一种产黄青霉的固定化方法及其应用与流程

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种产黄青霉的固定化方法及其应用。

背景技术：

早在1929年，alexanderfleming发现了在平板上抑制金黄色葡萄球菌的物质，后来命名为青霉素。青霉素(penicillin)可以被命名为多种名称，比如：青霉素g、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾，而现在用于治疗的很多抗生素都是来源于其弗莱明发现的β-内酰胺抗生素的衍生物。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提炼的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中的一大类抗生素的总称。青霉素作为一种毒素低、治疗效果好的抗生素，目前仍然是临床上重要的抗生素之一。

产黄青霉菌(penicilliumchrysogenum)属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属。产黄青霉是一种广泛存在于自然界中的霉菌，特别在潮湿的食物和环境中最为常见。产黄青霉最适宜生长的温度25-28℃不等，营养的要求不是很严格，所以，培养也比较容易。最早应用于生产青霉素的菌是点青霉，而现在是用产黄青霉，根据其菌丝的状态，可以将产黄青霉分为丝状菌和球状菌，在丝状菌和球状菌中还可以再按照孢子的颜色分为不同的菌，而我们现在用于青霉素生产的主要是绿孢子丝状菌。因为其菌落的形态和孢子独特的颜色，所以产黄青霉的菌落形态很容易辨认。但是，在工业生产中，由于种子培养时间长的问题使得发酵周期延长很多，发酵液也很粘稠，最终不利用产物的分离，菌体也容易老化。

于是，固定化的技术得到很多的关注，技术也越发成熟，从而广泛的应用于生物技术生产的各大领域。让菌体与一些适合固定化发酵的材料接触，菌体吸附在载体上，从而降低发酵液的浓度有利于营养物质的传递，此外，这些惰性的材料可以重复利用，即提高了发酵效率又有益于产物的分离，材料的重复利用，降低了生产成本的同时，也起到了环境保护的作用。

目前，细胞的固定化方法主要有：包埋法和吸附法，在我国细胞的固定化主要采用的是包埋法。但是，对于产黄青霉的固定化我们了解的很少，之前就报道海藻酸钙对产黄青霉的固定化，但是这种对细胞的固定化引入了副产物，对于后期的产物分离不是有利的，后期也会造成青霉素产量的损失。现在基于黑曲霉固定化的方法，我们也发明了一种产黄青霉固定化发酵的方法，就是在天然存在的惰性介质中，寻找一种适合产黄青霉生长的载体，使得发酵的效率能够提高，降低生产的成本，这就是我们在这过程中需要解决的问题。

随着技术的发展，近些年各种新型的惰性材料层出不穷，然而，在固定化的过程中，我们发现塑料介质作为介质进行固定化发酵，不仅无毒，而且工艺体现也很稳定，惰性材料很容易获得，产物分离以后还可以重复的利用，大大降低生产成本，更重要的是对活性细胞起到一定的保护作用，所以对于固定化发酵的效果非常显著，然而，青霉菌作为丝状菌，因为其菌丝长，菌体生长快，所以很少有人采用吸附法进行固定化发酵。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种产黄青霉的固定化方法，使产黄青霉的固定化既简单又方便，且固定化的过程稳定高效。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种产黄青霉的固定化方法，其将经过电晕改性后的塑料介质作为固定化载体，将产黄青霉活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上。

其中，所述的产黄青霉为atcc48271。

其中，所述的塑料介质为聚甲基丙烯酸甲酯。

其中，所述的塑料介质以15～20g/l(优选15g/l)的添加量置于固定化发酵培养基中。

其中，电晕改性包括如下步骤：

(1)将塑料介质在去离子水中清洗1-5次(2～10min)，再将清洗后的塑料介质在丙酮中抽提15～30h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘干30～60min；

(2)将步骤(1)处理后的塑料介质进行电晕处理，保存备用。

步骤(1)中，所述的抽提为循环抽，提纯溶剂丙酮一次性直接加50ml/0.1g。

步骤(2)中，所述电晕处理的设备是sdcd16-3-20；所述电晕的电流强度为6～14a(优选8a)；电晕的时间为10～30min(优选15min)；其中，电晕的原理是在介质表面持续放电，本发明采用电晕是为了改变基团性质，以使介质的亲水性更好。

