以FAPα和survivin为基础的DNA及其在制备肿瘤疫苗中的应用的制作方法

本发明涉及肿瘤dna疫苗领域。具体地说，本发明涉及靶向fapα和survivin的重组dna载体cpvr-osfs在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

背景技术：

癌症已成为严重危害人类健康的重大疾病。目前肿瘤治疗的主要方式包括手术治疗、化疗和放疗。但是传统治疗方式会对患者生理造成不可逆创伤和生理及心理的次生损害，而且还不能完全治愈癌症。因此，迫切需要新的癌症治疗方式，来减轻病人疼痛和提高病人生存质量，并且最终达到治愈。近年来以pd-1和pd-l1为代表的免疫检查点阻断疗法的临床成功，开启了癌症免疫治疗的新纪元。但是同大多免疫疗法一样，免疫检查点阻断疗法有效的前提是要有肿瘤特异性cd8⁺t淋巴细胞。作为癌症免疫治疗的重要组成部分，癌症疫苗因其能诱导大量的肿瘤特异性cd8⁺t细胞而成为研究热点。然而，由于肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)的存在，疫苗诱导产生的特异性cd8⁺t细胞不能有效进入到肿瘤内部来杀伤肿瘤，同时由于tme中的免疫抑制因素(如免疫抑制细胞：treg-调节性t细胞，mdsc-骨髓来源的抑制性细胞等；免疫抑制分子：il-10，tgf-β等)的存在，使得进入瘤内的t细胞也无法发挥有效的抗肿瘤效果。因此，找到一种能在破坏tme的同时，又能杀伤肿瘤细胞的治疗手段，将是理想且有效的癌症治疗方法。

cafs(cancer-associatedfibroblasts)作为tme的重要组成部分，通过产生调节ecm(extracellularmatrix)的可溶性因子，在肿瘤的生长、进展和转移过程中发挥着重要作用，而且cafs分泌的胶原蛋白还可以阻碍化疗药物的吸收和cd8+t细胞的浸润。成纤维激活蛋白α(fibroblastactivationproteinα，fapα)作为cafs表面的重要标记，被发现在90％以上的上皮癌中高表达(如乳腺癌、胰腺癌、肺癌等)，且与病人的不良预后相关。并且，删除fapα⁺cafs来调节肿瘤微环境消除免疫抑制因素，可以显著提高癌症疫苗的抗肿瘤效果。另外，凋亡抑制蛋白家族成员survivin在60多种肿瘤中高表达，在正常组织中除了胚胎组织中有表达外正常终末分化组织中均不表达，而且其与预后不良、药物抗性和病人生存期缩短呈正相关。因此，生存素(survivin)是一个非常理想的针对肿瘤细胞的靶抗原。因此，如能构建一种可以同时靶向fapα和survivin的肿瘤疫苗，既可通过杀伤fapα⁺cafs降低tme中免疫抑制因素，增强cd8⁺t细胞的浸润，进而提高cd8⁺t细胞杀伤表达survivin的癌症细胞的效率，达到一箭双雕的效果。

目前国内外未见同时以fapα和survivin为靶点的肿瘤疫苗，但已有研究证明靶向fapα可以显著提高其他疗法，包括免疫疗法的抗肿瘤效果，因此推测这种策略是可行的。例如stephengottschalk等人证明清除fapα⁺cafs，可提升疫苗在小鼠黑色素瘤模型上的抗肿瘤效果。elizabethk.duperret等人的研究表明，靶向fapα的dna疫苗可以重塑肿瘤基质并增强肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。

国内meihuachen等人研制的表达有fapα的瘤苗，在黑色素瘤，肺癌，结直肠癌等小鼠模型上具有良好的抗肿瘤效果，且显著延长了小鼠的生存期。我们在前期研究中，开发出了一种新型fapα肿瘤疫苗，在提高了疫苗免疫原性的同时，促进更多的t细胞浸润到肿瘤内部，且显著降低了tme中的免疫抑制因素，如mdsc、treg等。

技术实现要素：

本发明提供一种以fapα和survivin为基础的dna及其在制备肿瘤疫苗中的应用，构建了它们的dna疫苗，提供了靶向fapα和survivin的dna疫苗在抗肿瘤治疗中的应用。

本发明采取的技术方案是：

本发明所述的一种seqidno:1所示的osfsdna序列，所述序列包含一段kozak序列，一段分泌信号肽tpa序列，截短的fapα核苷酸序列，以及抗凋亡活性缺失的截短的survivin核苷酸序列。

