可结合PD-L1的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合pd-l1的多肽，所述的多肽在检测pdl1或治疗肿瘤或传染病中的应用。

背景技术：

肿瘤是指机体局部组织的细胞异常增生而形成的一种新生物，常常表现为局部的肿块。根据肿瘤的性质，一般将其分为良性肿瘤和恶性肿瘤。恶性肿瘤生长较快，易向周围组织扩散，容易发生转移，危及生命。pd-1(programmeddeath-1)蛋白是t细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白，为cd28超家族成员。一些肿瘤细胞能够表达pd-l1或者pd-l2与t细胞表面的pd-1结合，使pd-1的胞内结构域的酪氨酸磷酸化，抑制tcr信号通路，从而逃避t细胞的杀伤。因此，理论上可通过使用pdl1抑制剂例如抗pdl1抗体来对抗该免疫逃避机制，从而达到治疗这类肿瘤的目的。

1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(ch2和ch3)、一个铰链区和一个重链可变区(variableheavychaindomain，vhh，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13kda，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(nanobody，nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。

目前已有一些抗pdl1抗体作为二线药物用于治疗某些肿瘤或者用于检测是否表达pdl1以作为用药参考或预后指标。鉴于目前抗体在患者中应答率较低等原因，因此我们期望通过新的技术手段，获得更为高效稳定的抗pdl1抗体。

技术实现要素：

本发明通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗及其vhh，用于诊断和治疗pd-l1适应症病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合pd-l1的多肽，包括3个互补决定区cdr1-3，cdr1序列为或包括seqidno:1-34所示序列之一，cdr2序列为或包括seqidno:35-63所示序列之一，cdr3序列为或包括seqidno:64-100所示序列之一。

在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1-3交错排列。例如，可将fr1-4序列设计为如seqidno:101-104所示，但本发明的范围不限于此，也可将框架区fr1-4序列人源化为如seqidno:105-108所示。抗体的特异性识别和结合能力主要由cdr区序列决定，fr可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或骆驼源的fr区序列来连接上述cdr，从而得到一个可结合人pd1的多肽或结构域。

在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，所述多肽为vhh。

在一个优选实施方案中，所述多肽为骆驼源的vhh或人源化的vhh。

在一个具体实施方案中，所述多肽的cdr序列如下：cdr1的序列为seqidno:1，cdr2的序列为seqidno:35，并且cdr3的序列为seqidno:64。

