盾叶薯蓣来源的薯蓣皂素合成相关蛋白及编码基因与应用

(c4)中任一所示的蛋白质：
23.(c1)氨基酸序列如seq id no.11所示的蛋白质；
24.(c2)将(c1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
25.(c3)与(c1)或(c2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
26.(c4)在(c1)-(c3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
27.所述蛋白质d(来源于斑马鱼的甾醇7位还原酶，命名为drdhcr7)为如下(d1)-(d4)中任一所示的蛋白质：
28.(d1)氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质；
29.(d2)将(d1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
30.(d3)与(d1)或(d2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
31.(d4)在(d1)-(d3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
32.所述蛋白质e(来源于斑马鱼的甾醇24位还原酶，命名为drdhcr24)为如下(e1)-(e4)中任一所示的蛋白质：
33.(e1)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；
34.(e2)将(e1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
35.(e3)与(e1)或(e2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
36.(e4)在(e1)-(e3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
37.上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为his标签、flag标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
38.第二方面，本发明要求保护核酸分子或成套核酸分子。
39.本发明要求保护的核酸分子为编码前文所述蛋白质的核酸分子。
40.所述核酸分子为核酸分子a或核酸分子b。
41.本发明要求保护的成套核酸分子为成套核酸分子甲或成套核酸分子乙或成套核酸分子丙。
42.所述成套核酸分子甲由所述核酸分子a和所述核酸分子b组成。
43.所述成套核酸分子乙由所述核酸分子a、所述核酸分子b和核酸分子c组成。
44.所述成套核酸分子丙由所述核酸分子a、所述核酸分子b、所述核酸分子c、核酸分子d和核酸分子e组成。
45.所述核酸分子a为编码前文所述蛋白质a的核酸分子。
46.所述核酸分子b为编码前文所述蛋白质b的核酸分子。
47.所述核酸分子c为编码前文所述蛋白质c的核酸分子。
48.所述核酸分子d为编码前文所述蛋白质d的核酸分子。
49.所述核酸分子e为编码前文所述蛋白质e的核酸分子。
50.进一步地，所述核酸分子a编码dgcyp033，为如下(a1)-(a3)中任一所示的dna分子：
51.(a1)核苷酸序列如seq id no.10的第11-1477位所示的dna分子；
52.(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码前文所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子；
53.(a3)与(a1)或(a2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子。
54.所述核酸分子b编码dgcyp029，为如下(b1)-(b3)中任一所示的dna分子：
55.(b1)核苷酸序列如seq id no.8的第11-1501位所示的dna分子；
56.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码前文所述蛋白质b的dna分子；
57.(b3)与(b1)或(b2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质b的dna分子。
58.所述核酸分子c编码vvcpr，为如下(c1)-(c3)中任一所示的dna分子：
59.(c1)核苷酸序列如seq id no.12的第11-2125位所示的dna分子；
60.(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码前文中所述蛋白质c的dna分子；
