一株维斯假丝酵母及其在制备油溶性甜菜红色素中的用途的制作方法

本发明属于微生物领域和天然色素技术领域，特别涉及一株维斯假丝酵母及其在制备油溶性甜菜红色素中的用途。

背景技术：

甜菜红色素是一种水溶性食用天然色素，存在于藜科、苋科、仙人掌科、紫茉莉科以及商陆科等多种植物中，因最早提取于红甜菜根而得名。甜菜红色素具有无毒、安全、着色性能好等特点，是一种广泛使用的色素，已应用于饮料、糕点、果酒等食品领域。近年来，化学合成食用色素因安全性问题而逐渐被限制使用，天然色素是研发与应用的关注热点，甜菜红色素也成为化学合成色素的替代品之一。

甜菜红色素不溶于油脂，限制了甜菜红色素在油性食品中的应用，例如，蛋糕裱花用的奶油无法直接使用甜菜红色素着色。目前，尚未有油溶性甜菜红色素商品出售。

技术实现要素：

为了创新甜菜红色素产品，解决甜菜红色素在油性食品中应用的局限性问题，本发明发现一株酵母菌发酵所产生的生物表面活性剂对甜菜红色素的乳化效果优异。本发明的首要目的在于提供一株维斯假丝酵母。

本发明的另一目的在于提供上述维斯假丝酵母在食品领域中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种油溶性甜菜红色素。

为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：

一株维斯假丝酵母，名称为维斯假丝酵母(candidaviswanathii)tb07，保藏编号为gdmccno:60785，于2019年9月20日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的维斯假丝酵母发酵所得的生物表面活性剂乳化性能优异，适合在食品领域中进行应用；适合用于制备油溶性甜菜红色素。

一种油溶性甜菜红色素，通过如下步骤制备得到：

(1)甜菜红色素乳化剂的制备：将上述维斯假丝酵母进行摇瓶培养，然后将得到的维斯假丝酵母培养液接入发酵培养基，进行发酵培养，将得到的发酵液进行固液分离，得到液体a；将液体a进行浓缩，灭菌，得到甜菜红色素乳化剂；

(2)油溶性甜菜红色素的制备：将油脂与步骤(1)得到的甜菜红色素乳化剂混合均匀后静置，待分层稳定后取上层，得到乳化液；将乳化液和甜菜红色素混匀，得到油溶性甜菜红色素。

步骤(1)中所述的摇瓶培养的培养基优选由葡萄糖、酵母浸粉、麦芽浸膏、kh2po4、mgso4·7h2o和水配制而成，培养基配方优选为：葡萄糖25～35g/l、酵母浸粉3～5g/l、麦芽浸粉4～6g/l、kh2po41～3g/l、mgso4·7h2o0.3～0.5g/l，调节初始ph的范围为5.0～6.0，但不仅限于此配比方案；更优选为葡萄糖30g/l、酵母浸粉4g/l、麦芽浸粉5g/l、kh2po42g/l、mgso4·7h2o0.4g/l，调节初始ph的范围为5.5～6.0。

步骤(1)中所述的摇瓶培养的条件优选如下：摇瓶装液量为摇瓶容积的10％～20％，摇瓶转速为120～200r/min，培养温度为26～28℃，培养时间为18～22h。

步骤(1)中所述的维斯假丝酵母培养液的接种量优选为发酵培养基体积的2％～10％(v/v)。

步骤(1)中所述的发酵培养基优由选葡萄糖、酵母浸粉、kh2po4、mgso4·7h2o和水配制而成，培养基配方优选为：葡萄糖60～80g/l、酵母浸粉4～6g/l、kh2po42～2.4g/l、mgso4·7h2o0.4～0.5g/l，调节初始ph的范围为6.0～7.0。

步骤(1)中所述的发酵培养的条件优选为：搅拌转速为120～200r/min，发酵温度控制为26～28℃，发酵时间为120～144h；更优选为：拌转速为120～200r/min，发酵温度控制为26～28℃，发酵的通气比为0.2～0.5vvm，发酵时间为120～144h，在发酵期间的第0～40h，发酵的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵最后的36h，发酵的通气比控制为0.3vvm，中间的发酵的通气比控制为0.5vvm。

