本发明属于免疫检测
技术领域：
：，具体涉及一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的rt-pcr试剂盒及其预测方法。
背景技术：
：：免疫系统的一个重要功能是分辨自体正常细胞和外来/异常的细胞，从而在保留正常细胞的同时攻击外来/异常细胞。为了避免误伤，人体的t细胞在被激活的同时会表达某些有“免疫检测点”功能的蛋白，例如pd1、ctla4。如果某个细胞的表面有与之匹配的蛋白，则能够解除t细胞对该细胞的攻击性，例如pd-l1/pd-l2结合pd-1、cd80/cd86结合ctla-4。某些癌细胞可以表达这样的匹配信号蛋白，从而避免被免疫系统攻击。免疫检测点调节类药物，通过阻断检测到的癌细胞表面和其配型蛋白的结合，从而解除癌细胞的免疫逃逸。目前已有多种免疫检测点调节类药物上市，如靶向pd-1的派姆单抗pembrolizμmab(keytruda)、纳武单抗nivolμmab，靶向pd-l1的阿特朱单抗atezolizμmab(tecentriq)、avelμmab(bavencio)、durvalμmab(imfinzi)，以及靶向ctla-4的药物伊匹单抗ipilimμmab(yervoy)。为了预测免疫检测点调节类药物对肿瘤的疗效，目前已有的方法有(以pd-1为例)：1、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测癌细胞表面pd-l1的表达量。这种方法的缺陷是：1)取得肿瘤组织必须进行穿刺或者做微创手术，部分病人不愿意配合，也会增大肿瘤扩散风险；2)无法预测患者免疫系统对药物的反应，因此即使癌细胞表达pd-l1，免疫检测点调节类药物也只对约20％患者有效，预测准确度不高。2、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测dna错配修复缺陷(dmmr)，或用基因检测法检测微卫星不稳定性(msi)或肿瘤突变负荷(tmb)。这种方法的缺陷是：1)必须进行穿刺或者做微创手术；2)无法预测患者免疫系统对肿瘤突变是否产生反应，因此即使dmmr、msi或tmb检测值较高，免疫检测点调节类药物也只对少数患者有效，预测准确度不高。3、取得肿瘤组织切片，使用免疫组化方法检测肿瘤组织中浸润的淋巴细胞的数量和类型。这种方法的缺陷是：1)必须进行穿刺或者做微创手术；2)无法预测患者免疫系统对肿瘤的反应程度，因此即使检出较高数量肿瘤浸润淋巴细胞且检出pd-1表达，免疫检测点调节类药物也只对少数患者有效，预测准确度不高。4、采集患者血液进行基因检测，检测循环肿瘤dna(ctdan)和循环肿瘤细胞(ctc)。这种方法的缺陷是：无法预测患者免疫系统对肿瘤的反应程度，ctdna和ctc更多只是反映了当时肿瘤的进展，对免疫检测点调节类药物疗效的预测准确度不高。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的rt-pcr试剂盒及其预测方法，可有效解决现有方法无法预测免疫检测点调节类药物对肿瘤的疗效的问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的rt-pcr试剂盒，该试剂盒包括用于进行rt-pcr扩增的引物及其辅助成分；所述引物包括首轮rt-pcr扩增引物，以及对首轮扩增产物tcr区域进行第二轮pcr扩增的特异性引物；首轮rt-pcr扩增引物如seqidno.1～40所示；第二轮pcr扩增特异性引物如seqidno.41～50所示。进一步地，辅助成分包括rt-pcr缓冲液、mgcl2、dntp、ddh2o、酶。采用上述试剂盒对免疫检测点调节类药物疗效进行检测的方法，包括以下步骤：(1)提取用药后的待测样品rna；(2)以待测样品rna模板进行反转录，然后对反转录制得的cdna进行首轮rt-pcr扩增，收集纯化扩增产物；(3)再次对步骤(2)所得扩增产物进行第二轮pcr扩增，以扩增tcr可变区，获得可变区序列；(4)基于步骤(3)所得可变区序列计算其d50值。进一步地，步骤(4)中d50值的计算方法如下：测序得到tcr可变区序列信息，比对确定可变区序列的总数记为n，与可变区基因的不同序列的类型数为c，每一种序列的拷贝数为n1、n2……nc，并按拷贝数从多到少以n1、n2……nc进行排序，拷贝数最多且占据功能性可变区序列总数50％的克隆类型数记为h，h与c的比值即为d50。进一步地，当d50<0.01时，表明患者免疫力低下，使用免疫检测点调节类药物难以获得显著疗效；当0.01≤d50≤0.015，表明患者免疫力较差，使用免疫检测点调节类药物可能取得一定效果；当0.015<d50，表明患者免疫力相对较好，使用免疫检测点调节类药物有较大可能取得显著效果。其中，免疫检测点调节类药物疗效的定义为：完全缓解(completerelease,cr)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。部分缓解(completerelease,cr)：靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周。疾病稳定(stabledisease,sd)：靶病灶最大径之和缩小未达pr，或增大未达pd。疾病进展(progressivedisease,pd)：靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。进一步地，使用tcr可变区互补决定区3(cdr3)确定tcr可变区序列唯一性。本发明的有益效果为：本发明基于高通量测序技术和目标区域特异性扩增技术，从受试者外周血分离淋巴细胞，提取rna，逆转录获得cdna，利用特异性引物扩增tcr可变区域，获得其序列信息，评估其多样性。实现了使用很少量外周血样本，在基因分子水平，对免疫检测点调节类药物疗效的预测评估。说明书附图图1为rna提取质量检验；图2为tcr可变区扩增质量检验；图3为pd1抑制剂疗效与受试者d50分布关系；图4为根据受试者d50预测pd1抑制剂疗效。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
