重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及一种生物工程技术，特别是涉及一种重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)主要感染人上皮细胞，引起上皮细胞损伤，从而导致包括生殖器疣、宫颈癌等一系列疾病，近年来，越来越多的研究表明hpv感染还可以引起其他肛门与生殖器相关癌症，如阴道癌、肛门癌、阴茎癌等，甚至还与口咽癌有关。其中关注度最高、hpv致病机理最清楚的是宫颈癌，作为世界第三大女性癌症，宫颈癌每年夺走25万人的生命，而99％以上的宫颈癌都是由于hpv感染引起的。
3.hpv的主要传播途径为性传播，其进入人体的主要机理与上皮细胞的微损伤有关。
4.目前已发现至少两百多种基因型的hpv，根据其感染后是否具有致癌性，可分为高危型和低危型两种，其中高危型hpv主要与各种恶性肿瘤相关，低危型hpv主要引起尖锐湿疣、呼吸系统刺瘤等良性肿瘤。虽然在不同的国家和地区的hpv流行病学数据有一定的差异，但总体来讲，目前世界范围内流行程度最广的高危型hpv型别为hpv16和hpv18，这两种型别与70％的宫颈癌有关，其他流行程度较高的的高危型hpv型别为hpv31、hpv33、hpv45、hpv52、hpv58等。低危型hpv的主要流行型别为hpv6和hpv11。基于以上的流行病学趋势，目前已有三种hpv预防性疫苗上市，分别是葛兰素史克的(hpv16/18)，默克公司的(hpv6/11/16/18)和9(hpv6/11/16/18/31/33/45/52/58)，默克的两种疫苗可同时预防高危型和低危型的感染，极大程度地降低相应型别引起的宫颈癌发病率和尖锐湿疣发病率。
5.hpv属双链dna病毒，环状基因组全长约7900～8000bp，编码7个非结构蛋白e1～e7和2个衣壳蛋白l1、l2。其中l1蛋白为主要衣壳蛋白，360拷贝的l1蛋白组成72个五聚体，形成t＝7的病毒粒子；l2蛋白为次要衣壳蛋白，不承担结构骨架的功能，但与受体结合后的病毒dna释放有关。hpv主要的中和表位存在于l1蛋白上，基于这些中和表位的中和抗体可有效预防hpv的感染。
6.基于多种重组表达系统的研究已证明单独表达l1蛋白即可形成构象接近于天然病毒粒子的病毒样颗粒(virus-like particles,vlps)，这些hpv-vlp保留了天然hpv的中和表位，同时缺少病毒复制必须的dna，其安全性和可靠性已通过基于这些vlp的hpv预防性疫苗和9得到了充分的证明。是分别在杆状病毒系统内分别表达hpv16 l1和hpv18 l1，重组表达产物自组装成为vlp，两种重组表达产物分别经纯化、制剂后混匀制成疫苗制剂；是在酿酒酵母系统内分别表达hpv6l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1，同样也是将四种重组表达产物分别纯化、制剂后再混匀成为最终的产品。默克公司的第二代hpv预防性疫苗9，是在的基础上增加了5个高危型hpv型别——hpv31、hpv33、hpv45、hpv52和hpv58，加上gardasil原有的4价，成为保护
范围更广的9价疫苗。但无论是2价的4价的和最新的9价9疫苗，都需要为每个价型单独准备一套工艺，将单价的半成品制剂混匀后才得到多价疫苗制剂，这势必导致工艺复杂、繁琐，每增加一个价型都需要增加相应的投入，包括工程菌株的制备、相应的发酵、纯化、制剂等工艺的设备和人员投入，成本高、可控性差。


技术实现要素：

7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途，用于解决现有技术中制备hpv抗体工艺复杂、繁琐、成本高、可控性差的问题。
8.本发明的第一方面提供了一种重组表达载体系统，所述重组表达载体系统至少包含两个重组表达载体，每个所述重组表达载体上含有一个或多个核酸表达盒，每个核酸表达盒包含目的基因，以及与目的基因可操作地连接的启动子，每个所述目的基因分别独立选自hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1、hpv31 l1、hpv33 l1、hpv35 l1、hpv39 l1、hpv45 l1、hpv51 l1、hpv52 l1、hpv53 l1、hpv56 l1、hpv58 l1、hpv59 l1、hpv66 l1或hpv68 l1中的一种，且所有目的基因都互不相同。
9.所述多个可以是两个。所述多个可以是三个。所述多个可以是四个。
10.一种实施方式中，所述hpv6 l1如seq id no：1所示。
11.一种实施方式中，所述hpv11 l1如seq id no：2所示。
12.一种实施方式中，所述hpv16 l1如seq id no：3所示。
13.一种实施方式中，所述hpv18 l1如seq id no：4所示。
14.一种实施方式中，所述hpv31 l1的序列为aei60965.1。
15.一种实施方式中，所述hpv33 l1的序列为aaa46964.1。
16.一种实施方式中，所述hpv35 l1的序列为arq82609.1。
17.一种实施方式中，所述hpv39 l1的序列为agu90477.1。
18.一种实施方式中，所述hpv45 l1的序列为caa52578.1。
19.一种实施方式中，所述hpv51 l1的序列为amk51256.1。
20.一种实施方式中，所述hpv52 l1的序列为acx32362.1。
21.一种实施方式中，所述hpv53 l1的序列为abu54083.1。
22.一种实施方式中，所述hpv56 l1的序列为abo76795.1。
23.一种实施方式中，所述hpv58 l1的序列为acl12325.1。
24.一种实施方式中，所述hpv59 l1的序列为alt54908.1。
25.一种实施方式中，所述hpv66 l1的序列为abo76872.1。
26.一种实施方式中，所述hpv68l1的序列为agu90680.1。
27.hpv6 l1 dna编码序列(seq id no：1)
28.atgtggagaccatctgactcgactgtctacgttcctccacctaacccagtctctaaggttgtggctaccgacgcctacgtgactagaaccaacatcttctaccacgcatcgtcctctagattgctggccgttggacatccttacttctccatcaagagagccaacaaaaccgtcgtgccaaaggtttctggctaccagtatagagtcttcaaggtggttctgcctgaccctaacaagtttgccctgccagactcgtccttgttcgatcctacgactcaaagactcgtttgggcctgcactggtcttgaggttggcagaggacagccactcggagtcggcgtttctggtcatcctttcctgaacaagtacgac