步骤(1)中所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的离心的转速优选为6000～7000r/min。

步骤(1)中所述的浓缩的方式优选为真空蒸发浓缩。

所述的真空蒸发浓缩的温度优选为50～60℃。

所述的浓缩的程度优选为浓缩至液体a体积的20％～30％。

步骤(1)中所述的灭菌的条件优选为：于105～110℃灭菌8～12min。

步骤(2)中所述的油脂包括植物油和动物油。

所述的植物油包括但不限于大豆油、玉米油、葵花籽油、花生油、菜籽油等；优选为大豆油和玉米油中的一种或两种。

所述的动物油包括但不限于黄油。

步骤(2)中所述的油脂的用量优选按油脂：甜菜红色素乳化剂＝体积比1：1.5～2.5配比；更优选为按油脂：甜菜红色素乳化剂＝体积比1：2配比。

步骤(2)中所述的混合均匀的方式优选为在搅拌状态下进行均质。

所述的搅拌的转速优选为60～100rpm。

所述的均质的压力优选为30～40mpa。

所述的均质的次数优选为1次。

步骤(2)中所述的静置的容器优选为柱状容器。

步骤(2)中所述的静置的时间优选为8～12h。

步骤(2)中所述的甜菜红色素的添加量不超过12g/l；更优选为6～12g/l。

步骤(2)中所述的混匀的方式优选为搅拌后均质。

所述的均质的压力优选为30～40mpa。

所述的油溶性甜菜红色素色泽分布均匀，且状态稳定，适用于食品、化妆品和药品等工业领域。

本发明具有以下优点及效果：

(1)本发明提供了一株维斯假丝酵母，其发酵所产生的生物表面活性剂，乳化效果优异，根据国家颁发的《可用于食品的菌种名单》，其可用于食品领域中。

(2)本发明利用维斯假丝酵母发酵所产生的生物表面活性剂为乳化剂，将水溶性甜菜红色素溶于油脂中，制作成为油溶性甜菜红色素，于避光、密闭的条件下保存三个月，色泽分布均匀，无沉淀出现。本发明产品可以填补了油溶性甜菜红色素的市场空白，扩大甜菜红色素在油性食品领域的应用范围，丰富了油溶性天然色素的品种，有利于保障食品安全。

附图说明

图1是本发明的菌种扫描电镜照片图。

图2是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。

实施例1

以自然发酵5天的椰浆为菌种筛选材料。

平板分离培养基：葡萄糖50g/l，酵母膏20g/l，牛肉膏10g/l，氯霉素100mg/l，琼脂20g/l，调节ph6.0。平板分离培养基121℃灭菌20min，趁热倒入无菌的培养皿，冷凝形成平板。将自然发酵的椰浆进行梯度稀释，在无菌操作条件下，将无菌的豆油涂布在平板上，再将梯度稀释液涂布于平板上，置于28℃下培养96h。

斜面培养基采用yepd培养基。在无菌操作条件下，在平板菌落周围滴加少量无菌水，观察菌落周围的乳化情况。用接种针挑取有周围有乳化现象的80个单菌落，分别接入斜面培养基，于28℃下培养，菌苔长出后，置于4℃冰箱保藏，备用。

摇瓶筛选培养基：葡萄糖50g/l，酵母膏5g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，调节ph6.0。摇瓶培养基于121℃灭菌20min，冷却后，分别接入80株斜面菌种，每瓶接入1环，然后置于28℃、200rpm的条件下培养120h。将摇瓶培养液于6000r/min的条件下离心20min，收集上清液。在具塞刻度试管中，加入5ml上清液和等体积的豆油，利用涡旋振荡器在3000r/min的条件下进行剧烈振荡5min，静置24h，观察试管内液体的乳化情况，并测定上清液对豆油的乳化值e24(乳化值e24是乳化层高度占总液层高度的百分比)。根据乳化值e24，筛选出发酵液乳化能力最强的一株菌种，即为本发明的菌种。

