一种检测黄牛NCSTN基因拷贝数变异的方法及其应用与流程

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛(例如，云岭牛)ncstn基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组dna为模板进行实时定量pcr，以btf3基因为参照，根据-δδct值从而确定个体ncstn基因的拷贝数变异类型。

背景技术：

拷贝数变异(copynumbervariations,cnvs)指的是一个物种两个个体之间的大于50bp的基因组序列的插入、缺失变异，属于基因组结构变异。cnvs可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。随着牛全基因组测序工作的完成，牛基因组cnvs研究也成为热点。研究表明，有些cnv位点位于功能基因内部，有些与牛的各种经济性状相关。这些研究说明cnvs与牛的正常生长发育息息相关。在检测已知cnv的各种方法中，实时定量pcr(quantitivereal-timepcr,qpcr)是使用比较广泛的一种技术，其操作简单、敏感性高、速度快，pcr中选取单拷贝的基因作为内参基因(如liu等验证发现的牛单拷贝基因btf3)，然后利用2^-δδct的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

但目前为止，尚未见到关于检测云岭牛呆蛋白(nicastrin)基因拷贝数变异的实时定量pcr(quantitivereal-timepcr,qpcr)的方法报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法及其应用，以快速建立遗传资源优良的黄牛(例如，云岭牛)种群，加快黄牛良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以待测云岭牛个体全基因组dna为模板，以引物对p1以及p2为引物，分别通过实时定量pcr扩增ncstn基因的拷贝数变异区域以及作为内参对照的btf3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定云岭牛个体ncstn基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的ncstn基因的拷贝数变异区域位于牛ncstn基因参考基因组序列nc_037330.1的9345960位至9349559位。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据-δδct将定量结果分为的三类：多拷贝型，-δδct>0.5；缺失型，-δδct<-0.5；正常型，-0.5≤-δδct≤0.5。

优选的，所述的引物对p1为：

上游引物f1：5’-acctactaccctcatcgcct-3’

下游引物r1：5’-ctgtgttcgtggctgttgac-3’；

所述的引物对p2为：

上游引物f2：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’

下游引物r2：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。

优选的，所述的实时定量pcr所用的扩增体系以12.5μl计包括：50ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物对p1或p2所对应的上、下游引物各0.5μl、纯水4.25μl，及premixextaq^tmii6.25μl。

优选的，所述的实时定量pcr所用的反应程序为：(1)95℃预变性1min；(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。

上述检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述拷贝数变异类型中，具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体(例如，云岭牛个体)在生长性状上显著优于具有正常型、缺失型拷贝数变异类型的个体。

优选的，所述生长性状选自胸围、管围中的一种或两种。

一种与黄牛生长性状相关的ncstn基因拷贝数变异的实时定量pcr检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对p1和p2。

本发明的有益效果体现在：

本发明公开的检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型。根据本发明对黄牛(例如，云岭牛)ncstn基因的cnv变异类型进行的检测和类型频率统计，以及该cnv与黄牛(例如，云岭牛)的生长性状进行的关联分析，结果表明该cnv中的特定类型可以作为黄牛生长性状早期选择的分子标记，用于黄牛的快速选育。

附图说明

图1为本发明中进行qpcr(ncstn基因)绘制的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是对本发明保护范围的限制。

在前期的黄牛基因组重测序研究当中，发现牛ncstn基因组序列(参考基因组序列nc_037330.1)的9345960位至9349559位发生了拷贝数变异(cnv)，但基于ncstn基因的生理作用，尚无法明确其cnv在黄牛重要经济性状中的调节机制。

本发明根据以上重测序得到的牛ncstn基因组序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性引物，然后以云岭牛基因组dna为模板，进行qpcr扩增，并以btf3基因为内参基因，利用2^-δδct方法，判定个体的拷贝数类型。

本发明通过利用qpcr技术，检测云岭牛ncstn基因的拷贝数变异情况，并将不同的拷贝数变异类型与个体生长性状进行关联分析，发现了具有优势生长性状的拷贝数变异类型，从而可以加快云岭牛的种质资源改良工作，为黄牛的分子育种工作提供基础资料。

