分：nacl8.5g、nah2po4·2h2o0.356g、na2hpo4·12h202.772g，ph值为7.2～7.4。

优选的，所述elisa试剂盒的最低检出限为21.8ng/ml。

本发明提供了抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟p30蛋白的单域抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示。经过方阵滴定法确定抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17与非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原的亲和性，结果表明，所述单域抗体p30-17对非洲猪瘟p30蛋白具有较强的亲和性。

本发明提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒，分别以抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体p30-17作为捕获抗体和抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体p30-30作为检测抗体，基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒，能够实现快速、准确检测，检测阳性率达到100％。经过交叉实验发现，本发明提供的试剂盒只和非洲猪瘟病毒抗原发生反应，不和口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒均不发生反应，特异性为100％。

同时，本发明提供的检测试剂盒具有检测灵敏高的特点，实验表明最低检出限为21.8ng/ml。批间和批内重复性检测表明，具有良好的检测重复性。根据敏感性、特异性和重复性检测结果，3批次非洲猪瘟病毒试剂盒分别检测到20份阳性样本和30份阴性样本，与样本背景一致，符合率达到100％。

附图说明

图1为最佳封闭液的筛选结果。

具体实施方式

本发明提供了抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17，所述抗非洲猪瘟p30蛋白的单域抗体的氨基酸序列为qvqlvesgggsvqaggslrlscaasgytfsrycmgwfrqapgkereevaridsdgstnyadsvkgrftiskdnakntlylqmnslkpedtamyycaadrrrycrfqgpgdgmdywgkgtqvtvss(seqidno.1)。所述单域抗体p30-17包含125个氨基酸。本发明对所述单域抗体p30-17的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知单域抗体的来源即可。

在本发明中，抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17由p30蛋白免疫骆驼后采集骆驼抗凝血，提取总rna，反转录为cdna后构建噬菌体展示文库，使用p30蛋白进行亲和筛选后得到。

所述抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17的制备方法，优选包括以下步骤：

1)将p30-17的编码序列连接至表达载体pet-30a表达载体(酶切位点为ecori和xhoi)，构建得到原核表达载体；

2)将原核表达载体经过阳性菌落鉴定，筛选得到的阳性菌液按照1:100加入到tb培养基中进行扩大培养至od值为3.0后，加入终浓度为0.1mm的iptg进行诱导表达，6h后收集菌体，超声破碎后将沉淀用裂解液重悬，得到重悬液；

3)使用不同浓度的咪唑纯化所述重悬液，得到抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-17。

在本发明中，所述纯化的方法采用本领域所熟知的抗体纯化方法即可，例如参考申请号为201910059243.5的中国专利。纯化后的抗体优选包括经过氨基酸序列进行验证。

本发明提供了一种基于双抗体夹心法检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒，包括以下组成：

包被有捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体p30-17；

酶标记的检测抗体；所述检测抗体为氨基酸序列为seqidno.2所示的抗非洲猪瘟病毒p30蛋白的单域抗体p30-30；

标准阳性对照品；

血清稀释液；

底物显色液a液和tmb显色液b液；

终止液；

和浓缩洗涤液。

在本发明中，所述包被有捕获抗体的酶标板的制备方法，优选包括以下步骤：

用包被液将捕获抗体稀释成捕获抗体溶液，添加到酶标板的微孔中，4℃包被过夜；

洗涤过夜后的酶标板，用pbst溶液洗涤3次，去除水分，加入封闭液，37℃封闭1h，洗涤酶标板，用pbst溶液洗涤3次，再次去除水分，得到包被有捕获抗体的酶标板。

在本发明中，所述包被液优选为ph值9.4的磷酸盐缓冲液。所述捕获抗体溶液的浓度优选为5～7.5μg/ml，更优选为6μg/ml。添加到酶标板的微孔中的捕获抗体溶液的体积优选为100μl/孔。

在本发明中，所述封闭液优选为含有体积浓度5％的牛血清的ph值7.4值的pbs溶液。与其他种类的封闭液(5％马血清、5％蔗糖、10％牛血清、1％peg、0.1％酪蛋白、1％bsa和0.1％bsa)相比，使用5％的牛血清的pbs液作为封闭液时，p/n的值最高，反应效果最好。