本发明所述的一种seqidno:1所示的osfsdna片段，与原始序列相比进行了密码子优化。

本发明还包括上述dna序列制备的dna疫苗及其在抗肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明所述疫苗包括表达所述dna序列的重组dna疫苗及其衍生疫苗。

本发明所述的dna疫苗包含一种seqidno:1所示的osfsdna序列。

本发明所述的dna疫苗的载体骨架为cpvr，在所述cpvr载体上以多克隆酶切位点的连接方式插入seqidno:1所示的dna序列。

本发明所述插入的多克隆位点为psti/bamhi。

本发明所述疫苗包括所述dna片段的病毒载体疫苗、树突状细胞疫苗，包含由所述dna片段转录出的rna制备的rna疫苗、包含由所述的dna片段生产的蛋白类疫苗以及上述疫苗的衍生疫苗。

本发明所述产品中还可包括免疫佐剂和、或化疗药物；优选地，其中所述的免疫佐剂包括但不限于cpg、il-2、ifn-γ、可溶性pd-1/pd-l1分子，其中所述的化疗药物包括但不限于多柔比星、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、顺铂、奥沙利铂。

本发明的优点在于新序列包含有肿瘤微环境基质抗原(fapα)和肿瘤相关抗原(survivin)，其可以在动物体内同时激起针对肿瘤微环境基质和肿瘤细胞的免疫反应，达到对肿瘤的双重杀伤效果。这种联合方式未见报道，并且以上述序列为基础构建的dna疫苗比单独抗原序列dna疫苗具有更强的抗肿瘤活性，这为基于肿瘤微环境基质抗原fapα和肿瘤相关抗原survivin的dna疫苗、蛋白疫苗、病毒载体疫苗、rna疫苗、树突状细胞疫苗的构建和应用奠定了基础。

另外，因为dna疫苗是通过其携带的基因编码的蛋白抗原来诱导机体免疫系统从而发挥功效的，此次，使用本发明中的dna疫苗所编码的蛋白序列所制备的产品也在本发明的范围内。同时，密码子具有简并性，即不同的核酸序列可编码出相同的氨基酸序列。因此，通过密码子简并性而对本专利中的序列进行改变也在本发明的范围内。

附图说明

图1：dna疫苗载体cpvr；

图2：dna疫苗cpvr-osfs，该重组质粒为dna序列seqidno:1于cpvr载体中形成；

图3：cpvr-osfs真核表达鉴定，cpvr载体(阴性对照)、cpvr-osf(阳性对照)、cpvr-osfs转染293t细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；

图4：cpvr-osfs在小鼠4t1乳腺癌模型上的抗肿瘤效果探究的免疫策略，小鼠4组，每组5只，在攻瘤后7、9、12天进行免疫，第23处死小鼠进行检测；

图5：小鼠的平均肿瘤体积生长情况，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第11天开始，每隔两天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值+sd，(^***p<0.001,^****p<0.0001)；

图6：检测小鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，在攻瘤后第23天处死小鼠，取小鼠脾细胞elispot法检测脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应survivin和fapα小肽；

图7：检测小鼠ctl杀伤靶细胞的能力，在攻瘤后第23天处死小鼠，分离小鼠淋巴细胞作为效应细胞，与用特异survivin或者fapα小肽标记的p815细胞作为靶细胞共孵育，cfse荧光标记法检测免疫小鼠的ctl应答能力，e：t(效应细胞：靶细胞)＝50：1，(^*p<0.05，^**p<0.01,^***p<0.001)；

图8：肿瘤组织中survivin和fapα的表达量，提取肿瘤组织rna并逆转录为cdna，再通过荧光定量pcr检测survivin以及fapα在肿瘤中的表达量，与单独疫苗相比，cpvr-osfs能够更好的清除survivn和fapα，(^*p<0.05，^**p<0.01,^***p<0.001)；

图9：多柔比星(dox)清除mdsc的策略摸索，小鼠为组(未攻瘤小鼠，不做处理)，生理盐水阴性对照组(ns)，一针dox组(one)，以及两针dox组(two)。在攻瘤后第7、12、15、20、24、27天取小鼠脾和血液处理成单细胞，进行流式细胞仪检测mdsc的变化；

图10：小鼠脾中mdsc的变化；

图11：小鼠血液中mdsc的变化；

图12：cpvr-osfs与dox联合治疗乳腺癌，小鼠按图分为：cpvr组(第7、9、12天肌肉免疫载体)、dox组(第7、12天尾静脉注射dox)、cpvr-osfs组(第7、9、12天肌肉免疫疫苗)、dox/cpvr-osfs组(第7、12天尾静脉注射dox，第13、15、18天肌肉免疫疫苗)，每组5只；

