本发明属于微生物领域，具体涉及一种米曲霉发酵液的制备方法。
背景技术：
蛋白酶是一种常见的生物大分子，可高效水解蛋白质。按照蛋白酶特异性或催化机制，可以将肽蛋白酶分为外肽酶和内肽酶，蛋白酶的反应类型、催化位点的性质和化学性质、蛋白酶结构各不相同。蛋白酶存在于植物、动物、微生物中。在植物中，蛋白酶参与储存蛋白的动员、凋亡等过程；在动物中，蛋白酶有肾素、胰蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等种类，这些蛋白酶在消化过程中起着重要作用，同时动物蛋白酶也是防治害虫的生物防治措施。目前，大多数蛋白酶时由微生物产生的。有些微生物有自己分泌蛋白酶的自然能力，而不需要任何诱导。在生物反应器中通过微生物发酵来大量生产蛋白酶，微生物发酵通常采用固态发酵和深层发酵两种工艺从微生物中提取蛋白酶。通常情况下，蛋白酶可用于食品、医疗、化学等领域。比如，米曲霉蛋白酶能够水解面筋蛋白使面包变得柔软并增强面包的香气；巨芽孢杆菌胞内丝氨酸蛋白酶对水解酪蛋白和血红蛋白非常有效；细菌、真菌、放线菌等可产角蛋白，可用于皮革脱毛。
米曲霉可以被广泛应用于传统发酵食品行业，是酱油、清酒、烧酒、黄酒、豆豉等食品的关键发酵菌种。但是米曲霉在发酵生产蛋白酶的过程中也存在一些缺点关键点，比如米曲霉在不同培养基、培养条件（温度、ph等）下生长速度、产孢丝有较大的差异。目前工业上使用米曲霉发酵生产得到的蛋白酶酶活力有限，为后期蛋白酶纯化等过程造成困扰。因此，优化产酶条件能够为米曲霉工业应用带来重要经济价值。
技术实现要素：
针对现有技术中有关米曲霉发酵液的产物浓度低的问题，本发明提供了一种米曲霉发酵液的生产方法。
本发明提供的米曲霉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
s1：从米曲霉保存斜面上取孢子接种于活化培养基上进行活化，得到活化后的米曲霉；
s2：将s1中得到的活化后的米曲霉菌块接种到种子培养基中进行扩大培养，得到种子液；
s3：将s2中得到的种子液接种到发酵培养基中进行发酵，得到米曲霉发酵物。
优选地，所述的步骤s1中活化培养基包括：硝酸钠1-3g/l，磷酸氢二钾3-5g/l，硫酸镁1-3g/l，氯化钾0.1-3g/l，果糖20-40g/l，琼脂20g/l，ph6.5，蒸馏水。所述的步骤s1中的活化的条件为：30-35℃下活化培养36-72小时。
优选地，所述的步骤s2中的种子培养基包括：豆饼浸出液200-300ml，马铃薯浸出液200-300ml，葡萄糖20g，磷酸二氢钾4-8g/l，氯化钙1-3g/l，ph6.5，蒸馏水。所述的步骤s2中的种子培养的条件为：30-35℃下，180转/min摇床培养48小时；
进一步优选地，所述的种子培养基中豆饼浸出液与马铃薯浸出液的体积比为5:6，磷酸二氢钾与氯化钙的浓度比为2.5:1；
最优选地，所述的种子培养基包括：豆饼浸出液250ml，马铃薯浸出液300ml，葡萄糖20g，磷酸二氢钾5g/l，氯化钙2g/l，ph6.5，蒸馏水。
优选地，所述的步骤s3中的发酵培养基包括：豆饼浸出液30-45%（v/v），马铃薯浸出液20-30%（v/v），酵母浸出液10-20%（v/v），葡萄糖20-50g/l，磷酸二氢钾4-8g/l，硫酸镁1-5g/l，氯化钙2-8g/l，ph6.5，蒸馏水。所述的步骤s3中的发酵的条件为400r/min，通气量5.0l/min，培养60小时；
进一步优选地，所述的发酵培养基中豆饼浸出液与马铃薯浸出液的体积比为8:5:3，磷酸二氢钾与硫酸镁的浓度比为2:1；
最优选地，所述的种子培养基包括：豆饼浸出液40%（v/v），马铃薯浸出液25%（v/v），酵母浸出液15%（v/v），葡萄糖30g/l，磷酸二氢钾6g/l，硫酸镁3g/l，氯化钙5g/l，ph6.5，其余为蒸馏水。