在本发明中，再次去除水分优选依次包括拍干酶标板中水分和干燥处理。所述干燥的条件优选为25℃，30％湿度干燥6小时，用真空包装机包装，4℃保存备用。

在本发明中，所述浓缩洗涤液优选为25倍浓缩洗涤液，所述浓缩洗涤液优选为含有体积浓度0.5％吐温的ph值7.4的磷酸盐缓冲液。所述血清稀释液优选以500ml的蒸馏水为溶剂，包括以下含量的组分：nacl8.5g、nah2po4·2h2o0.356g、na2hpo4·12h202.772g，ph值为7.2～7.4。所述标准阳性对照为重组p30蛋白稀释液；所述重组p30蛋白稀释液的浓度优选为200ng/ml。

在本发明中，所述酶标记的检测抗体中检测抗体的氨基酸序列为hvqlvesgggsaqaggslrlsctasayansmgwirqapgkeregvaiiysgngatyyadsvkgrftisrdnakntiflqmnslkpedtamyycaasrpyqrtwfealdrgywgqgtqvtvss(seqidno.2)。所述检测抗体的制备方法同捕获抗体的制备方法，在此不做赘述。所述酶标记的检测抗体的稀释度优选为1:1000～2000。标记检测抗体用酶的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶即可。酶标记的检测抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶标记方法即可。所述底物显色液的种类根据酶的种类确定，当酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液为tmb底物a和b组。

在本发明中，所述elisa试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：

1)加样，将阴性对照及阳性对照各加两孔平行对照，被检样本100μl/孔，封板，37℃孵育15min；

2)洗涤将酶标板孔中的样品吸取弃掉，洗涤液300μl/孔洗涤3次，每次洗完在吸水纸上拍干；

3)加酶标二抗按100μl/孔加入酶标抗体工作液，封板，37℃孵育15min；

4)洗涤倾倒孔内液体，洗涤液300μl/孔洗涤5次，洗完在吸水纸上拍干。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次；

5)显色将tmb底物a和b组分按照1：1充分混匀，按100μl/孔加入底物溶液。盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min；

6)终止取出elisa酶标板，直接100μl/孔加入终止液，终止反应。

7)检测终止结束后，用酶标仪于主波长450nm进行检测。

所述elisa试剂盒检测，最低检出限为21.8ng/ml。

下面结合实施例对本发明提供的抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种检测猪的asfv的酶联免疫试剂盒的组分如下：

包被有捕获抗体的酶标板：捕获抗体为抗asfvp30蛋白的单域抗体(p30-17)；

检测抗体：检测抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体为抗asfvp30蛋白的单域抗体(p30-30)，稀释度为1:2000(1μg/ml)；

25×浓缩洗涤液：含有0.5％吐温的ph值7.4的磷酸盐缓冲液，工作时需要使用蒸馏水进行25倍稀释(购于兰州兽医研究所诊断中心)；

血清稀释液：nacl8.5g，nah2po4·2h2o0.356g，na2hpo4·12h202.772g，用蒸馏水溶解并定容至500ml，ph值为7.2～7.4；

显色液：tmb双组份显色液：

终止液：1mh2so4，将56ml的浓硫酸加入蒸馏水中，定容至1l，混匀冷却后室温保存；

标准阳性对照：重组p30蛋白稀释液。

其中，捕获抗体和检测抗体均是由p30蛋白免疫骆驼后采集骆驼抗凝血，提取总rna，反转录为cdna后构建噬菌体展示文库(参见申请号201910059243.5)，使用p30蛋白进行亲和筛选后得到的，单域抗体的氨基酸序列分别为：

p30-17:qvqlvesgggsvqaggslrlscaasgytfsrycmgwfrqapgkereevaridsdgstnyadsvkgrftiskdnakntlylqmnslkpedtamyycaadrrrycrfqgpgdgmdywgkgtqvtvss(seqidno.1)

p30-30:hvqlvesgggsaqaggslrlsctasayansmgwirqapgkeregvaiiysgngatyyadsvkgrftisrdnakntiflqmnslkpedtamyycaasrpyqrtwfealdrgywgqgtqvtvss(seqidno.2)。

通过构建pet-30a-vhh表达载体，表达并纯化p30-17和p30-30单域抗体；其中检测抗体是将p30-30蛋白进行hrp标记后进行使用的。其标记方法为：

1.向每10μl待标记的抗体溶液中加入1μl的启动液，反复吹打混匀，避免产生气泡；

2.打开辣根过氧化物酶瓶盖，将上述的已启动的混合液加入到该瓶中，反复吹打混匀，避免产生气泡，室温放置3小时；

3.向反应管中加入与启动液相同体积的终止液，充分混匀，室温放置1小时；

4.终止完成后，加入等体积的产物保护液，充分混匀。

包被有捕获抗体的elisa酶标板是按照以下方法制备：

1、包被

用包被液(ph9.4磷酸盐缓冲液)将捕获抗体稀释至5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜。

