一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法与流程

本发明涉及胚胎工程的
技术领域：
，具体涉及一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法。
背景技术：
：：体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。此技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要且常规的动物繁殖生物技术，此项技术不仅应用于畜牧业生产，同时，也成为研究其它胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段，通过体外受精可为外源基因的导入提供充足的胚胎来源，为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系，用分离的x和y精子与卵子体外受精，可对哺乳动物进行性别控制，同样，胚胎干细胞的分离也需要体外受精技术提供胚胎和培养体系，因而，这些生物技术的综合发展将对人类生活产生重大影响。最为重要的是，就目前而言，暂未发现体外受精动物表现有遗传和生理缺陷问题。目前，异种核移植可能成为保护高度濒危动物,建立治疗性克隆非人灵长类动物模型和核质互作关系研究动物模型的一种有效方法，可以避免人类治疗性克隆研究中的伦理、法律和临床上的实验限制。异种体细胞核移植研究不仅可以支持人类治疗性克隆、灵长类早期胚胎发育和核移植过程中的核质互作、核重编程和表观遗传学等基础研究，揭示不同动物之间细胞核质互作的特征和规律，在实践上可以使珍稀濒危动物的异种体细胞核移植研究可以快速繁育变得可行。但是，现阶段的克隆技术成功率低，因而很大程度上阻碍了克隆技术的发展，此外，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷及免疫失调等问题。因此，建立一种更为有效的能够替代异种核移植的技术迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法，采用体外受精的方法，将异种动物的卵母细胞作为介质来孵育另一动物的雄原核。本发明实现目的之一所采用的方案是：一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法，包括以下步骤：步骤1、获取带有第一极体的动物a的成熟卵母细胞并置于动物b的体外受精液微滴中；步骤2、将所述动物b的精子注入步骤1中的含有所述卵母细胞的体外受精液微滴中，获得精卵混合微滴；步骤3、将步骤2得到的精卵混合微滴置于co2培养箱中孵育，至所述动物b的精子进入所述卵母细胞的细胞质形成雄原核；其中，所述动物a和动物b为异种动物。优选地，所述步骤1中，动物a为昆明小鼠；动物b为高产奶牛、猕猴或熊猫。动物a即卵母细胞的来源动物，一般采用成本较低，繁殖能力强，容易获取，不受外界环境、四季变化等的影响的动物；动物b即精子的来源动物，采用卵母细胞不容易得到，比较珍贵的动物。且动物a和动物b为异种动物，种属相差较远。优选地，所述步骤1中，还包括以下操作：将所述卵母细胞进行透明带去除处理之后再置于所述体外受精液微滴中。优选地，采用0.25％的链霉蛋白酶对所述卵母细胞进行透明带去除处理。优选地，所述步骤2中，采用上浮法孵育获得活力较强的动物b的优质精子注入步骤1中的含有所述卵母细胞的体外受精液微滴中。优选地，所述步骤2中，动物b的精子浓度为3×105个/ml。优选地，所述步骤3中，采用动物b的体外受精条件和受精环境进行孵育，当动物b选择高产奶牛时，孵育条件为39℃，co2体积百分数为5％，饱和湿度，时间为6-8h。本发明具有以下优点和有益效果：本发明的方法中，利用异种动物不交叉受精的生殖隔离的受精生物学原理，运用体外受精的方法以异种动物间的卵母细胞作为介质来获得另一动物的雄原核，雄原核的形成率高达17.8％以上。单独进行体外受精的受精率较低，不能保证卵母细胞的高使用率，但是如果将已经形成的雄原核再置换到成熟的卵母细胞内，将会大大提高体外受精率，从而提高了卵母细胞的利用率，本发明采用繁殖力强易获得成本低的卵母细胞培育目标动物的雄原核，再移植到难以获得的、珍贵的卵母细胞中，提高了体外受精率，进一步提高了难以获得的、珍贵的卵母细胞的利用率，是一种能有效的替代种核移植的方法。附图说明图1是本发明实施例1中获得的高产奶牛雄原核的显微镜图。