其中，所述的固定化发酵培养基中各组分的质量百分比为黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，ph＝5.8。

其中，黄豆饼粉作为一种有机氮源，但确比常见的玉米浆更适合产黄青霉的固定化，且来源广泛易获得；色拉油作为多种植物油的混合体比起传统的玉米油则可以更加有效的减少气泡，所含的物质更适合青霉的发酵。

其中，所述的培养为25℃，培养3天。

上述方法所制备得到的固定化的产黄青霉也在本发明的保护范围之内。

上述固定化的产黄青霉在生产青霉素中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用为：将固定化的产黄青霉接种于换液固定化发酵培养基中是，在20～30℃、150～300rpm，摇床培养72～96h；

其中，所述的换液固定化发酵培养基各组分的质量百分比为黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，ph＝5.8。

优选地，是在25℃、220rpm，摇床培养72～96h。

其中，具体的发酵过程包括如下步骤：

(1)于-80℃冰箱取出冷冻保藏的产黄青霉甘油菌在平板上划线活化，在25℃培养3天。

(2)3天后待孢子成熟，用刮孢子液(0.9％nacl+吐温80)将孢子收集，接种于500ml摇瓶中，其中装液量为100ml，于25℃，220rmp摇床培养72-96h，测定发酵液中的苯乙酸浓度，当其低于0.01％，结束一批发酵，然后移出发酵液。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将新鲜的培养液倒入。这样反复进行9批。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、在本发明中，我们所采用的塑料介质为惰性材料，化学性质及其稳定，而且在发酵的过程中对细胞不会产生毒害作用，所承受的机械强度也很高，且不会被分解代谢掉，经过我们对其改性以后均匀度也很好，不会造成产黄青霉在载体上过度的生长且分布均匀。

2、本发明中，在发酵过程当中，死细胞的脱落和活细胞的吸附使此过程处于一个动态平衡的状态，从而减少发酵过程中对细胞的损害，大大减少发酵的总时间以及发酵的成本，有效缩短发酵总周期从21天缩短到18天。

3、选用的最优的塑料介质，因其具有较小的接触角，所以在单位体积里固定化的细胞数目比较多，不仅如此，由于固定化细胞的密度高，所以实现了产黄青霉的高密度发酵，此外，降低发酵液的粘度，发酵液的黏度适中，传质效果很好。在与游离发酵相比，我们发现，产物的效价大大提高，青霉素的效价达到1672.65u/ml，黏度的减少，有利于我们以后对产物的分离。

4、以塑料介质进行产黄青霉的固定化，生产青霉素，连续生产9批，青霉素的产量没有明显的降低，而且对比以前，此改性的塑料介质进行固定化发酵，工艺相当的稳定，且载体可重复利用。

附图说明

图1为实施例1～实施例6所制备载体的接触角。

图2为对比例1活性炭处理后的接触角。

图3为对比例2聚甲基丙烯酸甲酯未经电晕处理的接触角。

图4为以实施例1、3、5所得载体为介质的发酵数据。

图5为游离和载体添加量不同固定化发酵数据。

图6不同电晕处理接触角的变化，确定最优条件接触角图。

图7游离和固定化发酵对比。

图8为迟缓期生物膜的量。

图9为对数生长期生物膜的量。

图10为稳定期生物膜的量。

图11为衰亡期生物膜的电镜图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明所描述的方法可以适用于所有的青霉菌，在以下所实施的方案当中，我们所选用的产黄青霉菌株是atcc48271。

在众多的塑料介质中，通过对比我们发现，其表面都具有一定的疏水性，而对于丝状真菌产黄青霉来说，菌丝其亲水性比较强，要使其均匀的吸附到载体上，就要对载体进行相应的预处理，使其亲水性可以增强，从而促进种子液中的菌丝体和载体表面的吸附能够更加的均匀，具体实施方式如下：