2、封闭

洗板机洗涤酶标板，用pbst溶液洗涤3次，300μl/孔，拍干。加入封闭液(含有5％牛血清的ph7.4pbs溶液)，200μl/孔，37℃封闭1小时。洗板机洗涤酶标板，用pbst溶液洗涤3次，300μl/孔，拍干。

3、干燥

25℃，30％湿度干燥6小时，用真空包装机包装，4℃保存备用。

本发明试剂盒中血清稀释液、酶标抗体稀释液、tmb显色液、终止液、25倍浓缩洗涤液均购自中国农业科学院兰州兽医研究所生物制品诊断中心。

实施例2

实施例1制备的试剂盒的使用方法

1、加样

取出酶标板，阴性对照及阳性对照各加两孔平行对照，被检样本100μl/孔(样本直接加入孔底，应注意避免粘壁)，封板，37℃孵育15min。

2、洗涤

将酶标板孔中的样品吸取弃掉(切忌不能随意甩掉，避免造成污染)，洗涤液300μl/孔洗涤3次，每次洗完在吸水纸上拍干。

3、加酶标二抗

按100μl/孔加入酶标抗体工作液，封板，37℃孵育15min。

4、洗涤

倾倒孔内液体，洗涤液300μl/孔洗涤5次，洗完在吸水纸上拍干。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5、显色

将tmb底物a和b组分按照1：1充分混匀，按100μl/孔加入底物溶液。盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min。

6、终止

取出elisa酶标板，直接100μl/孔加入终止液，终止反应(此时蓝色立即转为黄色)。

7、检测

终止结束后，用酶标仪于主波长450nm进行检测。

8、结果判定

试验成立条件：

2个阴性对照重复测定孔的平均od450nm＜0.2，2个阳性对照重复测定孔的平均od450nm应≥1.0时，试验成立。

结果判定：

当样本od450nm≥0.3时，判定为非洲猪瘟病毒抗原阳性；

当样本od450nm<0.2时，判定为非洲猪瘟病毒抗原阴性。

当0.2≤od450nm<0.3时，判定为可疑，建议重新检测，若od450nm≥0.3，判定为阳性。若依旧在可疑范围内，建议用其他方法进一步确诊。

实施例3

捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定

用方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度。将多克隆抗体用包被液稀释至10μg/ml、7.5μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml后100ul/孔加入到elisa反应板中，4℃过夜包被。洗板后每孔加入5％脱脂乳，37℃封闭1h。将核酸检测阳性组织液1:100倍稀释后100ul/孔加入到elisa反应板中，37℃孵育15min。洗板后将检测抗体按照1:1000、1:2000、1:4000和1:8000进行稀释后加入到elisa反应板中，37℃孵育15min。洗板后将tmb底物a和b组分按照1：1充分混匀，按100μl/孔加入底物溶液，37℃避光显色15min。终止反应后用酶标仪于主波长450nm进行检测。结果详见表1。

表1方阵滴定od450值检测结果及p/n值

由表1可知，当捕获抗体的包被浓度为7.5μg/ml、检测抗体的稀释度为1:1000时，p/n值最大，但是基于节省原材料，选择捕获抗体的包被浓度为5.0μg/ml，检测抗体的稀释倍数为1:2000为最佳稀释度，此时阳性od值大于2.0，阴性od值小于0.1，是一个很理想组合。所以确定捕获抗体的最佳工作为5.0μg/ml，检测抗体的稀释度为1：2000。

实施例4

试剂盒的敏感性、特异性、重复性测定

使用20190325142、20190329142、20190409142三个批次试剂盒检测20份阳性样本，按照说明书操作。

a.阳性检出率

统计三个批次试剂盒检测阳性样本数，根据公式计算阳性检出率(阳性检出率＝【阳性数÷(阳性数+阴性数+可疑数)】×100％)，以确定试剂盒的敏感性。结果见表2及附表1(样本序号1～20)。