1.样品的采集及基因组dna提取

(1)血样的采集

本发明中采集的云岭牛来自于云南省昆明市小哨乡草地动物科学研究院，于2018年8月采集，均为24月龄，共计119个个体，血液的采集方法为颈静脉采血。同时收集这些个体的生长性状数据记录，如体高、体长、胸围、管围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。

(2)血样dna的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μl血液于1.5ml离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(pbs)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入dna抽提缓冲液500μl，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶k5μl(20mg/ml)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μl蛋白酶k混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μltris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管；重复步骤1次。

⑤加入氯仿500ml，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5ml离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500ml，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5ml离心管中。

⑦加入0.1倍体积的naac缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩加入80～100μl的te溶解干燥后的dna，4℃保存直至dna完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

2.目的基因及内参基因扩增用特异性引物的设计

以ncbi所公布的牛ncstn基因(nc_037330.1)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即ncstn基因(目的基因)组序列的9345960位至9349559位，利用prime5.0软件设计包含在此区域的引物，并在ncbi_blast中进行比对。引物序列具体如下(引物对p1)：

上游引物f1：5’-acctactaccctcatcgcct-3’

下游引物r1：5’-ctgtgttcgtggctgttgac-3’；

基于btf3基因既没有cnv序列也没有分段重复，使用btf3基因作为内参基因。设计的引物序列如下(引物对p2)：

上游引物f2：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’

下游引物r2：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。

利用普通pcr扩增和1％的琼脂糖凝胶电泳验证了以上引物对的扩增特异性。基于引物对p1扩增的pcr产物片段大小为100bp，基于引物对p2扩增的pcr产物片段大小为166bp。

3.实时定量pcr

qpcr反应体系如表1所示。

表1.qpcr的反应体系

qpcr反应程序为：

(1)95℃预变性1min，然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。

通过绘制扩增曲线和熔解峰确定引物适用于qpcr分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(参见图1)。

4.个体cnv类型判定

实验结果采用2^-△△ct方法进行计算，具体的计算方法为：δδct＝δct(实验组)-δct(参照组)，公式中，δct(实验组)＝ct(实验组目的基因)-ct(实验组内参基因)，δct(参照组)＝ct(参照组目的基因)-ct(参照组内参基因)；实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本，参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序中所选择的参照组云岭牛个体；ct即cyclethreshold，为pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据公式计算得出每个待测个体的-δδct，并根据cnv类型的判定标准：-δδct>0.5为多拷贝型(duplication)；-0.5≤-δδct≤0.5为正常型(median)；-δδct<-0.5为缺失型(deletion)，从而判定检测的云岭牛个体的拷贝数变异类型。

5.数据处理

统计检测群体中各种类型(deletion、median和duplication)的个体数，并统计各种类型的频率。计算公式如下：

pc＝nc/n

其中，pc代表某种拷贝数变异类型的频率；nc代表群体中具有c这种cnv类型的个体数；n代表检测群体的总数量。

利用spss(18.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响生长性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、性别、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

yijk＝μ+gj+eijk

其中，yijk为个体表型记录；μ为群体均值；gj为各位点的拷贝数类型；eijk为随机误差。

数据处理的结果如表2所示，缺失型个体的频率最高。

表2.云岭牛ncstn基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)；^*p<0.05；括号内的数值表示拷贝数变异类型的频率。

结果表明(表2)，云岭牛ncstn基因的拷贝数变异位点(牛ncstn基因参考基因组序列nc_037330.1的9345960位至9349559位)与管围、胸围这两个生长性状具有显著的关联性(该位点的多拷贝型对云岭牛的管围和胸围有显著的正效应)。其中，多拷贝型的个体生长性状显著优于正常型、缺失型的个体。因此，以上ncstn基因拷贝数变异位点的多拷贝型可以作为云岭牛生长性状(例如，管围和胸围性状)早期选择的分子标记，用于云岭牛的快速选育。

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法及其应用

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<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

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acctactaccctcatcgcct20

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

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aaccaggagaaactcgccaa20

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<212>dna

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