(1)将塑料介质在去离子水中清洗2-10min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提15-30h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘干30-60min

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为6-14a，时间为10-30min的电晕处理。

实施例1：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚丙烯(pp)在去离子水中清洗2min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提15h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为6a的电晕处理，处理时间15min，4℃冰箱备用。

实施例2：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚氯乙烯在去离子水中清洗6min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为12a的电晕处理处理时间10min，4℃冰箱备用。

实施例3：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8a的电晕处理，处理时间为15min，4℃冰箱备用。

实施例4：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚苯乙烯在去离子水中清洗8min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8a的电晕处理，处理时间为25min，4℃冰箱备用。

实施例5：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚乙烯在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8a的电晕处理，处理时间为15min，4℃冰箱备用。

实施例6：塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚碳酸酯在去离子水中清洗2min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为6a的电晕处理，处理时间为25min，4℃冰箱备用。

对比例1：采用活性炭这种介质，丙酮浸泡，电晕处理以后，介质的接触角不稳定，接触角如图7。

(1)将活性炭在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的活性炭介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的活性炭介质置于sdcd16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8a的电晕处理，处理时间为15min，4℃冰箱备用。

对比例2：以聚甲基丙烯酸甲酯为介质，不经过电晕处理，其接触角的变化如图8。

将塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min，4℃冰箱备用。

与对比例1中，以活性炭为介质，电晕处理后，亲水性较弱，不易于菌丝的吸附，其接触角如图2所示；与对比例2聚甲基丙烯酸甲酯未经过电晕处理，所得载体的疏水性较强，同样，亲水性较弱，不利于菌丝的吸附，接触角测量值如图3所示。从图1中可以看出，实施例1～实施例6对塑料介质进过预处理以后，其接触角都有显著的降低，亲水性增强，实现了固定化的高密度发酵，而且在发酵过程中传质的效率也提高。因此，本发明所选择的塑料介质和电晕预处理能够有效达到菌体吸附的作用。由图1可以看出，以聚丙烯(实施例1)、聚甲基丙烯酸甲酯(实施例3)和聚乙烯(实施例5)为载体，得到的预处理介质的接触角比较稳定，因此，下面以实施例1、3、5所得到的载体进行产黄青霉的固定化发酵，通过产黄青霉发酵生产青霉的效价确定三种载体中的最优载体。

实施例7中，以塑料介质-聚丙烯于摇瓶进行产黄青霉的固定化，从而生产青霉素。

依据例1的方法将塑料介质-聚丙烯进行预处理，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，ph＝5.8。

换液固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，ph＝5.8。

菌体活化，接发酵的步骤如下：

(1)于-80℃冰箱取出冷冻保藏的产黄青霉甘油菌在平板上划线活化，在25℃培养3天。

(2)3天后待孢子成熟，用刮孢子液(0.9％nacl+吐温80)将孢子收集，接种于500ml摇瓶中，其中装液量为100ml，与25℃，220rmp摇床培养72-96h，测定发酵液中的苯乙酸浓度低于0.01％，结束一批发酵，然后移出发酵液。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再在超净台将新鲜的换液固定化发酵培养基倒入。青霉素的效价最高为875.67u/ml，周期比游离增多24h，达不到缩短周期与提高效价的目的，且发酵中发现，载体会裂解的现象。这样反复进行9次。

实施例8：以塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯于摇瓶进行产黄青霉的固定化，从而生产青霉素。

依据例3的方法将塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯进行预处理，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价最高可以达到1542.75u/ml，发酵周期也相比游离缩短24h。

实施例9：以塑料介质-聚乙烯于摇瓶进行产黄青霉的固定化，从而生产青霉素。

依据例5的方法将塑料介质-聚乙烯进行预处理，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再在超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价可以达到1000.45u/ml，但是周期较游离相比延长24h。

对比例3：将对比例1的载体介质应用于产黄青霉中的应用

依据对比例1的方法将活性炭进行预处理，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再在超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价较低，为763.61u/ml。