利用扫描电镜观察该菌种的菌体形态，菌体形态与普通酵母的菌体形态一致(如图1所示)。利用分子鉴定方法分析该菌种的26srdna，在ncbi数据平台上检索与比对，确定该菌种为维斯假丝酵母(candidaviswanathii)。该菌种的26srdna如下所示：

tgcatatcaaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggctctttcagagtccgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggcctggctcttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtgagaatcccgtgcgatgagatgacccaggtccgtgtaaagttccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggcattttgcatgttgcttcttcgggggcggcctctgcggtttgtcgggccagcatcagtttgggcggcaggacaatcgcgtgggaatgtggcacggcctcggctgtgtgttatagcccgcgtggatactgccagcctagactgaggactgcggtttatacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgtcttgaaacacggaccagg。

将该菌种命名为维斯假丝酵母(candidaviswanathii)tb07，于2019年9月20日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60785。

实施例2

一种油溶性甜菜红色素的制作过程，如图2所示，具体如下：

(1)甜菜红色素乳化剂的制备

称取36g葡萄糖、4.8g酵母浸粉、6g麦芽浸粉、2.4gkh2po4、0.48gmgso4·7h2o，加水溶解，定容1.2l，调节ph至5.5，分装至8个1000ml三角瓶中，每瓶装液150ml，121℃灭菌20min，冷却后，接入1环维斯假丝酵母gdmccno:60785斜面菌种的菌苔，置于180r/min、27℃的条件下进行培养20h，即得酵母摇瓶培养液。

称取1400g葡萄糖、100g酵母浸粉、44gkh2po4、9gmgso4·7h2o，加水溶解，定容至20l，调节ph至6.5，放入发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后，接入1.2l酵母摇瓶培养液，启动搅拌和通入无菌空气，发酵132h。在发酵过程中，发酵罐搅拌转速控制为160r/min，发酵温度控制为27～28℃；根据发酵对溶解氧的需求，发酵0～32h的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵32～96h的通气比控制为0.5vvm，发酵96h后的通气比控制为0.3vvm。

发酵结束后，利用离心机在6500r/min的条件下进行离心除菌，获得20.2l上清液。在55℃的条件下，利用真空蒸发器将上清液浓缩至5.05l，然后将浓缩液在108℃灭菌10min，冷却至40℃，备用。

(2)甜菜红色素乳化剂的制备

将5.05l浓缩液与2.53l黄油(40℃、液态)放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在35mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在40℃下静置10h，取出上层的2.4l乳化层。在乳化层中，加入19.2g甜菜红色素，混匀，在35mpa的压力下进行均质，即可得到油溶性甜菜红色素，在避光、密闭的条件下保存3个月，色泽分布均匀、无沉淀出现，可用于蛋糕的裱花。

实施例3

一种油溶性甜菜红色素的制作过程，如图2所示，具体如下：

(1)甜菜红色素乳化剂的制备

称取54g葡萄糖、7.2g酵母浸粉、9g麦芽浸粉、3.6gkh2po4、0.72gmgso4·7h2o，加水溶解，定容1.8l，调节ph至6.0，分装至9个1000ml三角瓶中，每瓶装液200ml，121℃灭菌20min，冷却后，接入1环维斯假丝酵母gdmccno:60785斜面菌种的菌苔，置于200r/min、28℃的条件下进行培养18h，即得酵母摇瓶培养液。

称取1440g葡萄糖、108g酵母浸粉、43.2gkh2po4、9gmgso4·7h2o，加水溶解，定容至18l，调节ph至7.0，放入发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后，接入1.8l酵母摇瓶培养液，启动搅拌和通入无菌空气，发酵144h。在发酵过程中，发酵罐搅拌转速控制为200r/min，发酵温度控制为27～28℃；根据发酵对溶解氧的需求，发酵0～24h的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵24～108h的通气比控制为0.5vvm，发酵108h后的通气比控制为0.3vvm。

