一种CD3特异性慢病毒的构建及其应用

本发明属于医学生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种cd3特异性慢病毒的构建及其应用。
背景技术：
：当今癌症发病风险处于高水平，癌症患者不断增加。如果不采取相应的措施，预计到2020年，每年癌症新增患者将达到1500万人。car-t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-tcells)疗法作为一种新的肿瘤治疗策略倍受关注。特别是在治疗如难治性前b淋巴细胞白血病(refractorypre-bcellacutelymphoblasticleukemia)、弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma)等血液系统疾病上取得了巨大的突破，各种实体瘤中的治疗和研究也在不断的进展。novartis公司的kymriahtm和gilead公司的yescartatm先后在2017年的8月和10月被美国食品药品监督管理局(foodanddrugadministration，fda)批准上市，分别批准应用于儿童急性淋巴细胞白血病(all)和成人弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。传统的二代car(chimericantigenreceptors)通常是由单链抗体片段(scfv)、铰链和跨膜区以及衍生自cd3ζ链和cd28或4-1bb的胞内信号区构成。肿瘤的一个主要免疫逃避机制是肿瘤细胞丢失mhc(majorhistocompatibilitycomplex)相关抗原的表达，car-t细胞摆脱了mhc的限制，从而增强了其抗肿瘤活性。car-t细胞与相应的抗原结合后，活化、增值并杀伤肿瘤细胞，靶细胞耗竭后在胞内信号的调节下，car-t细胞水平大幅下降。一些临床试验发现，功能性的anti-cd19的car-t细胞可以在患者体内潜伏多年。换而言之，记忆性anti-cd19car-t细胞可以为患者提供长久的肿瘤免疫。car-t细胞疗法在实体瘤上的治疗效果尚不能让人满意。肿瘤微环境中的不利因素如免疫抑制靶点(pd-l1、lag3等)、肿瘤代谢环境改变和调解性t细胞浸润都使car-t细胞的功能受到抑制。脱靶效应、神经毒性和细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome,crs)等毒副反应也给car-t细胞疗法的临床应用带来挑战。但car-t细胞疗法总体上来说是行之有效的肿瘤治疗新策略。特别是在具有特定相关抗原的肿瘤，免疫治疗是一种能够很有前景的方案，fda批准了用于白血病car-t细胞治疗，随着技术的进步，实体肿瘤上的应用也只是时间问题。car-t细胞疗法是一种高度个体化的精准医疗，整个治疗流程从患者的t细胞开始，在体外经过一系列复杂的基因改造和体外扩增培养，最终回输到患者体内。car的稳定表达对于维持car-t细胞功能至关重要。虽然治疗原理已得到验证，但整个技术实现的过程和相关技术、人员和设备的配置要求极高。临床环境复杂多变，肿瘤患者数量庞大，在现有的技术条件下，将car-t细胞疗法应用于大规模临床实践显得极为困难。有人尝试构建能与患者hla匹配的同种异体car-t细胞，但即使这种尝试获得成功，car-t细胞的制备仍是一个复杂的技术过程。慢病毒(lentiviralvector,慢病毒)或γ-逆转录病毒载体是目前临床最常用的基因工程载体。这些基因工程载体能高效、稳定的将目的基因转染到原代细胞(包括一些难以转染的细胞)和细胞系，并稳定表达目的基因。慢病毒与γ-逆转录病毒载体相比的优势在于可以不像γ-逆转录病毒载体需要依赖于细胞分裂的窗口期将目的基因整合到真核细胞基因组。通过使用其他病毒或融合蛋白的包膜对慢病毒进行假型化改造，可以生产出具有细胞类型特异性的病毒颗粒。我们通过改造慢病毒包装体系中的编码包膜蛋白的基因，使慢病毒病毒颗粒具有cd3的特异性。car-t细胞治疗的过程复杂繁琐，制备耗时长，使car-t细胞疗法难以普及，价格高昂。car-t细胞在体外制备的过程中，患者hpbmcs(humanperipheralbloodmononuclearcells)中的t细胞活化后，使用慢病毒载体转染car基因，包膜蛋白vsv-g非特异性感染，导致非效应性t细胞表达car，回输回患者体内时产生竞争性抑制或其他不可预期的免疫反应可能。因此，本领域迫切需要构建一种cd3特异性慢病毒，针对cd3+t细胞群，表达car，产生效应性car-t细胞，从而提高car-t细胞制备效率和精确性，避免非效应性t细胞表达car；同时再体内直接生成car-t细胞。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种cd3特异性慢病毒，特异性感染cd3+t细胞群，并将car基因整合入细胞基因组，使其稳定表达car，产生效应性car-t细胞，从而提高car-t细胞制备效率和精确性，避免非效应性t细胞表达car；同时再体内直接生成car-t细胞。本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述蛋白具有式i所示的结构：l1-z1-scfv-z2-tm-z3(i)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；l1为任选的信号肽序列；z1为任选的标签多肽元件；scfv为靶向细胞标志物的抗原结合结构域，；z2为麻风病毒血凝素蛋白(measlesvirushemagglutininprotein)；tm为跨膜结构域；z3为胞内结构域。在另一优选例中，所述细胞标志物包括正常细胞的特异性标志物。在另一优选例中，所述细胞标志物选自下组：cd3、cd8、cd4、cd79、cd19、cd21、cd81、或其组合。在另一优选例中，所述细胞标志物包括肿瘤细胞标志物。在另一优选例中，所述细胞标志物选自下组：her2、b7h3、trkc、egfr、或其组合。在另一优选例中，所述靶向细胞标志物的抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。在另一优选例中，所述抗原结合片段是fab或scfv或单结构域抗体sdab。在另一优选例中，所述式i结构为从n端至c端。在另一优选例中，所述靶向细胞标志物的抗原结合结构域的结构如下式a或式b所示：vh1-vl1(a)；或vl1-vh1(b)；式中，vh1为抗细胞标志物抗体的重链可变区；vl1为抗细胞标志物抗体的轻链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。在另一优选例中，所述的式a和b的结构为从n端至c端。在另一优选例中，所述的vl和vh通过一柔性接头相连。在另一优选例中，所述的柔性接头为1-9个(较佳地6或9个，更佳地，3个)连续的(g)4s所示的序列。在另一优选例中，所述的vl和vh各自独立地为鼠源的、人源的、兔源的或人的。在另一优选例中，vl的氨基酸序列包括选自seqidno.:1所示的vl或其衍生vl(或其活性片段)。在另一优选例中，vh的氨基酸序列包括选自seqidno.:2所示的vh或其衍生vh(或其活性片段)。在另一优选例中，所述的vh链括以下三个互补决定区cdr：seqidno:3所示的cdr1(gytftryt)，seqidno:4所示的cdr2(inpsrgyt)，和seqidno:5所示的cdr3(aryyddhysldy)。在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留cd3结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。在另一优选例中，所述的vl链的互补决定区cdr由cdr1'、cdr2'和cdr3'组成。在另一优选例中，所述的vl链括以下三个互补决定区cdr：seqidno:6所示的cdr1'(ssvsy)，seqidno:7所示的cdr2'(dts)，和seqidno:8所示的cdr3'(qqwssnpft)。在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留cd3结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。在另一优选例中，所述的scfv为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。在另一优选例中，所述l为选自下组的蛋白的信号肽：免疫球蛋白、mhc分子、细胞因子(如il-2)、能够有效引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链、或其组合。在另一优选例中，所述的tm为选自下组蛋白的跨膜区：麻风病毒血凝素蛋白。在另一优选例中，所述tm的氨基酸序列如seqidno.:9所示。在另一优选例中，所述胞内结构域为选自下组的蛋白的胞内结构域：麻风病毒血凝素蛋白。在另一优选例中，所述胞内结构域的氨基酸序列如seqidno.:10所示。在另一优选例中，所述的z2包括全长蛋白或蛋白片段。在另一优选例中，z2包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的z2来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。在另一优选例中，所述z2还包括麻风病毒血凝素蛋白的衍生物。在另一优选例中，所述麻风病毒血凝素蛋白的衍生物包括经修饰的麻风病毒血凝素蛋白、氨基酸序列与天然麻风病毒血凝素蛋白同源且具有天然麻风病毒血凝素蛋白活性的蛋白分子、麻风病毒血凝素蛋白的二聚体或多聚体、含有麻风病毒血凝素蛋白氨基酸序列的融合蛋白。在另一优选例中，所述经修饰的麻风病毒血凝素蛋白是peg化的麻风病毒血凝素蛋白。在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然麻风病毒血凝素蛋白同源且具有天然麻风病毒血凝素蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与麻风病毒血凝素蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然麻风病毒血凝素蛋白活性的蛋白分子。在另一优选例中，所述z2的氨基酸序列选自下组：(a)氨基酸序列如seqidno.:11所示的多肽；(b)将seqidno.:11所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地，1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的天然麻风病毒血凝素蛋白衍生物，或其活性片段；(c)序列与seqidno.:11所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的天然麻风病毒血凝素蛋白衍生物，或其活性片段。在另一优选例中，z2的氨基酸序列如seqidno.:11所示。在另一优选例中，所述标签多肽元件选自下组：his-tag、flag-tag、avi-tag、snap-tag、gfp、gst、c-myc、荧光素酶(luciferase)、或其组合。在另一优选例中，所述his标签元件包括6-10个his标签元件，优选6×his标签元件和8×his标签元件。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列选自下组：(a)氨基酸序列如seqidno.:12所示的多肽；(b)将seqidno.:12所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地，1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的融合蛋白的衍生物，或其活性片段；(c)序列与seqidno.:12所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的融合蛋白的衍生物，或其活性片段。