一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于动物病原检测领域，具体涉及一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法。

背景技术：

猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)属于黄病毒科，瘟病毒属，是单股正链rna病毒，是猪瘟的病原，危害家猪和野猪，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)感染引起的疣猪、豪猪、野猪以及家养猪的一种烈性传染病。该病毒属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是线状双链dna病毒。猪感染该病毒后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％。世界动物卫生组织(oie)将猪瘟和非洲猪瘟列为法定上报的动物疫病，在我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将猪瘟和非洲猪瘟列为一类动物疾病。

目前，非洲猪瘟常用的实验室检测方法主要为病原学检测。在病原学诊断方面，病毒的分离鉴定是诊断动物疫病的金标准，但由于非洲猪瘟的分离培养对实验室的水平要求较高，多数地方不具备这个条件，因而该方法很难普及推广。荧光pcr是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术，2019年1月4日，中国动物疫病预防控制中心公布了第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂评价结果，共3类11个品种，其中有8个为荧光pcr产品。

尽管非洲猪瘟具有典型的临床症状和病理变化，但由于临床感染日趋复杂，多种病原混合感染，因而很难依据临床症状和病理变化对非洲猪瘟作出确诊，尤其与对养猪业危害较大的猪瘟更加无法区分。此外，目前在世界范围内尚无可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，因而对于非洲猪瘟只能是尽早做出准确地诊断，从而及时采取相应的扑杀、消毒等措施。如果能够建立一种既方便、快捷，又能区分猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的鉴别诊断方法，从而为临床上猪瘟与非洲猪瘟的快速确诊提供科学、准确的依据，进而为相应防控措施的制定提供指导方向，这将具有巨大的市场应用前景。

目前检测单一猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的荧光rt-pcr和荧光pcr方法和专利均有报道，而能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测试剂及其制备方法与应用，还罕见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供分别用于检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的荧光pcr引物和探针。

本发明的第二个目的是提供用于检测和鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测方法。

与单重荧光pcr相比，本发明通过引物设计和pcr各组分的调整，在敏感性和特异性均不降低的前提下，实现一次分析，同时检测和区分猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能大大节省检测的时间，为疫病防治赢得宝贵时间；

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂，针对猪瘟病毒5’-utr基因和非洲猪瘟病毒p72基因，分别设计并筛选出能覆盖所有毒株，又适合双重检测的引物和探针，包括二对特异性引物和二条特异性探针，扩增目的片段长度分别为94bp和249bp，引物和探针序列为：

猪瘟病毒：

上游引物csfv-f：5’-tgcccayagtaggactag-3’seqidno.1

下游引物csfv-r：5’-ctactgacgactgtcctg-3’seqidno.2

探针csfv-p：5’-tggcgagctccctgggtggtcta-3’seqidno.3

非洲猪瘟病毒：

上游引物asfv-f：5’-gataccacaagatctgccgt-3’seqidno.4

下游引物asfv-r：5’-ctgctcatggtatcaatcttatcg-3’seqidno.5

探针asfv-p：5’-ccacgggaggaataccaacccagtg-3’seqidno.6

所述探针csfv-p和探针asfv-p在5’端分别标记不同的荧光报告基团，所述探针csfv-p和探针asfv-p在3’端均标记相同或不同的荧光淬灭基团，所述上游引物csfv-f中的y为简并碱基，y＝c/t。

进一步的，所述荧光报告基团为fam或vic，所述荧光淬灭基团为tamra或bhq。

进一步的，所述探针csfv-p在5’端标记fam，在3’端标记tamra；所述探针asfv-p在5’端标记vic，在3’端标记bhq。

一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂盒，包括所述的二对特异性引物和二条特异性探针。

进一步的，所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶、阳性对照和阴性对照。

进一步的，所述反应缓冲液为onesteprt-pcrbuffer；所述酶为extaq和primescriptrtenzyme；所述阳性对照为猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒合成片段的体外重组质粒；所述阴性对照为灭菌去离子水。

一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测方法，包括以下步骤：

步骤一、提取待测样本的dna和rna，将rna反转录成cdna；

步骤二、以步骤一中所述的dna和cdna为模板，利用权利要求4所述的试剂盒进行双重荧光pcr扩增；

步骤三、分析pcr产物，根据扩增反应结果判定待测样本中是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒。

进一步的，步骤二中，猪瘟病毒5’-utr基因最适上游引物csfv-f和下游引物csfv-r的终浓度均为0.4μmol/l，最适探针csfv-p的终浓度为0.6μmol/l；检测非洲猪瘟病毒p72基因最适上游引物asfv-f、下游引物asfv-r的终浓度均为0.6μmol/l，最适探针asfv-p的终浓度为0.6μmol/l。

进一步的，步骤二中，双重荧光pcr扩增的反应程序为：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃30s，共45个循环。

本发明相对于现有技术的有益效果是：

(1)覆盖性和通用性好：本发明中涉及的引物和探针都分别针对猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒最保守的基因设计，覆盖了genebank中现有该种病毒的所有序列，不会存在漏检的情况。另外，本发明的引物和探针形成的扩增条件与其它几种猪重要传染病的扩增条件相同，可以与其它疫病在同一平台同时开展实验，通用性较好，这是目前医学诊断已经开始的研发方向，目的是让诊断更快捷、更方便；这是本发明的主要创新点。

