狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立

狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆及反向遗传系统的建立
技术领域
1.本发明涉及一种病毒的感染性cdna克隆及反向遗传系统的建立，特别涉及一种狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆及反向遗传系统的建立。本发明属于生物技术领域。


背景技术：

2.犬瘟热病毒(canine distemper virus，cdv)的自然感染宿主不断增多，对世界范围内的多种陆生和水生食肉动物都存在生命威胁。cdv对不同易感宿主致病性不同，可引起不同程度的全身性疾病，致死率也有不同。其中，家猫发病死亡率为0％，家养犬为50％，雪貂达到100％。犬瘟热对毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成了巨大经济损失。目前，我国人均拥有的宠物犬猫数量逐年增多，犬瘟热对人类公共卫生的影响已不容忽视。而且，已经证实cdv融合蛋白和血凝素蛋白在paget's疾病中促进破骨细胞的形成，人类可能成为cdv的新宿主。
3.cdv为副黏病毒科(paramyxoviridae)麻疹病毒属(morbillivirus)成员，是单股负链、不分节段rna病毒。根据血凝素(h)基因的遗传多样性，cdv被划分为7个基因型，但只有1个血清型。cdv基因组从3’端到5’端依次为：3’端非编码区(3’utr)、核基因(n)、磷基因(p)(内部含有两个非结构蛋白基因c和v)、基质基因(m)、融合基因(f)、血凝素基因(h)、大聚合酶基因(l)和5’端非编码区(5’utr)。cdv基因组rna在核蛋白n的包裹下，聚合酶蛋白(l)及其辅助因子磷蛋白(p)共同作用，形成核衣壳(rnp)，这是cdv最小感染单位，遵循“6碱基原则”的顺序合成加帽和启动病毒转录与翻译，产生子代病毒。
4.由于rna病毒的基因组难以在体外任意操作，反向遗传技术的发明，为体外改造病毒rna基因组提供了强有力的工具。目前，国内外学者建立了多个cdv反向遗传系统，但主要针对cdv弱毒疫苗株。cdv弱毒疫苗株与cdv强毒株在核苷酸序列上存在较大差异，并且，弱毒疫苗株一般不引起动物发病和死亡，不适合用于阐述犬瘟热病毒的致病机理。此外，cdv强毒虽然能导致动物发病和死亡，但体外分离和培养较为困难。cdv强毒无法感染野生型vero细胞，只能感染表达信号淋巴细胞活化分子(signaling lymphocyte activation molecule,slam)的稳定细胞系，从而实现体外大量增殖。随着cdv强毒对细胞的适应和传代次数增加，可能会导致cdv强毒毒力和致病性下降。cdv强毒的这些特性，极大地限制了其反向遗传系统的建立，及cdv强毒相关重组病毒的拯救和增殖。因此，本发明构建了狐源犬瘟热病毒强毒株hbf-1的反向遗传系统。犬瘟热病毒强毒株hbf-1为从北极狐病料样品中分离的一株强毒(犬瘟热病毒强毒株hbf-1株的培育及致病性研究，高晗等，中国预防兽医学报，2012年12月，第32卷，第12期)。为了区别野生型cdv病毒wthbf-1株，我们在pcdna3.2-hbf-1中人为添加了遗传标记位点。比较了重组病毒rhbf-1与wthbf-1的体外生长特性。数据结果显示：本研究利用构建的狐源cdv强毒hbf-1反向遗传系统，成功拯救获得重组病毒rhbf-1，rhbf-1具有与野生型wthbf-1相似的生长特性。本发明的提出为未来深入研究cdv的致病机
20.r3 5
’-
ggattaattaacacggtcatcatccctcagttcaattga-3’21.f4 5
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cggatgcccaggtcggaccgcgaggaggtggagatgccatgccgacccaccagacaaagctgggtatgataac-3’23.(4)真核表达载体pcdna3.1的改造
24.对真核表达载体pcdna3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有notⅰ、bsiwⅰ、pmeⅰ、pacⅰ、cpoⅰ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过pmeⅰ酶切过后的pcdna3.1载体上，将改造后的载体命名为pcdna3.2；
25.(5)将f1、f2、f3、f4片段分别依次连接至peasy-blunt，测序，将测序正确的各基因片段分别连接到改造后的载体pcdna3.2的cmv启动子下游，获得含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆的质粒。