gatgttgagaactctggttccggaggcaatcctggacaggacaacagagtcaatgttggcatggactacaagcaaactcagctctgtatggtgggatgcgcacctccactgggtgagcattggggaaaaggcaagcagtgcaccaacactccagttcaggcaggtgactgccctccattggagctgattacctcggtcatccaggacggtgatatggttgacaccggattcggtgccatgaacttcgctgacctgcagaccaacaagtccgatgtgccaatcgacatctgcggaacgacctgtaaataccctgactacttgcagatggcagccgatccatacggcgacagactcttcttctttctgagaaaggagcagatgtttgctagacactttttcaacagagccggagaggtcggtgagcctgttccagacaccctgatcattaagggctcgggaaacagaacttctgtcggctcctcgatctacgtgaacaccccttccggttcgttggtgtcgtccgaggctcaactgttcaacaagccatactggctccagaaagcccaaggtcacaacaatggcatctgctggggtaaccagctgttcgttactgtcgtggacaccacgagatcgaccaacatgactctgtgtgcctccgttaccacatcttcgacttacaccaactccgactataaggagtacatgagacacgttgaagagtacgacttgcaattcatctttcagctctgctcgattaccctgtccgcagaagtcatggcctacatccacactatgaatccatcggtgcttgaggactggaactttggcttgtccccacctccaaacggaactctggaagacacctatagatacgtgcagtcgcaagccatcacgtgccagaagccaacccctgagaaggaaaagccagatccttacaagaacctgtccttctgggaggtcaatctcaaggagaagttctcgtccgaactggaccagtacccattgggtagaaagttcctgctccagtctggataccgtggtagatcgtccatcagaaccggagtgaagagaccagcagtttccaaggcttctgccgcacctaagcgtaaaagagccaagaccaagagataatag
29.hpv11 l1 dna编码序列(seq id no：2)
30.atgtggagaccatctgactcgaccgtctacgttcctccacctaacccagtctccaaagtggttgctactgatgcctacgtcaagagaaccaacatcttctaccacgcctcttcgtccagattgctggcagttggacatccttactattccatcaagaaagttaacaagaccgtggtccctaaggtttcgggctatcagtacagagtgttcaaggtcgttctgccagaccctaacaagtttgccttgccagattcctcgctgttcgaccctaccactcaaagactggtttgggcttgcacgggtttggaagtgggcagaggacaaccactgggtgtcggagtttccggccatccattgctgaacaagtacgacgatgttgagaactcgggtggatacggtggcaatccaggacaagacaacagagtgaatgtcggcatggactacaagcaaacccagctgtgcatggttggttgtgcaccacctctgggtgaacattggggaaagggcactcagtgctccaacacctctgttcagaatggtgactgtcctccactggagctgatcacctcggttattcaggatggagacatggtggacactggcttcggtgcaatgaactttgccgacttgcagaccaacaagtccgatgttccattggacatttgcggcactgtgtgcaaatatcctgactacctgcagatggctgcagatccatacggtgacagactcttcttctacctgagaaaggagcagatgttcgccagacacttctttaacagagctggcaccgttggtgagcctgttccagatgacctgttggtgaagggtggaaacaatagatcctctgttgcctcgtccatctacgtccacaccccatcgggctctctggtgtcctcggaggcccaactgttcaacaagccttactggctccagaaggcccaaggacacaacaatggcatctgctggggaaaccacctgttcgtcaccgttgtggacacgactagatccaccaacatgactttgtgtgcctctgtttccaagtcggctacctacacgaactcggactataaggagtacatgagacatgttgaagagttcgacctgcagtttatcttccagctctgctccattaccttgtcggcagaagtgatggcctacatccacacgatgaacccatccgtcttggaagactggaacttcggtctgtctccacctccaaatggcaccctggaagacacgtacagatatgtgcagtcgcaagccatcacctgtcagaaaccaactcctgaaaaggagaaacaggacccatacaaggatatgtcgttctgggaggtcaacctgaaggagaagttctcttcggaactggaccagttcccattgggaagaaagttcctgctccagtctggttatagaggaagaacctccgcaagaactggcatcaagagacctgccgtgtcgaagccatccaccgctcctaagagaaagagaacgaagaccaaaaagtaatag
31.hpv16 l1 dna编码序列(seq id no：3)
32.atgtctctttggttgccatccgaggctactgtttacttgccacctgtcccagtttctaaggtcgtgtcaactgatgaatacgttgctagaaccaacatctattaccacgctggaacttctagattgcttgctgttggtcatcca
tacttccctatcaagaaacctaacaataacaagatccttgttccaaaggtctctggattgcagtacagagttttcagaatccacttgcctgacccaaacaagttcggttttcctgacacctccttctacaacccagatactcaaagattggtgtgggcctgtgttggtgtcgaggttggacgtggtcaaccattgggagttggtatttctggacatcctttgcttaacaagttggatgacactgaaaatgcttctgcctacgcagccaacgctggtgttgacaacagagagtgtatctctatggattacaaacagacccaattgtgtcttattggttgcaagccacctattggtgaacactggggtaagggatctccatgtaccaacgttgctgtcaatccaggtgattgtcctccattggagcttatcaacactgttattcaagatggtgacatggttgatactggatttggtgctatggacttcactaccttgcaagctaacaagtccgaggttccattggacatttgtacttctatctgcaagtatccagactacattaagatggtctctgaaccatacggtgactccttgtttttctaccttcgtagagagcaaatgtttgttagacacttgttcaacagagctggtgccgttggtgagaatgtcccagacgatttgtacatcaagggatctggttccactgcaaacttggcctcttccaactacttcccaactccttcaggttctatggttacctccgatgctcaaatcttcaacaagccttactggttgcaaagagcacagggtcacaacaatggaatttgttggggtaaccaacttttcgttactgtcgttgataccacaagatccaccaacatgtccttgtgtgctgccatttctacttcagaaaccacatacaagaatactaacttcaaggagtaccttagacatggtgaggaatacgacttgcagttcatctttcaattgtgcaagattaccttgactgctgacgttatgacctacatccactctatgaactccactatccttgaagattggaacttcggattgcaaccacctccaggtggaaccttggaagatacttacagatttgtcacatcccaagccattgcttgtcagaagcacactcctccagctcctaaggaagatccacttaagaaatacaccttctgggaagtcaacttgaaagagaagttctctgctgaccttgatcagtttcctttgggtagaaagttcttacttcaagctggattgaaggccaaaccaaagttcaccttgggtaaaagaaaggctactccaaccacatcatctacttccacaaccgccaaacgtaagaagagaaaactgtaatag