本发明所述的v/v是指体积比。
以上技术方案均能够实现本发明所述的技术效果。
本发明还提供了上述制备方法得到的米曲霉发酵液在生产高活力蛋白酶中应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明使用由沪酿336-2米曲霉发酵得到的提取物，具有蛋白酶活性，酶活力高，最高可达4695.6u。
（2）本发明的米曲霉发酵酶液提取物的制备方法简单，进一步优化种子液培养基和发酵培养基，将碳源氮源豆饼浸出液与马铃薯浸出液进行合理配比，并且进一步优化磷酸二氢钾与硫酸镁的浓度比，使的整体方案达到最优。本发明提供的制备方法能够为蛋白酶提取提供高酶活的米曲霉发酵液。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
本说明书中所述实施例1-4及对比例1-4采用的实验材料、试剂和方法如下：
1.实验材料，试剂和仪器
材料：沪酿336-2米曲霉。
试剂：福林酚，0.4mol三氯乙酸溶液，0.4mol碳酸钠溶液，ph7.2磷酸盐缓冲液，2%酪蛋白溶液，100ug/ml酪氨酸溶液。
仪器：分析天平，光电比色计或分光光度计，水浴锅，移液管。
实验方法
2.1米曲霉发酵液的制备方法，包括以下步骤：
s1：从米曲霉保存斜面上取孢子接种于活化培养基（ph6.5）上进行活化，得到活化后的米曲霉；
s2：将s1中得到的活化后的米曲霉菌块接种到种子培养基（ph6.5）中进行扩大培养，得到种子液；
s3：取出s2中得到的种子液接种到发酵培养基（ph6.5）中进行发酵，得到米曲霉发酵物。
2.2蛋白酶含量的检测
2.2.1酪氨酸标准液
取6只试管并编号，按表1各吸取不同浓度酪氨酸1ml，各加入0.4mol碳酸钠5ml，再分别加入已稀释的福林酚溶液1ml。摇匀后放置于水浴锅中。在40℃温度下保温显色20min，然后在紫外分光光度计上分别测定光密度，减去蒸馏水空白管所测得的od值为净od值，得到标准曲线。
2.2.2蛋白酶活力测定：
样品测定：取样品发酵液1ml加入9ml蒸馏水。取试管并编号，将样品稀释液向每管内加入1ml，置于40℃水浴锅中水浴预热2min，再分别加入酪蛋白溶液1ml并预热，保温10min，立即再分别加入0.4mol三氯乙酸2ml，以结束反应。继续放于水浴锅中水浴保温20min。离心或过滤沉淀后的残余蛋白质，再重新取试管编号，分别加入滤液1ml，再加0.4ml碳酸钠5ml以及稀释后的福林试剂1ml，并摇匀。40℃水浴锅水浴保温显色20min后测定光密度。
空白试验：取3支试管并编号，测定方法和上述一样，只是在加入酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2ml，让酶失去活性，再加入蛋白酶。
按照表2样品和空白实验准备进行试验。
2.2.3蛋白酶活力计算
计算：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位=a/10×4×n×1/（1-w）
式中：a-样品所测od值，根据标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或od值×k）；n-酶液稀释的倍数；w-样品水分百分含量。
实施例及对比例
对比例1
使用中国专利cn105586328a提供的米曲霉发酵液的制备方法声场米曲霉发酵液。
对比例2
使用《米曲霉3.042种曲蛋白酶特性研究》（中国调味品2009年第3期总34卷）所述的方法制备米曲霉。
实验结果：见表4.
综上所述，本专利提供的制备方法的米曲霉发酵液的蛋白酶活力最高达到4695.6u。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化也应视为本发明的保护范围。