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.:12所示。本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：dna序列、rna序列。在另一优选例中，所述的dna序列选自下组：基因组序列、cdna序列。在另一优选例中，所述多核苷酸如seqidno.:13所示。本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。在另一优选例中，所述载体还包含编码t细胞受体、car(嵌合抗原受体)或其他可稳定整合到靶细胞中的核酸序列。本发明第四方面提供了一种基因工程化的重组病毒，所述病毒具有本发明第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述融合蛋白整合于所述病毒的包膜上。在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。在另一优选例中，所述病毒的基因组中具有外源基因。在另一优选例中，所述外源基因包括表达t细胞受体、car(嵌合抗原受体)或其他可稳定整合到靶细胞中的的外源基因。本发明第五方面提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述细胞为可被scfv特异性靶向的真核细胞。在另一优选例中，所述细胞包括cd3+细胞群。在另一优选例中，所述细胞包括jurkat细胞、nk细胞、t细胞。本发明第六方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的重组病毒、和/或本发明第五方面所述的宿主细胞。本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于治疗用基因治疗所治疗的疾病。在另一优选例中，所述用基因治疗所治疗的疾病选自下组：感染性疾病、癌症、遗传性疾病、心血管疾病、或其组合。在另一优选例中，所述癌症选自下组：难治性前b淋巴细胞白血病(refractorypre-bcellacutelymphoblasticleukemia)、弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma)、儿童急性淋巴细胞白血病(all)、或其组合。在另一优选例中，所述遗传性疾病选自下组：血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症、腺苷脱氨酶缺乏症(aadenosinedeaminasedeficiency、ada)及其所致重症联合免疫缺陷症(ada-scid)、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、慢性肉芽肿病(chromosomalgonadaldysgenesis、cgd)、苯丙酮尿症、溶酶体贮积症(lsd)、或其组合。在另一优选例中，所述心血管疾病选自下组：动脉粥样硬化性心脏病、经皮腔内冠状动脉成形术后的再狭窄(rs,restenosis)、心肌梗塞、获得性闭塞性血管病、动脉血栓、心力衰竭、心肌缺血、移植物动脉粥样硬化、高血压、或其组合。在另一优选例中，所述感染性疾病选自下组：艾滋病、类风湿、病毒性肝炎、sars、或其组合。在另一优选例中，所述治疗是通过将本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体直接注射入体内进行的。在另一优选例中，所述本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用量为0.5-50×106tu/ml/kg，较佳地，5-20×106tu/ml/kg，更佳地，8-12×106tu/ml/kg。本发明第八方面提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第四方面所述的重组病毒和任选的赋形剂。在另一优选例中，所述的制剂为药物制剂。在另一优选例中，所述的赋形剂为药学上可接受的赋形剂。本发明第九方面提供了一种治疗疾病的方法，包括：向需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体或本发明第八方面所述的制剂。在另一优选例中，所述施用包括注射。在另一优选例中，所述权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体的用量为0.5-50×106tu/ml/kg，较佳地，5-20×106tu/ml/kg，更佳地，8-12×106tu/ml/kg。在另一优选例中，所述疾病包括用基因治疗所治疗的疾病。在另一优选例中，所述用基因治疗所治疗的疾病选自下组：感染性疾病、癌症、遗传性疾病、心血管疾病、或其组合。在另一优选例中，所述癌症选自下组：难治性前b淋巴细胞白血病(refractorypre-bcellacutelymphoblasticleukemia)、弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma)、儿童急性淋巴细胞白血病(all)、或其组合。在另一优选例中，所述遗传性疾病选自下组：血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症、腺苷脱氨酶缺乏症(aadenosinedeaminasedeficiency、ada)及其所致重症联合免疫缺陷症(ada-scid)、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、慢性肉芽肿病(chromosomalgonadaldysgenesis、cgd)、苯丙酮尿症、溶酶体贮积症(lsd)、或其组合。在另一优选例中，所述心血管疾病选自下组：动脉粥样硬化性心脏病、经皮腔内冠状动脉成形术后的再狭窄(rs,restenosis)、心肌梗塞、获得性闭塞性血管病、动脉血栓、心力衰竭、心肌缺血、移植物动脉粥样硬化、高血压、或其组合。