图13：小鼠的平均肿瘤生长。在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第10天开始，每隔两天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值+sd，(^****p<0.0001)；

图14：小鼠肿瘤称重的结果，在第24天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，与空载体组(cpvr)比较，dox治疗组、cpvr-osfs组及dox/cpvr-osfs组模型小鼠肿瘤生长抑制率分别为51.4％，51.3％及78.3％，(^***p<0.001，^****p<0.0001)；

图15：检测荷瘤鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，在第24天处死小鼠，取脾并处理成单细胞，elispot法检测处死荷瘤鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特异性小肽，阳性刺激物为survivin和fapα小肽，(^*p<0.05，*^**p<0.001,^****p<0.0001)；

图16：肿瘤内浸润的cd3⁺cd8⁺t细胞占cd45⁺细胞的比例，(^**p<0.01，^****p<0.0001)；

图17：肿瘤内浸润的mdsc占肿瘤细胞的比例，(^**p<0.01，^***p<0.001)；

图18：肿瘤内浸润的treg占cd4⁺细胞的比例，(^*p<0.05，^**p<0.01,^***p<0.001)；

图19：cpvr-osfs与gem联合治疗胰腺癌，对c57小鼠进行皮下致死量的panc02肿瘤注射(1x10⁵/只)，在第五天对小鼠进行随机分组，每组5只：untreated组(未治疗组)、gem组(在第5、8、12、15天进行吉西他滨的治疗)、cpvr-osfs组(在第5、7、10天进行疫苗肌肉免疫)、gem/osfs组(在第5、8、12、15天进行吉西他滨的治疗，第5、7、10天进行疫苗肌肉免疫)；

图20：小鼠的肿瘤重量对比，在第25天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，与cpvr组相比，gem组、cpvr-osfs组及gem/cpvr-osfs组的抑瘤率分别为34.7％、41.3％、84.4％，(^**p<0.01，^****p<0.0001)；

图21：不同组荷瘤鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，小鼠完成疫苗治疗后，在第25天用elispot法检测脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应survivin和fapα小肽，(^*p<0.05，^****p<0.0001)。

具体实施方式

1.cpvr-osfsdna疫苗的构建及蛋白表达鉴定。

所用载体为引入cpg基序的真核表达质粒vr1012，简称为cpvr，包含有启动子cmv，内含子a、bgh序列，cpg序列，卡纳霉素抗性序列，共5305bp，图谱见图1。

以cpvr-osf和cpvr-os为模板，通过pcr获得核苷酸序列osf和os片段seqidno:1，并在两端引入psti/bamhi酶切位点和与载体两端序列相同的同源臂序列，将目的dna片段和经过psti/bamhi酶切获得的载体片段进行dna电泳和胶回收，获得目的片段和载体，使用同源重组试剂盒，50℃孵育15分钟，转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性的lb平板，37℃下培养过夜。挑选阳性菌落于5mllb培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用psti/bamhi酶切鉴定，并进行序列测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒cpvr-osfs，图谱见图2。

分别将cpvr-osf和cpvr-osfs以及cpvr空质粒转染293t细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行westernblot蛋白免疫印迹分析，结果如图3所示：适用fapα抗体可以检测到与预期分子量100kd相符合的osfs条带，cpvr阴性载体质粒没有检测到蛋白条带，结果说明cpvr-osfs能够正确表达目的基因编码的蛋白。

2.cpvr-osfsdna疫苗在小鼠乳腺癌模型上的抗肿瘤应用

2.1.cpvr-osfsdna疫苗的抗肿瘤效果

治疗性疫苗的抗肿瘤效果直接表现在抑制肿瘤生长上，为了更好的验证疫苗的抗肿瘤效果，我们在已经成瘤的小鼠上进行疫苗的有效性评价。

选取体重为16～18g的balb/c小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4t1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤。成瘤后，将小鼠随机分为4组，每组5只，包括包括cpvr空载体对照组，cpvr-os疫苗组(单独survivin疫苗)，cpvr-osf疫苗组(单独fapα疫苗组)，以及cpvr-osfs疫苗组(融合表达疫苗)。按照图4，在第7、9、12天采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫，共3次。在接种瘤后的第11天开始测量肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。肿瘤生长曲线(图5)显示：对比cpvr载体组，3种疫苗都具有一定的抗肿瘤效果(p<0.0001)；并且cpvr-osfs相比于单独疫苗组具有更强的抑瘤作用(p<0.001)。