33.hpv18 l1 dna编码序列(seq id no：4)
34.atggctctgtggagaccatctgacaacaccgtctacttgccacctccatctgttgccagagtcgttaacaccgacgattacgtcactagaacatccatcttctaccacgctggttcctctagattgcttactgttggtaatccatacttcagagttccagctggtggaggtaataagcaagacattcctaaggtttctgcttaccaatatagagtctttagagttcagttgcctgacccaaacaagttcggtttgcctgatacttctatctacaacccagagactcaaagattggtttgggcctgtgctggtgtcgagatcggtagaggacaacctttgggagttggtctttctggacacccattctacaacaagttggatgacactgaatcttcacatgctgccacttccaatgtttctgaggatgttcgtgacaacgtctctgttgattacaagcaaactcagttgtgtatccttggatgtgcccctgctattggtgaacactgggctaaaggtactgcctgtaagtccagaccattgtctcaaggtgactgcccacctttggagcttaagaacactgttttggaagatggtgacatggttgatactggatatggtgctatggacttctctaccctgcaggatactaagtgtgaggttccattggacatctgtcaatctatttgtaagtaccctgattatcttcagatgtctgctgacccatacggtgattctatgttcttttgcttgagacgtgagcaacttttcgctagacacttttggaacagagcaggtactatgggtgacaccgttccacaatctttgtatatcaaaggaactggtatgagagcttctcctggatcctgtgtttactcaccatctccttccggttctattgttacctcagactctcaattgtttaacaagccatactggttacacaaggctcagggtcataacaatggtgtttgctggcacaaccaattgttcgttactgtcgttgacaccactagatccaccaatttgacaatttgtgcttctactcagtcccctgttccaggtcaatatgatgctaccaaattcaagcaatactctagacacgttgaggaatatgacttgcagtttatcttccaattgtgtactattaccttgactgccgatgttatgtcttacattcattccatgaactcttcaatcttggaggattggaactttggtgttccaccacctccaacaacttctttggttgacacctacagattcgtccaatctgttgctattacctgtcagaaggatgccgcaccagctgaaaacaaggatccatacgacaagttgaagttttggaatgtcgatttgaaggagaagttctcccttgacttggatcaatacccacttggtagaaagttcttggttcaggctggtttgagacgtaagcc
aactatcggtccaagaaaacgttctgctccatcagccactacctcttccaaacctgctaagagagttcgtgtcagagctagaaagtaatag
35.进一步地，每个所述核酸表达盒内的启动子选自mox。所述mox的序列如seq id no：5所示。
36.进一步地，每个所述核酸表达盒内的终止序列选自aoxtt。所述aoxtt的序列如seq id no：6所示。
37.mox dna序列(seq id no：5)
38.gtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaa
39.aoxtt dna序列(seq id no：6)
40.gtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatc
41.进一步地，每个所述重组表达载体还包含一个或者多个含有选择物标记基因的核酸表达盒。
42.进一步地，所述选择物标记基因选自抗生素抗性基因。所述抗生素抗性基因可以是zeocin抗性基因、g418抗性基因或者其他目前常用的抗生素抗性基因。
43.进一步地，所述启动子选自酵母表达片段。所述启动子基因可选自mox、gapdh、das或者其他酵母可用的启动子。
44.进一步地，所述重组表达载体通过将目的基因插入质粒获得。例如质粒可以是ppiczb。
45.进一步地，所述重组表达载体系统包含两个重组表达载体，每个重组表达载体上包含两个核酸表达盒，两个核酸表达盒的目的基因分别独立的选自hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1、hpv31 l1、hpv33 l1、hpv35 l1、hpv39 l1、hpv45 l1、hpv51 l1、hpv52l1、hpv53 l1、hpv56 l1、hpv58 l1、hpv59 l1、hpv66 l1或hpv68 l1中的一种，且所选目的基因都互不相同。
46.本发明的第二方面提供了一种重组工程菌，其包含如上所述的重组表达载体系统。
47.进一步地，所述重组工程菌是酵母。
48.进一步地，所述酵母选自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(kluyveromyces lactis)，或栗酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)中的任一种或多种。
49.本发明的第三方面提供了一种上述重组表达载体系统的制备方法，所述方法为通过改造原始质粒获得，具体包括以下步骤：将目的基因的启动子和终止序列分别替换两个原始质粒的启动子和终止序列；再将目的基因分别插入启动子和终止序列之间。
50.进一步地，所述方法为：将质粒ppiczb改造获得，具体包括以下步骤：
51.(1)质粒pmmz的构建：采用第一启动子mox插入片段和第一终止序列aoxtt分别替换质粒ppiczb中的启动子和终止序列，获得质粒pmoxz-1；采用第二启动子mox插入片段和第二终止序列aoxtt分别替换质粒ppiczb中的启动子和终止序列，获得质粒pmoxz-2；连接质粒pmoxz-1和质粒pmoxz-2；
52.(2)替换质粒上的选择标记物基因，获得与步骤(1)中的质粒具有不同选择标记物基因的质粒；
53.(3)将目的基因分别插入步骤(1)和步骤(2)构建的质粒中获得重组表达载体。
54.进一步地，所述目的基因分别独立选自hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1、hpv31 l1、hpv33 l1、hpv35 l1、hpv39 l1、hpv45 l1、hpv51 l1、hpv52 l1、hpv53l1、hpv58 l1、hpv59 l1、hpv66 l1或hpv68 l1中的至少一种。
55.进一步地，所述第一启动子mox插入片段为采用seq id no：7、seq id no：8所示序列为引物，汉逊酵母基因组dna为模板，扩增得到。
