本发明涉及一种检测猪水泡症状相关病毒的试剂盒，特别涉及一种用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr核酸检测试剂盒，属于生物制品检测和诊断技术领域。
背景技术：
猪水泡病（swinevesiculardisease,svd），又称为猪传染性水泡病，是一种由猪水泡病毒（swinevesiculardiseasevirus,svdv）引起的传染病，svdv属于小rna病毒科肠道病毒属。临床症状为猪鼻颈部、舌面等处发生水泡等。与口蹄疫病毒具有相似的临床症状，通常很难通过临床诊断作出确诊，二者均被我国划分为一类动物疫病，具有严格的检疫防控措施。
口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv）引起的，是偶蹄动物易感的一种急性传染病，可以引起猪、牛、羊等家畜发病，也可以感染70多种野生动物。fmdv属于小rna病毒科口蹄疫病毒属，主要包括七个血清型，a、c、o、asia1和southernafricanterritories(sats)1、2、和3型。在我国，该病被列为一类动物疫病和强制免疫计划疫病，在猪群中具有一定的感染情况。该病的检疫要求严格，处理措施明确，因此就要就对该病的诊断要及时准确，尤其要与其他水泡症状疾病进行鉴别诊断。
塞尼卡谷病毒a（senecavalleyvirus，svv）是一种二十面体无囊膜单股正链不分节段的rna病毒，是小rna病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。svv感染的猪会在鼻吻或口腔等黏膜交界处出现完整或破裂的小水泡，也可能出现跛行、冠状带和蹄壁周围发红或发热，出现溃疡性病变，病猪厌食、嗜睡等症状。2002年，在美国首次报道svv，确认该病毒存在于per.c6细胞培养物中，认为是细胞培养基的污染物。在对先前患有水泡症状的病猪保藏样品进行测序分析发现，自20世纪80年代，美国猪群中便存在该病毒。2002-2015年，猪感染svv的病例只有在美国和加拿大零星发生，但自2015年下半年起，在美国、巴西、哥伦比亚、中国等相继出现了svv感染猪的病例。2015年初，巴西有6个州报告了svv感染的疫情。同年，美国中西部多个地区的猪群发生水疱性疫情，感染猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变，偶见腹泻症状，病情急促，新生仔猪病死率达30%～70%。后经实验室病原学鉴别诊断，排除口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等重要动物疫病，最终确诊为svv感染。2015年5月，我国广东省也发生了svv感染猪的疫情，其特征是鼻吻和蹄冠部出现明显水泡，发病母猪发热、厌食，产房仔猪急性死亡。2016年10月，泰国北部一猪场爆发svv疫情。2017年初，我国福建和河南再次发生猪感染svv的疫情。至此，svv在我国猪群中明确存在，且有蔓延趋势。
针对以上问题，为加强对猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的监测，急需建立一套能够同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的方法，为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的流行病学监测和早期预警提供强有力的技术支撑和储备。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供用于检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒，利用三重荧光rt-pcr技术，可快捷地甄别猪群中猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒。该试剂盒的机理是：以猪水泡病毒衣壳蛋白vp1基因中的保守序列为分子标识设计引物和mgb探针，同时，分别以口蹄疫病毒5’utr基因和猪塞尼卡谷病毒3d基因中的保守序列为分子标识设计引物和mgb探针，建立猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒三重检测体系，最终组装成猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒。
本发明通过以下技术方案来实现：用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒，由a盒和b盒组成，a盒含有裂解液、1.5mleppendorf管，b盒含有阳性对照、阴性对照、rt反应液和pcr反应液；所述pcr反应液中有3对引物和3个mgb探针，引物分别用于扩增猪水泡病毒vp1基因片段、口蹄疫病毒5’utr基因片段和塞尼卡谷病毒3d基因片段，探针分别用于识别猪水泡病毒vp1基因、口蹄疫病毒5’utr基因和塞尼卡谷病毒3d基因。
进一步的，用于检测猪水泡病毒vp1基因的引物对及其探针序列如下：
svdv-f：5’-tgtcgataccattcattg-3’
svdv-r：5’-cgtgtctcatatatagtgtc-3’
svdv-p：5’-fam-catcggcaacgcatacagcat-bhq1-mgb-3’
其中fam为荧光基团，bhq-1为淬灭基团；
用于检测猪口蹄疫病毒5’utr基因的引物对及其探针序列如下：