(2)多重性和高通量：该双重荧光pcr体系可实现在一个反应中同时对猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒进行快速鉴别检测，65分钟内即可完成检测，节约了检测时间和成本。能满足大批量检测的要求，有利于疫病特别是混合感染的及时确诊，为疫病防治赢得宝贵时间。

(3)灵敏度高：该双重荧光pcr检测方法的灵敏性与相应的单重荧光pcr检测方法相当，克服了目前国产商品化的多重荧光pcr试剂盒敏感性下降的弱点。

(4)特异性强：设计引物和探针时充分考虑了病原之间可能存在的干扰，经实验证明该双重荧光pcr与猪只常见的其它重要传染病，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒之间无交叉反应。

(5)本发明的扩增循环数由目前国产试剂盒常用的40循环增加到进口试剂盒常用的45个循环，结果判定标准由常用的35个循环增加到38个循环，使试剂盒的整体水平有了进一步的提升；这也是本发明的创新点之一。

附图说明

图1为本发明中猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒基因特异性扩增曲线。其中，1为猪瘟病毒阳性对照扩增曲线；2为非洲猪瘟病毒阳性对照扩增曲线；3-11为阴性对照、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒扩增曲线。

图2为本发明中猪瘟病毒基因扩增曲线。

图3为本发明中猪瘟病毒基因标准曲线。

图4为本发明中非洲猪瘟病毒基因扩增曲线。

图5为本发明中非洲猪瘟病毒基因标准曲线。

图6为本发明中猪瘟病毒基因单重与双重荧光pcr扩增曲线的比较。其中，1为猪瘟病毒单重荧光pcr扩增曲线；2为猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr中猪瘟病毒扩增曲线。

图7为本发明中非洲猪瘟病毒基因单重与双重荧光pcr扩增曲线的比较。其中，1为非洲猪瘟病毒单重荧光pcr扩增曲线；2为猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr中非洲猪瘟病毒扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料如无特殊说明均为常规生化试剂。

实施例1：

用于检测和鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测方法的建立。

第一步骤是猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒引物、探针的设计与合成：

在ncbi序列比对分析的基础上，针对猪瘟病毒5’-utr基因和非洲猪瘟病毒p72基因，分别设计并筛选出能覆盖所有毒株，又适合双重检测的引物和探针，包括二对特异性引物和二条特异性探针，扩增目的片段长度分别为94bp和249bp，引物和探针序列如下：

猪瘟病毒：

上游引物：f：5’-tgcccayagtaggactag-3’seqidno.1

下游引物：r：5’-ctactgacgactgtcctg-3’seqidno.2

探针：p：5’-tggcgagctccctgggtggtcta-3’seqidno.3

探针在5’端标记fam，3’端标记tamra。

非洲猪瘟病毒：

上游引物：f：5’-gataccacaagatctgccgt-3’seqidno.4

下游引物：r：5’-ctgctcatggtatcaatcttatcg-3’seqidno.5

探针：p：5’-ccacgggaggaataccaacccagtg-3’seqidno.6

探针在5’端标记vic，3’端标记bhq。

第二步骤是猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒阳性对照的制备：

(1)在ncbi网站中，对猪瘟病毒5’-utr基因序列进行比对，选择一段序列保守、且包含上述引物的片段，将该片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；将合成的片段与克隆载体连接，转化至dh5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的猪瘟病毒阳性对照。

(2)在ncbi网站中，对非洲猪瘟病毒p72基因序列进行比对，选择一段序列保守、且包含上述引物的片段，将该片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；将合成的片段与克隆载体连接，转化至dh5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的非洲猪瘟病毒阳性对照。

第三步骤是优化检测猪瘟病毒5’-utr基因和非洲猪瘟病毒p72基因的双重荧光pcr反应体系与扩增条件：

(1)对第一步骤确定的引物和标记探针的浓度，用无菌水分别稀释至终浓度为0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.6μmol/l、0.8μmol/l、1.0μmol/l和1.2μmol/l。

(2)采用onestepprimescriptrt-pcrkit试剂及推荐的反应扩增条件，在abi7500pcr仪上对不同使用浓度组合的引物和标记探针进行荧光rt-pcr矩阵法筛选试验。

(3)以获得最小ct值、较高的荧光强度增加值(δrn)以及典型的s型扩增曲线为综合判定依据，最终确定检测猪瘟病毒5’-utr基因最适上游引物、下游引物的终浓度均为0.4μmol/l，最适探针的终浓度为0.6μmol/l；检测非洲猪瘟病毒p72基因最适上游引物、下游引物的终浓度均为0.6μmol/l，最适探针的终浓度为0.6μmol/l。

(4)在最适引物和探针浓度以及通用荧光rt-pcr反应扩增试剂条件下，扩增体系中反应缓冲液的添加量依次为6μl、8μl、10μl和12μl，对扩增反应液的使用量进行筛选，以获得最小ct值、较高的荧光强度增加值(δrn)以及典型的s型扩增曲线为综合判定依据，最终确定反应缓冲液的添加量为10μl。