56.进一步地，所述第一终止序列aoxtt采用seq id no：10、seq id no：11所示序列为引物，ppiczb质粒为模板，扩增得到。
57.更进一步地，质粒pmoxz-1为采用bglii+ndei联合酶切处理mox启动子插入片段，ndei+bamhi处理aoxtt终止序列片段，bglii+bamhi处理ppiczb，再用小牛肠碱性磷酸酶处理ppiczb-bglii+bamhi片段，三片段连接后得到。
58.进一步地，所述第二启动子mox插入片段为采用seq id no：7、seq id no：9所示序列为引物，汉逊酵母基因组dna为模板，扩增得到。
59.进一步地，所述第二终止序列aoxtt为采用seq id no：11、seq id no：12所示序列为引物，ppiczb质粒为模板，扩增得到。
60.更进一步地，质粒pmoxz-2为采用bglii+hindiii联合酶切处理mox启动子插入片段，hindiii+bamhi处理aoxtt终止序列片段，bglii+bamhi处理ppiczb，再用小牛肠碱性磷酸酶处理ppiczb-bglii+bamhi片段，三片段连接后得到。
61.本发明的第四方面提供了一种重组工程菌的制备方法，所述方法为将上述重组表达载体系统转化至工程菌中获得。
62.本发明的第五方面提供了上述重组表达载体系统或重组工程菌在制备hpvl1蛋白中的用途。
63.本发明的第六方面提供了一种制备hpvl1蛋白的方法，所述选自以下两种的任意一种：
64.a.将如上所述的重组表达载体系统转化至重组工程菌中，利用重组工程菌表达hpvl1蛋白；
65.b.利用如上所述的重组工程菌表达hpvl1蛋白获得。
66.利用上述方法获得的hpvl1蛋白至少有两种亚型。
67.本发明的第七方面提供了一种蛋白，所述蛋白采用如上所述的制备hpvl1蛋白的方法制备获得。
68.如上所述，本发明的多基因重组表达片段、表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
69.本发明制备的重组工程菌可以用来制备hpv疫苗。重组工程菌可以同时表达多种hpvl1蛋白。实验结果显示，quadri-l1免疫后血清可诱导hpv抗体，抗体滴度水平相近，具有一定的量效关系。
附图说明
70.图1显示为本发明酵母双表达质粒pmmz结构示意图。
71.图2显示为本发明酵母双表达质粒pmmg结构示意图。
72.图3显示为本发明hpv6 l1/hpv11 l1双表达质粒结构示意图。
73.图4显示为本发明hpv16 l1/hpv18 l1双表达质粒结构示意图。
74.图5显示为本发明6l1-11l1-pmmg、16l1-18l1-pmmz酶切鉴定结构示意图。
75.其中1.6l1-11l1-pmmg未酶切；2.6l1-11l1-pmmg nhei+noti酶切鉴定；3.6l1-11l1-pmmg bstbi+sbfi酶切鉴定；4.16l1-18l1-pmmz未酶切；5.16l1-18l1-pmmz nhei+noti酶切鉴定；6.16l1-18l1-pmmz bstbi+sbfi酶切鉴定；7.250bp dnamarker(takara).
76.图6显示为本发明型别特异性中和单抗检测hpv16 l1/hpv18 l1双表达菌株破菌上清。
77.a1～a6、b1～b2：h16.v5检测16l1-18l1-cbs4732-1～8#；b3：h16.v5检测阳性对照(hpv16 l1标准品)；c1～c6、d1～d2：h18.j4检测16l1-18l1-cbs4732-1～8#；d3：h18.j4检测阳性对照(hpv18 l1标准品)。
78.图7显示为本发明型别特异性中和单抗检测hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1四表达菌株破菌上清。
79.a1～a10、b7：h6.m48检测6l1-11l1-16l1-18l1-cbs4732-1～11#；b1、b8：h6.m48检测阳性对照(hpv6 l1标准品)；
80.c1～c10、d7：h11.h3检测6l1-11l1-16l1-18l1-cbs4732-1～11#；d1、d8：h11.h3检测阳性对照(hpv11 l1标准品)；
81.e1～e10、f7：h16.v5检测6l1-11l1-16l1-18l1-cbs4732-1～11#；f1、f8：h16.v5检测阳性对照(hpv16 l1标准品)；
82.a1～a10、h7：h18.j4检测6l1-11l1-16l1-18l1-cbs4732-1～11#；h1、h8：h18.j4检测阳性对照(hpv18 l1标准品)；
83.图8显示为本发明quadri-l1-vlp透射电子显微镜图。
84.图9显示为本发明quadri-l1鼠血清几何抗体平均滴度(gmt)。
具体实施方式
85.术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且通常是指基本上由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的任何长度的聚合物。核酸可包含嘌呤和/或嘧啶碱基，和/或其他天然的、化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。核酸的主链可以包含糖和磷酸基团，如通常可以在rna或dna中发现的，和/或一种或多种修饰的或取代的(例如，2'-o-烷基化，例如，2'-o-甲基化或2'-o-乙基化；或2'-o,4'-c-炔基化，例如2'-o,4'-c-乙基化)糖或一个或多个修饰或取代的磷酸基团。
86.术语“核酸表达盒”指包含一种或多种转录控制元件(例如但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列和内含子)的核酸分子，所述转录控制元件指导与它们可操作地连接的(转)基因表达。
87.术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于每一种的排列，使得元件功能性连接并且能够在基因表达的背景下彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列、一个或多个内含子、以及待表达的感兴趣基因的编码序列(例如目的基因)。当适当取向或可操作地连接时，核酸序列元件一起起作用以确保或调节编码序列的表达。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以以每个元件的5'末端和3'末端而言表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过元件之间的居间核苷酸或碱基对的数目来表示。
88.术语“目的基因”是指要在导入有核酸序列的宿主细胞中表达的编码多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。如何将核酸序列导入宿主细胞中不是必需的，例如它可以通过整合到基因组中或作为附加型质粒。
89.术语“启动子”是指能够结合rna聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(有义链中的5')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。
90.术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其表示转录的3'加工和终止。
91.术语“选择标志物基因”包括赋予表达它的宿主细胞表型以促进鉴定和/或选择用转基因转染或转化的宿主细胞的任何基因。
92.术语“载体”是指可以接受多核苷酸插入或克隆的多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的dna分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性内切酶位点，并