fmdv-f：5’-ccggttagtactcttaacac-3’
fmdv-r：5’-cgtagagcgtcgaactaa-3’
fmdv-p：5’-rox-ctccgcctacttggtcgtca-bhq2-mgb-3’
其中rox为荧光基团，bhq-2为淬灭基团；
用于检测猪塞尼卡谷病毒3d基因的引物对及其mgb探针序列如下：
svv-f：5’-ctggttggtacggattac-3’
svv-r：5’-ggcaggagtcatcttatac-3’
svv-p：5’-hex-cgccacctcattgaagtccag-bhq1-mgb-3’
其中hex为荧光基团，bhq-1为淬灭基团。
进一步的，a盒用于样本核酸的提取，室温保存；b盒用于rna的逆转录和pcr扩增反应，-20℃保存。
本发明的积极效果是：
1．本发明提供了一种同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr试剂盒，应用本试剂盒可同时鉴定猪水泡病毒vp1基因、口蹄疫病毒5’utr基因和塞尼卡谷病毒3d基因。相对于市场上其他核酸检测试剂，本试剂盒为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的诊断、监测、防控与净化提供了快捷的检测工具，具有重要的实践意义。
2．本发明试剂盒涉及的mgb-taqman探针，回避了多重rt-pcr中探针、引物以及扩增产物之间干扰的问题。具体如下：首先，探针3’末端利用了本身不产生荧光的bhq作为淬灭基团，具有灵敏度高且荧光背景低等优点；其次，探针3’末端偶联mgb可以与dna中小沟结合，形成较为稳定的异源双链，提高tm值10℃左右，从而增加了荧光rt-pcr检测方法的特异性；最后，mgb探针较短，一般长度约为14-20bp，尤其适用于变异序列较多的特异性识别，易于设计。同时，3’端的淬灭基团和报告基因的空间位置较近，将较大程度地提升检测结果的准确性以及分辨率。
3．本发明无柱式核酸提取方法，操作快捷简单，且对实验仪器设备的要求较低，大大提高了检测效率和检测成本。此外，本试剂盒将rna逆转录试剂和pcr反应试剂整合为rt反应液和pcr反应液，使用简单，操作方便，极大的提高了工作效率，方便在临床实践中推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例中的实验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的实验方法，若无特别说明，均为常规实验方法。
用于鉴别检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr试剂盒，试剂盒内包括a盒和b盒。a盒内设有裂解液、1.5mleppendorf管，b盒内设有阳性对照、阴性对照、rt反应液、pcr反应液。
所述pcr反应液中有3对引物和3个mgb探针，引物分别用于扩增猪水泡病毒vp1基因片段、口蹄疫病毒5’utr基因片段和塞尼卡谷病毒3d基因片段，探针分别用于识别猪水泡病毒vp1基因、口蹄疫病毒5’utr基因和塞尼卡谷病毒3d基因。
一、检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的引物及探针
参考genebank中收录的猪水泡病毒（no.y14516.1）、口蹄疫病毒（no.x83209.1）与塞尼卡谷病毒（no.eu271772.1）毒株序列，应用ncbi提供的在线引物设计工具primer-blast
表1引物和探针序列信息
上述引物和探针由金维智生物科技有限公司合成提供。
二、试剂盒内各试剂的来源和制备过程
2.1裂解液的制备
称取异硫氰酸胍47.25g，250mmol/l柠檬酸钠（ph7.0）10ml，加depc水至100ml；加入0.2mmol/lnacl（ph4.5）10ml，氯仿20ml，b-硫基乙醇1ml，混匀，分装，6ml/瓶，置0～4℃保存。
2.2阳性对照的制备
参考genebank中收录猪水泡病毒（no.y14516.1）、口蹄疫病毒（no.x83209.1）与塞尼卡谷病毒（no.eu271772.1）毒株序列，设计引物分别扩增猪水泡病毒vp1基因、口蹄疫病毒5’utr基因和塞尼卡谷病毒3d基因片段连接到pmd18-t载体上。用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用无rnase纯化水稀释至1×106copies/µl，分装120µl/瓶，置于-20℃保存。
2.3阴性对照的制备
将焦炭酸二乙酯与ddh2o按1：1000的体积比混匀，4℃放置约14小时。高压灭菌121℃，30min，分装，120µl/瓶，置于-20℃保存。
2.4rt反应液的制备
rt缓冲液的配制：取20ml0.1mol/l的tris-hcl（ph8.4），25ml1.0mol/l的kcl溶液，3ml0.1mol/l的mgcl2溶液，用无rnase超纯水定容至100ml，充分混匀。rt反应液的配制：rt缓冲液8ml，dntps(2.5mmol/l)8l，反转录酶1ml，rna酶抑制剂1ml，充分混匀，用0.22μm的除菌滤器过滤，无菌分装成300µl/瓶，置于-20℃保存。
2.5pcr反应液的制备