在一个具体实施方案中，所述多肽的cdr序列如下：

i)cdr1的序列选自seqidno:9-11；并且

ii)cdr2的序列为39或43；并且

iii)cdr3的序列选自seqidno:72-74。

优选地，cdr1的序列为seqidno:9，cdr2的序列为seqidno:39，并且cdr3的序列为seqidno:72；或

cdr1的序列为seqidno:10，cdr2的序列为seqidno:39，并且cdr3的序列为seqidno:73；或

cdr1的序列为seqidno:11，cdr2的序列为seqidno:43，并且cdr3的序列为seqidno:74。

在一个具体实施方案中，所述多肽的cdr序列如下：

i)cdr1的序列为seqidno:13、14或33；并且

ii)cdr2的序列为45；并且

iii)cdr3的序列为seqidno:76或77。

优选地，cdr1的序列为seqidno:13，cdr2的序列为seqidno:45，并且cdr3的序列为seqidno:76；或

cdr1的序列为seqidno:14，cdr2的序列为seqidno:45，并且cdr3的序列为seqidno:77；或

cdr1的序列为seqidno:33，cdr2的序列为seqidno:45，并且cdr3的序列为seqidno:77。

在一个具体实施方案中，所述多肽的cdr序列如下：

i)cdr1的序列为seqidno:17；并且

ii)cdr2的序列为48或49；并且

iii)cdr3的序列选自seqidno:80-82。

优选地，cdr1的序列为seqidno:17，cdr2的序列为seqidno:48，并且cdr3的序列为seqidno:80；或

cdr1的序列为seqidno:17，cdr2的序列为seqidno:48，并且cdr3的序列为seqidno:82；或

cdr1的序列为seqidno:17，cdr2的序列为seqidno:49，并且cdr3的序列为seqidno:81。

在一个具体实施方案中，所述多肽的cdr序列如下：

i)cdr1的序列选自seqidno:19-26；并且

ii)cdr2的序列选自51-56；并且

iii)cdr3的序列选自seqidno:84-93。

优选地，cdr1的序列为seqidno:19，cdr2的序列为seqidno:51，并且cdr3的序列为seqidno:84；或

cdr1的序列为seqidno:20，cdr2的序列为seqidno:52，并且cdr3的序列为seqidno:85；或

cdr1的序列为seqidno:21，cdr2的序列为seqidno:53，并且cdr3的序列为seqidno:86；或

cdr1的序列为seqidno:22，cdr2的序列为seqidno:54，并且cdr3的序列为seqidno:87；或

cdr1的序列为seqidno:23，cdr2的序列为seqidno:55，并且cdr3的序列为seqidno:88；或

cdr1的序列为seqidno:26，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:93；或

cdr1的序列为seqidno:25，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:91；或

cdr1的序列为seqidno:24，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:89；或

cdr1的序列为seqidno:24，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:90；或

cdr1的序列为seqidno:26，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:93；或

cdr1的序列为seqidno:25，cdr2的序列为seqidno:56，并且cdr3的序列为seqidno:92。

本发明针对高表达pd-l1的肿瘤或传染病患者进行纳米抗体药物开发，通过制备pd-l1蛋白、免疫骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合pd-l1的纳米抗体vhh，鉴定了其cdr序列。本发明为高表达pdl1的肿瘤患者或传染病患者提供潜在的纳米抗体新药。

附图说明

图1为pd-l1第3和4次免疫骆驼一周后的抗血清效价检测曲线；

图2为不同稀释度的第3次和第4次免疫骆驼一周后的抗血清结合pd-l1蛋白的曲线，以免疫前的血清为对照；

图3为spdl1-vhh噬菌体抗体文库为模板扩增的pcr产物的电泳图；

图4为spdl1-vhh噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，a为噬菌体文库针对spd-l1蛋白淘选后elisa检测统计图；b为从第二轮(2^nd)和第三轮(3^rd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选40个和46个克隆进行噬菌体elisa检测统计图；

图5为原核表达的vhh抗体的elisa检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对spd-l1的od450/空白对照的od450，比值大于5.0定义为阳性。

图6为175个细菌上清与spd-l1结合的读值和与空白对照的读值的比值。

具体实施方式

1.免疫原的制备

我们依据ncbi网站上的pd-l1蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导骆驼产生针对pd-l1蛋白的特异性抗体的多肽spdl1，在c端连接his-tag(spd-l1-his)或兔fc(spd-l1-rfc)用于后续纯化及检测。

2.骆驼免疫与抗血清的获得

用250μgspd-l1-rfc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对双峰骆驼进行初免，在第14天、28天、42天用spd-l1-rfc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。

抗血清效价通过elisa检测，用浓度为0.5μg/ml的pd-l1蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前骆驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的goatanti-llammaigg(h+l)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μltmb底物，37℃孵育10min，50μl0.2m的h2so4中止反应，测定od450nm。elisa检测血清效价规定为在od450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。

结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为3.65×10⁵和1.09×10⁶。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对pd-l1蛋白的高滴度抗血清。

3.vhh噬菌体库构建及淘选

收集200ml免疫后骆驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(geficoll-paqueplus)分离获得骆驼的pbmc，根据trizol操作手册，提取rna，并利用oligo(dt)反转为cdna,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将骆驼的vhh基因克隆至phagemid质粒，转化tg1细菌，得到vhh噬菌体库。为了进一步鉴定sgn-vhh噬菌体库是否构建成功，通过pcr扩增免疫spd-l1骆驼的vhh目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图3)，说明该spd-l1-vhh噬菌体抗体文库里含有vhh基因。挑选39个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列没有完全一致的重复序列；比对结果显示，差异序列大多在cdr结合区。经检测，该构建了一个spd-l1-vhh噬菌体抗体文库的库容为1.0×10⁹，阳性率为97.8％，序列多样性(diversity)为100％，有效插入率(inframerate)大于92％。

在m13ko7辅助噬菌体的帮助下，用vhh-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用peg/nacl进行沉淀。将包被有50μg/ml的spd-l1-his蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与spd-l1蛋白elisa的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体pvax1，转染293f细胞表达生产纳米单抗。