26.其中，优选的，步骤(2)获得的cdna的核苷酸序列如seq id no.2所示，步骤(4)中带有notⅰ、bsiwⅰ、pmeⅰ、pacⅰ、cpoⅰ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如seq id no.3所示。
27.再次，本发明还提出了所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆在拯救重组狐源犬瘟热病毒强毒rhbf-1株中的应用。
28.进一步的，本发明还提出了一种狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的反向遗传操作系统，所述的操作系统由含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的三个辅助质粒组成。
29.其中，优选的，编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的核苷酸序列分别如seq id no.4-6所示。
30.其中，优选的，所述的含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆的重组质粒通过以下方法制备得到：
31.(1)真核表达载体pcdna3.1的改造
32.对真核表达载体pcdna3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有notⅰ、bsiwⅰ、pmeⅰ、pacⅰ、cpoⅰ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过pmeⅰ酶切过后的pcdna3.1载体上，将改造后的载体命名为pcdna3.2，其中，带有notⅰ、bsiwⅰ、pmeⅰ、pacⅰ、cpoⅰ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如seq id no.3所示；
33.(2)将所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆连接到改造后的载体pcdna3.2的cmv启动子下游，获得含cdv hbf-1株全基因组的质粒。
34.其中，优选的，所述的表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的三个辅助质粒是通过将编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的核苷酸序列分别克隆至真核表达载体pcdna3.1的cmv启动子下游，获得表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n、p、l蛋白的三个辅助质粒。
35.再进一步的，本发明还提出了所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的反向遗传操作系统在拯救狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株以及对狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株进行反向遗传学研究中的应用。
36.更进一步的，本发明还提出了一种拯救狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的方法以及由该方法获得的重组狐源犬瘟热病毒强毒rhbf-1株，所述的方法包括以下步骤：
37.将含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的三个辅助质粒转染到bsr细胞中，优选的，含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的三个辅助质粒按照5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染；转染72h后，取细胞悬液，添加至vero-dslam细胞上，37℃5％co2培养5-10天，观察cdv引起的典型合胞体病变(cpe)，待出现cpe后，收集细胞及上清，并在vero-dslam细胞中继续传代，培养6-7d，收获病毒，获得拯救的重组病毒，命名为rhbf-1。
38.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