：的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
技术领域：
：的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例1免疫图谱分析及免疫检测点调节类药物疗效预测方法的建立一、淋巴细胞分离和mrna的提取1、淋巴细胞分离取6个受试者静脉血10ml，置于紫盖edta抗凝管中，用人淋巴细胞分离液(天津灏阳，货号lts1077)分离淋巴细胞，具体操作步骤如下：(1)将采集的新鲜血液10ml加入50ml离心管中，加入生理盐水定容到25ml，轻轻吹打混匀。(2)在新的50ml离心管中，加入25ml的淋巴细胞分离液(等量)，然后用移液管吸取血样轻轻的沿壁加于分离液液面之上，500g，20℃，离心30min，升速为2，降速为1(thermol公司低速离心机)。(3)离心后，用10ml移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到新的50ml离心管中，加入生理盐水定容到50ml，轻轻上下颠倒混匀，300g，20℃离心8min，弃上清。(4)再次清洗细胞，先将管底细胞弹散，之后再加入生理盐水定容到20ml，轻轻上下颠倒混匀，400g，20℃离心5min，弃上清。(5)向50ml离心管中加入2mlpbs轻轻吹打均匀混悬细胞，获得分离的淋巴细胞。(6)细胞计数：取100μl混悬液，加900μlpbs稀释10倍，混匀后进行细胞计数(可根据细胞量自行调整稀释倍数)，细胞计数公式为：细胞数密度＝4大格细胞总数×稀释倍数×104/4＝细胞数/ml。2、淋巴细胞基因组mrna的提取及检测按照trizol试剂(ambion，货号15596026)说明书操作，一般取5×106～1×107个细胞，细胞量一定要严格计数，细胞不宜过多，会导致rna酶抑制不彻底，导致rna降解。具体操作步骤如下：(1)取分离的5×106个淋巴细胞的混悬液，400g，4℃，离心5min，弃上清。(2)轻弹离心管底部，松散细胞沉淀物。向淋巴细胞中加入1mltrizol试剂，用枪吹打混匀，看不到沉淀，室温静止5min，使细胞充分裂解。(3)加入200μl氯仿，手动剧烈摇晃15s后，室温静置5min。(4)4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，转移至另一离心管，约450μl。(5)加入500μl异丙醇混匀，室温静置10min。(6)4℃，12000g离心10min，弃上清，rna沉于管底。(7)加入1ml75％乙醇(depc水配制)，温和震荡离心管，使rna沉淀整片悬浮。(8)4℃，7500g离心5min，弃上清，室温放置5-8min，挥发酒精，不能过于干燥。(9)用30μldepc/无酶水溶解rna沉淀，少量分装后，做好标记，-80℃冰箱保存。(10)取2μlrna，用微量紫外分光光度计检测浓度和od值，取2μlrna电泳检测条带，使用2％的凝胶，dl2000marker，同时立刻进行反转录实验。检测结果为rna总量＞5μg，体积＞20μl，od260/280比值1.8以上，同时2％琼脂糖电泳检测，出现三条带，为28srna、18srna、5srna，其中28s为18s条带亮度的1～2倍，5s条带最浅(见图1)。实施例2逆转录及pcr扩增1、rt-pcr(逆转录及第一轮pcr)使用qiagenonesteprt-pcr试剂盒(货号210212)对提取的rna立刻进行反转录，之后在同一体系内连续进行第一轮扩增。逆转录及pcr反应体系见表1，反应程序见表2。表1反应体系表2反应程序其中，trtmix为逆转录引物，也作为pcr反应3’端引物，名称和序列如表3所示，各引物等摩尔比浓度混合，再稀释至总浓度为20μm，或者各引物先配成20μm溶液，然后再按等体积混合。表3逆转录引物vβmix引物为5’端多重pcr引物，引物名称和序列如表4所示，各引物等摩尔比浓度混合，再稀释至总浓度为20μm，或者各引物先配成20μm溶液，然后再按等体积混合。表4pcr引物2、第二轮pcr使用同科公司taq酶(货号tk01015)对tcr区域进行特异性扩增，反应体系和条件如表5和表6所示。表5pcr反应体系表6pcr反应程序其中，vβmix引物为5’端多重引物，与rt-pcr反应的vβmix相同，浓度也为20μm。3’端htcrcbbcx引物(20μm)选自表7中的一种引物，表7中的引物含有不同的barcocde序列，一个样品选用一种htcrcbbcx引物，一个样对应唯一一个barcode(大写字母)，在本实施例中6个样本的3’端引物分别为seqidno:41-seqidno:46。表7特异性序列htcrcbbcx序列5’-3’编号htcrcbbc1gagttactcgcgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:41htcrcbbc2gagtcgttagcgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:42htcrcbbc3gagtaccgagcgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:43htcrcbbc4gagtgttctccgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:44htcrcbbc5gagttcgcaccgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:45htcrcbbc6gagttgcgtacgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:46htcrcbbc7gagtctacgacgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:47htcrcbbc8gagtgacagacgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:48htcrcbbc9gagtagaacacgcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:49htcrcbbc10gagtcatcctagcacagcgacctcgggtgggaacseqidno:503、电泳检测电泳检测步骤2扩增效果，目的条带在350bp左右，见图2。