在皮下接瘤的第23天，对小鼠进行安乐死，并取脾进行相关细胞免疫检测。分离各组小鼠的脾脏，剪碎研磨制备单细胞悬液，检测各组小鼠脾细胞中分泌fapα特异性ifn-γ的淋巴细胞数目以及淋巴细胞ctl杀伤能力。如图6所示，当用加入无关小肽(nspeppties)刺激后，3组小鼠脾细胞分泌ifn-γ的水平没有明显差异，且数目都小于50，而当用survivin和fapα小肽刺激后，同cpvr组相比，免疫有nda疫苗的组的脾细胞在对应抗原肽刺激下ifn-γ分泌的斑点数明显提高(p<0.05)，并且cpvr-osfs相比于单独疫苗组脾细胞分泌ifn-γ的能力并没有减弱，这说明融合形式并没有影响单个抗原激起免疫反应的能力。脾细胞的特异性杀伤活性检测如图7所示，相比cpvr组，免疫有疫苗的组特异性细胞杀伤活性明显提高(p<0.01),并且cpvr-osfs组相比于单独疫苗组，杀伤能力得到进一步增强(p<0.05)。

2.1.cpvr-osfsdna疫苗降低微环境中的抗原表达。

取适量肿瘤组织，提取rna，逆转录得到cdna，并进行荧光定量pcr检测fapα和survivn在肿瘤内的表情况。结果显示，cpvr-osfs疫苗相比于单独疫苗能更好地清除了肿瘤中的fapα和survivn(图8，p<0.05)。

综合2.1与2.2表明，cpvr-osfs相比cpvr-os和cpvr-osf能够诱导的更强的特异性细胞免疫反应,具有更强的抗肿瘤效果。证明了fapα和survivn的这种融合方式(osfs片段)在在制备抗肿瘤产品中更具有优势。3.低剂量多柔比星能降低肿瘤诱导产生的骨髓来源的抑制性细胞(mdsc)

由图5可知，cpvr-osfs相比cpvr-os和cpvr-osf抗肿瘤效果更好，但是并没有达到完全治愈的效果，有研究表明，在肿瘤的生长过程中会诱导产生例如骨髓来源的抑制性细胞(mdsc)来抑制疫苗的抗肿瘤效果，而且像多柔比星(dox)等化药具有清除mdsc的作用。

为了探究肿瘤对mdsc诱导以及dox清除mdsc的最有策略，选取体重为16～18g的balb/c小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4t1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤后进行随机分组。如图9所示，组(未攻瘤)；ns组(荷瘤小鼠，在第7和12天尾静脉注射生理盐水)；one组(荷瘤小鼠，在第7天尾静脉注射5mg/kg的dox)；two组(荷瘤小鼠，在第第7和12天尾静脉注射5mg/kg的dox)。在第7、9、12、15、20、24、27天每组处死3只小鼠，取脾和血液，通过流式细胞术检测脾脏和血液中mdsc的比例变化。结果如图10、图11所示，随着肿瘤的生长，mdsc在脾脏中和血液中的比例急剧上升，血液中的mdsc在第24天左右接近100％；并且两针dox具有更强的mdsc清除能力。

4.cpvr-osfs疫苗联合多柔比星(dox)的抗乳腺癌应用

4.1.cpvr-osfs疫苗联合多柔比星抗肿瘤效果和免疫反应检测

为了探究cpvr-osfs疫苗联合多柔比星的抗肿瘤效果以及dox的应用是否会影响抗肿瘤免疫反应，选取体重为16～18g的balb/c小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4t1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤后进行随机分组，每组5只。如图12所示，cpvr组(第7、9、12天肌肉免疫载体)、dox组(第7、12天尾静脉注射dox)、cpvr-osfs组(第7、9、12天肌肉免疫疫苗)、dox/cpvr-osfs组(第7、12天尾静脉注射dox，第13、15、18天肌肉免疫疫苗)。在接种瘤后的第10天开始测量肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。肿瘤生长曲线(图13)显示：对比cpvr载体组，3种治疗方案都具有一定的抗肿瘤效果(p<0.0001)；并且dox/cpvr-osfs组相比于分开治疗组具有更强的抑瘤作用(p<0.0001)。在种瘤后的第24天进行剥瘤称重。瘤重结果(图14)显示：与cpvr组相比，dox治疗组、cpvr-osfs组及dox/cpvr-osfs组模型小鼠肿瘤生长抑制率分别为51.4％，51.3％及78.3％；并且dox/cpvr-osfs组的瘤重远远小于分开治疗组(p<0.001)。

脾细胞分泌ifn-γ水平(图15)结果可以看出，dox的加入并没有虚弱疫苗激起免疫反应的能力，反而与分开治疗组相比dox/cpvr-osfs组脾细胞分泌ifn-γ的能力更强(p<0.001)。