发酵结束后，利用离心机在7000r/min的条件下进行离心除菌，获得18.6l上清液。在60℃的条件下，利用真空蒸发器将上清液浓缩至5.58l，然后将浓缩液在105℃灭菌12min，冷却至30℃，备用。

(2)甜菜红色素乳化剂的制备

将5.58l浓缩液与2.79l大豆油放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在40mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在常温下静置12h，取出上层的2.6l乳化层。在乳化层中，加入31.2g甜菜红色素，混匀，在40mpa的压力下进行均质，即可得到油溶性甜菜红色素，在避光、密闭的条件下保存3个月，色泽分布均匀、无沉淀出现，可用于油性食品的染色。

实施例4

一种油溶性甜菜红色素的制作过程，如图2所示，具体如下：

(1)甜菜红色素乳化剂的制备

称取12g葡萄糖、1.6g酵母浸粉、2g麦芽浸粉、0.8gkh2po4、0.16gmgso4·7h2o，加水溶解，定容0.4l，调节ph至6.0，分装至4个1000ml三角瓶中，每瓶装液100ml，121℃灭菌20min，冷却后，接入1环维斯假丝酵母gdmccno:60785斜面菌种的菌苔，置于120r/min、26℃的条件下进行培养22h，即得酵母摇瓶培养液。

称取1200g葡萄糖、80g酵母浸粉、40gkh2po4、8gmgso4·7h2o，加水溶解，定容至20l，调节ph至6.0，放入发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后，接入0.4l酵母摇瓶培养液，启动搅拌和通入无菌空气，发酵120h。在发酵过程中，发酵罐搅拌转速控制为120r/min，发酵温度控制为26～27℃；根据发酵对溶解氧的需求，发酵0～40h的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵40～84h的通气比控制为0.5vvm，发酵84h后的通气比控制为0.3vvm。

发酵结束后，利用离心机在6000r/min的条件下进行离心除菌，获得18.8l上清液。在50℃的条件下，利用真空蒸发器将上清液浓缩至3.76l，然后将浓缩液在110℃灭菌8min，冷却至30℃，备用。

(2)甜菜红色素乳化剂的制备

将3.76l浓缩液与1.88l玉米油放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在30mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在常温下静置8h，取出上层的1.7l乳化层。在乳化层中，加入10.2g甜菜红色素，混匀，在30mpa的压力下进行均质，即可得到油溶性甜菜红色素，在避光、密闭的条件下保存3个月，色泽分布均匀、无沉淀出现，可用于油性食品的染色。

对比例1

将5l纯净水与2.5l黄油(40℃、液态)放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在35mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在40℃下静置10h，取出上层的2.4l油脂层。在油脂层中，加入9.6g甜菜红色素，搅拌混合，在35mpa的压力下进行均质，在避光、密闭的条件下静置60min，甜菜红色素不溶于黄油，沉淀在黄油底部。

对比例2

将5l纯净水与2.5l大豆油放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在40mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在常温下静置12h，取出上层的2.4l油脂层。在油脂层中，加入9.6g甜菜红色素，搅拌混合，在40mpa的压力下进行均质，在避光、密闭的条件下静置60min，甜菜红色素不溶于大豆油，沉淀在大豆油底部。

对比例3

将5l纯净水与2.5l玉米油放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在30mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在常温下静置8h，取出上层的2.4l油脂层。在油脂层中，加入9.6g甜菜红色素，搅拌混合，在30mpa的压力下进行均质，在避光、密闭的条件下静置60min，甜菜红色素不溶于玉米油，沉淀在玉米油底部。

对比例4

(1)酵母发酵与发酵液处理

称取36g葡萄糖、4.8g酵母浸粉、6g麦芽浸粉、2.4gkh2po4、0.48gmgso4·7h2o，加水溶解，定容1.2l，调节ph至5.5，分装至8个1000ml三角瓶中，每瓶装液150ml，121℃灭菌20min，冷却后，接入1环酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cicc1023(购买于中国工业微生物菌种保藏中心)斜面菌种的菌苔，置于180r/min、27℃的条件下进行培养20h，即得酵母摇瓶培养液。