39.本研究首次建立了犬科动物北极狐源cdv强毒hbf-1株的反向遗传操作系统。cdv强毒hbf-1能感染犬科动物，并引起其死亡。但在机体外，hbf-1却无法感染普通vero细胞，要实现其大量增殖培养，必须利用表达slam受体分子的vero-dslam细胞，这极大地限制了对hbf-1毒株的培养和深入研究，也为病毒拯救工作带来了难题。因此，本发明以适应vero-dslam细胞的hbf-1毒株为模式病毒，构建了hbf-1的全基因组重组质粒pcdna3.2-hbf-1和表达狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1 n蛋白、p蛋白和l蛋白的三个辅助质粒。通过优化确定各个质粒转染比例与拯救条件，成功建立犬科动物狐源cdv强毒hbf-1株的反向遗传操作平台。将四质粒系统共转染bsr细胞，将各个质粒pcdv3.2-hbf-1、pccdv3.1-n、pccdv3.1-p、pccdv3.1-l按照5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染，转染试剂用量为质粒用量的3倍。转染72h后，将bsr细胞悬液接种至vero-dslam细胞，共培养6-8d，可看见犬瘟热病毒典型的合胞体细胞病变。
40.考虑到hbf-1的强毒特性，为明确重组病毒rhbf-1的传代稳定性和生长特性。本发明将rhbf-1接种至vero-dslam细胞，传代9次，rhbf-1对vero-dslam细胞存在逐渐适应过程，从第4代起，rhbf-1病毒滴度达到105tcid
50
/ml。在病毒的传代中rhbf-1最高滴度可稳定在10
5.667
tcid
50
/ml，wthbf-1的病毒滴度可稳定在10
5.3
tcid
50
/ml。将rhbf-1同wthbf-1病毒悬液按moi＝0.1接种到vero-dslam细胞上，于不同时间点收获上清和细胞，分别测定病毒滴度。结果可见，重组病毒rhbf-1与亲本病毒wthbf-1相比具有相似的生长特性。亲本病毒和重组病毒相比，上清和细胞相关病毒滴度均可在72h达到最高滴度。电镜观察也可见到，rhbf-1大小、形态与典型的犬瘟热病毒的一致。
附图说明
41.图1为hbf-1株全长感染性cdna克隆的构建策略；
42.图2为质粒pccdv3.2-hbf-1的酶切鉴定结果；
43.m：dl5000 dna marker 1:notⅰ、bsiwⅰ2:pacⅰ、cpoⅰm:dl15000 marker；
44.图3为辅助质粒的鉴定结果；
45.1：nheⅰ2:pmeⅰ3:mluⅰm:dl 15000 dna marker；
46.图4为重组病毒rhbf-1的鉴定；
47.(a)rhbf-1在vero-dslam细胞上形成的细胞病变(
×
40)；(b)阴性vero-dslam细胞(
×
40)；(c)rhbf-1免疫荧光染色(
×
40)；(d)阴性vero-dslam细胞免疫荧光染色(
×
40)；
48.图5为重组病毒rhbf-1遗传标记的酶切鉴定；
49.(a)rt-pcr以及酶切鉴定结果；(b)测序结果；
50.1.wthbf-1 pcr鉴定产物；2.wthbf-1 pcr鉴定产物bsiw i酶切结果；3.rhbf-1 pcr鉴定产物；4.rhbf-1 pcr鉴定产物bsiw i酶切结果；m:dl 2,000 dna marker；
51.图6为电镜下rhbf-1毒株的病毒粒子形态；
52.图7为rhbf-1的生长特性；
53.(a)rhbf-1的传代稳定性；(b)wthbf-1和rhbf-1的一步生长曲线。
具体实施方式
54.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
55.实施例1狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株的感染性cdna克隆及反向遗传系统的建立
56.1材料与方法
57.1.1病毒、细胞、载体
58.适应vero-dslam细胞的北极狐源犬瘟热病毒强毒hbf-1株，表达slam受体的非洲绿猴肾细胞(vero-dslam)(可参见文献：稳定表达貉犬瘟热病毒细胞受体slam的vero细胞系的建立及应用，赵建军等，《微生物学报》2012年12期)、仓鼠肾细胞(bsr)由中国农业科学院特产研究所特种动物疫病防控研究室保存；pcdna3.1购自invitrogen公司。
59.1.2主要试剂
60.总rna提取试剂盒rneasy mini kit购自qiagen；反转录试剂盒superscriptmⅲfirst-strand synthesis supermix购自invitrogen；高保真酶transstart fastpfu dna polymerase，peasy-blunt cloning kit，感受态细胞trans1-t1均购自北京全式金生物技术有限公司；dna凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自axygen；质粒中量提取试剂盒购自qiagen；t4 dna连接酶和其他限制性内切酶均购自thermo scietific；0.25％胰酶购自全式金；培养基使用为含10％和2％胎牛血清的dmem购自corning；x-tremegene hp dna transfection reagent转染试剂购自roche；cdv n单克隆抗体(mab)购自rmrd；绿色荧光标记的羊抗鼠的二抗购自proteintech。
61.1.3引物设计与合成
62.利用本发明人自行研发的不同cdv毒株通用特异性扩增反应系统，对狐源cdv强毒hbf-1的全基因组进行了扩增和序列测定。用dnaman软件分析全基因组序列的单一性酶切位点，用primer premier 5.0软件设计四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4，在f1片段上游引入锤头状核酶序列(hamrz)，在f4片段末端引入丁型肝炎病毒核酶序列(hdvrz)以确保转录产物末端序列的准确，为了便于全基因组片段的拼接，引物添加相应酶切位点，具体序列见表1，并设计了用于扩增cdv强毒hbf-1 n、p和l基因的上下游引物，送由上海生工生物技术公司合成。
63.表1.扩增用引物序列
[0064][0065]
注：加方框部分为酶切位点依次为notⅰ、bsiwⅰ、pme1、pacⅰ、cpoⅰ，加粗部分锤头状核酶(hamrz)序列，单下划线部分为丁型肝炎病毒核酶(hdvrz)部分序列。
[0066]
1.4含有狐源cdv强毒hbf-1株感染性cdna克隆的重组质粒与三个辅助质粒的构建
[0067]
为了便于全基因组的拼接，对选用的真核表达载体pcdna3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有notⅰ、bsiwⅰ、pmeⅰ、pacⅰ、cpoⅰ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列(seq id no.3所示)连接到通过pmeⅰ酶切过后的pcdna3.1载体上，将改造后的载体命名为pcdna3.2。根据qiagen总rna试剂盒的说明，提取hbf-1病毒悬液的总rna。依据superscripttmⅲfirst-strand synthesis supermix试剂盒的操作说明，对rna进行反转录，获得cdna(seq id no.2所示)。利用primer premier 5.0设计的四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4(表1)，以hbf-1基因组rna的反转录产物cdna为模板，用高保真dna聚合酶(trans start fastpfu dna polymerase)将hbf-1分4段进行扩增，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收。将f1、f2、f3、f4片段分别连接至peasy-blunt，送至上海生工生物技术公司测序。将测序正确的各基因片段分别依次连接到改造后的载体pcdna3.2的cmv启动子下游，获得含cdv hbf-1株感染性cdna克隆的质粒pccdv3.2-hbf-1(图1)，其中所述的cdv hbf-1株感染性cdna克隆核苷酸序列如seq id no.1所示。以相同方法，以hbf-1基因组rna的反转录产物cdna为模板，使用表1中扩增cdv hbf-1株n、p和l基因
的上下游引物n-f/n-r、p-f/p-r、l-f/l-r、分别扩增cdv hbf-1株的n、p、l的orf框，将扩增得到的cdv hbf-1株的n、p、l的orf框克隆至真核表达载体pcdna3.1的cmv启动子下游，获得表达cdv n、p、l蛋白的三个辅助质粒pccdv3.1-n、pccdv3.1-p、pccdv3.1-l，其中，编码cdv hbf-1株的n蛋白、p蛋白和l蛋白的核苷酸序列分别如seq id no.4-6所示。经测序鉴定正确后，用qiagen质粒大量提取试剂盒制备高纯度质粒，于-80℃冰箱保存备用。
[0068]
1.5病毒拯救
[0069]
待六孔板中bsr细胞长至90％开始转染，使用x-treme gene hp dna转染试剂22μl，以pccdv3.2-hbf-1、pccdv3.1-n、pccdv3.1-p、pccdv3.1-l分别按5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染，转染方法参照说明书。转染72h后，取细胞悬液大约300μl，添加至密度约为80％的vero-dslam细胞上，37℃5％co2培养5-10天，观察cdv引起的典型合胞体病变(cpe)。待出现cpe后，收集细胞及上清，并在vero-dslam细胞中继续传代，培养6-7d，收获病毒，获得拯救的重组病毒，命名为rhbf-1。
[0070]
1.6重组病毒rhbf-1的间接免疫荧光(ifa)鉴定
[0071]