61.(c3)与(c1)或(c2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质c的dna分子。
62.所述核酸分子d编码drdhcr7，为如下(d1)-(d3)中任一所示的dna分子：
63.(d1)核苷酸序列如seq id no.3的第813-2249位所示的dna分子；
64.(d2)在严格条件下与(d1)限定的dna分子杂交且编码前文所述蛋白质d的dna分子；
65.(d3)与(d1)或(d2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质d的dna分子。
66.所述核酸分子e编码drdhcr24，为如下(e1)-(e3)中任一所示的dna分子：
67.(e1)核苷酸序列如seq id no.4的第493-2043位所示的dna分子；
68.(e2)在严格条件下与(e1)限定的dna分子杂交且编码前文所述蛋白质e的dna分子；
69.(e3)与(e1)或(e2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文所述蛋白质e的dna分子。
70.其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂
洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
71.第三方面，本发明要求保护如下生物材料中的任一种：
72.(c1)重组载体，为含有前文所述核酸分子的重组载体。
73.(c2)表达盒，为含有前文所述核酸分子的表达盒。
74.(c3)转基因细胞系，为含有前文所述核酸分子的转基因细胞系。
75.(c4)重组菌，为含有前文所述核酸分子的重组菌。
76.(c5)成套重组载体，为成套载体甲或成套载体乙或成套载体丙。
77.所述成套载体甲由重组载体a和重组载体b组成。
78.所述成套载体乙由所述重组载体a、所述重组载体b和重组载体c组成。
79.所述成套载体丙由所述重组载体a、所述重组载体b、所述重组载体c、重组载体d和重组载体e组成。
80.所述重组载体a为含有前文所述核酸分子a的重组载体；所述重组载体b为含有前文所述核酸分子b的重组载体；所述重组载体c为含有前文所述核酸分子c的重组载体；所述重组载体d为含有前文所述核酸分子d的重组载体；所述重组载体e为含有前文所述核酸分子e的重组载体。
81.(c6)成套表达盒，为成套表达盒甲或成套表达盒乙或成套表达盒丙。
82.所述成套表达盒甲由表达盒a和表达盒b组成。
83.所述成套表达盒乙由所述表达盒a、所述表达盒b和表达盒c组成。
84.所述成套表达盒丙由所述表达盒a、所述表达盒b、所述表达盒c、表达盒d和表达盒e组成。
85.所述表达盒a为含有前文所述核酸分子a的表达盒；所述表达盒b为含有前文所述核酸分子b的表达盒；所述表达盒c为含有前文所述核酸分子c的表达盒；所述表达盒d为含有前文所述核酸分子d的表达盒；所述表达盒e为含有前文所述核酸分子e的表达盒。
86.(c7)成套转基因细胞系，为成套转基因细胞系甲或成套转基因细胞系乙或成套转基因细胞系丙。
87.所述成套转基因细胞系甲由转基因细胞系a和转基因细胞系b组成。
88.所述成套转基因细胞系乙由所述转基因细胞系a、所述转基因细胞系b和转基因细胞系c组成。
89.所述成套转基因细胞系丙由所述转基因细胞系a、所述转基因细胞系b、所述转基因细胞系c、转基因细胞系d和转基因细胞系e组成。
90.所述转基因细胞系a为含有前文所述核酸分子a的转基因细胞系；所述转基因细胞系b为含有前文所述核酸分子b的转基因细胞系；所述转基因细胞系c为含有前文所述核酸分子c的转基因细胞系；所述转基因细胞系d为含有前文所述核酸分子d的转基因细胞系；所述转基因细胞系e为含有前文所述核酸分子e的转基因细胞系。
91.(c8)成套重组菌，为成套重组菌甲或成套重组菌乙或成套重组菌丙。
92.所述成套重组菌甲由重组菌a和重组菌b组成。
93.所述成套重组菌乙由所述重组菌a、所述重组菌b和重组菌c组成。
94.所述成套重组菌丙由所述重组菌a、所述重组菌b、所述重组菌c、重组菌d和重组菌e组成。
95.所述重组菌a为含有前文所述核酸分子a的重组菌；所述重组菌b为含有前文所述核酸分子b的重组菌；所述重组菌c为含有前文所述核酸分子c的重组菌；所述重组菌d为含有前文所述核酸分子d的重组菌；所述重组菌e为含有前文所述核酸分子e的重组菌。
96.第四方面，本发明要求保护一种构建工程菌的方法。
97.本发明要求保护的构建用于合成薯蓣皂素的酵母工程菌的方法，可包括如下步骤：对能够合成胆固醇的酵母菌进行改造，使其表达前文所述的蛋白质a、前文所述的蛋白质b以及细胞色素p450还原酶，改造后的酵母菌即为目的工程菌。
98.进一步地，所述能够合成胆固醇的酵母菌可按照包括如下步骤的方法制备：对出发酵母菌进行改造，使其表达甾醇7位还原酶和甾醇24位还原酶，改造后的酵母菌即为所述能够合成胆固醇的酵母菌。
99.对应于基因水平，所述方法可包括如下步骤：将前文所述的核酸分子a、前文所述的核酸分子b以及所述细胞色素p450还原酶的编码基因导入所述能够合成胆固醇的酵母菌，得到表达所述蛋白质a、所述蛋白质b以及所述细胞色素p450还原酶的重组酵母菌，即为所述目的工程菌。
100.进一步地，所述能够合成胆固醇的酵母菌可按照包括如下步骤的方法制备：将所述甾醇7位还原酶的编码基因和所述甾醇24位还原酶的编码基因导入所述出发酵母菌，得到表达所述甾醇7位还原酶和所述甾醇24位还原酶的重组酵母菌，即为所述能够合成胆固醇的酵母菌。
101.其中，所述细胞色素p450还原酶可为前文所述的蛋白质c；所述甾醇7位还原酶可为前文所述的蛋白质d；所述甾醇24位还原酶可为前文所述的蛋白质e。
102.对应于基因水平，所述细胞色素p450还原酶的编码基因可为前文所述的核酸分子c；所述甾醇7位还原酶的编码基因可为前文所述的核酸分子d；所述甾醇24位还原酶的编码基因可为前文所述的核酸分子e。
103.进一步地，各所述核酸分子或编码基因可通过重组载体或表达盒的形式导入相应的受体酵母菌中。
104.在本发明的具体实施方式中，所述核酸分子a和所述核酸分子b以及所述细胞色素p450还原酶的编码基因(如前文所述核酸分子c)被整合到所述能够合成胆固醇的酵母菌的基因组的gal80位点。所述甾醇7位还原酶的编码基因(如前文所述核酸分子d)和所述甾醇24位还原酶的编码基因(如前文所述核酸分子e)被整合到所述出发酵母菌的基因组的gal7位点。
105.更进一步地，所述酵母菌可为酿酒酵母等。
106.在本发明的具体实施方式中，所述出发酵母菌具体为酿酒酵母by-t3。
107.在本发明的具体实施方式中，前文所述核酸分子d和所述核酸分子e是通过表达盒的形式导入所述出发酵母菌中的。所述表达盒为表达盒ppgk-drdhcr7-adh1t和表达盒pgal1-drdhcr24-cyc1t。所述表达盒ppgk-drdhcr7-adh1t的序列为seq id no.3；所述表达盒pgal1-drdhcr24-cyc1t的序列为seq id no.4。当向所述出发酵母菌中导入所述表达盒
ppgk-drdhcr7-adh1t和所述表达盒pgal1-drdhcr24-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段gal7-ura3-up和同源臂marker片段gal7-ura3-down(实现了整合于酿酒酵母的gal7位点)；所述同源臂marker片段gal7-ura3-up的序列如seq id no.5所示；所述同源臂marker片段gal7-ura3-down的序列如seq id no.6所示。
108.在本发明的具体实施方式中，前文所述核酸分子a、所述核酸分子b和所述核酸分子c是通过表达盒的形式导入所述能够合成胆固醇的酵母菌中的。所述表达盒为表达盒ppgk-dgcyp029-adh1t、表达盒ptdh3-vvcpr-tpi1t和表达盒ptef-dgcyp033-cyc1t。
109.所述表达盒ppgk-dgcyp029-adh1t以是质粒pm2-dgcyp029-sy-sc为模板使用引物1-m-peasy-pgk1-f和引物3g-1-m-adht-tdh3-r进行pcr扩增，扩增获得的片段。所述引物1-m-peasy-pgk1-f的序列如seq id no.15所示；所述引物3g-1-m-adht-tdh3-r的序列如seq id no.16所示。所述质粒pm2-dgcyp029-sy-sc为将seq id no.8的第11-1501位所示dna片段(dgcyp029-sy-sc)替换pm2质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒。
110.所述表达盒ptdh3-vvcpr-tpi1t以是质粒pm4-vvcpr-sy-sc为模板使用引物3g-3-m-adht-tdh3-f和引物3g-3-m-tpi1t-tef1-r进行pcr扩增，扩增获得的片段。所述引物3g-3-m-adht-tdh3-f的序列如seq id no.17所示；所述引物3g-3-m-tpi1t-tef1-r的序列如seq id no.18所示。所述质粒pm4-vvcpr-sy-sc为将seq id no.12的第11-2125位所示dna片段(vvcpr-sy-sc)替换pm4质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒。
111.所述表达盒ptef-dgcyp033-cyc1t以是质粒pm3-dgcyp033-sy-sc为模板使用引物3g-2-m-tpi1t-tef1-f和引物m-cyc1t-peasy-r进行pcr扩增，扩增获得的片段。所述引物3g-2-m-tpi1t-tef1-f的序列如seq id no.19所示；所述引物m-cyc1t-peasy-r的序列如seq id no.20所示。所述质粒pm3-dgcyp033-sy-sc为将seq id no.10的第11-1477位所示dna片段(dgcyp033-sy-sc)替换pm3质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒。