称取1400g葡萄糖、100g酵母浸粉、44gkh2po4、9gmgso4·7h2o，加水溶解，定容至20l，调节ph至6.5，放入发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后，接入1.2l酵母摇瓶培养液，启动搅拌和通入无菌空气，发酵132h。在发酵过程中，发酵罐搅拌转速控制为160r/min，发酵温度控制为27～28℃；根据发酵对溶解氧的需求，发酵0～32h的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵32～96h的通气比控制为0.5vvm，发酵96h后的通气比控制为0.3vvm。

发酵结束后，利用离心机在6500r/min的条件下进行离心除菌，获得20l上清液。在55℃的条件下，利用真空蒸发器将上清液浓缩至5l，然后将浓缩液在108℃灭菌10min，冷却至40℃，备用。

(2)甜菜红色素与浓缩液混合

将5l浓缩液与2.5l黄油(40℃、液态)放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在35mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在40℃下静置10h，没有出现乳化现象。取出上层的2.4l油脂层，加入9.6g甜菜红色素，混匀，在35mpa的压力下进行均质，在避光、密闭的条件下静置60min，甜菜红色素不溶于黄油，沉淀在黄油底部。

对比例5

(1)酵母发酵与发酵液处理

称取54g葡萄糖、7.2g酵母浸粉、9g麦芽浸粉、3.6gkh2po4、0.72gmgso4·7h2o，加水溶解，定容1.8l，调节ph至6.0，分装至9个1000ml三角瓶中，每瓶装液200ml，121℃灭菌20min，冷却后，接入1环产朊假丝酵母(candidautilis)cicc1422(购买于中国工业微生物菌种保藏中心)斜面菌种的菌苔，置于200r/min、28℃的条件下进行培养18h，即得酵母摇瓶培养液。

称取1440g葡萄糖、108g酵母浸粉、43.2gkh2po4、9gmgso4·7h2o，加水溶解，定容至18l，调节ph至7.0，放入发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后，接入1.8l酵母摇瓶培养液，启动搅拌和通入无菌空气，发酵144h。在发酵过程中，发酵罐搅拌转速控制为200r/min，发酵温度控制为27～28℃；根据发酵对溶解氧的需求，发酵0～24h的通气比由0.2vvm逐步增加至0.5vvm，发酵24～108h的通气比控制为0.5vvm，发酵108h后的通气比控制为0.3vvm。

发酵结束后，利用离心机在7000r/min的条件下进行离心除菌，获得18.4l上清液。在60℃的条件下，利用真空蒸发器将上清液浓缩至5.52l，然后将浓缩液在105℃灭菌12min，冷却至30℃，备用。

(2)甜菜红色素与浓缩液混合

将5.52l浓缩液与2.76l大豆油放入带搅拌的容器中，调节搅拌转速80r/min，一边搅拌，一边送入高压均质机，在40mpa的压力下进行均质，然后放入柱状容器，在常温下静置12h，没有出现乳化现象。取出上层的2.6l油脂层，加入10.4g甜菜红色素，混匀，在35mpa的压力下进行均质，在避光、密闭的条件下静置60min，甜菜红色素不溶于大豆油，沉淀在大豆油底部。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东轻工职业技术学院

邓毛程

李静

<120>一株维斯假丝酵母及其在制备油溶性甜菜红色素中的用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>618

<212>dna

<213>维斯假丝酵母(candidaviswanathii)

<220>

<223>26srdna序列

<400>1

tgcatatcaaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtg60

aagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggctctttcagagtccgagttgtaatttgaag120

aaggtatctttgggcctggctcttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtg180

agaatcccgtgcgatgagatgacccaggtccgtgtaaagttccttcgacgagtcgagttg240

tttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagag300

accgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaa360

aagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggcattttgcatgttg420

cttcttcgggggcggcctctgcggtttgtcgggccagcatcagtttgggcggcaggacaa480

tcgcgtgggaatgtggcacggcctcggctgtgtgttatagcccgcgtggatactgccagc540

ctagactgaggactgcggtttatacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgt600

cttgaaacacggaccagg618