pcr缓冲液配置：取25ml1.0mol/l的tris-hcl（ph9.0），20ml2.0mol/l的(nh4)2so4溶液，2ml2.0mol/l的mgso4溶液，10ml甘油，用无rnase超纯水定容至100ml，充分振荡混匀。pcr反应液的配制：5mlpcr缓冲液，4mldntps(2.5mm)，1mltaq酶，1mlsvdv-f（20pmol/µl），1mlsvdv-r（20pmol/µl），1mlsvv-f（20pmol/µl），1mlsvv-r（20pmol/µl），1mlsvdv-p（20pmol/µl），1mlsvv-p（20pmol/µl），4ml无rnase超纯水，充分振荡混匀，用0.22μm的除菌滤器过滤，无菌分装成600µl/瓶，置于-20℃保存。
三、测试过程和原理
3.1测试过程
3.1.1待检样品的核酸提取
（1）水泡液或血液样品：将20µl水泡液或血液加入到无菌的1.5mleppendorf管，然后加入100µl的裂解液，金属浴加热60℃5分钟，12000r/min离心2min,轻轻地将上清吸出置于无rnase的eppendorf管中，用于检测。
（2）新鲜水泡皮、淋巴结、脾脏、肌肉等组织样品：将4-6mg组织与100µl的裂解液充分研磨或用匀浆机打碎，金属浴加热60℃5分钟，12000r/min离心2min,轻轻地将上清吸出置于无rnase的eppendorf管中，用于检测。
3.1.2rt-pcr
取出rt反应液和pcr反应液，置于室温融化，按每份取rt反应液5µl、pcr反应液10µl的比例预混两种反应液（操作过程要避光），按15µl/管分装到荧光pcr专用管中；分别向分装好的荧光pcr管中加入5µl待检样本核酸或阴性对照或阳性对照，在荧光定量pcr仪上运行以下程序：42℃30min，95℃3min；然后进行94℃10s，60℃20s；40个循环。
荧光通道选择fam、rox和hex，其中fam用于检测猪水泡病毒vp1基因，rox用于检测猪口蹄疫病毒5’utr基因，hex用于检测猪塞尼卡谷病毒3d基因，在每个循环的60℃时收集荧光信号。设置扩增体系为20µl，同时要选择passivereference和quencher为none的模式。
3.1.3结果判定
基线和阈值设定：基线调整取3-12个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点；
质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线或ct值＞35或无ct值；阳性对照ct值均≤35.0，且出现二条明显的扩增曲线，否则实验视为无效；
样品判定：待检样品若fam通道荧光信号呈指数型增加，且结果显示ct值＜35.0，则报告为猪水泡病毒阳性；待检样品若rox通道荧光信号呈指数型增加，且结果显示ct值＜35.0，则报告为猪口蹄疫病毒阳性；待检样品若hex通道荧光信号呈指数型增加，且结果显示ct值＜35.0，则报告为猪塞尼卡谷病毒阳性；待检样品若任何两个通道荧光信号呈指数型增加，且结果显示ct值＜35.0，则报告为通道荧光信号所对应的两种病毒为阳性；待检样品若fam、rox和hex通道荧光信号均呈指数型增加，且结果显示ct值＜35.0，则报告为猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒均为阳性。
3.2试剂盒特异性试验
如表2所示，本试剂盒具有良好的特异性，检测结果不受其他猪水泡症状相关病毒以及常见猪类病毒的干扰。此外，在对猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒毒株核酸样本检测中，试剂盒表现出准确的鉴别区分能力。
表2试剂盒的特异性试验
注：svdv代表猪水泡病毒，fmdv代表口蹄疫病毒，svv代表塞尼卡谷病毒，vsv代表水泡性口炎病毒，prrsv代表猪繁殖与呼吸综合征病毒，csfv代表猪瘟病毒，pcv2代表猪圆环病毒2型，pcv3代表猪圆环病毒3型，jev代表日本乙型脑炎病毒，prv代表伪狂犬病毒，pedv代表猪流行性腹泻病毒；括号内为ct值；“+”代表检测结果阳性，“-”代表检测结果阴性。
3.3试剂盒敏感性试验
将猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒阳性质粒混合，107copy/µl，按10倍梯度进行稀释。用本发明的试剂盒检测稀释样本，灵敏度可以达到106稀释度，见表3。
表3试剂盒的敏感性试验
注：括号内为ct值；“+”代表检测结果阳性，“-”代表检测结果阴性；猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒毒株阳性核酸由河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站提取保存。
四、试剂盒组装
将各试剂组装成试剂盒，按表4取各组份分别进行密封，粘贴内包装标签。
表4试剂盒组份
将组装好的试剂盒a盒置于室温保存，b盒置于-20℃保存，间隔45天测定其敏感性和特异性，以确定试剂盒的保存期。本发明的试剂盒保质期为6个月。
序列表
<110>安阳工学院
<120>用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>prt
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
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thrglythrcysglyalathralacyscysalathrthrcysalathr
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