一种禽流感通用表位疫苗的制作方法

1.本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种禽流感通用表位疫苗。


背景技术：

2.类病毒颗粒(virus-like particle,vlp)是由病毒衣壳蛋白等生物大分子自由组装而成，结构高度有序重复，能够有效地与b细胞受体发生交联反应。近年国内外相关研究内容发展迅速，且vlp结构的多样性和功能的丰富性使我们可以预期到未来关于vlp的研究将成为行业内的热点之一。ms2vlp作为一种非病毒的载体系统可以展示外源的抗原多肽。
3.禽流感是由禽流感病毒引起的禽类烈性传染病，被世界卫生组织定为a类传染病，给全世界养禽业带来了巨大的压力和经济损失。禽流感病毒是一种rna病毒，主要包括内部核衣壳和外部的病毒囊膜两部分。核衣壳是病毒的核心，主要储存病毒的遗传信息，是由病毒基因组和病毒rna聚合酶亚单位pb1、pb2、pa以及np形成的具有特定空间构象的复合物。囊膜由内向外，可分为内膜蛋白、类脂和糖蛋白三层，内膜蛋白包括m1和m2，类脂层是脂质双层结构，糖蛋白ha和na镶嵌在类脂中向外突出形成刺突。
4.禽流感病毒表面糖蛋白具有类型多，变异快的特点，针对ha和na的抗体在不同血清型间的交叉保护效果差。为了更加方便的控制疫情的爆发和传播，制备一种具有通用保护效果的疫苗显得尤为重要。现有的禽流感通用疫苗，经小鼠免疫实验结果表明，通用保护效果差，免疫应答效果不理想。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种多肽及禽流感通用表位疫苗，该疫苗具有提高的通用保护效果和免疫应答效果。
6.第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列包括选自以下群组的氨基酸序列：(1)由seq id no.1所示的氨基酸序列；(2)由seq id no.2所示的氨基酸序列；(3)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.2所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(4)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(5)由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(6)由seq id no.1所示的氨基酸序列、由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；以及(7)由seq id no.4所示的氨基酸序列，其中，在seq id no.1所示的氨基酸序列中第6位氨基酸w可任选地替换为氨基酸y或者f，第15为氨基酸e可任选地替换为氨基酸d，第18位氨基酸r可任选地替换为氨基酸h或者k，和/或第22位氨基酸f可任选地替换为氨基酸w或者y；和/或在seq id no.2所示的氨基酸序列中第7位氨基酸y可任选地替换为氨基酸w或者f。
7.众所周知，性质相似氨基酸彼此之间保守性替换通常不会影响肽序列的活性。在一个实施例中，seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4的氨基酸序列中的
某些氨基酸可以被保守性替换，而且可以预期保守性替换前后的氨基酸序列所编码多肽的活性基本相同。例如，对于seq id no.1的第6位和22位以及seq id no.2的第7位氨基酸而言，w、y和f都属于芳香族氨基酸，可以用来进行保守性替换。对于seq id no.1的第15位氨基酸而言，e和d都属于酸性氨基酸，可以用来进行保守性替换。对于seq id no.1的第18位氨基酸而言，r、h和k都属于碱性氨基酸，可用来进行保守性替换。
8.在一个实施例中,该多肽的氨基酸序列任选地与额外的通用表位的氨基酸序列通过柔性短肽连接。
9.第二方面，本发明提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列由选自以下群组的氨基酸序列组成：(1)由seq id no.1所示的氨基酸序列；(2)由seq id no.2所示的氨基酸序列；(3)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.2所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(4)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(5)由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(6)由seq id no.1所示的氨基酸序列、由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；以及(7)由seq id no.4所示的氨基酸序列，其中，在seq id no.1所示的氨基酸序列中第6位氨基酸w可任选地替换为氨基酸y或者f，第15为氨基酸e可任选地替换为氨基酸d，第18位氨基酸r可任选地替换为氨基酸h或者k，和/或第22位氨基酸f可任选地替换为氨基酸w或者y；和/或在seq id no.2所示的氨基酸序列中第7位氨基酸y可任选地替换为氨基酸w或者f。