且可以能够在确定的宿主细胞中自主复制，或者可以整合在确定的宿主的基因组内，使得克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。
93.术语“重组工程菌”是指用于转化的那些细胞，即用于表达目的基因的细胞。重组工程菌可以是分离的细胞或培养物中培养的细胞系，或者是存在于活组织或生物体中的细胞。在本发明的上下文中，宿主细胞优选是能够在培养物中生长的细胞。
94.术语“转化”是指将外源核酸导入生物体中，使得核酸可作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。
95.表达片段：
96.本文提供的表达片段包含至少第一核酸表达盒和第二核酸表达盒，其中所述第一核酸表达盒和所述第二核酸表达盒不是彼此的拷贝，并且其中每个表达盒包含可操作地连接到一个或更多个目的基因的启动子。每个表达盒上连接在每个目的基因上的启动子可以相同也可以不同。在优选的实施例中为采用相同的启动子。
97.其他序列可以掺入根据本发明的核酸表达盒中。更具体地，核酸表达盒包括进一步增加或稳定转基因产物表达的序列(例如内含子和/或转录终止序列)。
98.优选地，本文涵盖的表达片段包含选择标志物基因。所述选择标志物基因优选不包含在表达片段的核酸表达盒中。因此，在实施方案中，本文涵盖的表达片段还包含一个或多个包含选择标志物基因的核酸表达盒。选择标志物基因的表达可以指示宿主细胞的核酸表达盒已经转化，因此，允许选择经转化的宿主细胞。选择标志物基因盒通常还包括启动子和转录终止子序列，其可操作地连接到选择标志物基因。
99.合适的标志物可以选自赋予抗生素抗性、视觉标志物或互补宿主细胞营养缺陷的标志物。例如，选择标志物可以赋予对抗生素如潮霉素b(如hph基因)、zeocin/腐草霉素(如ble基因)、卡那霉素或g418(如nptii或aphviii基因)、壮观霉素(如aada基因)、新霉素(如aphviii基因)、杀稻瘟素(如bsd基因)、诺尔丝菌素(如natr基因)、嘌呤霉素(如pac基因)和巴龙霉素(如aphviii基因)的抗性。也可以使用视觉标志物并包括例如β-葡糖醛酸酶(gus)、萤光素酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白等。营养缺陷的两个突出实例是氨基酸亮氨酸缺陷(例如leu2基因)或尿嘧啶缺陷(例如ura3基因)。乳清苷-5'-磷酸脱羧酶阴性(ura3-)的细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。因此，功能性ura3基因可以在具有尿嘧啶缺陷的宿主细胞上用作选择标志物，并且可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。仅用功能性ura3基因转化的细胞能够合成尿嘧啶并在此类培养基上生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷，则必须制备具有缺陷的营养缺陷型突变体，以便使用ura3作为菌株的选择标志物。实现这点的方法是本领域公知的。
100.载体系统：
101.本文涵盖的表达盒可以原样使用，或者通常，它们可以是核酸载体的一部分(即导入核酸载体)。本文公开的表达片段的核酸表达盒可以位于相同载体上或在不同载体上。本发明特别涵盖包含至少两个载体的载体系统，其中每个载体至少包括两个核酸表达盒。本文涵盖的载体系统的载体可以相同或不同。
102.本文教导的载体可以进一步含有用于线性化或片段化的各种类型的限制性位点。
103.许多载体是本领域技术人员已知的，并且可以使用任何此类载体。选择合适的载体是一个选择问题。载体可以是非病毒载体或病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、阳
离子脂质、脂质体、纳米颗粒、peg、pei等。病毒载体源自病毒，包括但不限于：逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒等。
104.本文用于转化重组工程菌的方法是技术人员所公知的。例如，可以使用如本领域已知的电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂的)转化方法或根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法。
105.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
106.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
107.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
108.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
109.实施例1酵母双表达质粒的构建与改造
110.为同时在酵母中表达hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv 18l1，需要改造得到两种可同时表达两种蛋白的表达质粒，每一种质粒都含有两个独立的表达盒，同时两种质粒含有的筛选标记不同，以便于通过两次转化、筛选的方法将两种不同的双表达质粒导入酵母。具体的质粒构建方案如下：
111.1.1酵母双表达质粒pmmz的构建
112.通过pcr方式，采用seq id no：7-8所示序列为引物，汉逊酵母全基因组dna为模板，扩增得到mox启动子插入片段(seq id no：26)；采用seq id no：10，seq id no：12所示序列为引物，ppiczb质粒为模板，扩增得到含aoxtt终止序列(seq id no：27)的片段。bglii+ndei联合酶切处理mox启动子插入片段，ndei+bamhi处理aoxtt终止序列片段，bglii+bamhi处理ppiczb，再用小牛肠碱性磷酸酶处理ppiczb-bglii+bamhi片段，三片段连接后得到质粒pmoxz-1(seq id no：28)。
113.引物序列(seq id no：7)
[0114]5’-
accaaaagatctgtcgacgcggag-3；
[0115]
引物序列(seq id no：8)
[0116]5’-
cttggctacatatgatcgatcgtgtacacgtttcgaatttgtttttgtacttt-3’；
[0117]
引物序列(seq id no：10)
[0118]5’-
gcccgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaa-3’[0119]
引物序列(seq id no：12)
[0120]5’-
tgggggatccgcacaaacgaa-3’[0121]
pcr序列(seq id no：26)
[0122]
accaaaagatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgtagccaag
[0123]
pcr序列(seq id no：27)
[0124]
gcccgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatccccca
[0125]
pmoxz-1序列(seq id no：28)
[0126]
agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggc
aggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaat
gctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc
[0127]
通过pcr方式，采用seq id no：7,9所示序列为引物，汉逊酵母基因组dna为模板，扩增得到mox启动子插入片段(seq id no：29)；采用seq id no：11-12所示序列为引物，ppiczb质粒为模板，扩增得到含aoxtt终止序列(seq id no：30)的片段。bglii+hindiii联合酶切处理mox启动子插入片段，hindiii+bamhi处理aoxtt终止序列片段，bglii+bamhi处理ppiczb，再用小牛肠碱性磷酸酶处理ppiczb-bglii+bamhi片段，三片段连接后得到质粒pmoxz-2(seq id no：31)。
[0128]
引物序列(seq id no：9)
[0129]5’-
tcaagtcaagcttcacgtggctagctttgtttttgtacttt-3’；
[0130]
引物序列(seq id no：11)
[0131]5’-
aaacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttct-3’；
[0132]
pcr序列(seq id no：29)
[0133]
accaaaagatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgacttga
[0134]
pcr序列(seq id no：30)
[0135]
aaacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatccccca
[0136]
pmoxz-2序列(seq id no：31)
[0137]
agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattag
aaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc
[0138]
将pmoxz-2质粒表达盒通过bglii和bamhi酶切后连接的方式(参见invitrogen ppiczb操作手册提到的体外多拷贝质粒构建方案)插入bglii处理的pmoxz-1质粒，得到带有zeocin抗性的汉逊酵母双表达质粒pmmz(seq id no：32)(图1)。
[0139]
pmmz序列(seq id no：32)
[0140]
agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaa
aacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttc
[0151]
pcr序列(seq id no：33)
[0152]
cccttagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagaccgca
[0153]
pcr序列(seq id no：34)
[0154]
gggtatcgtcaccgcggccggctacagcacttgaagtcggacagtgagtgtagtcttgagaaattctgaagccgtatttttattatcagtgagtcagtcatcaggagatcctctacgccggacgcatcgtggccgacctgcagggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatcttaagccaata
[0155]
pmoxzg序列(seq id no：35)
[0156]
agatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaa
ttgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgccccccccccccctgcaggtcggccacgatgcgtccggcgtagaggatctcctgatgactgactcactgataataaaaatacggcttcagaatttctcaagactacactcactgtccgacttcaagtgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgacc
ggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc
[0157]
通过pcr方式，采用seq id no:17-18所示序列为引物，pmoxzg为模板，扩增得到puc复制子+tef1启动子+em7启动子+g418抗性基因片段(seq id no：36)；bamhi酶切处理puc复制子+tef启动子+em7启动子+g418抗性基因片段，bamhi+bglii联合酶切处理pmmz质粒(剔除原pmmz质粒的zeocin抗性表达盒和puc复制子)，两片段连接后得到带有g418抗性的汉逊酵母双表达质粒pmmg(seq id no：37)(图2)。
[0158]
引物序列(seq id no：17)
[0159]5’-
gttggatcctcgatcacatgtgagc-3’[0160]
引物序列(seq id no：18)
[0161]5’-
aaaggatcctgaggtctgcctcgt-3’[0162]
pcr序列(seq id no：36)
[0163]
gttggatcctcgatcacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgt
accacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcaggatccttt
[0164]
pmmg序列(seq id no：37)
[0165]
ggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgc
taccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcctcgatcacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccg
gtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctca
[0166]
实施例2构建6l1-11l1-pmmg双表达质粒和16l1-18l1-pmmz双表达质粒
[0167]
2.1hpvl1双表达质粒构建
[0168]
编码hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1的dna序列如seq id no：1-4，由苏州金唯智公司合成，密码子使用频率参考酵母偏爱性密码子，连接在金唯智公司提供的通用克隆质粒puc57上，分别得到hpv6l1-puc57、hpv11l1-puc57、hpv16l1-puc57、hpv18l1-puc57。分别将hpv6 l1、hpv11 l1插入pmmg质粒，将hpv16 l1、hpv18 l1基因插入pmmz质粒。
[0169]
2.2 hpv6 l1/hpv11 l1双表达质粒构建
[0170]
通过pcr方式，采用seq id no:19-20所示序列为引物，hpv11l1-puc57质粒为模板，扩增得到hpv11 l1片段(seq id no：38)；bstbi+sbfi联合酶切处理hpv11 l1片段和pmmg质粒，两片段连接后得到11l1-pmmg(seq id no：39)。
[0171]
通过pcr方式，采用seq id no:21-22所示序列为引物，hpv6l1-puc57质粒为模板，扩增得到hpv6 l1片段(seq id no：40)，nhei+noti联合酶切处理hpv6 l1片段和11l1-pmmg质粒，两片段连接后得到6l1-11l1-pmmg(seq id no：41)(图3)。
[0172]
2.3 hpv16 l1/hpv18 l1双表达质粒构建
[0173]
通过pcr方式，采用seq id no:19、23所示序列为引物，hpv16l1-puc57质粒为模板，扩增得到hpv16 l1片段(seq id no：42)；bstbi+sbfi联合酶切处理hpv16 l1片段和pmmz质粒，两片段连接后得到16l1-pmmz(seq id no：43)。
[0174]
通过pcr方式，采用seq id no:24-25所示序列为引物，hpv18l1-puc57质粒为模板，扩增得到hpv18 l1片段(seq id no：44)，nhei+noti联合酶切处理hpv18 l1片段和16l1-pmmz质粒，两片段连接后得到16l1-18l1-pmmz(seq id no：45)(图4)。
[0175]
引物序列(seq id no：19)
[0176]5’-
cggacaaattcgaaacgatgt-3’[0177]
引物序列(seq id no：20)
[0178]5’-
acagaaacctgcaggctattactttttggtc-3’[0179]
引物序列(seq id no：21)
[0180]5’-
aatcgctagcatgtggagaccatctg-3’[0181]
引物序列(seq id no：22)
[0182]5’-
ttggtaatgcggccgcctattatctcttggtc-3’[0183]
引物序列(seq id no：23)
[0184]5’-
tgcttcctgcaggctattacagttttctc-3’[0185]
引物序列(seq id no：24)
[0186]5’-
attcgctagcatggctctgtggagac-3’[0187]
引物序列(seq id no：25)
[0188]5’-
ttccttatgcggccgctattactttctagct-3’[0189]
pcr序列(seq id no：38)
[0190]
cggacaaattcgaaacgatgtggagaccatctgactcgaccgtctacgttcctccacctaacccagtctccaaagtggttgctactgatgcctacgtcaagagaaccaacatcttctaccacgcctcttcgtccagattgctggcagttggacatccttactattccatcaagaaagttaacaagaccgtggtccctaaggtttcgggctatcagtacagagtgttcaaggtcgttctgccagaccctaacaagtttgccttgccagattcctcgctgttcgaccctaccactcaaagactggtttgggcttgcacgggtttggaagtgggcagaggacaaccactgggtgtcggagtttccggccatccattgctgaacaagtacgacgatgttgagaactcgggtggatacggtggcaatccaggacaagacaacagagtgaatgtcggcatggactacaagcaaacccagctgtgcatggttggttgtgcaccacctctgggtgaacattggggaaagggcactcagtgctccaacacctctgttcagaatggtgactgtcctccactggagctgatcacctcggttattcaggatggagacatggtggacactggcttcggtgcaatgaactttgccgacttgcagaccaacaagtccgatgttccattggacatttgcggcactgtgtgcaaatatcctgactacctgcagatggctgcagatccatacggtgacagactcttcttctacctgagaaaggagcagatgttcgccagacacttctttaacagagctggcaccgttggtgagcctgttccagatgacctgttggtgaagggtggaaacaatagatcctctgttgcctcgtccatctacgtccacaccccatcgggctctctggtgtcctcggaggcccaactgttcaacaagccttactggctccagaaggcccaaggacacaacaatggcatctgctggggaaaccacctgttcgtcaccgttgtggacacgactagatccaccaacatgactttgtgtgcctctgtttccaagtcggctacctacacgaactcggactataaggagtacatgagacatgttgaagagttcgacctgcagtttatcttccagctctgctccattaccttgtcggcagaagtgatggcctacatccacacgatgaacccatccgtcttggaagactggaacttcggtctgtctccacctccaaatggcaccctggaagacacgtacagatatgtgcagtcgcaagccatca
cctgtcagaaaccaactcctgaaaaggagaaacaggacccatacaaggatatgtcgttctgggaggtcaacctgaaggagaagttctcttcggaactggaccagttcccattgggaagaaagttcctgctccagtctggttatagaggaagaacctccgcaagaactggcatcaagagacctgccgtgtcgaagccatccaccgctcctaagagaaagagaacgaagaccaaaaagtaatagcctgcaggtttctgt
[0191]
11l1-pmmg序列(seq id no：39)
[0192]
ggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacg
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[0193]
pcr序列(seq id no：40)
[0194]
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[0201]
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[0202]
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[0203]
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[0204]
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[0205]
6l1-11l1-pmmg与16l1-18l1-pmmz酶切鉴定结果见图5，从结果可知，6l1-11l1-pmmg经nhei+noti酶切处理后可得到约7719bp+1513bp片段，经bstbi+sbfi酶切处理后可得到约7710bp+1522bp片段；16l1-18l1-pmmz经nhei+noti酶切处理后可得到约7322bp+1533bp片段，经bstbi+sbfi酶切处理后可得到约4496+2825+1534bp片段。酶切结果与理论条带相符。
[0206]
实施例3四表达菌株构建与筛选
[0207]
基于实施例2中构建的6l1-11l1-pmmg双表达质粒和16l1-18l1-pmmz双表达质粒，通过两次转化、两次筛选(两种筛选标记)的方法将两种双表达质粒整合于汉逊酵母宿主菌cbs4732(atcc 34438)，得到同时表达hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1的重组工程酵母菌株，具体步骤如下：
[0208]
3.1 hpv16 l1/hpv18 l1双表达菌株构建与筛选
[0209]
将重组构建的16l1-18l1-pmmz质粒由bglii酶线性化，电转汉逊酵母cbs4732，电转条件为1500v，120ω，50μf。电转后菌液涂布ypd平板(200μg/ml zeocin)，37℃过夜倒置培养。挑取部分克隆划线ypd平板(1500μg/ml zeocin)，37℃倒置培养2天。挑取生长情况较好的数株接种于ypd液体培养基，37℃振荡培养一天，离心收集菌体后弃去ypd培养基，加入bmmy培养基(0.5％甲醇)，37℃振荡诱导培养48小时。收集菌体，玻璃珠剧烈振荡破碎后收集破菌上清，通过斑点杂交法检测分别检测hpv16 l1和hpv18 l1表达情况(图6)，检测用抗体分别为hpv16 l1型别特异性中和单抗h16.v5和hpv18 l1型别特异性中和单抗h18.j4中和单抗(宾夕法尼亚州立大学neil christensen实验室提供)。挑取hpv16 l1和hpv18 l1表达情况均较理想的一株保存并用于进一步构建，该菌株命名为dual-l1-hp。
[0210]
3.2 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1四表达菌株构建与筛选
[0211]
将重组构建的6l1-11l1-pmmg质粒由bglii酶线性化，电转实施例3.1构建得到的dual-l1-hp，电转条件为1500v，120ω，50μf。电转后菌液涂布ypd平板(200μg/ml g418)，37℃过夜倒置培养。挑取部分克隆划线ypd平板(1200μg/ml g418)，37℃倒置培养2天。挑取生长情况较好的数株接种于ypd液体培养基，37℃振荡培养一天，离心收集菌体后弃去ypd培养基，加入bmmy培养基(0.5％甲醇)，37℃振荡诱导培养48小时。收集菌体，玻璃珠剧烈振荡破碎后收集破菌上清，通过斑点杂交法检测分别检测hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1、hpv18 l1表达情况(图7)，检测用抗体分别为hpv6 l1型别特异性中和单抗h6.m48、hpv11 l1型别特异性中和单抗h11.h3中和单抗、hpv16 l1型别特异性中和单抗h16.v5中和单抗、hpv18 l1型别特异性中和单抗h18.j4中和单抗。挑取hpv6 l1、hpv11l1、hpv16 l1、hpv18 l1表达情况均较理想的一株保存，该菌株命名为quadri-l1-hp。
[0212]
实施例4 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1抗原制备
[0213]
将quadri-l1-hp接种于500ml ypd培养基，37℃振荡培养16～20小时，培养后菌液
作为发酵种子菌液以1：15的比例接种于biotech-7jg-7000a发酵罐(保兴生物)，培养基为基础盐bsm。发酵初始温度设定37℃，初始ph 5～6，转速300rpm，通气量0.5vvm，do值100％，添加ptm1痕量盐类。初始增殖阶段培养20～24小时左右，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压和补加纯氧维持溶氧值20～40％。当菌体湿重达到60～90g/l时，补加50％甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值20～40％，补加4～8小时。检测菌体湿重增加到100～200g/l时，停止补料。将温度设定在30～37℃，ph值控制调为6～7，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100ml/min。维持溶氧值>20％，温度设定在30～37℃，ph值控制为6～7，诱导40小时发酵结束。4℃，8000rpm，离心10分钟收集菌泥，-20℃冻存。按1：3加入破菌缓冲液，1200bar，高压匀浆破碎4次。破碎后悬浊液以4℃，8000rpm，离心30min收集上清液。破菌上清液使用20％～50％蔗糖梯度超离，4℃，40000rpm，超离4小时，收集40％梯度样品，超滤去除蔗糖，得到quadri-l1纯化样品。
[0214]
实施例5 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1抗原含量检测
[0215]
夹心法elisa检测quadri-l1中hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv18 l1含量，包被抗体为自制兔多抗，检测抗体为型别特异性中和单抗：使用hpv6 l1兔多抗和h6.m48中和单抗对hpv6 l1含量进行定量；使用hpv11 l1兔多抗(和h11.h3中和单抗对hpv11 l1含量进行定量；使用hpv16 l1兔多抗和h16.v5中和单抗对hpv16 l1含量进行定量；使用hpv18 l1兔多抗和h18.j4中和单抗对hpv18 l1含量进行定量。
[0216]
操作步骤简述如下：向96孔酶标板中分别加入不同型别的自制兔多抗，4℃包被过夜；弃去包被液，洗涤，37℃封闭2小时；加入quadri-l1纯化样品和对应的hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv18 l1标准品(对倍稀释6～12个梯度)，37℃放置1小时；对应兔多抗型别，分别加入不同的型别特异性中和单抗，37℃放置1小时；加入hrp标记的羊抗鼠igg，37℃1小时；加入tmb显色液，37℃放置5～20分钟；加入终止液终止显色反应，酶标仪测定450nm吸收值。根据hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv18 l1标准品的读数制作标准曲线，确定quadri-l1纯化样品中相应的抗原含量(表1)。
[0217]
表1quadri-l1纯化样品中hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv18 l1抗原含量检测(夹心法elisa)
[0218]
quadri-l1抗原含量抗原含量(μg/ml)hpv6 l16.984hpv11l115.201hpv16l17.112hpv18l15.018
[0219]
实施例6 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1颗粒结构确证
[0220]
透射电子显微镜(tem)观察quadri-l1纯化样品，结果如图8，quadri-l1纯化样品形成了颗粒直径约55～70nm的vlp。
[0221]
实施例7 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1疫苗制备
[0222]
将quadri-l1纯化样品吸附磷酸铝佐剂，制备得到quadri-l1疫苗。
[0223]
实施例8 hpv6 l1/hpv11 l1/hpv16 l1/hpv18 l1疫苗免疫原性测定
[0224]
取6～8周龄的balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，scxk(京)2016-0011),每组8只，分为6组，分别对应5μg、2μg和0.5μg hpv16 l1的quadri-l1，另取1组免疫
未吸附抗原蛋白的空白氢氧化铝佐剂。免疫程序：0天、14天、28天三次免疫(皮下注射)，42天处死小鼠，眼球取血，4000g离心10分钟，取血清-20℃冻存。
[0225]
elisa检测鼠血清转阳率，方法简述如下：向96孔酶标板中分别加入hpv6 l1、hpv11l1、hpv16 l1和hpv18 l1标准品，4℃包被过夜；弃去包被液，洗涤，37℃封闭2小时；加入对倍稀释的鼠血清，37℃放置1小时；弃去鼠血清，洗涤，加入hrp标记的羊抗鼠igg，37℃1小时；加入tmb显色液，37℃放置5～20分钟；加入终止液终止显色反应，酶标仪测定450nm吸收值，以8个阴性对照血清(免疫铝佐剂的鼠血清)的450nm吸收值的平均值加上3倍标准差(sd)设定为cutoff值。稀释后待检血清的od450值大于cutoff值的为阳性，否则为阴性。取所有待检血清最高的阳性稀释倍数作为血清抗体滴度值，分别计算各组的抗体几何平均滴度(gmt)，结果如图9。
[0226]
结果显示，quadri-l1免疫后血清可诱导hpv6 l1、hpv11 l1、hpv16 l1和hpv18 l1抗体，抗体滴度水平相近，具有一定的量效关系。
[0227]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。