112.当向所述能够合成胆固醇的酵母菌中导入所述表达盒ppgk-dgcyp029-adh1t、所述表达盒ptdh3-vvcpr-tpi1t和所述表达盒ptef-dgcyp033-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段gal80-leu-up和同源臂marker片段gal80-leu-down(实现了整合于酿酒酵母的gal80位点)；所述同源臂marker片段gal80-leu-up的序列如seq id no.13所示；所述同源臂marker片段gal80-leu-down的序列如seq id no.14所示。
113.第五方面，本发明要求保护利用前文第四方面中所述方法制备得到的工程菌。
114.在本发明的具体实施方式中，所述工程菌为工程菌dg001；所述工程菌dg001是按照包括如下步骤的得到制备获得的：
115.(d1)向酿酒酵母by-t3导入所述表达盒ppgk-drdhcr7-adh1t(seq id no.3)、所述表达盒pgal1-drdhcr24-cyc1t(seq id no.4)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up(seq id no.5)以及所述同源臂marker片段gal7-ura3-down(seq id no.6)后得到的重组菌为所述能够合成胆固醇的酵母菌；
116.(d2)向所述能够合成胆固醇的酵母菌导入所述表达盒ppgk-dgcyp029-adh1t、所述表达盒ptdh3-vvcpr-tpi1t和所述表达盒ptef-dgcyp033-cyc1t、所述同源臂marker片段
gal80-leu-up(seq id no.13)以及所述同源臂marker片段gal80-leu-down(seq id no.14)后得到的重组菌即为所述工程菌dg001。
117.第六方面，本发明要求保护前文所述的蛋白质或所述的成套蛋白质或所述的核酸分子或所述的成套核酸分子或所述的生物材料或所述的工程菌在制备薯蓣皂素中的应用。
118.第七方面，本发明要求保护一种制备薯蓣皂素的方法。
119.本发明所要求保护的制备薯蓣皂素的方法，可包括如下步骤：对前文第五方面中所述的工程菌进行发酵培养，收集发酵产物；所述发酵产物中即含有薯蓣皂素。
120.进一步地，所述培养的温度为30℃。
121.更进一步地，所述培养的条件为：1)以2％(百分号表示g/100ml)葡萄糖作为碳源的选择性培养基于30℃250rpm培养30h。2)转至以2％(百分号表示g/100ml)半乳糖为碳源的选择培养基于30℃250rpm培养90h。
122.实验证明，利用本发明所提供的盾叶薯蓣来源的薯蓣皂素合成相关基因，与细胞色素p450还原酶编码基因一起导入能够合成胆固醇的酿酒酵母菌，能够得到能够合成薯蓣皂素的酿酒酵母工程菌株。本发明实现了酿酒酵母薯蓣皂素的生物合成。
附图说明
123.图1为从胆固醇出发的薯蓣皂素合成途径。
124.图2为菌株dg-cho发酵产物gc-ms鉴定。
125.图3为菌株dg001发酵产物gc-ms鉴定。
具体实施方式
126.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
127.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
128.质粒pm2：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ppgk1启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子adht和asc1酶切位点。
129.质粒pm3：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ptef1启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子cyc1t和asc1酶切位点。
130.质粒pm4：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ptdh3启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子tpi1t和asc1酶切位点。
131.质粒pyes2.0：为addgene产品。
