一种杆菌肽及其组分的分析方法与流程

技术背景

本发明涉及药物分析化学领域，具体而言，涉及一种杆菌肽及其组分的分析方法。

背景技术：

杆菌肽(结构式结合图1和表1)是由枯草杆菌和地衣芽孢杆菌产生的多组分抗菌肽，能强烈抑制革兰氏阳性菌，主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染。杆菌肽具有特殊的抑菌机理，会干扰细菌细胞壁的合成，同时在肽聚糖的合成中抑制磷脂受体的再生，使得其具有抗菌谱广、不易产生耐药性等特性。在药用过程中添加锌离子以增强活性。

表1杆菌肽结构通式a和b的rn的表达式

由于是发酵产品，杆菌肽组分较多，在《美国药典》40版中收录了杆菌肽a、b、c、f等组分，《欧洲药典》9.6版中收录了19种组分或有关物质，另外还有其他未知组分。而《美国药典》40版、《欧洲药典》9.6版采用的高效液相色谱法(磷酸氢二钾/乙腈/甲醇体系)选择非挥发性流动相体系，不适合直接进行质谱分析，无法实现在线确定未知组分的结构。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明中公布了一种杆菌肽及其组分的分析方法，该方法为高效液相色谱-质谱(hplc-ms)分析方法。经一级质谱及二级质谱分析验证这种杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y，命名为杆菌肽hz(bacitracinhz)。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案包括：

本发明的第一方面是提供一种新的杆菌肽，命名为杆菌肽hz(bacitracinhz)。该种杆菌肽的组分为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y。

进一步地，亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑啉环，6至12位氨基酸形成环7肽；双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a是指原杆菌肽a的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙烯基化，其结构如下：

或原杆菌肽a的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的α”位发生乙烯基化，其结构如下：

进一步地，所述双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑环，6至12位氨基酸形成环7肽；双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y是指原杆菌肽y的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙基化，其结构如下：

进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a，β’及α”、β”-碳的构型是r构型或s构型。

进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的组成氨基酸是l型或d型。

进一步地，双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的β’-碳的构型是r构型或s构型。

进一步地，双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的组成氨基酸是l型或d型。

进一步地，杆菌肽hz的1位、5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸，转化后形成的组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化。

进一步地，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式a-i和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式y-i分别如下所示：

本发明的第二方面提供存在于杆菌肽hz新的非天然蛋白质氨基酸：2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸a、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸b、3-乙烯基半胱氨酸c、2-乙烯基半胱氨酸d，结构式如下：

进一步地，杆菌肽包括杆菌肽hz的氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物、磺酸化产物等，或者其他杆菌肽产物。

本发明的第三方面是提供包括杆菌肽hz的杆菌肽原料药或杆菌肽锌原料药或药物组合。

本发明的第四方面是提供包括上述原料药或药物组合物的药物制剂为注射剂、软膏剂或眼膏。

本发明的第五方面是提供获得杆菌肽的组分及其结构的方法为高效液相色谱-质谱(hplc-ms)分析方法。

进一步地，ms离子化方式可以选择电喷雾离子化、大气压离子化等，优选为电喷雾离子化。

进一步地，ms的质量分析器可以选择四级杆飞行时间质谱、线性或三维离子肼质谱、三重四级杆质谱、轨道离子肼质谱等，优选为四级杆飞行时间质谱。

进一步地，杆菌肽hz及其他杆菌肽组分可以通过一级质谱及二级质谱的信息进行结构判断。

进一步地，ms及ms/ms扫描范围为50-2000amu。

进一步地，二级质谱碰撞能量设置范围为10-30ev，优选为20ev、30ev。

进一步地，测得的杆菌肽hz的分子量为736.8908([m+2h]²⁺)，二级质谱的特征离子为m/z604.32、491.23、382.14、362.19、334.19、253.10、249.11和110.07。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次发现杆菌肽hz，即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y，可能具有不同于常见杆菌肽组分的抗菌活性或毒性，有潜在的应用价值，并且该类化合物的结构确证也为严格控制杆菌肽的质量提供了研究基础；

(2)本发明首次通过ms及ms/ms数据鉴定了双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的结构；

(3)本发明揭示存在新的非天然蛋白质氨基酸，如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、3-乙烯基半胱氨酸、2-乙烯基半胱氨酸；