10.在一个实施例中，柔性短肽由3-10个氨基酸组成。在另一个实施例中，所述柔性短肽由4个氨基酸组成。在另一个实施例中，连接由seq id no.1所示的氨基酸序列、由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列之间的柔性短肽可以相同或者不同。在另一个实施例中，连接由seq id no.1所示的氨基酸序列、由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列之间的柔性短肽可以相同或不同地选自氨基酸序列ggggs、gggs、ggg和ggsgg。在另一个实施例中，柔性短肽由氨基酸gggs组成。
11.第三方面，本发明提供了上述多肽在制备禽流感通用表位疫苗中的用途。
12.第四方面，本发明提供了一种编码上述多肽的核酸分子。
13.在一个实施例中，该核酸分子编码上述多肽。在另一个实施例中，该核酸分子由seq id no.5所示的核苷酸序列组成。在另一个实施例中，该核酸分子的核苷酸序列是基于上述多肽氨基酸序列经过密码子优化合成。
14.第五方面，本发明提供了一种包括上述多肽的重组病毒样颗粒。
15.在一个实施例中，该重组病毒样颗粒是利用表达上述核苷酸序列的大肠杆菌菌种经过培养、分离纯化获得。在另一个实施例中，该表达有上述核苷酸序列的大肠杆菌菌种是将经过密码子优化合成的核苷酸序列与表达载体连接，连接产物再转化大肠杆菌dh5α感受态细胞得到重组质粒，然后再将重组质粒转化大肠杆菌bl21感受态细胞中经培养获得。
16.第六方面，本发明提供了一种包括该重组病毒样颗粒的禽流感通用表位疫苗。
17.在一个实施例中，该禽流感通用表位疫苗还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
18.第七方面，本发明提供了一种制备该重组病毒样颗粒的方法。该方法包括(a)以编码上述的多肽的核苷酸序列为模板，进行基因片段的扩增；(b)将扩增的基因片段与表达载
体连接并转化入克隆菌株的宿主细胞，得到重组质粒；(c)将所述重组质粒转化入表达菌株的宿主细胞进行表达，得到重组蛋白；以及(d)将所述重组蛋白进行分离纯化，得到所述重组病毒样颗粒。
19.在一个实施例中，表达载体是ms2衣壳蛋白串联表达载体pdms2。在另一个实施例中，克隆菌株是大肠杆菌dh5α，表达菌株是大肠杆菌bl21。在一个实施例中，用于扩增所述基因片段的上游引物由seq id no.6组成，下游引物由seq id no.7组成。
20.在一个实施例中，上述制备重组病毒样颗粒的方法的步骤(d)中，包括如下步骤：
21.(1)将大肠杆菌菌种发酵液经过离心处理后，弃上清液，菌体沉淀物再进行重新悬浮，然后破碎菌体，再经分离得到上清液，
22.(2)对步骤(1)得到的上清液利用10％-30％饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，弃上清液，得到目的蛋白沉淀物，
23.(3)将上述目的蛋白沉淀物在0-200mm nacl溶液中重新溶解，再经过离心处理，再次得到上清液；
24.(4)将步骤(3)得到的上清液利用阴离子交换色谱层析法，经过洗脱纯化得到所需的重组病毒样颗粒。
25.本发明将该多肽氨基酸序列展示在ms2vlp表面，具有表达量高、易于纯化、免疫原性高等优点，利用该多肽制备的禽流感通用表位疫苗可以提高通用保护效果和免疫应答效果。
附图说明
26.图1为根据本发明的一个实施例，m2e的氨基酸序列、np抗原1氨基酸序列、和np抗原2氨基酸序列与表达载体pdms2连接所构建的载体图谱。
27.图2为根据本发明的一个实施例的多肽的氨基酸的展示序列。
28.图3为根据本发明的一个实施例，seq id no.5核苷酸序列与表达载体pdms2连接所编码产生的重组蛋白纯化后的sds-page检测结果。
29.图4为根据本发明的一个实施例，免疫实验中elisa方法检测加强免疫2周后血清中的抗体滴度结果。
30.图5为根据本发明的一个实施例，免疫实验中elispot方法分析加强免疫2周后脾脏γ-干扰素分泌细胞数结果。
31.发明详述
32.本发明的一些实施例提供了一种用于制备禽流感通用表位疫苗的多肽。在一个实施例中，该多肽包括由seq id no.1所示的氨基酸序列，或由seq id no.2所示的氨基酸序列。
33.本发明第一次发现由seq id no.1所示的氨基酸序列(命名为np抗原1氨基酸序列)和由seq id no.2所示的氨基酸序列(命名为np抗原2氨基酸序列)在禽流感病毒的不同亚基中具有高度保守性，而且由seq id no.1编码的多肽和由seq id no.2编码的多肽分别具有免疫抗原性，所以np抗原1多肽和np抗原2多肽可以作为针对禽流感病毒的通用表位多肽。
34.m2e多肽是禽流感病毒m2蛋白的膜外部分，在不同亚型之间具有高度保守性并具