在另一优选例中，所述感染性疾病选自下组：艾滋病、类风湿、病毒性肝炎、sars、或其组合。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了质粒p-cmv-hmo结构图。图2显示了质粒p-cmv-vsvgsalⅰ、bglⅱ双酶切产物电泳结果。图3显示了片段ct△18-tm-h-(g4s)3pcr电泳结果。图4显示了片段ct△18-tm-h-(g4s)3pcr电泳结果。图5显示了片段intron-ct△18pcr电泳结果。图6显示了片段his-βpcr电泳结果。图7显示了片段intron-ct△18-tm-h-(g4s)3overlappcr电泳结果。图8显示了片段(g4s)3-okt3-hisoverlappcr电泳结果。图9显示了p-cmv-hmo不同单克隆菌落pcr电泳凝胶成像结果。图10显示了p-cmv-hmosalⅰ、bglⅱ双酶切结果电泳。图11显示了293ft和jurkat感染hmo组慢病毒48h后荧光镜检结果(各实验组加入75ul病毒原液或培养液)。图12显示了293ft和jurkat感染分别感染vsvg和hmo组慢病毒48h后流式细胞仪检测gfp表达情况结果(jurkat/293ft细胞blank组为加病毒原液进行感染，jurkat/293ft细胞hmo组和vsvg组各组每孔加入500ul相应病毒原液进行感染)。图13显示了hmo组及vsvg组2种慢病毒原液分别感染anti-cd3预处理后的293ft和jurakt，48h后流式检测gfp表达情况。图14显示了hmo组及vsvg组2种慢病毒原液感染jurakt，48h后流式检测gfp表达情况。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，首次构建一种cd3特异性慢病毒，特异性感染cd3+t细胞群，并将car基因整合入细胞基因组，使其稳定表达car，产生效应性car-t细胞，从而提高car-t细胞制备效率和精确性，避免非效应性t细胞表达car；同时再体内直接生成car-t细胞，大大简化了car-t的生产流程，为car-t细胞疗法的应用和推广提供便利，并且本发明的cd3特异性慢病毒可高效转染哺乳动物细胞，转染率可达约20％。此外，本发明还构建一种慢病毒模型，能特异性的靶向表达特定抗原的细胞，转染并表达目的基因序列，是一种可以兼具灵活性和稳定性的基因编辑工具。在此基础上，本发明人完成了本发明。术语为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。如本文所用，“嵌合抗原受体(car)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”也称为“嵌合受体”、“t-body”或“嵌合免疫受体(cir)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。如本文所用，“细胞标志物”可以是肿瘤相关抗原，是指在肿瘤细胞或正常细胞上存在的抗原分子，并非肿瘤细胞所特有，正常细胞可微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达；也可是正常细胞特异性表达的细胞膜分子。如本文所用，"单链可变区片段(scfv)"是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scfv的实例包括经重组dna技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。改造scfv的各种方法是本领域技术人员已知的。如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人cd3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种融合蛋白或携带有融合蛋白基因的载体，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。细胞标志物本发明的细胞标志物可以是肿瘤相关抗原，包括但并不限于her2、b7-h3、trkc。以her2为例。her2是her2蛋白与表皮生长因子受体(egfr)、her-3、her-4等同属i类受体酪氨酸激酶(rtk)超家族，通常称为her家族。它的结构与egfr极其类似,其胞质区的260个氨基酸残基(727-986)与egfr的tk区有95％以上的同源性,故可以认为它是一个被激活的生长因子受体。her-2可与rtk超家族的其他成员之间形成异二聚体,当配体与细胞表面的异二聚体受体复合物包括her2蛋白结合后，导致细胞内酪氨酸激酶的蛋白活化,发生酪氨酸自身的磷酸化,进而引发瀑布式的连锁反应，信号转导经细胞膜和细胞间质至细胞核,激活基因,促进有丝分裂。her-2原癌基因在正常情况下不会引起肿瘤,相反地,还具有重要生理功能,它与其他表皮生长因子受体一起,通过复杂的信号网络调节细胞的生长和分化,在细胞进行生命获得中必不可少。her-2在胎盘、胚胎上皮组织及许多肿瘤细胞中呈高表达,而在正常组织中为阴性或微量表达。体外与动物实验已明确显示her-2基因扩增/蛋白过度表达在致瘤转化和肿瘤发生中起着关键作用。her2诱导肿瘤发生的基本要素为her-2基因的扩增,在一个上皮细胞内产生多于正常的两个基因拷贝,导致her-2基因转录增加,引起her2mrna水平升高,同时her蛋白合成增加,在细胞表面过度表达。her-2过度表达的致瘤作用被认为与以下几个因素相关：一是诱导细胞对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)产生耐受；二是可激活多种信号传导通路,引起基因活化,最终导致细胞增殖；三是因为细胞膜表面her-2蛋白含量增多,her2杂合二聚体数量增多、作用时间延长,导致信号传导(如有丝分裂原活化的蛋白激酶路径)增加,最终导致肿瘤生长。