(4)本发明中的hplc-ms/ms方法可用于直接分析杆菌肽中的其他组分的结构，即综合采用一级质谱获得分子量、二级质谱碎片离子及氨基酸残基离子推测组分结构，该解析策略也可推广至其他多肽类抗生素的结构解析中。

附图说明

图1为本发明背景技术中杆菌肽组分的结构通式；

图2为本发明一实施例中杆菌肽供试品的质谱总离子流图；

图3为本发明一实施例中杆菌肽hz的一级质谱图；

图4为本发明一实施例中杆菌肽hz的二级质谱图；

图5为本发明一实施例中杆菌肽a的裂解规律图；

图6为本发明一实施例中杆菌肽hz：双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的化学结构式；

图7为本发明一实施例中杆菌肽hz：双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的化学结构式；

图8为本发明一实施例中杆菌肽hz：双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a-i(1位异亮氨酸被亮氨酸取代)的化学结构式；

图9本发明一实施例中为杆菌肽hz：双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y-i(1位异亮氨酸被亮氨酸取代)的化学结构式；

图10本发明一实施例中为新的非天然蛋白质氨基酸的化学结构式；

其中，a：2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、b：2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、c：3-乙烯基半胱氨酸、d：2-乙烯基半胱氨酸。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

本发明中涉及的杆菌肽，以杆菌肽《美国药典》对照品为具体实施案例，但也可适用于其他杆菌肽对照品及制剂中。

实施例1

本实施例提供一种新的杆菌肽，命名为杆菌肽hz(bacitracinhz)。该种杆菌肽的组分为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y。其中，亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑啉环，6至12位氨基酸形成环7肽。双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的组成单元包括1位异亮氨酸、2位半胱氨酸、3位亮氨酸、4位谷氨酸、5位异亮氨酸、6位赖氨酸、7位鸟氨酸、8位异亮氨酸、9位苯丙氨酸、10位组氨酸、11位天冬氨酸、12位天冬酰胺，1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑环，6至12位氨基酸形成环7肽。

双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a是指原杆菌肽a的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙烯基化，其结构如(ⅰ)所示；或1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的α”位发生乙烯基化，其结构如(ⅱ)所示；双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y是指原杆菌肽y的1位异亮氨酸处的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化，2位半胱氨酸处的β”位发生乙基化，其结构如(ⅲ)所示。

双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a中的β’及α”、β”-碳的构型是r构型或s构型，组成氨基酸是l型或d型。双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的β’-碳的构型是r构型或s构型，组成氨基酸是l型或d型。

杆菌肽hz的1位、5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸，转化后形成的组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化。其中，双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式a-i和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式y-i分别如下所示：

实施例2

本实施例提供杆菌肽hz在药物中的应用。一种包括杆菌肽hz的杆菌肽原料药或药物组合以及包括上述原料药或药物组合物的药物制剂。

所述药物制剂的组成包括注射用杆菌肽、杆菌肽软膏、杆菌肽眼膏。

其中，注射剂的规格为每毫升1000单位(溶于等渗氯化钠注射液)；

软膏剂的规格为1g：500单位、5g:4000单位；

眼膏的规格为1g：500单位、2g:1000单位。

验证实验

本研究前期开发了一种甲酸铵-乙腈分离体系(中国药学杂志，2018，53(23):2041-2046及中国发明专利：201811467424.3)，对杆菌肽各组分的分离效果较佳，并可直接用于质谱分析。本验证实验将采用甲酸铵-乙腈分离体系的质谱分析方法来对杆菌肽hz的结构进行解析。

一、仪器与试药

agilent1290型高效液相色谱仪-6550qtof-ms(美国agilenttechnologies公司)。

杆菌肽《美国药典》对照品(批号：r048co)。

二、实验条件

本发明中采用中国发明专利(张含智等，一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法，中国发明专利，201811467424.3)中的液相方法，即以50mmol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至4.0)为流动相a，乙腈为流动相b，按下表2中的线性梯度条件洗脱，流速为1ml/min；柱温为30℃；进样量为4μl；检测波长为254nm。以esi-q/tof-ms为检测器，以正离子扫描模式采集一级质谱图和二级质谱图，采集范围m/z50-1700，二级质谱碰撞能量为10-30ev。

表2流动相a和流动相b的线性洗脱条件

三、杆菌肽对照品样品溶液配制及分析

精密称杆菌肽《美国药典》对照品20mg，置10ml量瓶中，加流动相a-流动相b(77:23，v:v)溶解并定量稀释至刻度，摇匀，浓度为2mg/ml。经hplc-esi-q/tof-ms分析，其总离子流图见图2所示，杆菌肽a及杆菌肽hz的洗脱位置见图中所示(杆菌肽hz的一级质谱图见图3所示，杆菌肽hz的二级质谱图见图4所示)。