4.2.cpvr-osfs疫苗联合多柔比星的肿瘤微环境调节作用

为了探究cpvr-osfs以及联合疗法对肿瘤微环境中的效应细胞和抑制性细胞的影响，将剥离的肿瘤细胞进行胶原酶处理，分离成单细胞悬液，进行抗体染色流式细胞仪分析。结果显示单独的cpvr-osfs就可以有效的促进cd3⁺cd8⁺效应细胞浸润到肿瘤内部(图16，p<0.001)，并且降低了mdsc(图17，p<0.01)和treg(图18，p<0.01)免疫抑制性细胞的浸润。更重要的是，当疫苗联合dox后，促进更多的cd3⁺cd8⁺效应细胞浸润到肿瘤内部(图16，p<0.01)，并且进一步降低了瘤内mdsc(图17，p<0.05)的比例。

综合2.1与2.2结果显示，cpvr-osfs联合dox后具有更强的抗肿瘤活性，并且联合疗法增强了抗肿瘤免疫反应，具有更强的肿瘤微环境调节能力。

5.cpvr-osfs疫苗联合吉西他滨(gem)在小鼠胰腺癌模型上的抗肿瘤应用。

选取体重为16～18g的c57雌雄小鼠，在第0天以致死剂量(10万个)的panc02肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第5天皮下肿瘤成瘤后，将小鼠按照图19，随机分为4组，每组5只，untreated组(未治疗组)、gem组(在第5、8、12、15天进行吉西他滨的治疗)、cpvr-osfs组(在第5、7、10天进行疫苗肌肉免疫)、gem/osfs组(在第5、8、12、15天进行吉西他滨的治疗，第5、7、10天进行疫苗肌肉免疫)。在小鼠皮下接瘤后的第25天，将小鼠安乐死，剥瘤称重(图20)。与cpvr组相比，gem组、cpvr-osfs组及gem/cpvr-osfs组的抑瘤率分别为34.7％、41.3％、84.4％。并且联合组的抑瘤效果要远远优于单独治疗组(p<0.0001)。

随后，我们对小鼠脾细胞表位肽特异性的ifn-γ分泌水平进行了检测。如图21所示，低剂量gem的加入并没有削弱特异性抗肿瘤反应，反而有一定程度的增强效果(p<0.05)。

综上，说明cpvr-osfs联合gem相比于单独疫苗组和gem组具有更强的抑瘤效果以及可以诱导更强的抗肿瘤免疫反应，这种联合方式在治疗胰腺上具有一定的临床应用前景。

序列表

<110>吉林大学

<120>以fapα和survivin为基础的dna及其在制备肿瘤疫苗中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2709

<212>dna

<213>人工合成(人工合成)

<400>1

ctgcaggccgccaccatggacgccatgaagaggggactgtgctgcgtgctgctgctgtgc60

ggagccgtgttcgtgtctccaagcaggcctagcagggtgcacaactccgaggagaatacc120

atgagagccctgacactgaaggacatcctgaatggcacctttagctacaagacattcttt180

cccaactggatctccggccaggagtatctgcaccagtctgccgataacaatatcgtgctg240

tataatatcgagaccggccagtcttacacaatcctgagcaaccggaccatgaagagcgtg300

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tacgacgccatcagctactataagatcttttctgacaaggatggctacaagcacatccac1140

tatatcaaggataccgtggagaatgccatccagatcacatctggcaagtgggaggccatc1200

aacatcttccgggtgacccaggacagcctgttctactctagcaatgagtttgaggagtac1260

ccaggcaggagaaacatctatcgcatctctatcggcagctacccacccagcaagaagtgc1320

gtgacctgtcacctgaggaaggagagatgccagtactatacagcctccttttctgattac1380

gccaagtactatgccctggtgtgctatggcccaggcatccccatctccaccctgcacgac1440

ggaaggacagatcaggagatcaagatcctggaggagaacaaggagctggagaatgccctg1500

aagaacatccagctgcctaaggaggagatcaagaagctggaggtggacgagatcaccctg1560

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caggtgtacggaggaccttgcagccagagcgtgaggagcgtgttcgccgtgaactggatc1680

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ttccagggcgataagctgctgtacgccgtgtatcgcaagctgggcgtgtacgaggtggag1800

gaccagatcacagccgtgaggaagttcatcgagatgggctttatcgatgagaagagaatc1860

gcaatctggggatgggcatacggaggatacgtgagcagcctggccctggcatccggaacc1920

ggactgttcaagtgtggaatcgcagtggcaccagtgagctcctgggagtactatgccagc1980

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tgaggatcc2709