淘选后的文库与pd-l1蛋白进行结合检测。噬菌体elisa结果显示，没有富集前的spd-l1-vhh噬菌体文库与spd-l1蛋白的结合读值为3.40，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为1.66、7.57、12.84(图4)。为了进一步验证富集后的文库中结合spd-l1-vhh蛋白的阳性噬菌体率，从第2轮和第3轮富集后的文库里各挑选了40个克隆进行单个噬菌体elisa检测。结果显示，第2轮文库里，12.5％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里21.1％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且结合的读值/空白对照的读值大于3.0(图5)，通过spd-l1蛋白淘选成功的富集了高结合力的spd-l1-vhh噬菌体文库。

4.vhh原核表达文库的构建及vhh表达

对上述二轮和三轮淘选富集后的2nd-sgn-vhh和3rd-sgn-vhh噬菌体抗体文库进行pcr扩增；获取并纯化抗体库中所有vhh的基因片段，将vhh的基因片段克隆至原核表达载体，转化ss320菌株，构建vhh的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落1000个，使用iptg诱导表达抗体上清，对抗体上清与spd-l1蛋白进行elisa结合检测。

结果显示，有175个细菌上清与spd-l1蛋白结合，同时不与空白对照结合，spd-l1结合的读值/空白对照的读值大于5.0(图6和表1)。将175个序列进行测序比对，剔除重复序列，最终获得91个的vhh抗体序列。进一步的实验证实，这91个vhh抗体以及从vhh抗体得到的cdr均可特异性地结合pd-l1蛋白。

表191个vhh抗体与spd-l1蛋白的结合值及其序列

5.流式细胞法检测vhh抗体阻断pdl1与t细胞的结合

将vhh抗体、pdl1与h9细胞(t淋巴细胞系)混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％pbsf洗涤两遍后，加入二抗alexafluor488goatantihumanigg，4℃30min；以0.5％pbsf洗涤两遍后，上机检测。结果显示，上述pdl1被抗体中和，不能结合到h9细胞上。使用人源化的vhh抗体亦得到类似的结果。可见，上述vhh抗体具有中和pdl1的能力，使其无法与t细胞表面的pd1分子结合，避免表达pdl1的肿瘤逃避免疫机制，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此这些vhh抗体均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。由于上述vhh抗体具有中和pdl1的能力，同时有可能通过阻断pdl1激活pd1的机会，从而通过增强t淋巴细胞杀伤病毒或者细菌的能力，最终达到防控传染病的目的，因此这些vhh抗体均有潜力成为治疗传染病的新型抗体药物。

6.使用aav病毒载体装载的人源化vhh进行体内实验

腺相关病毒载体(aav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

aavhelper-free病毒包装系统购于cellbiolabs,sandiegousa。将上述vhh的dna编码序列通过分子克隆技术插入到paav-mcs质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒paav-ab与phelper和paav-dj质粒按照质量比1:1:1的方式使用pei转染试剂共转染aav-293t细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xpeg8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的aav溶解于pbs里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。

将aav-vhh注射至pdl1阳性的小鼠肿瘤，结果显示aav-vhh对肿瘤有良好的治疗效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>源道隆（苏州）医学科技有限公司