四、杆菌肽a的结构解析

以杆菌肽a为例介绍结构解析过程，其准分子离子峰[m+h]⁺的m/z为1422.76。在溶液状态或是在电喷雾过程中，杆菌肽a容易加和两个h⁺而主要以[m+2h]²⁺(m/z，711.89)存在。以[m+2h]²⁺为母离子，调整碎裂电压得到杆菌肽a的二级质谱图，其裂解规律见图5所示。杆菌肽a从线性链端(n端)开始裂解时，首先脱去异亮氨酸脱羧正离子(a1离子，m/z，86.10)得到x11离子(m/z，1337.67)，再失去噻唑啉环酰基得到y10离子，然后失去亮氨酰基、谷氨酰基、异亮氨酰基得到y9、y8、y7离子，最终为环七肽；以上肽均易失去天冬酰胺上的氨基。相应的b离子如b5、b4、b3及b2，另外b离子也可以失去酰基(如b3离子失去酰基得到碎片离子m/z284.18)或a1离子得到低端分子量的碎片峰。环肽的特征离子丰度较低，有两条裂解路径，其一是经历失去苯丙氨酰基和异亮氨酰基(同时失去，碎片离子m/z627.29)、天冬氨酰氨基(碎片离子m/z513.25)及天冬氨酰基(碎片离子m/z398.22)的过程，最后的碎片离子(m/z，243.18)只包括赖氨酸和鸟氨酸；其二是失去鸟氨酰基和赖氨酰基、天冬氨酰氨基、天冬氨酰基得到特征碎片。在低端分子量可以观测到组成杆菌肽a的氨基酸残基，如亮氨酰基或异亮氨酰基失去酰基后的碎片离子(m/z，86.10)、谷氨酰基残基(m/z，102.06)、鸟氨酰基残基(m/z，115.09及87.09)、苯丙氨酰残基(m/z，120.08)、组氨酰基残基(m/z，138.07及110.07)、天冬氨酸残基(m/z，88.04)、天冬酰胺残基(m/z，87.06)及赖氨酰胺残基(m/z，129.10)，各氨基酸残基的详细数据及以上碎片离子信息可以还原出杆菌肽a的序列，也能为其他组分的结构推导提供借鉴。

五、杆菌肽hz的结构解析

杆菌肽hz的m/z为736.89([m+2h]²⁺)，与杆菌肽a相比，分子量增加50。与杆菌肽a的二级质谱碎片离子比对发现，特征离子m/z491.23、362.19、334.19、249.11比杆菌肽a相应的离子441.22、312.17、284.18、199.09分子量增加50，说明线性肽段发生变化。特征离子a1的m/z为110.07比杆菌肽a的a1增加24，推测1位异亮氨酸的β’-甲基及γ’-甲基发生亚甲基化。碎片离子253.09比杆菌肽a的相应离子227.09大26，结合m/z249.11及110.07，可判断发生修饰的位点在噻唑啉环上，推测在原2位半胱氨酸处的β”或α”位发生乙烯基化，即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a，见图6中的结构式。

也有可能噻唑啉环转化为噻唑环，β”位发生乙基化，即双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y，见图7中的结构式。

1位异亮氨酸也有可能转化为亮氨酸，即γ’处的两个甲基发生亚甲基化，则杆菌肽hz结构式也有可能如图8(即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a-i)、图9(即双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y-i)中所示。

四种新的非天然蛋白质氨基酸，如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸(a)、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸(b)、3-乙烯基半胱氨酸(c)、2-乙烯基半胱氨酸(d)，其结构式如图10所示，未标识α-碳的手性，r或s构型均有可能。其中，a或者b对应的是杆菌肽的1位氨基酸，c或d对应的是杆菌肽的2位氨基酸。

综上所述，本发明中发现了新的杆菌肽组分，并可通过hplc-ms及ms/ms方法解析其结构，将其命名为杆菌肽hz，即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽a及双亚甲基化及乙基化的杆菌肽y。另外，本发明揭示存在新的非天然蛋白质氨基酸，如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、3-乙烯基半胱氨酸、2-乙烯基半胱氨酸。这种新型的多双键化组分可能具有不同的抗菌活性及生物活性，具有潜在的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。