本发明的细胞标志物可以是正常细胞特异性表达的细胞膜分子，包括但并不限于cd3、cd8、cd4、cd79、cd19、cd21、cd81。以cd3为例。cd3是一种蛋白质复合物，它由四个不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物含有一个cd3γ链，cd3δ链，和2条cd3ε链。仅存在于t细胞表面，由6条肽链组成，常与tcr紧密结合形成含有8条肽链的tcr-cd3复合体。抗原结合结构域在本发明中，本发明的抗原结合结构域特异性结合于细胞标志物。在一优选实施方式中，本发明的抗原结合结构域靶向cd3。融合蛋白在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式i所述结构，即含有包括任选的信号肽元件、任选的标签多肽元件、靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域、麻风病毒血凝素蛋白、跨膜结构域、胞内结构域融合而成的多肽。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物，这些活性片段和衍生物能能够特异性结合细胞膜表面蛋白。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在dna聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的dna链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。本发明融合蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列用来表达或生产重组蛋白或携带有重组蛋白的病毒载体。一般来说有以下步骤：(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够生产携带有重组蛋白的病毒载体表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、ns0、cos7、或293细胞的动物细胞等。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用rbcl。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。表a一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。肽接头本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。连接肽的长度一般为0-20个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。为了保证效果，本发明使用的连接肽为15个氨基酸。跨膜结构域本发明的跨膜结构域是指麻风病毒血凝素蛋白的穿膜段。源自天然麻风病毒血凝素蛋白的穿膜段结构，与胞内段协同将麻风病毒血凝素蛋白锚定于宿主细胞膜，并在病毒包装过程中构成病毒的包膜结构。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的跨膜结构域为麻风病毒血凝素蛋白的跨膜结构域。胞内结构域本发明的胞内结构域是指麻风病毒血凝素蛋白的胞内段。源自天然麻风病毒血凝素蛋白的胞内段结构，与穿膜段协同将麻风病毒血凝素蛋白锚定于宿主细胞膜，并在病毒包装过程中构成病毒的包膜结构，无向胞内转到信号功能。在优选的实施方式中，本发明的胞内结构域为麻风病毒血凝素蛋白的胞内段。嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)如本文所用，术语“car-t细胞”、“car-t”、“本发明car-t细胞”均指本发明所述的car-t细胞，本发明car-t细胞可靶向肿瘤细胞表面抗原(优选cd3)，用来治疗肿瘤细胞表面抗原(如cd3)高表达或阳性的肿瘤。car-t细胞较其它基于t细胞的治疗方式存在以下优势：(1)car-t细胞的作用过程不受mhc的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的car基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)car既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)car-t细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。本发明的car-t细胞在体内直接生成，极大的简化了car-t细胞治疗流程。嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)如本文所用，术语“car-nk细胞”、“car-nk”、“本发明car-nk细胞”均指本发明所述的car-nk细胞。本发明car-nk细胞可靶向肿瘤细胞表面抗原(优选cd3)，用于治疗肿瘤细胞表面抗原(如cd3)高表达或阳性的肿瘤。自然杀伤(nk)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的nk细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。与自体car-t细胞相比，car-nk细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与car-t细胞治疗类似。外源t细胞抗原受体如本文所用，外源t细胞抗原受体(tcellreceptor,tcr)为通过基因转移技术从肿瘤反应性t细胞中克隆出tcr的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到t细胞内的tcr。