132.酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)by-t3：dai,z.et al.identification of a novel cytochrome p450enzyme that catalyzes the c-2αhydroxylation of pentacyclic triterpenoids and its application in yeast cell factories.metabolic engineering 51,70-78(2019).来源于本实验戴住波老师2019年文献。公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
133.实施例1、酿酒酵母胆固醇合成底盘菌株dg-cho的构建
134.1、构建酵母多基因整合片段
135.选取斑马鱼(danio rerio)来源的甾醇7位还原酶(drdhcr7)和24位还原酶(drdhcr24)对上述两个蛋白进行密码子优化，该优化与基因合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，获得的优化后的基因命名为drdhcr7-sy-sc，drdhcr24-sy-sc。drdhcr7-sy-sc基因的序列如seq id no.3的第813-2249位所示，编码seq id no.1所示的蛋白质；drdhcr24-sy-sc基因的序列如seq id no.4的第493-2043位所示，编码seq id no.2所示的蛋白质。用thermo公司sexa1和asc1酶切克隆载体质粒pm2，pyes2.0和基因片段drdhcr7-sy-sc，drdhcr24-sy-sc，酶切产物用上海生工生物工程有限公司的pcr产物胶回收试剂盒进行胶回收备用。将酶切载体pm2与上述所得drdhcr7-sy-sc基因片段各50ng加入连接体系：5μl 2
×
quick ligation buffer(neb公司)、0.5μl quick ligase(neb公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至10μl，室温反应10min得到连接产物，转入trans1-t1感受态细胞并冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl lb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后，pcr筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pm2上插入目的片段，得到质粒pm2-drdhcr7-sy-sc。用于上述相同的方法应用酶切备用的pyes2.0载体和drdhcr24-sy-sc基因片段构建质粒pyes-drdhcr24-sy-sc。
136.以构建好的质粒pm2-drdhcr7-sy-sc为模板使用引物1-m-peasy-pgk1-f和1-m-adht-gal1-r(见表2)进行pcr扩增，扩增体系为takarahs dna聚合酶5
×
buffer 10μl，dntp mix 4μl，引物(见表1)各1μl，质粒pm2-drdhcr7-sy-sc模板0.5μl，primerstar hs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。所得扩增产物命名为ppgk-drdhcr7-adh1t(seq id no.3)，该片段包含pgk启动子(seq id no.3的第63-812位)，斑马鱼来源的drdhcr7基因(seq id no.3的第813-2249位)以及adh1终止子(seq id no.3的第2250-2407位)将得到的pcr扩增产物，进行胶回收纯化备用。以构建好的质粒pyes-drdhcr24-sy-sc为模板使用引物2-m-adht-gal1-f和m-cyc1t-peasy-r(见表1)用上述相同方法进行pcr扩增，获得pgal1-drdhcr24-cyc1t片段(seq id no.4)，该片段包含gal1启动子(seq id no.4的第51-492位)，斑马鱼来源的drdhcr24基因(seq id no.4的第493-2043位)以及cyc1终止子(seq id no.4的第2044-2243位)。同样对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。
137.表1 drdhcr7-sy-sc和drdhcr24-sy-sc基因整合片段扩增引物
[0138][0139]
2、酿酒酵母菌株dg-cho的构建
[0140]