表2试剂盒阳性检出率统计结果

由表2可知，该试剂盒的阳性检出率为100％。

b.最低检出量

将浓度为0.7mg/ml的全病毒蛋白倍比稀释，用试剂盒检测不同稀释倍数的全病毒蛋白，以出现可疑结果为界限，确定试剂盒的最低检出量。结果见表3。

表3灵敏度检测结果

由表3可见，当表达蛋白稀释32000倍时即样品含量为21.8ng/ml，检测为阳性；当稀释为64000倍时即含量为10.9ng/ml时，检测为可疑；当稀释为128000倍时即含量为5.4ng/ml时，检测为阴性；则试剂盒的最低检出限为21.8ng/ml。

c.特异性检验

使用20190325142、20190329142、20190409142三个批次试剂盒检测。按照说明书操作，检测猪瘟病毒培养物3份、口蹄疫o型病毒样本5份、猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活培养物3份、猪细小病毒灭活培养物3份、伪狂犬病毒灭活培养物3份、圆环病毒灭活培养物3份、猪健康组织样本5份、健康猪全血样本5份，共计30份样本。统计3批次试剂盒检测结果，计算阴性检出率(阴性检出率＝【阴性数÷(阳性数+阴性数+可疑数)】×100％)，通过阴性检出率比较试剂盒特异性。结果如表4及附表1(样本序号21～50)所示。

表4非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒特异性检测结果统计

由表4可见，3批次非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒检测异型病毒培养物或阳性样本及健康组织样本均为阴性结果，未见可疑及阳性结果，3批次试剂盒特异性均为100％。

d.重复性检验

使用20190325142、20190329142、20190409142三个批次试剂盒检测50份样品，分3人独立完成实验。检验内容包括批内和批间重复性检验。重复性分析方法：检测结果在excel表中进行汇总，通过stdev和average函数计算每一组样本3批次检测od450nm值平均标准差(sd)和平均值(mean)，则变异系数计算公式为：c.v＝(sd/mean)×100％，再通过对50份样本3次检测结果的变异系数求均值，从而对试剂盒重复性作出评价。

1)批间重复性检验

3批次试剂盒检测50份样品盘样本，按照试剂盒判断标准判定样本阴阳性，并对判定结果一致性进行统计，实验结果见表5及附表1。

表53批次非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒批间重复性实验结果

由表5可见，3批次试剂盒检测样品盘样本阴阳性判定结果一致，无批间差异；方差分析3批次试剂盒检测结果(od450nm值)，平均标准差为0.0296，变异系数为6.87％，批间重复性良好。

2)批内重复性检验

3批次试剂盒每批次独立检测3次样品盘，对检测结果进行阴阳性判定，比较每份样本检测结果一致性，并对检测结果进行统计分析，结果见表6及附表2～4。

表63批次非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒批内重复性实验结果

由表6可见，3批次试剂盒批内检测每份样本阴阳性检测结果一致，未出现结果分歧；方差分析结果显示2019032514220190329142和20190409142批次试剂盒批内平均标准差分别为0.0193、0.0204和0.0188，变异系数分别为4.11％、4.56％和4.39％，批内重复性良好。

e.符合性检验

根据敏感性、特异性和重复性检测结果，3批次非洲猪瘟病毒试剂盒分别检测到20份阳性样本和30份阴性样本，与样本背景一致，符合率100％。

实施例5

最佳封闭液的选择

分别使用5％马血清、5％蔗糖、5％牛血清、10％牛血清、1％peg、0.1％酪蛋白、1％bsa和0.1％bsa8种封闭液同时封闭酶标板，筛选封闭效果最佳的封闭液。筛选结果见图1。

由图1可知，使用5％的牛血清作为封闭液时，p/n的值最高，反应效果最好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

附表13批次非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒检测样品盘样本检测结果

附表220190325142批非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒批内检测结果

附表320190329142批非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒批内检测结果

附表420190409142批非洲猪瘟病毒夹心elisa检测试剂盒批内检测结果

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>125

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyservalglnalaglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrthrpheserargtyr

202530

cysmetglytrppheargglnalaproglylysgluargglugluval

354045

alaargileaspseraspglyserthrasntyralaaspservallys

505560

glyargphethrileserlysaspasnalalysasnthrleutyrleu

65707580

glnmetasnserleulysprogluaspthralamettyrtyrcysala

859095

alaaspargargargtyrcysargpheglnglyproglyaspglymet

100105110

asptyrtrpglylysglythrglnvalthrvalserser

115120125

<210>2

<211>122

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

hisvalglnleuvalgluserglyglyglyseralaglnalaglygly

151015

serleuargleusercysthralaseralatyralaasnsermetgly

202530

trpileargglnalaproglylysgluarggluglyvalalaileile

354045

tyrserglyasnglyalathrtyrtyralaaspservallysglyarg

505560

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65707580

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115120