外源tcr修饰的t细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化tcr与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高t细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。合适的启动子的一个例子为u6启动子。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于cmv启动子、类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momu慢病毒启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febsletters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(deliveryvehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(exvivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。制剂本发明提供了一种本发明所述的病毒载体、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述病毒载体的浓度为0.5-50×106tu/ml/kg个病毒载体/kg体重，更优地8-12×106tu/ml/kg个病毒载体/kg体重。在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。本发明的主要优点在于：(1)本发明能够针对cd3+t细胞群，表达car，产生效应性car-t细胞，从而提高car-t细胞制备效率和精确性，避免非效应性t细胞表达car；同时再体内直接生成car-t细胞，大大简化了car-t的生产流程，为car-t细胞疗法的应用和推广提供便利。(2)本发明的病毒载体能特异性的靶向表达特定抗原的细胞，转染并表达目的基因序列，是一种可以兼具灵活性和稳定性的基因编辑工具。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。在本发明中，tu/ml是指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数，tu为“transducingunits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。通用方法1.1构建质粒材料二代三质粒体系包膜蛋白质粒p-cmv-vsvg和携带有anti-cd3scfvdna序列的质粒p-30由福建医科大学免疫治疗研究所提供。改造后的麻风病毒血凝素蛋白通过查阅相关文献获得,比对获得dna序列，送生工生物合成。dh5α、stbl3感受态细胞购于全是金公司。根据质粒p-cmv-hmo自行设计引物后送铂尚生物合成。1.2包装慢病毒(lentiviralvector,慢病毒)材料二代三质粒体系包膜蛋白质粒p-pdch-gfp、p-spax2、p-cmv-vsvg由福建医科大学免疫治疗研究所提供。p-cmv-hmo自行在p-cmv-vsvg基础上改造获得。准备实验用细胞293ft细胞(人胚肾细胞)和jurkat细胞(人外周血白血病t细胞)由福建医科大学免疫治疗研究所提供。1.3主要试剂配方(1)dmem完全培养基：将保存于-20℃的胎牛血清(fbs)置于4℃缓慢溶解，于超净台中分装50ml/管。在450mldmem培养基中分别加入50ml胎牛血清、5mlhepes(238.3mg/ml)，5mll-glutamine(200mm100×)。(2)1640完全培养基：将保存于-20℃的胎牛血清置于4℃缓慢溶解，于超净台中分装50ml/管。在450ml1640培养基中分别加入50ml胎牛血清、5mlhepes(238.3mg/ml)，5mll-glutamine(200mm100×)。(3)peg-80004×慢病毒浓缩液(4×lentivirusconcentratorsolution)：将80gpeg-8000粉末、14.0gnacl溶解于80ml超纯水中，再加入20ml10×pbs(ph7.4)，轻摇至完全溶解，滴定ph至7.0～7.2之间，最后加入超纯水滴定至200ml体积，过0.22μm滤膜，封装后4℃保存。(4)细胞冻存液配置：每7mldmem/1640培养基中加入2mlfbs和二甲基亚砜(dimethy1sulphoxide，dmso)1ml轻吹混匀，现配现用。实施例1慢病毒包膜蛋白质粒的cd3特异性改造(质粒结构如图1所示)1.1麻风病毒血凝素蛋白dna序列及相关引物的合成麻风病毒血凝素蛋白的核酸序列送生工生物合成。设计相关引物见表1，使其能在pcr过程中在h蛋白和okt3之间加入适当的linker(g4s)3。合成的引物4000rpm离心5min后加入适量ddh2o，使引物终浓度为10um。表1.为构建质粒过程中使用引物，测序引物和鉴定引物另提供1.2双酶切获取线性载体p-cmv-vsvg(salⅰ、bglⅱ)以将质粒p-cmv-vsvg与限制性内切酶salⅰ、bglⅱ共孵育2h后，电泳酶切产物，电泳后凝胶成像结果见图2，胶回收线性载体p-cmv-vsvg(salⅰ、bglⅱ)产物，大小约4063bp(basepair)。1.3麻风病毒血凝素蛋白的pcr扩增以生工生物合成的puc57-h为模板，利用设计好的上下游引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过pcr扩增获得线性麻风病毒血凝素蛋白dna序列ct△18-tm-h-(g4s)3，并在序列5’端和3’端各加入20bp同源序列，5’端同源序列序列与片段intron-ct△183’端最后20bp序列相同，3’端同源序列与片段(g4s)3-okt3-his的5’端最前20bp序列相同，片段ct△18-tm-h-(g4s)33’端末尾加入适当长度的linker片段(g4s)3，电泳后凝胶成像结果见图3，胶回收片段ct△18-tm-h-(g4s)3，大小约1876bp。