出发菌株酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)by-t3于接种液体筛选培养基(配方：0.8％sd-his(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖(各百分号均表示g/100ml)；各百分号均表示g/100ml)过夜培养。取1ml(od600约0.6-1.0)分装到1.5ml ep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(配方：10mm liac；10mm dtt；0.6m山梨醇；10mm tris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇缓冲液重悬两次)，到最终体积约为90μl。加入步骤1获得的片段ppgk-drdhcr7-adh1t，pgal1-drdhcr24-cyc1t以及同源臂marker片段gal7-ura3-up(seq id no.5；该同源臂片段包含gal7位点上游400bp同源区域，ura3marker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，gal7-ura3-down(seq id no.6；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及gal7位点下游300bp同源区域)(实现将drdhcr7-sy-sc和drdhcr24-sy-sc基因片段整合于酿酒酵母by-t3的gal7位点)各1.5μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：0.8％酵母筛选培养基sd-his-ura-trp-leu，2％葡萄糖，0.01％trp，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株dg-cho。
[0141]
实施例2、酿酒酵母菌株dg-cho发酵生产胆固醇
[0142]
在固体选择培养基(同实施例1步骤2)中活化酿酒酵母菌株dg-cho以及对照菌株by-t3，于相应液体选择培养基(同实施例1步骤2)中制备种子液(30℃，250rpm，12h)，以1％接种量将种子液分别接种于含有15ml相应的液体选择培养基的100ml三角瓶，30℃，250rpm培养30h后5000rpm离心收集菌体用15ml相应的2％(百分号表示g/100ml)半乳糖为碳源的液体选择培养基重悬于100ml三角瓶，30℃，250rpm继续振荡培养90h得到发酵液，对细胞生长(od
600
)及产物进行测定。
[0143]
取6ml的发酵液于破碎管中，13000rpm离心1min，弃上清；沉淀用无菌水清洗后，同样条件下离心，弃上清；加入适量玻璃珠(直径0.5mm)，1ml萃取液(甲醇：丙酮＝1:1)，震荡
破碎5min，超声破碎30min，13000rpm离心2min，取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行gc-ms检测。gc-ms检测方法：气相质谱串联-质谱(gc-ms)安捷伦科技5975c与三轴插入xl msd探测器，配备色谱柱：hp-5ms(30m*0.25mm*0.5μm)。gc-ms测定条件：进样口温度300℃，进样体积1μl，不分流，溶剂延时5min；色谱条件：240℃维持5min，10℃/min加热至300℃，300℃保持25min，总共36min。ms条件：sim：69,139,282和414。
[0144]
检测结果：经检测将斑马鱼来源的drdhcr7和drdhcr24整合进酿酒酵母by-t3后，获得的菌株dg-cho的发酵产物通过gc-ms检测定性分析有胆固醇生成(图2)。所以成功构建可以体内合成胆固醇的酿酒酵母底盘菌株dg-cho。
[0145]
实施例3、薯蓣皂素从头合成工程菌株的构建
[0146]
1、构建酵母多基因整合片段
[0147]
选取盾叶薯蓣(d.zingiberensis)来源的胆固醇16位和22位双氧化酶(dgcyp033)和26位氧化酶(dgcyp029)以及葡萄来源的细胞色素p450还原酶(vvcpr)对上述3个蛋白进行密码子优化，该优化与基因合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，获得的优化后的基因命名为dgcyp029-sy-sc，dgcyp033-sy-sc和vvcpr-sy-sc。两端分别带有酶切位点sexa1和asc1识别序列的dgcyp029-sy-sc基因的序列如seq id no.8所示，seq id no.8的第11-1501位编码seq id no.7所示的蛋白质；两端分别带有酶切位点sexa1和asc1识别序列的dgcyp033-sy-sc基因的序列如seq id no.10所示，seq id no.10的第11-1477位编码seq id no.9所示的蛋白质，两端分别带有酶切位点sexa1和asc1识别序列的vvcpr-sy-sc基因的序列如seq id no.12所示，seq id no.12的第11-2125位编码seq id no.11所示的蛋白质。用thermo公司sexa1和asc1酶切克隆载体质粒pm2，pm3，pm4和两端分别带有酶切位点sexa1和asc1识别序列的基因片段dgcyp029-sy-sc，dgcyp033-sy-sc，vvcpr-sy-sc，酶切产物用上海生工生物工程有限公司的pcr产物胶回收试剂盒进行胶回收备用。将酶切载体pm2与上述所得dgcyp029-sy-sc基因片段，酶切载体pm3与基因片段dgcyp033-sy-sc，酶切载体pm4与基因片段vvcpr-sy-sc进行连接(方法同实施例1步骤1)，最终获得构建好的质粒pm2-dgcyp029-sy-sc(将seq id no.8的第11-1501位所示dna片段替换pm2质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒)，pm3-dgcyp033-sy-sc(将seq id no.10的第11-1477位所示dna片段替换pm3质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒)，pm4-vvcpr-sy-sc(将seq id no.12的第11-2125位所示dna片段替换pm4质粒的酶切位点sexa1和asc1之间的小片段后得到的重组质粒)。
[0148]
以构建好的质粒pm2-dgcyp029-sy-sc为模板使用引物1-m-peasy-pgk1-f和3g-1-m-adht-tdh3-r，以质粒pm4-vvcpr-sy-sc为模板使用引物3g-3-m-adht-tdh3-f和3g-3-m-tpi1t-tef1-r，以质粒pm3-dgcyp033-sy-sc为模板使用引物3g-2-m-tpi1t-tef1-f和m-cyc1t-peasy-r进行pcr扩增，扩增获得的片段分别为ppgk-dgcyp029-adh1t，ptdh3-vvcpr-tpi1t和ptef-dgcyp033-cyc1t，扩增好的片段进行胶回收纯化备用(上述使用的引物见表1、2)。
[0149]
表2 vccyp94n-sy-sc，dgcyp033-sy-sc和vvcpr-sy-sc基因整合片段扩增引物
[0150][0151]
2、酿酒酵母菌株dg-001的构建
[0152]
出发菌株酿酒酵母dg-cho接种于液体筛选培养基(配方：0.8％sd-his-ura(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖；各百分号均表示g/100ml)过夜培养。取1ml(od600约0.6-1.0)分装到1.5ml ep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mm liac；10mm dtt；0.6m山梨醇；10mm tris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。加入步骤1获得的片段ppgk-dgcyp029-adh1t，ptdh3-vvcpr-tpi1t和ptef-dgcyp033-cyc1t以及同源臂marker片段gal80-leu-up(seq id no.13；该同源臂片段包含gal80位点上游400bp同源区域，leu2marker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，gal80-leu-down(seq id no.14；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及gal80位点下游300bp同源区域)(实现将vccyp94n-sy-sc,vvcpr-sy-sc和dgcyp033-sy-sc基因片段整合于酿酒酵母dg-cho的gal80位点)各1.5μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：0.8％酵母筛选培养基sd-his-ura-trp-leu，2％葡萄糖，0.01％trp，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株dg001。
[0153]
实施例4、酿酒酵母菌株dg001发酵生产薯蓣皂素
[0154]
在固体选择培养基(同实施例1步骤2)中活化酿酒酵母菌株dg001以及对照菌株dg-cho，于相应液体选择培养基(同实施例1步骤2)中制备种子液(30℃，250rpm，12h)，以1％接种量将种子液分别接种于含有15ml相应的液体选择培养基的100ml三角瓶，30℃，250rpm培养30h后5000rpm离心收集菌体用15ml相应的2％(百分号表示g/100ml)半乳糖为碳源的液体选择培养基重悬于100ml三角瓶，30℃，250rpm继续振荡培养90h得到发酵液，对细胞生长(od
600
)及产物进行测定(产物提取及测定方法同实施例2)。
[0155]
检测结果：经检测将dgcyp029-sy-sc、vvcpr-sy-sc和dgcyp033-sy-sc基因片段整合于酿酒酵母dg-cho，获得的菌株dg-001的发酵产物通过gc-ms检测定性分析有薯蓣皂素
的生成(图3)。所以成功构建可以体内从头合成薯蓣皂素的酿酒酵母底盘菌株dg001，其薯蓣皂素产量为3.2mg/l。