具体实施方式为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明的实施例中：bo液的配方：6.55mg/ml氯化钠、0.3mg/ml氯化钾、0.249mg/ml氯化钙、0.0497mg/ml氯化镁、0.0869mg/ml磷酸二氢钠、3.104mg/ml碳酸氢钠、2.5mg/ml葡萄糖、0.055mg/ml丙酮酸钠、0.065mg/ml青霉素、0.05mg/ml硫酸链霉素；bo-a液的配方：bo液、5mm咖啡因、10mg/ml肝素钠、3mg/mlbsa；培养液crlaa配方：114.7mmnacl、3.1mmkcl、26.2mmnahco3、0.4mm丙酮酸钠、5.0mm乳酸半钙、3mg/mlbsa、1.0mml-谷氨酰胺；培养液m2，htf，购买于sigma公司；超排激素pmsg、hcg购买于宁波第二激素厂。【实施例1】获取昆明小鼠成熟卵母细胞；本实施例中所用昆明小鼠购买于武汉市疾控中心，6-10周龄昆明白雌鼠控光(14h光照，10h黑暗)饲养1-2周后，腹腔注射10iu/支pmsg46-48h，腹腔注射10iu/支hcg进行超排。超排20-22h后，采用颈椎脱臼法处死超排小鼠，解剖取得其壶腹膨大部，获得超排卵母细胞，倒置显微镜下观察，获得带有第一极体的成熟卵母细胞。高产奶牛优质精子获取：本实施例中所用精液为西蒙塔尔奶牛冷冻精液，购买于武汉市奶牛改良站。采用上浮发获取优质精子，具体操作方法：从液氮罐取细管冻精放入37℃水浴中30-40s快速解冻，用75％酒精消毒后剪开细管，将精子放入含有1ml体外受精液的离心管中，用移液枪轻轻吹打后，上下颠倒几次，置于二氧化碳培养箱中静置20-30min，使精子上浮，将上浮的精子离心处理，1500r/min，5min，用体外受精液再次离心处理两次，1500r/min，5min；弃上清，获得所需优质精子。将昆明小鼠带有第一极体的成熟卵母细胞置于高产奶牛的体外受精液bo-a中平衡30min，用高产奶牛体外受精液bo处理高产奶牛精液，体外受精微滴采用bo-a，精子的终浓度为3×105个/ml，然后在co2培养箱中孵育6h，体外受精条件采用高产奶牛体外受精条件进行精卵孵育：39℃，5％co2，饱和湿度。体外受精6h后，用移液器轻轻吹打卵母细胞，除去浮在卵母细胞表面的高产奶牛的精子，倒置显微镜下观察雄原核形成情况。图1是本发明实施例1中获得的高产奶牛雄原核的显微镜图。【实施例2】本实施例与实施例1的区别在于：将昆明小鼠的成熟卵母细胞置于小鼠体外受精培养液htf中平衡30min，并用小鼠体外受精液htf处理高产奶牛精液，体外受精微滴采用htf，体外受精条件采用小鼠体外受精条件进行精卵孵育：37℃，5％co2，饱和湿度。【实施例3】将实施例1中获得的具有高产奶牛雄原核的昆明小鼠卵母细胞用奶牛胚胎培养液crlaa洗涤三次后置于奶牛胚胎培养液crlaa中，采用奶牛胚胎培养条件进行培养：39℃，5％co2，饱和湿度。【实施例4】本实施例与实施例4的区别在于：将实施例1中获得的具有高产奶牛雄原核的昆明小鼠卵母细胞用小鼠胚胎培养液m2洗涤三次后置于小鼠胚胎培养液m2中，采用用小鼠胚胎培养条件进行培养：37℃，5％co2，饱和湿度。【实施例5】本实施例与实施例1的区别在于：将昆明小鼠卵母细胞用0.25％链霉蛋白酶进行透明带去除处理后再进行后续操作，对比透明带对雄原核形成的影响。结果统计：表一实施例1和实施例2的雄原核形成情况记录实施例处理细胞数雄原核形成数(％)实施例119723(11.7)实施例21453(2)由表一数据可知：采用高产奶牛体外受精条件：包含受精液和受精环境，更有利于高产奶牛雄原核的生成，即以异种动物卵母细胞为介质获得雄原核的条件为精子来源动物的体外受精条件。表二实施例4和实施例5体外受精胚胎发育情况实施例处理细胞数卵裂数(％)囊胚数(％)实施例4328(25)0实施例5286(21.4)0由表二数据可知：种属相差较远的两个动物进行体外受精，可以得到目的动物的雄原核，但是得不到发育的胚胎，不存在动物杂交的伦理问题。表三实施例1和实施例5的透明带对雄原核形成情况记录实施例处理细胞数雄原核形成数(％)实施例1(有透明带)19723(11.7)实施例6(无透明带)21338(17.8)由表三中数据可知：去除动物卵母细胞的透明带后，更有利于得到目的动物的雄原核。以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3