将收获的rhbf-1病毒液，接种于vero-dslam细胞，待细胞出现cpe后，以4％多聚甲醛固定40min，将cdv n蛋白单克隆抗体1:500倍稀释作为一抗，以1:100倍稀释fitc标记羊抗鼠igg为二抗，进行ifa检测，最后，dapi进行核染色，在荧光显微镜中观察绿色荧光。
[0072]
1.7重组病毒rhbf-1的rt-pcr鉴定
[0073]
利用rna提取试剂盒，分别提取wthbf-1和经vero-dslam细胞传代的rhbf-1，反转录为cdna。在rhbf的酶切位点bsiwⅰ上下300bp处设计引物(上游5-ggtatcgccttgggttca-3,下游5-aggcagcgatccaaatgt-3)，以各自的cdna为模板，进行pcr扩增，pcr产物一部分送往公司测序，一部分做pmeⅰ酶切。rhbf-1的基因组中人为添加了pme i酶切位点，wthbf-1中无此位点识别序列。
[0074]
1.8病毒生长特性
[0075]
将wthbf-1和rhbf-1分别按照moi＝0.1接种于vero-dslam细胞，在感染后12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h，分别收获细胞和上清，冻存于-80℃冰箱。取不同时间点收获的病毒悬液100μl进行10倍系列稀释。96孔板中每个稀释度分别做4个重复，每孔接种100μl vero-dslam细胞(5
×
104个)，感染后第6-8d，观察cpe，分别计算不同时间点，上清和细胞相关的病毒滴度(tcid
50
/ml)。利用软件grappad prism 6绘制病毒生长曲线。
[0076]
2结果
[0077]
2.1 hbf-1株全基因组序列测定与分析
[0078]
用rt-pcr方法获得覆盖hbf-1全基因组的11个基因片段，经1％琼脂糖凝胶电泳，11个目的条带，大小与预期结果相符。hbf-1株全基因组测序结果与genbank中hebei株序列比对发现：有13处氨基酸发生变异，其中，p蛋白突变率为0.39％，h蛋白突变率为0.33％，是变异率最高的二个结构蛋白。
[0079]
2.2 hbf-1全长质粒鉴定
[0080]
含有hbf-1株感染性cdna克隆的重组质粒pccdv3.2-hbf-1，分别经notⅰ和bsiwⅰ、pacⅰ和cpoⅰ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，得到大小分别为17300bp、3500bp和14100bp、6700bp目的条带，与预期结果相符(图2)。
[0081]
2.3辅助质粒鉴定
[0082]
辅助质粒pccdv3.1-n、pccdv3.1-p、pccdv3.1-l分别经nheⅰ、pmeⅰ、mluⅰ限制性酶切位点进行酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳，获得6600bp、5000bp、1700bp、12000bp的目的条带，与预期结果一致(图3)。
[0083]
2.4重组病毒rhbf-1的鉴定
[0084]
2.4.1免疫荧光检测
[0085]
将重组病毒rhbf-1感染vero-dslam细胞，观察到典型细胞病变情况(图4a)，同时空白对照无病变(图4b)，用犬瘟热n蛋白单克隆抗体进行免疫荧光，进一步确定。结果发现，发生病变的细胞能与cdv-np抗体特异性结合，呈阳性信号(图4c)，空白对照组无荧光，为阴性(图4d)。
[0086]
2.4.2 rt-pcr检测结果
[0087]
分别提取wthbf-1和重组病毒rhbf-1的总rna，反转录为cdna，以其为模板，进行rt-pcr和酶切鉴定。结果显示，野生型wthbf-1不能被pmeⅰ切割，pcr片段和酶切结果均显示600bp大小的目的条带(图5a)。重组病毒rhbf-1的pcr扩增产物，则可以被bsiwⅰ酶切。pcr产物大小约为600bp，pme i酶切后，被截断为两个大小约为300bp的目的条带。由于2个目的条带大小均为300bp，因此，电泳凝胶结果显示为1条带(图5a)。rhbf-1的rt-pcr鉴定产物，测序结果也验证了遗传标记bsiw i识别序列的存在(图5b)。
[0088]
2.4.3 rhbf-1的形态鉴定
[0089]
重组病毒rhbf-1的上清液用于负染，在电子显微镜下观察。结果可见，病毒粒子外部有一层囊膜包裹，囊膜上含有纤突，是副黏病毒的形态特征(图6)。
[0090]
2.4.4重组病毒与亲本毒株在vero-dslam细胞上的生长特性比较
[0091]
将拯救获得的rhbf-1在vero-dslam细胞上传代9次，测定每一代病毒悬液所含病毒滴度。结果可见，从第4代起，病毒滴度有明显上升，达到105tcid
50
/ml(图7a)，同野生型wthbf-1的滴度较为接近。将wthbf-1与rhbf-1感染以moi＝0.1感染vero-dslam细胞，不同时间点收集上清与细胞，并测定各个时间段的病毒滴度，绘制出生长曲线。可见，与wthbf-1相比，rhbf-1存在基本一致的生长特性(图7b)。