1.4okt3的pcr扩增以p-30质粒为模板，利用设计好的上下游引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过pcr扩增获得线性okt3dna序列(g4s)3-okt3-his，并在序列5’端和3’端各加入20bp同源序列，5’端同源序列序列与片段ct△18-tm-h-(g4s)3的3’端最后20bp序列相同，3’端同源序列与片段his-β的5’端最前20bp序列相同，片段(g4s)3-okt3-his5’端末尾加入适当长度的linker片段(g4s)3，电泳后凝胶成像结果见图4，胶回收片段(g4s)3-okt3-his，大小约781bp。1.5片段intron-ct△18的pcr扩增以p-cmv-vsvg质粒为模板，利用设计好的上下游引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过pcr扩增获得片段intron-ct△18，并在序列5’端和3’端各加入20bp同源序列，5’端同源序列序列与线性载体p-cmv-vsvg(salⅰ、bglⅱ)的3’端最后20bp序列相同，3’端同源序列与片段ct△18-tm-h-(g4s)3的5’端最前20bp序列相同，电泳后凝胶成像结果见图5，胶回收片段intron-ct△18，大小约723bp。1.6片段his-β的pcr扩增以p-cmv-vsvg质粒为模板，利用设计好的上下游引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过pcr扩增获得片段his-β，并在序列5’端和3’端各加入20bp同源序列，5’端同源序列序列与(g4s)3-okt3-his的3’端最后20bp序列相同，3’端同源序列与线性载体p-cmv-vsvg(salⅰ、bglⅱ)5’端最前20bp序列相同，电泳后凝胶成像结果见图6，胶回收片段his-β，大小约269bp。1.7overlappcr获取片段intron-ct△18-tm-h-(g4s)3因为片段intron-ct△183’端和片段ct△18-tm-h-(g4s)35’端有20bp的同源序列，利用设计好的引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过overlappcr连接两个片段，电泳后凝胶成像结果见图7，胶回收片段intron-ct△18-tm-h-(g4s)3，大小约2559bp。1.8overlappcr获取片段(g4s)3-okt3-his-β因为片段(g4s)3-okt3-his3’端和片段his-β5’端有20bp的同源序列，利用设计好的引物和primestarhsdnapolymerase，设计反应温度和体系，通过overlappcr连接两个片段，获得片段(g4s)3-okt3-his-β，电泳后凝胶成像结果如见图8，胶回收片段(g4s)3-okt3-his，大小约1013bp。1.9构建质粒p-cmv-hmo及鉴定线性载体p-cmv-vsvg(salⅰ、bglⅱ)、片段intron-ct△18-tm-h-(g4s)3和(g4s)3-okt3-his-β三个片段之间的5’和3’端之间次序都有20bp同源序列。利用infusion(同源重组技术)将3片段接合，构建环形质粒p-cmv-hmo。转化dh5α感受态大肠杆菌后，设计菌落pcr引物，见表2。菌落pcr鉴定单克隆菌落是否成功转化p-cmv-hmo，成功转化p-cmv-hmo的单克隆菌落pcr能见大小约1624bp大小的片段，菌落pcr电泳后凝胶成像结果见图9。表2.为质粒p-cmv-hmo菌落pcr引物序列如图9所见，1、2和5号单克隆在2000bp左右见清晰条带，考虑成功转化p-cmv-hmo，选1、2和5号菌液小提质粒。1.10质粒p-cmv-hmo和salⅰ、bglⅱ双酶切鉴定小1、2和5号菌液小提质粒，获得质粒p-cmv-hmo1、2和5号单克隆样本，分别与限制性内切酶salⅰ、bglⅱ共孵育2h，如质粒结构正确，会被酶切为4065bp、1304bp、1158bp和800bp四个片段，电泳后凝胶成像结果见图10。1.11质粒p-cmv-hmo设计测序引物送测序质粒p-cmv-hmo1和2单克隆salⅰ、bglⅱ双酶切鉴定大致结构无误，设计好测序引物，选送1、2号p-cmv-hmo单克隆送测序，测序引物序列见表3。表3.为质粒p-cmv-hmo构建完成后测序引物(3)测序结果汇报后与质粒p-cmv-hmo，结构比对，2号单克隆序列正确，无突变，作为构建完成的p-cmv-hmo，备病毒包装使用。实施例2包装生产慢病毒2.1293ft细胞培养293ft细胞由福建医科大学免疫治疗研究所提供，液氮罐中取出复苏，洗去冻存液后加入约5mldmem完全培养基重悬细胞，计数后取约2×106cell293ft细胞于75cm2培养瓶中加入约10mldmem完全培养基，co2恒温培养箱培养。2.2慢病毒pcdh-gfp-vsvg和pcdh-gfp-hmo包装生产转染前一天，消化状态良好的293ft细胞，6孔板铺4孔细胞，按4×105cell/孔均匀铺孔，37℃co2恒温培养箱培养。第二天显微镜下查看细胞，待细胞汇合度在70％-90％之间时可进行转染。转染前2h用dmem完全培养基换液。取2个ep管，分别标记vsvg组(阳性对照)，hmo组(实验组)各组质粒用量及其他组分用量见表4。表4.为包装慢病毒过程中质粒及其他组分用量。载体质粒p-pcdh-gfp：包装质粒p-spax2：包膜蛋白质粒p-cmv-vsvg/p-cmv-hmo为3：2：1。pei用量为质粒总量(ug)的3倍。质粒、和pei用量为6孔板单孔用量。轻吹匀后，室温静置约15mins，将dna/pei混合物加入对应vsvg组、hmo组。轻摇混匀，放置37℃co2恒温培养箱培养。转染后6-8用dmem完全培养基换液，去除pei。转染后48h收获上清至15ml离心管，此为病毒原液。2.3peg8000浓缩慢病毒原液用常规方法将病毒原液浓缩10-20倍，－80℃冻存病毒，也可超离纯化慢病毒，如需工业化扩大生产，也可使用各类型分析柱纯化。