<120>可结合pd-l1的多肽及其应用

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>56

ileserargleuglyglylysthr

15

<210>57

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>57

valserglyserglyalaarglys

15

<210>58

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>58

metthrargaspglyserthr

15

<210>59

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>59

thrileileglyglyserthr

15

<210>60

<211>6

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>60

ilehisthrglyalathr

15

<210>61

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>61

ilethrlysglyglylysthr

15

<210>62

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>62

ilesertrptyrproglyargthr

15

<210>63

<211>8

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>63

thrleuthralavalglyilethr

15

<210>64

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>64

argalaaspvalproglytyrglyargile

1510

<210>65

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>65

alavalglnalaglnleuargglyprovalasnasptyrtyrthrarg

151015

alatyrargtyr

20

<210>66

<211>12

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>66

asnvalvalvalglyhistrpileaspvalglutyr

1510

<210>67

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>67

alaalaileasnaspphehispheserser

1510

<210>68

<211>12

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>68

alaargtyrserasptyralatyrglutyrasptyr

1510

<210>69

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>69

alathrhisasnalatyrargtyrglutyr

1510

<210>70

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>70

alalyscysglysertrptyralaaspasntyrglymetasptyr

151015

<210>71

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>71

alaargglythrasnaspleucystrpargglyserserasntyrasn

151015

tyr

<210>72

<211>12

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>72

thrserthrthrglutrptyrprothralathrser

1510

<210>73

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>73

alaarggluglysertrppromettyrasptyr

1510

<210>74

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>74

alaargvalmetseralatrptyraspproargmetaspser

1510

<210>75

<211>19

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>75

alaalaglyserargtrppropheargserlystrpargthrserasp

151015

pheserser

<210>76

<211>24

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>76

alaalaasnglyprometthrmetalaserasnargasntyrvalphe

151015

thraspargasnargtyralaile

20

<210>77

<211>24

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>77

alaalaasnglyprometthrmetalapheasnargasntyrvalphe

151015

seraspargasnargtyralaphe

20

<210>78

<211>18

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>78

alaalaasparggluglycysleuserilealaleuvalargalatyr

151015

asptyr

<210>79

<211>5

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>79

asnthrasnglntyr

15

<210>80

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>80

alaalaargleuglyalathrtrpserargargproalaasppheasp

151015

ser

<210>81

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>81

alaalaargleuglyalathrtrpserargargprocysasppheasp

151015

ser

<210>82

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>82

alaalaargleuglyalathrtrpserargargproalaaspleuasp

151015

ser

<210>83

<211>16

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>83

asnalaglyalaservalargglyservalthrglytyrilegluval

151015

<210>84

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>84

alaglyargleuthralaalahisalametaspilemetthrasplys

151015

alaasnglymetasptyr

20

<210>85

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>85

alaalagluthrglnsertyrprosersersertyriletyrthrala

151015

serthrargtyrasntyr

20

<210>86

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>86

alaalaglymettyrglythrglntrpaspglutyrsertyr

1510

<210>87

<211>12

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>87

alaalaasnleutyrglyleuglysertyrasptyr

1510

<210>88

<211>16

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>88

alaalaargargtrpglythrsermetileserserglutyrleutyr

151015

<210>89

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>89

alavalaspproserserleualatrpvalileargthrthrprohis

151015

asptyrserasn

20

<210>90

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>90

alavalaspproserserleualatrpvalleuargthrthrprohis

151015

asptyrserasn

20

<210>91

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>91

alaalaaspproserserleualatrpvalileargserthrprohis

151015

asptyrserasn

20

<210>92

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>92

alathraspproserserleualatrpvalileargserthrprohis

151015

asptyrserasn

20

<210>93

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>93

alavalaspproserserleualatrpvalvalargthrthrprohis

151015

asptyrserasn

20

<210>94

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>94

alaalaaspserglyilethrpheserproarglysglyproproarg

151015

prothrasppheglyser

20

<210>95

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>95

asnalavalglyserserglnpheglyargleuvalglutyr

1510

<210>96

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>96

asnvalargthrleuleuargasntyr

15

<210>97

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>97

alaargglutyrleuglypheasptyr

15

<210>98

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>98

asnalaalaproglutrptrptyrglyvalproalaaspglutyrasp

151015

tyr

<210>99

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>99

alaalaaspproargglyvalileasnalatyrasptyrasntyr

151015

<210>100

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>100

tyralaargglyvalhisleuvalthrargalaleuasnasptyr

151015

<210>101

<211>25

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>101

glnleuglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnalaglyasp

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>102

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>102

metglytrppheargglnalaproglylysgluarggluphevalala

151015

gly

<210>103

<211>38

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>103

sertyrthraspseralalysaspargphethrileserlysaspasn

151015

thrlysasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysprogluasp

202530

thralavaltyrleucys

35

<210>104

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>104

trpglyglnglythrglnvalthrvalserser

1510

<210>105

<211>25

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>105

glnvalargleuvalgluserglyglyglyservalglnalaglyglu

151015

thrleuargleusercysthralaser

2025

<210>106

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>106

metglytrptyrargglnglyproglyasnglucysglumetvalala

151015

tyr

<210>107

<211>36

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>107

alaaspserthrlysglyargphethrileserglnaspasnalalys

151015

histhrleutyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthrgly

202530

valtyrtyrcys

35

<210>108

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>108

glyglnglythrargvalthrvalserser

1510