本发明涉及一种靶向型小分子荧光探针化合物，更具体地说是一种基于靶向肿瘤细胞表面特异性受体的近红外化合物对原发性卵巢癌的重要标志物β-半乳糖苷酶（β-gal）的检测，属于荧光传感器探针化合物领域。
背景技术：
β-半乳糖苷酶（β-gal）是一种典型的糖苷酶，可以催化乳糖水解为产生能量的关键成分半乳糖和葡萄糖，对生物体起到了关键性的作用。异常表达的β-gal被认为是潜在的癌症生物标志物，尤其是卵巢癌和结肠直肠癌，准确检测β-gal的活性对于早期诊断癌症和预测治疗效果具有非常重要的意义。但是大多数用于β-gal检测的可激活成像探针，是通过简单地将可识别β-gal的底物αd-半乳糖（αd-gal）与淬灭的荧光团相连接而设计的，导致这些探针化合物在活体成像时受到生理条件下溶解度小和递送至肿瘤组织效率低等限制。因此，开发一种能够选择性地递送至肿瘤中并且被β-gal激活的成像探针，将为与β-gal相关的疾病诊断和病理生理学的研究做出很大贡献。
在过去的几年中，已经开发了许多能够靶向癌细胞中标记物的分子成像探针，为早期检测癌症和快速监测治疗提供了重要的工具。这些成像探针根据机理通常主要分为两种类型。第一种类型的探针通常利用受体介导的主动递送机制，通过细胞摄取在癌细胞中积累和保留。第二种类型称为可激活成像探针，依赖于对癌细胞中识别分子触发的特定成像信号。然而，由于存在某些类似于癌细胞特性的正常（非肿瘤）细胞的交叉反应性，它们仍具有较低的特异性。为了克服这一局限性，提出了构建同时包含两种不同靶向配体分子的成像探针以增强癌细胞摄取的策略。
本文中，设计并合成了一种新的靶向肿瘤并被β-gal激活的近红外荧光探针（rn-gal）。该探针通过引入αvβ3-整合素受体靶向的配体c-rgd，特异性检测活体小鼠肿瘤中β-gal的活性，探针化合物可以被肿瘤细胞通过αvβ3-整合素受体介导的内吞作用选择性地吸收，仅在肿瘤细胞中观察到明显增强的近红外荧光。为活体内的非侵入性肿瘤成像提供了潜在的应用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题：一是提供一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针化合物及其制备方法，所述探针化合物对检测β-半乳糖苷酶具有靶向性高、选择性强、检测速度快，非侵入性活体成像的优点。二是在于提供检测β-半乳糖苷酶的方法，操作方法简单，效果明显。
为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下：
本发明提供一种靶向肿瘤细胞中β-半乳糖苷酶的近红外荧光探针，具有如下分子结构式：
化合物rn-gal
本发明还提供一种用于β-半乳糖苷酶检测的荧光探针化合物的制备方法，步骤包括：
（1）将吲哚衍生物在丁醇和苯的混合溶液中与2-氯-1-甲酰基-3-（羟基亚甲基）化合物反应，得到化合物一；
化合物一
（2）将化合物一和碳酸二叔丁酯反应，得到化合物二；
化合物二
（3）将化合物二和4-氯-1,2-二羟基苯反应后，合成化合物三；
化合物三
（4）将化合物三与三氟乙酸反应，脱去boc基团，合成近红外荧光染料蓝色化合物，即化合物四；
化合物四
（5）将染料化合物四和n-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯反应，合成化合物五；
化合物五
（6）将化合物五与2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-d-吡喃糖溴化物反应，并在甲醇钠中水解，得到化合物六；
化合物六
（7）将化合物六与c-rgd-sh在dmf中搅拌，得到近红外荧光探针化合物rn-gal的蓝色产物。
本发明的优点:
本发明的荧光探针，荧光发射波长在710nm，是一种近红外荧光探针。
本发明的荧光探针，具有快速响应β-半乳糖苷酶的特性，反应后荧光强度显著提高了240倍。
本发明的荧光探针，通过细胞成像可以用于区分正常细胞和过表达β-半乳糖苷酶的肿瘤细胞。
本发明的荧光探针，可以静脉注射到小鼠体内，通过αvβ3-整合素受体介导，主动递送进入肿瘤组织。
本发明的荧光探针ph和温度的适用范围较宽，有利于生命系统中β-半乳糖苷酶的检测。
本发明的荧光探针对β-半乳糖苷酶有很好的选择性和很强的抗干扰能力。在可能干扰的离子、生物分子，活性酶等的存在下都不影响探针分子对β-半乳糖苷酶的响应。
因此，本发明是一种非侵入性，靶向肿瘤细胞，可对β-半乳糖苷酶进行原位、实时监测，且应用范围广泛的检测试剂。在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种用于β-半乳糖苷酶检测的荧光探针化合物的制备方法，步骤包括：
1）化合物一的合成：
将2-氯-1-甲酰基-3-（羟基亚甲基）化合物（1.2mmol，1eq）和吲哚衍生物（3mmol，2.5eq）溶于30ml丁醇/苯（5：2）溶液中，经回流搅拌后，用分水器除去水。将反应溶液在80℃下再搅拌8小时。真空蒸发除去溶剂后，将剩余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用ch2cl2/ch3oh（20∶1至1∶1）作为洗脱剂，得到化合物一，为绿色固体，产率70％。
