一种3D微载体细胞吸附培养的方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，特别涉及一种3d微载体细胞吸附培养的方法。

背景技术：

细胞培养技术作为医学生物技术中最核心、最基础的技术，广泛应用于生命科学的众多领域，与其他学科领域的交叉研究也日趋增多。传统细胞培养指细胞浸入到培养液中在普通的玻璃或塑料培养瓶、培养皿及培养板的表面生长，并且只会沿着二维平面延伸，是二维培养模式。二维培养，虽然具有较好的伸展性，但不能充分真实模拟体内生长模式，最终影响细胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表达等细胞过程。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种3d微载体细胞吸附培养的方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种3d微载体细胞吸附培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

s01：将载体浸没于pbs缓冲液中，灭菌后得到载体悬液；

s02：去除步骤s01载体悬液中的pbs缓冲液并晾干载体，加入包被液，在二氧化碳培养箱中对载体进行包被；

s03：去掉包被液，将载体浸没于细胞悬液中，放入二氧化碳培养箱中进行细胞吸附；

s04：吸附完成后，将步骤s03中的载体取出，放入无血清培养基，静态培养；

所述的载体为3d微载体。

优选地，所述细胞悬液的密度为5×10⁵～1×10⁶个细胞/ml，所述的细胞悬液为间充质干细胞重悬于无血清培养基中得到，所述细胞悬液的体积与所述3d微载体的数量比为600～1500μl/每片3d微载体。

优选地，步骤s01中，灭菌时，在103.4kpa蒸汽压下，121℃灭菌20分钟。

优选地，步骤s02中，包被时间为1-3小时。

优选地，步骤s03中，细胞吸附时间为2-4小时。

优选地，所述的二氧化碳培养箱中，二氧化碳的浓度为5％，温度为37℃。

优选地，所述的载体成分为100％纯聚对苯二甲酸乙二醇酯。

优选地，步骤s03中，细胞悬液和载体均置于离心管中，当离心管放入二氧化碳培养箱中进行细胞吸附，离心管盖悬松；间隔一定的时间，将离心管取出，封闭并摇晃离心管，再重新放入二氧化碳培养箱中。

本发明的工作原理：

本发明先对载体进行预处理，然后进行包被，再使得细胞吸附于载体上，最后培养细胞，细胞在载体上增值生长。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.三维细胞培养技术是将细胞放置在模仿体内细胞环境的三维培养载体内进行体外培养，细胞在三维载体的立体空间结构中生长，构成三维的细胞载体复合物。相较于传统的二维单层细胞培养，三维培养能更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，为细胞的最佳生长、分化提供了一个合适的微环境，并有在体外创造组织样结构的能力。通过允许单个细胞维持其正常的三维形状，有助于细胞与相邻细胞间形成复杂的相互作用和信号接收及发送，为不同类型的细胞培养创造一个更自然的生长环境。

2.本发明中的微载体来源简单，可以大规模制造，并且是医药级别，是细胞临床治疗的可行性路径。

3.本发明的细胞吸附于载体类似于一种潮汐式系统，将细胞交替暴露于培养基和氧气中，当离心管放入二氧化碳培养箱中，离心管盖悬松，细胞暴露于氧气中，间隔一定的时间，将离心管取出，封闭并摇晃离心管，此时细胞和氧气隔绝，细胞只暴露于无血清培养基中，即将细胞交替暴露于培养基和氧气中，这样短时间内可以促进细胞贴附在载体上，这样细胞可以比较均匀的分散于每片载体上，然后可以贴附生长，这种培养方式和后期大规模生物反应器的配合使用非常方便，是一种更好的三维培养模式，细胞的功能发挥更好。

4.本发明方法细胞吸附在载体上，其吸附率高；细胞的增值能力强，培养7天，增值倍数可以达到5倍左右。

5.本发明的载体成分为100％纯聚对苯二甲酸乙二醇酯，医药级别，在载体的培养上更有优势，更利于载体生长。

附图说明

图1是本发明吸附在载体上的细胞数量示意图；

图2是本发明吸附在载体上的细胞吸附效率示意图；

图3是本发明带有细胞的载体染色结果示意图；

图4是本发明细胞增值能力示意图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例中所用的耗材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；实施例中的细胞为从胚胎干细胞诱导分化成的间充质干细胞。

本发明所用的3d微载体是bionoc^tmii，是一种片状微载体，成分是100％纯聚对苯二甲酸乙二醇酯，商购于新加坡esco生物公司。

实施例1

1.载体灭菌：取30片载体(3d微载体，以下都称为载体)加入到含有30mlpbs(无ca²⁺或mg²⁺)的50ml离心管，使载体分别完全浸没在pbs中，121℃高压灭菌20分钟。灭菌后，将载体悬液保存在室温，保证浸没pbs中直至使用。