有免疫抗原性，也是制备通用疫苗的良好靶点。在一个实施例中，m2e多肽的氨基酸序列由seq id no.3所示。
35.由一个通用表位多肽或将多个通用表位多肽串联组成的多肽，可以作为制备通用疫苗的良好靶点。在一个实施例中，用于制备禽流感病毒通用表位的多肽的氨基酸序列包括或由下述氨基酸序列组成：(1)由seq id no.1所示的氨基酸序列；(2)由seq id no.2所示的氨基酸序列；(3)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.2所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(4)由seq id no.1所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(5)由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；(6)由seq id no.1所示的氨基酸序列、由seq id no.2所示的氨基酸序列和由seq id no.3所示的氨基酸序列通过柔性短肽组合而成的氨基酸序列；或(7)由seq id no.4所示的氨基酸序列。
36.在一个实施例中，上述用于制备禽流感病毒通用表位的多肽的氨基酸序列还可进一步与额外的通用表位多肽的氨基酸通过柔性短肽连接。额外的通用表位多肽的氨基酸序列不是由seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列。
37.由柔性短肽编码的柔性蛋白可促进由其连接的表达蛋白进行正确折叠，以减少由于空间构象相互影响而可能产生的对表达蛋白抗原性的影响。在一个实施例中，柔性短肽由3-10个氨基酸、4-8个氨基酸、4-6个氨基酸或优选为4个氨基酸组成。在一个实施例中，连接seq id no.1、seq id no.2和/或seq id no.3所示的氨基酸序列的柔性短肽可相同或者不同。在另一个实施例中，连接seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示的氨基酸序列和/或额外的通用表位多肽的氨基酸序列的柔性短肽可相同或不同。
38.在一个实施例中，当seq id no.1、seq id no.2与seq id no.3所示氨基酸通过柔性短肽连接时，3个氨基酸序列可以以任何组合顺序进行，例如seq id no.1—柔性短肽—seq id no.2—柔性短肽—seq id no.3或seq id no.2—柔性短肽—seq id no.1—柔性短肽—seq id no.3或seq id no.2—柔性短肽—seq id no.3—柔性短肽—seq id no.1等。
39.在本发明的实施例中，np抗原1氨基酸序列中第6位氨基酸w可以替换为氨基酸y或者f，第15为氨基酸e可以替换为氨基酸d，第18位氨基酸r可以替换为氨基酸h或者k，和/或第22位氨基酸f可以替换为氨基酸w或者y，以上为达到同等或者相似的免疫反应效果而进行的氨基酸的替换在本发明的范围内。
40.在本发明的实施例中，np抗原2氨基酸序列中第7位氨基酸y可以替换为氨基酸w或者f，以上为达到同等或者相似的免疫反应效果而进行的氨基酸的替换在本发明的范围内。
具体实施方式
41.下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
42.实施例1
43.本实施例提供的用于制备禽流感通用表位疫苗的多肽，其氨基酸序列(重组蛋白氨基酸序列)是通过m2e蛋白氨基酸序列、np抗原1氨基酸序列和np抗原2氨基酸序列通过序
列为gggs的柔性短肽串联组合而成。
44.本实施例还提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列是基于上述多肽氨基酸序列经过密码子优化合成。
45.本实施例中的序列表说明：
46.seq id no.1为np抗原1氨基酸序列；
47.seq id no.2为np抗原2氨基酸序列；
48.seq id no.3为m2e蛋白氨基酸序列；
49.seq id no.4为用于制备禽流感通用表位疫苗的多肽氨基酸序列；
50.seq id no.5为密码子优化合成的核苷酸序列；
51.seq id no.6为用于扩增seq id no.5核苷酸序列的上游引物(从5
’-3’
)；
52.seq id no.7为用于扩增seq id no.5核苷酸序列的下游引物(从5
’-3’
)；
53.本实施例提供了一种重组病毒样颗粒，其是利用表达有上述核苷酸序列的大肠杆菌菌种经过培养、分离纯化获得。具体的，该表达有所述核苷酸序列的大肠杆菌菌种是将经过密码子优化合成的核苷酸序列与ms2衣壳蛋白串联表达载体pdms2连接，连接产物再转化大肠杆菌dh5α感受态细胞得到重组质粒，然后再将重组质粒转化大肠杆菌bl21感受态细胞中经培养获得。
54.上述重组病毒样颗粒的制备方法，具体包括如下步骤：
55.步骤一，重组质粒的构建：
56.经过大肠杆菌密码子优化的编码重组蛋白基因全长序列seq id no.5(所述核苷酸序列)由体外合成，并以该核苷酸序列为模板，进行pcr扩增；
57.具体的，用于pcr扩增基因片段的上游引物的序列为seq id no.6，下游引物的序列为seq id no.7。
58.扩增片段的上下游分别引入酶切位点bamh i和sal i，pcr条件如下：
[0059][0060]
将通过pcr扩增得到的基因片段，经bamh i和sal i酶切消化处理后，连接到用同样酶切处理的pdms2表达载体上，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有硫酸卡那霉素的平板，37℃下培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有硫酸卡那霉素的3ml液体培养基中，37℃下培养，然后提取质粒，得到重组质粒。
[0061]
本实施例的载体图谱如图1所示，其中展示序列(display sequence)为图2所示。m2e的氨基酸序列通过柔性短肽gggs与np抗原1氨基酸序列连接。np抗原1氨基酸序列通过柔性短肽gggs与np抗原2氨基酸序列连接。bamh i和sal i酶切位点处于图2所示。
[0062]
步骤二，带有重组质粒的大肠杆菌菌种的构建：
[0063]
将步骤一获得的重组质粒转化大肠杆菌bl21感受态细胞，涂布于含有硫酸卡那霉素的平板，37℃下培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有硫酸卡那霉素的
3ml液体培养基中，37℃下培养，从中取1ml菌液加入终浓度为17％的甘油，-80℃冷冻保存，作为后续试验中需要的带有重组质粒的大肠杆菌菌种。
[0064]
步骤三，重组蛋白的大量表达：
[0065]
在-80℃下取出带有重组质粒的大肠杆菌菌种，接种到含有硫酸卡那霉素的100ml液体lb培养基中，37℃下培养至菌体达到对数期，按照1％的比例接种到含有1l液体lb培养基的三角瓶中，37℃下培养，等od600值到0.6时，加入0.4mm的iptg，20℃诱导表达12小时，获得大量表达有重组蛋白的大肠杆菌菌种发酵液。
[0066]
步骤四，重组蛋白(目的蛋白)的纯化：将步骤三的大肠杆菌菌种发酵液进行分离纯化得到所需的重组病毒样颗粒；
[0067]
具体的，该分离纯化过程包括如下步骤：
[0068]
(1)将大肠杆菌菌种发酵液在5000rpm条件下离心10min，弃上清液，按照1g菌体对应10ml缓冲液i(20mm tris(ph7.4)，100mm nacl)的比例重悬菌体，然后采用均质机以700bar压力破碎菌体4次，然后在24000rpm的条件下离心1小时，留取上清液，通过15％sds-page电泳检测目的蛋白的表达量；
[0069]
(2)对步骤(1)得到的上清液利用20％饱和度的硫酸铵溶液进行初步沉淀，在20000rpm的条件下离心30min，弃上清液，得到目的蛋白沉淀物；
[0070]
(3)将上述目的蛋白沉淀物在100mm nacl溶液中重新溶解，再在24000rpm的条件下离心1小时，再次得到上清液，以达到初步分离和富集目的蛋白的作用；
[0071]
(4)将步骤(3)得到的上清液运用阴离子交换色谱层析法，经过洗脱纯化得到所需的重组病毒样颗粒(目的蛋白)。其中，层析填料为：qff，上样后，利用缓冲液a和b进行梯度洗脱，缓冲液a为：20mm的tris(ph7.4)；缓冲液b为：20mm的tris(ph7.4)，1m nacl，洗脱完成后，收集目的蛋白，并利用sds-page检测洗脱的蛋白样品，其结果如图3所示，sds-page电泳结果未见明显杂蛋白条带，并且目的蛋白分子量大约为33kda。
[0072]
本发明提供的一种禽流感通用表位疫苗，包含上述技术方案中所述的重组病毒样颗粒，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0073]
在本实施例中，该禽流感通用表位疫苗的制备过程为：将上述重组病毒样颗粒与铝佐剂按照3:7的比例充分混合，乳化，制备疫苗样品。
[0074]
免疫实验
[0075]
将上述疫苗样品按照10g的剂量免疫小鼠，作为实验组，对照组为非免对照；其中，实验组中，初次免疫和加强免疫间隔2周。免疫结束2周后取血清样品，并收集脾脏细胞用于检测细胞免疫。采用elisa方法检测血液抗体滴度，结果如图4所示，采用elispot方法分析γ-干扰素分泌细胞，结果如图5所示。
[0076]
图4表明elisa方法检测加强免疫2周后血清中的抗体滴度结果为1.6
×
105，而对照组的抗体滴度为1.1
×
101。图5表明elispot方法分析加强免疫2周后脾脏γ-干扰素分泌细胞数结果：每105个脾细胞中γ-干扰素分泌细胞数为108个；而对照组为15个。
[0077]
因此，从图4和图5可知，实验组的血液抗体水平和脾脏γ-干扰素分泌细胞数均分别远高于对照组，说明实验组具有较理想的免疫应答效果。
[0078]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技
术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。