(5)在最适引物探针浓度和最佳反应缓冲液添加量以及通用荧光rt-pcr反应扩增试剂条件下，扩增体系中酶的添加量依次为0.6μl、0.8μl、1.0μl和1.2μl，对酶的使用量进行筛选，以获得最小ct值、较高的荧光强度增加值(δrn)以及典型的s型扩增曲线为综合判定依据，最终确定酶的添加量为1.0μl。

(6)在最适引物探针浓度和最佳反应缓冲液、酶添加量以及通用荧光rt-pcr反应扩增试剂条件下，对退火延伸温度在55℃--62℃范围内进行筛选试验，最终确定退火延伸温度为60℃。

(7)优化的20μlpcr反应体系中，猪瘟病毒上、下游引物的终浓度均为0.4μmol/l，探针的终浓度为0.6μmol/l，非洲猪瘟病毒上、下游引物的终浓度均为0.6μmol/l，探针的终浓度为0.6μmol/l，反应缓冲液的使用量为10μl，酶的添加量为1.0μl，模板的添加量为2.0μl，去离子水补足至总体积20μl。优化的pcr扩增条件为：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃30s，共45个循环。

(8)结果判定

1)质控标准：

阳性对照出现特定的s形扩增曲线，且ct值在20-25左右；阴性对照无扩增曲线，且无ct值。

满足此条件，判定检测结果成立。

2)结果判定：

a、待测样本在fam和vic通道均出现特定扩增曲线，且ct值≤38，则判定待测样品中同时存在猪瘟病毒和非洲猪瘟核酸；

b、待测样本在fam或vic某一通道出现特定扩增曲线，且ct值≤38，则判定待测样品中存在猪瘟病毒或非洲猪瘟核酸；

c、待测样本在fam和/或vic通道出现特定扩增曲线，且38＜ct值≤40，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性；

d、待测样本在fam和vic通道均未出现特定扩增曲线，且ct值＞40或无ct，则判定待测样品中无猪瘟病毒或非洲猪瘟核酸。

第四步骤是猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光pcr特异性实验：

(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒，均为购买的商品化疫苗。上述疫苗核酸的提取按照相应的商品化试剂盒说明书进行；

(2)以第三步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光pcr扩增，结果表明猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒阳性对照均出现特定的扩增曲线；猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和阴性对照等均未出现特定的扩增曲线。实验结果见图1。

第五步骤是猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光pcr敏感性和标准曲线的建立：

(1)对猪瘟病毒5’-utr基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第三步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光pcr扩增，荧光pcr扩增的动力学曲线见图2；

(2)根据扩增曲线结果绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为：y＝-3.17x+39.73，相关系数(r²)为0.999，扩增效率为106.8％，见图3；表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到10个拷贝的猪瘟病毒5’-utr基因阳性对照分子，可用于猪瘟病毒核酸的定性和定量检测；

(3)对非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第三步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光pcr扩增，荧光pcr扩增的动力学曲线见图4；

(4)根据扩增曲线结果绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为：y＝-3.256+38.05，相关系数(r²)为1，扩增效率为102.8％，见图5；表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到10个拷贝的非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照分子，可用于非洲猪瘟瘟病毒核酸的定性和定量检测。

实施例2

用于检测和鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测方法的应用。

依据本发明建立的检测与鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光pcr方法和之前建立的猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒单重荧光pcr检测方法进行比较，以两种病毒不同浓度的重组质粒组合作为临床样品(样品编号为：1-12)，以灭菌水为阴性对照，分别采用本发明提供的方法和单重荧光pcr方法进行实验室检测，结果见表1、图6和图7。结果表明，猪瘟病毒单重荧光pcr的荧光强度高于猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr中猪瘟病毒的荧光强度，结果见图6(为了更加清楚的比对，图6只展示了组合质粒7-12猪瘟病毒的扩增结果)；12个质粒组合样品的平均ct值二者相差0.05，几乎无差异。非洲猪瘟病毒单重荧光pcr的荧光强度和猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr中非洲猪瘟病毒的荧光强度几乎没有差异，结果见图7(为了更加清楚的比对，图7只展示了组合质粒1-6非洲猪瘟病毒的扩增结果)；12个质粒组合样品的平均ct值二者相差0.32，也在正常差异范围内。这些结果表明采用本发明提供的检测和鉴别猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的双重荧光pcr检测方法与相应的单重荧光pcr检测方法相比，灵敏性和特性性并没出现差异，但反应时间大大缩短，进而为检测赢得了宝贵时间。

表1本发明的检测方法与单重荧光pcr检测方法ct值结果比较

本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>黑龙江八一农垦大学

黑龙江省农垦科学院

<120>一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgcccayagtaggactag18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctactgacgactgtcctg18

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tggcgagctccctgggtggtcta23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gataccacaagatctgccgt20

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctgctcatggtatcaatcttatcg24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccacgggaggaataccaacccagtg25