一种特异性靶向三阴乳腺癌的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，尤其是涉及一种特异性靶向三阴乳腺癌的多肽及其应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提升和平均寿命的延长，世界范围内癌症的发病率逐年攀升，成为威胁人类健康的主要因素。《世界癌症报告》的数据显示，2012年全球癌症病例为1400万例，到2035年将上升至2400万例。乳腺癌是世界上发病率排第二的癌症，也是女性中发病率最高的癌症类型。2012年全球乳腺癌新增病例为167万例，占当年所有新增癌症病例的25％。按照不同的分子分型，乳腺癌可被划分为：雌激素/孕激素阳性型(er/pr+)、her2高表达型(her2+)和三阴型。对于er/pr+型乳腺癌，目前可采用内分泌法进行治疗；对于her2+型，目前可采用her2单抗药物或her2抑制剂进行治疗，如帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、拉帕替尼、阿法替尼等。三阴乳腺癌在所有乳腺癌中占比大约15％-20％，是恶性程度最高的乳腺癌种类，患者五年生存率远低于前两种类型。但对于三阴乳腺癌，目前还未发现有效的分子靶点，主要依赖手术治疗、传统化疗或放疗。但传统癌症治疗手段往往存在严重的副作用，在治疗癌症的同时，损害了身体的正常功能，破坏人体的自身免疫力。因此，寻找三阴乳腺癌可能的生物靶点，一直是乳腺癌领域研究的热点和难点之一。

噬菌体展示技术是一种能够将所需性质的多肽从大量变异体的集落中提取出来的体外筛选技术。自从smith首次提出该方法以来，噬菌体展示技术已经发展成为一种发现新特性及改变已有多肽性质的强大工具。噬菌体展示技术在发现靶标分子对应的新的结合多肽上极为有效。其基本原理是：首先，将随机序列的核苷酸序列插入噬菌体衣壳蛋白基因中，从而使噬菌体可以展示该核苷酸所编码的多肽。接着，通过该噬菌体库，对靶标分子进行筛选，使能够与该靶标分子进行特异性结合的噬菌体进行富集，从而得到对应的特异性结合多肽。噬菌体展示技术在为各种类型的靶标分子筛选特异性结合物的过程中，显示出了非常强大的应用潜力和重要作用。基于此，有必要寻找能够特异性靶向三阴乳腺癌的多肽。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够特异性靶向三阴乳腺癌的多肽以及该多肽的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种多肽，该多肽具有如seqidno.1(asyssgphtvqy)所示的氨基酸序列。

本发明实施例的有益效果是：

该多肽与decorin具有同源性，能够和三阴乳腺癌的癌细胞表面的decorin受体结合，从而起到靶向作用，同时，该多肽与其它类型的乳腺癌细胞的结合能力较为微弱，展现出了较高的特异性选择性，可以以此用于三阴乳腺癌的靶向治疗或成像诊断。

本发明的第二方面，提供一种偶联物，该偶联物包括上述的多肽和偶联部分。该偶联物可以与三阴乳腺癌细胞特异性结合，具有较高的特异性选择性，可以以此用于三阴乳腺癌的靶向治疗或成像诊断。

根据本发明的实施例，偶联部分选自成像剂、治疗剂中的至少一种。

根据本发明的实施例，成像剂为各类影像学技术的造影剂中的至少一种，诸如计算机断层扫描(ct)、核磁共振(mri)、超声、放射性核素扫描、正电子发射断层扫描(pet)等影像学技术。

根据本发明的实施例，成像剂为光学标记中的至少一种，诸如荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物等。

根据本发明的实施例，成像剂选自放射性核素、放射性核素标记物、分子影像剂、荧光素、量子点中的至少一种。

根据本发明的实施例，治疗剂选自药物、毒素、细胞因子、载体蛋白、抗体、酶、凝集素中的至少一种。

本发明的第三方面，提供一种核酸分子，该核酸分子编码前述的多肽或偶联物。

本发明的第四方面，提供一种重组载体，该重组载体包括前述的核酸分子。该重组质粒用于三阴乳腺癌的靶向治疗或成像诊断。

根据本发明的实施例，该重组载体可以是重组质粒、噬菌体。

根据本发明的实施例，该重组载体为重组质粒，该重组质粒在质粒载体的多克隆位点插入上述核酸分子。

根据本发明的实施例，该重组载体为重组噬菌体。

根据本发明的实施例，该重组噬菌体在其dna或rna链上插入前述的核酸分子，随外壳蛋白的表达而表达，从而高效表达前述的多肽。

根据本发明的实施例，该重组噬菌体为包含前述核酸分子的m13噬菌体。

本发明的第五方面，提供一种重组细胞，该重组细胞包括前述的核酸分子。

根据本发明的实施例，该重组细胞通过在宿主细胞内转导或转染前述核酸分子得到。

根据本发明的实施例，宿主细胞为革兰氏阴性菌；更具体地，是大肠杆菌。

本发明的第六方面，提供一种组合物，该组合物包括前述的多肽、偶联物、核酸分子、重组载体、重组细胞中的任一种。该组合物为用于三阴乳腺癌的诊断组合物或治疗组合物。

根据本发明的实施例，组合物为药物组合物，该药物组合物还包括药物递送载体。

根据本发明的实施例，药物递送载体为纳米级载体系统、微米级载体系统中的任一种。

根据本发明的实施例，药物递送载体选自脂质体、聚合物胶束、树枝状化合物、无机纳米颗粒中的至少一种。

本发明的第七方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述的多肽、偶联物中的任一种。该多肽或偶联物具有对三阴乳腺癌细胞的靶向特异性，以此制备的试剂盒能够用于特异性识别、标记三阴乳腺癌细胞或用于三阴乳腺癌细胞的诊断、治疗。

本发明的第八方面，提供前述的多肽、偶联物、核酸分子、重组载体、重组细胞、组合物在制备用于诊断、预防、治疗三阴乳腺癌的试剂中的用途。

附图说明

图1是本发明的一个实施例中28条多肽对三阴乳腺癌细胞的选择性结合的elisa实验结果。其中，编号7为本实施例所要求保护的多肽，实验组细胞系mda-mb-231为三阴乳腺癌细胞，对照组细胞系mcf-7为非三阴性的乳腺癌细胞。

图2是本发明的实施例2的fam荧光基团与多肽连接后的免疫荧光检测结果。其中，a和b表示对照组细胞系mcf-7，为非三阴性的乳腺癌细胞；c和d表示实验组细胞系mda-mb-231，为三阴乳腺癌细胞。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

1.多肽的筛选

采用negative-/positive+的方法利用噬菌体肽库对细胞进行筛选，mcf-7(负筛)，mda-mb-231(正筛)，共三轮。每轮筛选步骤如下：

1)将贴壁的mcf-7细胞中加入0.5％bsa封闭1h；

2)将噬菌体随机十二肽库(ph.d.-12噬菌体展示肽库试剂盒，newenglandbio-labs,美国)以5×10¹⁰pfu(5μl)的滴度加入到mcf-7细胞培养皿，37℃孵育1h(负筛)；

3)3000rpm/min离心3min，收集上清(含有没有结合非三阴性的乳腺癌细胞的噬菌体)，移入mda-mb-231细胞所在免疫管，37℃震荡孵育1h(正筛)；

4)孵育完成后，3000rpm/min离心3min；

5)弃上清，细胞沉淀用pbst溶液(pbst中tween-20的浓度逐步由0.1％提高到0.5％)洗5次，再用pbs溶液洗5次；

6)加入1ml洗脱液，12000rpm离心，将上清转移到新的离心管中，加入150μl中和液，此即第一轮淘选得到的噬菌体；

7)将淘选得到的噬菌体在e.colier2378宿主菌进行扩增并滴定计数。

其中，每轮噬菌体肽库筛选中的滴度测定及富集率如表1所示

表1.不同筛选轮次的富集率

其中，富集率＝洗脱噬菌体量/加入噬菌体量

从最后一轮噬菌体滴定平板中随机选取28个独立的噬菌蓝斑进行扩增，送测序公司进行测序，将具有相同氨基酸序列的的噬菌体克隆编号合并。测序结果表明，其中一个噬菌体单克隆展示的多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。