4、磁珠纯化一个样本做1～2管第二轮pcr后即可纯化。在pcr产物中加入1.4倍体积dna片段分选纯化磁珠(百迈格生物货号bmsx)，使用30μl水洗脱。使用微量分光光度计检测纯化后产物浓度。5、等浓度混合6个不同barcode样本(最多10个，对应10种htcrcbbcx引物)，建库测序及后续分析。实施例3建库、测序及数据分析获得免疫图谱1、建库及高通量测序(1)建库严格按照操作手册操作，加上测序接头及定量工作。根据试剂盒说明书进行建库，包括ionplusfragmentlibrarykit(货号4471252)、ionxpressbarcodeadaptors1-16kit(货号4471250)、agencourtampurexp(货号a63881)，仪器包括pcr仪、qubit定量仪及核酸定量试剂。(2)模板制备及上机测序ionchef-自动化模板制备仪，安装好试剂及耗材即可自动进行实验，完成文库加上isp磁珠、富集、loading芯片工作。ions5-测序仪，完成测序工作及初步数据处理。使用试剂包括ion520/530ext-chef-4rxns&4initnew-for600bp(货号a30670)、ion530chipkit(货号a27764)。2、数据分析获得免疫图谱高通量测序完成后，使用fq文件进行数据分析，序列进行igblast，从中抓取出需用于d50计算的功能性的不同种类的cdr3氨基酸序列，同时统计对应的数量，数量按从高到低排序，保存文件名为受试者编号_productive_cdr3_count.csv。具体如下：(1)使用网上免费平台分析，链接https://usegalaxy.org/。原数据fq文件进行reverse反向处理。(2)合并正反向数据后分barcode，得到单个样本fq文件。(3)单个样本fq文件进行fastqc质检，下载结果。(4)对单个样本fq文件再次进行reverse反向处理。(5)反向处理的fq文件进行格式转换，得到fasta文件。(6)单个样本fasta文件进行vdj数据比对(推荐使用免费平台igblast比对，链接https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，得到比对文件。(7)比对文件抓取功能性序列的比对数据，单独保存，文件名productive。(8)再从功能性序列的比对数据中进一步抓取不同种类的cdr3氨基酸序列，同时统计对应的数量，数量按从高到低排序，单独保存，文件名为productive_cdr3_count。productive_cdr3_count文件进行d50计算，具体计算方式如下：测序所得的tcr可变区序列信息，其中所有功能性基因可变区cdr3序列的总数记为n，不同序列(克隆)的cdr3类型数记为c，每一种克隆的拷贝数被记为n1、n2……nc并按拷贝数从多到少排序(n1≥n2≥……nc-1≥nc)，拷贝数最多且占据功能性cdr3序列总数50％的克隆类型数记为h，h与c的比值被定义为d50。实施例4评估受试者免疫力水平6个受试者的数据分析及d50计算结果如下：对tcr测序数据进行处理，其中，qc结果见表8，d50相关数据统计见表9。表8受试者qc检测结果表9d50检测数据3、根据d50数据，对受试者使用免疫检测点调节类药物的疗效的进行预测：(1)若d50<0.01，表明受试者免疫力低下，使用免疫检测点调节类药物难以获得显著疗效；(2)若0.01≤d50≤0.015，表明受试者免疫力较差，使用免疫检测点调节类药物可能取得一定效果；(3)若0.015<d50，表明受试者免疫力相对较好，使用免疫检测点调节类药物有较大可能取得显著效果。其中，免疫检测点调节类药物疗效的定义为：(1)完全缓解(completerelease,cr)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。(2)部分缓解(completerelease,cr)：靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周。(3)疾病稳定(stabledisease,sd)：靶病灶最大径之和缩小未达pr，或增大未达pd。(4)疾病进展(progressivedisease,pd)：靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。实施例5大范围进行免疫检测点调节类药物疗效的预测评估根据实施例1中描述的方法对31个淋巴瘤受试者进行免疫图谱检测分析，所有的受试者对应的d50值如表10所示：表10淋巴瘤受试者免疫图谱检测分析理想情况下，每一种cdr3克隆只有一个功能性拷贝，d50＝0.5；当受试者免疫力下降，或罹患肿瘤、免疫缺陷等疾病时，d50数值会急剧下降。因此，受试者健康状况与免疫多样性(d50)具有显著相关性。根据受试者接受免疫检测点调节类药物治疗后疗效进行分类，再对照受试者d50数值大小进行分析。完全缓解(cr)病人，d50平均值为0.03，中位数为0.018，均显著高于其他病人(non-cr)(见表11，图3)。表11免疫检测点调节类药物疗效与d50数值的关系再根据d50对受试者进行分类分析，当d50<0.01，15位受试者使用免疫检测点调节类药物后，只有1位获得完全缓解(6.7％)；当0.01≤d50≤0.015时，7位受试者中有4位获得完全缓解(57.1％)；当0.015<d50时，9位受试者有7位获得完全缓解(77.8％)。