对比例4：将对比例2的载体介质应用于产黄青霉中的应用

依据对比例2的方法将活性炭进行预处理，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

(3)固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再在超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价较经过电晕处理的低很多，为929.03u/ml。

通过实施7～实施例9，结合图1和图4，我们可以看出，虽然实施例1、3、5介质的接触角都很稳定，且呈现一定的亲水性，但是因为聚丙烯(实施例2)亲水性较弱没能达到菌体与介质很好的吸附，从而导致效价降低，周期也延长；而聚乙烯(实施例5)虽然亲水性很强，却反而导致大量菌体的吸附，不利于产物的分泌，效价也是有所降低；而对于聚甲基丙烯酸甲酯(实施例3)，我们发现该载体具有一定的亲水性，且固定化发酵生产青霉素的效价也是高于其他两种(如图4)，周期也较游离缩短一天(如图7w-i固定化发酵(实施例12)；w-f游离发酵)，故我们选择聚甲基丙烯酸甲酯进行产黄青霉的固定化发酵。在对比例3和4中，我们同样测定青霉素效价，发现，经过电晕处理的活性炭与未经处理的聚甲基丙烯酸甲酯都呈现较弱的亲水性，效价也是明显低于经过处理的聚甲基丙烯酸甲酯。

实施例10：在介质聚甲基丙烯酸甲酯的基础上，研究电晕处理的时间长短和电流强度对介质的影响。

(1)依据实施例3的步骤1；

(2)方案一：根据实施例3中，电流强度不变，电晕处理时间改为20min；方案二：根据实施例3中，电流强度改为6a，处理时间不变；方案三，根据实施例3中，电流强度改为12a，电晕处理时间改为30min三者接触角如图5。

根据实施例10，结合图5，我们可以确定聚甲基丙烯酸甲酯该介质的电晕处理的最优条件为电晕的时间为15min，而电流强度为8a，此外我们从图可以看出电晕处理的时间对载体的影响大于电流强度对介质的影响。

实施例11，依据例10确定的最优条件处理介质，然后，经过预处理以后的材料称取10g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价为987.13u/ml。

实施例12，依据例10确定的最优条件处理介质，然后，经过预处理以后的材料称取15g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价为1672.65u/ml。

实施例13，依据例10确定的最优条件处理介质，然后，经过预处理以后的材料称取20g/l于摇瓶中，作为产黄青霉固定化发酵的介质。

固定化发酵培养基、换液固定化发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

固定化反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将换液固定化发酵培养基倒入。这样反复进行9次，青霉素的效价为1029.03u/ml。

依据实施例11～实施例13，结合图6的固定化发酵数据，我们可以得到，介质的最佳添加量为15g/l。

由上述实施例可以知道，最优的载体介质为聚甲基丙烯酸甲酯，最优的预处理条件为电晕15min，电晕的电流强度为8a，介质的最佳添加量为15g/l，即实施例12为最优的实施例，在此条件下，青霉素的效价为1672.65u/ml，且周期较游离(对比例5)减少一天，发酵过程中稳定性好，这样反复进行9次，如图7(w-f游离发酵；w-i固定化发酵)。

对比例5，以上固定化是相较于游离发酵，此对比例给出游离发酵的过程。

不添加塑料介质作为载体

游离发酵培养基、游离换液发酵培养基的成分同实施例7。

菌体活化，接发酵的步骤如下：步骤(1)和步骤(2)同实施例7。

(3)游离反复批次发酵：配置新鲜的培养液1l。然后500ml锥形瓶分装100ml，于115℃，20min灭菌。结束灭菌以后，将第一批次的菌液倒掉，然后再超净台将换液游离发酵培养基倒入。这样反复进行9次，游离发酵青霉素效价为1032.58u/ml。

实施例14：

在批次发酵过程当中，我们选取不同生长时期实施例12改性的材料进行了电镜图的拍摄，发现，随着菌体的浓度的变化，生物膜的量呈现周期的变化，生物膜量的多少体现了菌体和介质之间的吸附量的多少，说明细胞和介质之间的吸附处于一个动态平衡的状态，如图8-11。

本发明提供了一种产黄青霉的固定化方法及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。