2.选择性结合测试

通过酶联免疫反应(elisa)测试第三轮筛选得到的28条多肽对三阴乳腺癌细胞的选择性结合能力，具体步骤如下：

1)于96孔板中分别接种mcf-7和mda-mb-231细胞，待细胞生长至适宜密度；

2)对细胞进行固定，每孔加入100μl4％多聚甲醛溶液，室温固定15min，再用pbs溶液洗板三次；

3)每孔加入200μl1％bsa-pbs-t封闭液，于37℃封闭2h。封闭完成后用pbs溶液洗板三次；

4)每孔加入封闭液稀释的噬菌体，于室温孵育90min，孵育完成后用pbst溶液洗板三次，再用pbs溶液洗板三次；

5)加入100μl封闭液稀释的辣根过氧化氢酶标记的鼠m13噬菌体抗体，于室温孵育90min，孵育完成后用pbs溶液洗板三次；

6)每孔加入100μlelisa显色液，于暗处显色15min后，用2mol/l的硫酸终止反应，pbs溶液洗板三次；

7)用酶标仪在492nm波长下读取溶液吸光度数值。

图1是本实施例中28条多肽对三阴乳腺癌细胞的选择性结合的elisa实验结果。其中，编号7为本实施例所要求保护的前述氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽，实验组细胞系mda-mb-231为三阴乳腺癌细胞，对照组细胞系mcf-7为非三阴性的乳腺癌细胞。从图中可以看出，编号7所表示的多肽与三阴乳腺癌细胞mda-mb-231特异性结合，但与非三阴的乳腺癌细胞mcf-7结合较差，说明本发明提供的多肽对三阴乳腺癌细胞的结合是选择特异性的，可以特异性靶向三阴乳腺癌细胞。

实施例2

靶向三阴乳腺癌细胞的荧光探针

一种特异性靶向三阴乳腺癌细胞的荧光探针，包括实施例1中氨基酸序列如seqidno.1所示的编号7的多肽以及偶联在该肽链上的荧光基团fam(羧基荧光素)。

对该荧光探针的靶向特异性进行检测，具体步骤如下：

1)合成连接fam荧光基团的多肽；

2)于24孔板中分别接种mcf-7和mda-mb-231细胞，待细胞生长至适宜密度；

3)吸去培养基，用pbs洗涤三次，每次3min，每孔加入500μl4％的多聚甲醛溶液，室温固定20min，吸去固定液，用pbs溶液清洗三次，每次3min；

4)多肽按1:500稀释，添加到相应的孔板内，37℃孵育1h，pbs清洗三次，每次5min；

5)每孔加入100μl的dapi染液，室温孵育15min，吸走dapi，pbs清洗3次，每次5min；

6)用镊子从24孔板中夹起盖玻片，在载玻片上滴加10μl抗荧光淬灭封片剂，将铺有细胞的盖玻片倒扣在载玻片上，自然风干后于共聚焦显微镜观察荧光强度、拍照。

图2是本发明的实施例2的fam荧光基团与多肽连接后的免疫荧光检测结果。其中，a和b表示对照组细胞系mcf-7，为非三阴性的乳腺癌细胞；c和d表示实验组细胞系mda-mb-231，为三阴乳腺癌细胞。如图2所示，对照组mcf-7细胞除dapi的蓝色荧光外，未见有其他荧光，表示连有荧光基团fam的多肽没有结合到mcf-7细胞上；而实验组mda-mb-231细胞可以观察到有明亮的红色荧光，表示连有荧光基团fam的多肽结合到了mda-mb-231细胞上；该结果表明本实施例所提供的荧光探针可以与三阴性乳腺癌细胞发生特异性结合。

通过以上实施例可见，本发明提供的多肽具有靶向三阴乳腺癌细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂结合，用于肿瘤的靶向治疗，或与影像学诊断试剂结合，用于靶向肿瘤的分子成像与诊断。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

sequencelisting

<110>清华-伯克利深圳学院筹备办公室

<120>一种特异性靶向三阴乳腺癌的多肽及其应用

<130>9

<160>1

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