2.载体附着因子包被

将灭菌后的载体悬液置于生物安全柜，在生物安全柜进行操作，吸走离心管中多余的pbs，并用无菌镊子将载体转移到培养皿中，大约40分钟让载体完全晾干；

将在载体转移到三支15ml新的离心管中，每管10片载体，分别加入浓度为10ug/ml的fibronectin(纤维粘连蛋白)3ml,包被载体2小时，保证包被液浸没载体。(fibronectin包被液从市场上买来后，用含ca²⁺或mg²⁺的pbs稀释至10ug/ml)；

达到包被时间后，吸出离心管中多余的包被液，并用无菌镊子将载体转移到培养皿，大约40分钟让载体完全干透，并将载体转移到新的15ml离心管中(共三支，每支10片载体)，盖上盖子，暂放生物安全柜。

3.细胞准备

将新鲜培养，状态良好的p2代esc-msc(人胚胎干细胞来源的间充质干细胞),细胞数量1.5*10⁶，存活率大于90％，用6ml无血清培养基(购于友康生物，本发明的无血清培养基均是完全无血清的)重悬细胞，制成细胞悬液。

4.细胞接种

将细胞悬液平均分成3份，命名为a、b、c，用1ml移液器将细胞悬液沿管壁缓慢加入离心管中，该离心管内的载体已经过包被处理，每管10片载体浸没在2ml细胞悬液中。

5.细胞吸附(即细胞接种)

a、轻轻翻转离心管2-3次，以使细胞与载体均匀混合，并避免倾斜超过90°，目的是为了减少细胞损失。且混合细胞时，把瓶盖旋紧。

b、将离心管直立置于37℃的co2培养箱中(培养箱中二氧化碳的含量为5％)，培养3-4小时。放置在co2培养箱时，把瓶盖松开。

在第一个小时内每隔15分钟，重复步骤a以混匀已沉到管底的细胞。之后将管放回co2培养箱中。在接下来的2-3小时内，以30分钟的间隔重复步骤a。

孵育3小时后，将离心管放入生物安全柜中，轻轻混合培养液，并抽取约50ul培养液,进行细胞计数。计算出留在培养液中的悬浮细胞并计算附着细胞的百分比(即吸附率)。将接种总数量减去留在培养液中的悬浮细胞数，即为吸附在载体上的细胞数量，如图1所示；吸附率如图2所示。

6.细胞培养

细胞吸附到载体上后，将载体转移到t25培养瓶，每瓶加入8ml无血清培养基(购于友康生物)，共a、b、c三瓶,轻轻混匀，使载体均匀分散在t25培养瓶中，之后放入37℃，co2培养箱(培养箱中二氧化碳的含量为5％)中培养72小时后观察细胞。

7.细胞换液

细胞接种后第3天，显微镜下观察，若没有细胞从载体脱落，吸走培养液，加入新鲜的无血清培养基(购于友康生物)8ml。

细胞接种后第5天，显微镜下观察，若没有细胞从载体脱落，吸走培养液，加入新鲜的无血清培养基(购于友康生物)8ml。

8.载体染色

细胞接种后第5天，用无菌镊子从t25培养瓶分别取一片载体，用70％乙醇处理15分钟以固定细胞，之后用pbs清洗乙醇一次，加入台酚蓝染色10分钟，再用pbs清洗掉多余的染料，在明视野显微镜下观察带有细胞的载体。染色结果如图3所示。

9.细胞收获：细胞接种后第7天，显微观察，取出载体，消化细胞并计数。

具体步骤如下：

a、将每瓶t25培养瓶中的载体分别转移到15ml离心管，每支离心管用5mlpbs(不含mg²⁺或ca²⁺)轻轻洗涤载体，每次清洗时上下温和倒转离心管5次。

b、弃上清，每支离心管加入3mltrypleexpress(一种细胞消化液，用于使细胞从载体上解离下来，可从市场购买得到)在37℃co2培养箱(培养箱中二氧化碳的含量为5％)孵育15分钟，每隔5分钟轻轻弹离心管。

c、孵育结束后，将上述b中溶液转移到15ml离心管中，并加入7mlpbs。

d、将收集到的15ml离心管中的溶液300g进行离心处理，3min，弃上清，然后加入1mlpbs溶液，重新悬浮细胞在1mlpbs中,并取样20ul在细胞计数仪上进行细胞计数。最后，计算出每瓶载体所获得细胞总数量，和细胞接种时数量做对比就可判断细胞增殖能力，增值倍数结果如图4所示。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。