2）化合物二的合成：
向化合物一（0.5mmol，1eq）的乙醇溶液中，加入碳酸二叔丁酯（1.2mmol，2.4eq）和tea（1.2mmol，2.4eq），将混合物在室温下持续搅拌3小时。减压蒸发除去溶剂，并将剩余物溶于乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤，并用无水na2so4干燥。减压蒸发除去溶剂，得到化合物二，其直接用于下一步。
3）化合物三的合成：
将4-氯-1,2-二羟基苯（5mmol，1eq）和tea（2.5mmol，0.5eq）溶于5.0ml无水dmf中，将溶液在室温下搅拌，并保持在氮气气氛下20分钟，向其中滴加2.0ml溶解在无水dmf中的化合物二。随后将溶液加热至85℃，并搅拌6小时。减压蒸发除溶剂，并将剩余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用ch2cl2/ch3oh（80：1）作为洗脱剂，得到化合物三，为蓝绿色固体，其直接用于下一步。
4）化合物四的合成：
化合物三与二氯甲烷/三氟乙酸混合物（1：1，20ml），于室温下反应1小时，以脱去boc基团。减压蒸发除溶剂，加入乙醚，过滤后收集沉淀物，得到为蓝色固体的近红外荧光染料化合物四，产率为38%。
5）化合物五的合成：
将化合物四（0.5mmol，1eq），n-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯（0.9mmol，1.8eq）和tea（0.5mmol，1eq）溶解在10ml无水thf中，并将混合物在室温氮气气氛下搅拌2小时。反应完成后，减压蒸发除溶剂，并将剩余物通过硅胶柱色谱法纯化，利用ch2cl2/ch3oh（80∶1至20∶1）作为洗脱剂，得到化合物五，为蓝色固体，产率为85%。
6）化合物六的合成：
将化合物五（1.5mmol，1eq）与碘化钠（1.9mmol，1.25eq），溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-d-吡喃糖溴化物（1.1mmol，0.7eq），室温下搅拌5h,后升温至85℃回流10h。用tcl板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水mgso4干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，得到化合物直接用于下一步。向产物的无水甲醇溶液中滴加甲醇钠（3mmol，2eq）溶液，使反应混合物在室温下搅拌6小时。利用盐酸将ph调节至中性，反应完全后，用二氯甲烷萃取溶液，有机相减压蒸发，通过硅胶色谱纯化残余物，得到化合物六，产率为55%。
7）化合物rn-gal的合成：
将化合物六（0.02mmol，1eq）和c-rgd-sh（0.028mmol，1.4eq）溶解在8mldmf中，并在室温下搅拌1小时。得到化合物rn-gal，为蓝色固体，产率为70%。
实施例2
探针化合物rn-gal对β-gal紫外吸收和荧光发射的时间响应变化
取实施例1合成的rn-gal制备5μm探针溶液，加入β-gal（5u/ml）的标准溶液，测量其紫外吸收和荧光性质。在608nm处的吸收峰逐渐降低，同时在692nm处出现新的吸收峰，伴随着紫外可见吸收的红移。以625nm为激发光，在710nm处的荧光发射也随着时间的增加而增加，并且在60分钟后达到最大荧光强度。通过荧光同步扫描，经β-gal激活的探针rn-gal在710nm处的最大荧光约为反应前的240倍。
实施例3
探针化合物rn-gal的荧光线性范围测定
取实施例2中荧光探针溶液（5μm），分别加入β-gal（0-10u/ml），进行荧光检测（λex=625nm），表明探针在β-gal浓度0-5u/ml范围内呈线性关系，线性相关系数为r2=0.99863。
实施例4
探针化合物rn-gal对肿瘤细胞中其他代表性蛋白酶的选择性
取实施例2中荧光探针溶液（5μm），用抑制剂d-半乳糖（50μm）进行预处理。分别加入100eq的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的β-gal标准溶液，在37°c下反应30min后以625nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，可以发现，其他干扰物质对化合物rn-gal的荧光几乎没有影响，而β-gal的加入使化合物rn-gal的荧光显著增强。
实施例5
探针化合物rn-gal对活细胞中β-gal的荧光成像检测
将u87mg细胞与rn-gal（5μm）孵育不同的时间（0、1、2、4、6h），并进行细胞内近红外荧光成像。荧光强度随孵育时间的增加而增加，孵育4小时后达到最大值。这些结果表明探针rn-gal可以被激活并进入u87mg细胞。
上述仅为本发明的优选具体实施方式，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。