因此，受试者免疫多样性(d50)可以用于预测其使用免疫检测点调节类药物的预后状况(表12，图4)。表12d50数值与免疫检测点调节类药物疗效的关系因此，我们定义通过免疫图谱分析评估受试者使用免疫检测点调节类药物的预后状况的标准为：(1)当d50<0.01时，表明患者免疫力低下，使用免疫检测点调节类药物难以获得显著疗效；(2)当0.01≤d50≤0.015时，表明患者免疫力较差，使用免疫检测点调节类药物可能取得一定效果；(3)当0.015<d50时，表明患者免疫力相对较好，使用免疫检测点调节类药物有较大可能取得显著效果。因此，综上所述，可以确定了标志cdr3多样性的指标d50作为评估受试者其使用免疫检测点调节类药物的预后状况的指标。序列表<110>成都益安博生物技术有限公司<120>一种用于预测免疫检测点调节类药物疗效的rt-pcr试剂盒及其预测方法<160>50<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>8<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgggagat8<210>2<211>8<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cttttggg8<210>3<211>8<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccagtgtg8<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctctgcttctgatggctcaaacacagc27<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggtgctgtcgtctctcaacatccgag26<210>6<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agtgctgtcatctctcaaaagccaagcag29<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tctcagactattcatcaatggccagcgacc30<210>8<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gatgctgtagttacacaattcccaagacacag32<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaagctgacatctaccagaccccaagatacc31<210>10<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gatgctgatgttacccagaccccaaggaata31<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaagcccaagtgacccagaacccaagatac30<210>12<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gatgtgaaagtaacccagagctcgagatatctagtc36<210>13<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gatggtggaatcactcagtccccaaagtacc31<210>14<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gatgctgaaatcacccagagcccaag26<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gatgctgaaatcacccagagcccaag26<210>16<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gatgctgaaatcacccagagcccaag26<210>17<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gatgctgaaatcacccagagcccaag26<210>18<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gatgccatggtcatccagaacccaagatac30<210>19<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gatgccatggtcatccagaacccaagatac30<210>20<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20cccagacaccaaaatacctggtcacagc28<210>21<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cacctggtcatgggaatgacaaataagaagtc32<210>22<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gctgctggagtcatccagtcccc23<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gattctggagtcacacaaaccccaaagcac30<210>24<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24agatatctgatcaaaacgagaggacagca29<210>25<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25acacacctgatcaaaacgagaggacagca29<210>26<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26aatgccggcgtcatgcagaacccaaga27<210>27<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27ggtgaagaagtcgcccagactccaaaac28<210>28<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gacaccaaggtcacccagagacctag26<210>29<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gagcctggagtcagccagaccc22<210>30<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30cccaggcacaaagtgacagagatgggacaa30<210>31<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31ccccggcacgaggtgacagagatgggacaa30<210>32<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32gaagctggagttactcagttccccagc27<210>33<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gaacctgaagtcacccagactcccagc27<210>34<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gaagctggagtggttcagtctcccag26<210>35<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gaagctggagtggttcagtctcccag26<210>36<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36ccccagacacaagatcacaaagaggggac29<210>37<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37ctcccaggtacaaagtcacaaagaggggac30<210>38<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38cccctaggtacaaagtcgcaaagagaggac30<210>39<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39ccctgagacacaaggtagcaaagaagggaaa31<210>40<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40cccccagtaacaaggtcacagagaagggaaa31<210>41<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gagttactcgcgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>42<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gagtcgttagcgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>43<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gagtaccgagcgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>44<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gagtgttctccgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>45<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45gagttcgcaccgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>46<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46gagttgcgtacgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>47<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47gagtctacgacgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>48<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48gagtgacagacgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>49<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49gagtagaacacgcacagcgacctcgggtgggaac34<210>50<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50gagtcatcctagcacagcgacctcgggtgggaac34当前第1页12当前第1页12