将上述病毒包装生长的vsvg组和hmo组病毒原液800g、室温离心10mins，取上清转移至新的15ml离心管。加入1/3原液体积peg8000(4×)慢病毒浓缩液，剧烈晃动混匀60s，将混合物置于macsmixtmtuberotator上，4℃、60rpm旋转摇晃至少4h。加入1/3原液体积peg8000(4×)慢病毒浓缩液，剧烈晃动混匀60s，将混合物置于macsmixtmtuberotator上，4℃、60rpm旋转摇晃至少4h。将充分混匀的peg8000和病毒原液混合物1600g、4℃离心1h。吸弃上清，加入适量dmem无血清培养基/1640无血清培养基重悬沉淀，使病毒原液浓缩10-20倍，－80℃冻存病毒。实施例3慢病毒感染细胞3.1选择合适的细胞选取293ft细胞和jurkat细胞用于实验，293ft细胞和jurkat细胞由福建医科大学免疫治疗研究所提供。293ft细胞是人胚肾细胞，不表达cd3。jurkat细胞是人外周血白血病t细胞，稳定表达cd3。3.2慢病毒感染293ft/jurkat细胞将状态良好的293ft和jurkat细胞，计数后铺24孔板各9孔。加入病毒原液感染对应实验组细胞(详见表5)。表5.为慢病毒感染293ft/jurkat细胞时各实验组慢病毒原液用量细胞vsvg组(ul)hmo组(ul)空白对照293ft7575未加jurkat7575未加空白对照组加入等量dmem完全培养基/1640完全培养基，封口膜密封24孔板，2000rpm、37℃离心90mins，去除封口膜，co2恒温培养箱培养48h。实施例4荧光显微镜及流式细胞仪检测感染不同慢病毒后293ft/jurkat细胞gfp表达情况4.1荧光显微镜检测293ft/jurkat细胞感染hmo组慢病毒48h后gfp表达情况见图11。293ft/jurkat细胞分别感染不同梯度的vsvg组和hmo组病毒原液48h后，将24孔板密封后转移至倒置荧光显微镜下，观察gfp表达情况。如图11示hmo组慢病毒感染稳定表达cd3的jurkat细胞，不感染无表达cd3的293ft细胞，且萤光显示gfp表达较高，说明hmo组慢病毒具有cd3特异性，且具有感染能力。4.2流式细胞仪检测293ft/jurkat细胞感染不同慢病毒后48h后gfp表达情况见图12病毒原液感染293ft/jurkat细胞48h后，分别取各孔细胞至少约1×105至流式管，加入pbs约1ml/管，500g室温离心3分钟后，弃上清，加入500ulpbs，涡旋振荡重悬后，使用流式细胞仪检测gfp表达情况。如图12所示，hmo组慢病毒特异性感染稳定表达cd3的jurkat细胞，几乎不感染不表达cd3的293ft细胞，说明hmo组慢病毒具有cd3特异性，且具有感染能力，vsvg组无特异性感染293ft及jurkat细胞。4.3验证慢hmo组慢病毒感染特异性感染是否由通过识别cd3膜分子实现hmo组及vsvg组2种慢病毒原液分别感染anti-cd3预处理后的293ft细胞(无cd3表达)和jurakt细胞(稳定表达cd3)，48h后检测gfp表达，明确感染能力是否是通过识别cd3膜分子实现。流式结果见图13。如图13所示，anti-cd3预处理使hmo组慢病毒对jurkat细胞特异性感染下降，但也看出hmo组慢病毒整体感染能力较差或不稳定。anti-cd3预处理对vsvg组慢病毒感染jurkat/293ft细胞均无影响。验证了hmo组慢病毒的感染是通过cd3膜分子实现的。4.4重复验证hmo组慢病毒感染jurkat能力实验hmo组慢病毒体现出较好的cd3特异性和感染能力，但在后续的重复实验中感染效率不稳定，为进一步明确hmo组病毒感染能力，病毒原液予peg8000浓缩20倍后加入300ul病毒/孔(24孔板)，感染48h后流式检测gfp表达情况。如图14所示，hmo组慢病毒能特异性感染jurkat，感染率约20％。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>福建医科大学<120>一种cd3特异性慢病毒的构建及其应用<130>p2019-1851<160>28<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aspilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly151015glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysserglythrserprolysargtrpiletyr354045aspthrserlysleualaserglyvalproalahispheargglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserglymetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnprophethr859095pheglyserglythrlysleugluilelysarg100105<210>2<211>121<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metalaglnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargpro151015glyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethr202530argtyrthrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglu354045trpileglytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasngln505560lys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