一种高纯度香叶基黄酮A的分离纯化工艺的制作方法

本申请涉及一种高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，属于化工领域。

背景技术：

汉麻全株已发现化合物共500多种，其中黄酮类化合物已报道的有20多种，常见的有芹黄素，木樨草素，槲皮素，荭草素，芦丁，牡荆素等。另外，香叶基黄酮a(cannflavina)和香叶基黄酮b(cannflavinb)则为大麻植中特有的两种类黄酮化合物。

大麻黄酮类化合物已被证明具有多种药理活性，如barrett等报道了大麻中的香叶基黄酮a/b可极大强化抗炎作用，并且对类风湿性滑膜细胞中前列腺素e-2的抑制作用是阿司匹林的30倍(barrett,m.l.,a.m.scutt,etal.,"cannflavinaandb,prenylatedflavonesfromcannabissativa".experientia42(4):(1986)452-453)。美国专利us20190083452a1，公开了大麻黄酮及其衍生物用于预防和治疗神经退行性疾病方面的通途。美国专利us20180353462a1，公开了大麻黄酮类衍生物用于治疗和预防癌症方面的用途。

但是至今，这一植物源的化合物并没有得到开发应用。工业大麻花叶中的香叶基黄酮a含量约为万分之二，相对的，香叶基黄酮b的含量则低至十万分之一，因而样品大量制备比较困难，目前市面甚至完全没有标准品出售，当前文献中能查到的分离方法，基本都仅限于mg级的植化分离，譬如以氯仿9：1甲醇的提取，或者依次以石油醚正己烷，氯仿，乙酸乙酯甲醇水的提取，再经过硅胶柱层析等手段纯化，只能制备少量样品，不适宜工业化生产。

因此，香叶基黄酮a的综合开发利用，首先急需解决制备方法，目前，工业化的制备方案，国内外均未见报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种可工业化制备高纯度香叶基黄酮a的工艺。其中香叶基黄酮a纯度可以达到95％以上。

根据本申请的一个方面，提供了一种制备高纯度香叶基黄酮a的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

a)大麻花叶原料前处理；

b)将经前处理的大麻花叶原料经溶剂i提取，提取液浓缩，分离得上清液；

c)将所述上清液经过大孔吸附树脂吸附，溶剂ii洗出，浓缩，得到香叶基黄酮a粗品；

d)将所述香叶基黄酮a粗品经溶剂iii转溶，分离，得到不溶物；

e)将所述不溶物重结晶，得到香叶基黄酮a初品。

可选地，步骤a)中，所述前处理包括：将大麻花叶粉碎至10-60目。

可选地，所述前处理还包括脱脂。

可选地，所述脱脂包括：将大麻花叶粉碎后得到的10-60目的大麻花叶原料，经石油醚、正己烷或正庚烷浸提。

可选地，所述脱脂包括：将大麻花叶粉碎后得到的10-60目的大麻花叶原料，经石油醚、正己烷或正庚烷浸提2-4h。

可选地，步骤a)包括：将大麻花叶粉碎后得到的10-60目的大麻花叶原料，经2-5倍(m/v)量石油醚(或正己烷，正庚烷)浸提2-4h后，烘渣机减压(45-55℃，-0.06～-0.08mpa)烘干，得到前处理后的大麻花叶原料。

可选地，步骤a)包括：将大麻花叶，烘烤至水分15％以下(烘烤步骤的作用是易于储存)粉碎至10-60目得到未脱脂的大麻花叶原料；而将此粉碎至10-60目的原料，经2-5倍(m/v)量石油醚(或正己烷，正庚烷)浸提2-4h后，烘渣机减压(45-55℃，-0.06～-0.08mpa)烘干，即得前处理后的大麻花叶原料。

通过脱脂可以除去大麻花叶原料中的大部分油脂，减轻后处理压力。

可选地，步骤a)中，大麻花叶原料用量在300kg以上。

可选地，步骤a)中，大麻花叶原料用量在300kg-1200kg之间。

可选地，步骤b)中，所述溶剂i选自甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种。

可选地，步骤b)中，用以大麻花叶原料质量5-20倍体积(w/v)的65-95wt％溶剂i冷浸或热回流1-3h，提取2-4次，合并浓缩至溶剂i浓度50-70wt％，分离得上清液。

可选地，步骤c)中，所述大孔吸附树脂选自hpd系列、ads系列、hz系列、xad系列、sp系列大孔吸附树脂或聚酰胺树脂中的至少一种。

可选地，所述大孔吸附树脂选自ab-8、d-101、hpd700、xad2、xda-8、lsa-7、d-941、dm-130、ads600、ads-17、sp-825、hpd-600和sp825大孔吸附树脂中的至少一种。

可选地，所述大孔吸附树脂的用量是所述大麻花叶原料的投料质量的10-75％。

可选地，所述大孔吸附树脂的用量是所述大麻花叶原料的投料质量的15-60％。

可选地，所述大孔吸附树脂的用量是所述大麻花叶原料的投料质量的18-53％。

可选地，所述大孔吸附树脂的用量是所述大麻花叶原料的投料质量的上限选自15％、18％、20％、30％、40％、42.5％、50％、52.7％、53％、60％、70％或75％；下限选自10％、15％、18％、20％、30％、40％、42.5％、50％、52.7％、53％、60％或70％。

本申请中，所用大孔吸附树脂具有以下结构特点：1)树脂存在永久性微孔，其大小、孔道的数量和分布情况，可根据需要在制备过程中通过致孔剂和交联度来控制调节，同时，给予了使用者选择空间。例如在实际实验中，发现微孔大小在80-100a°的优于其他规格。

(2)由于树脂内部为多孔海绵状，因而表面积极大(大到1000m²/g以上)，可以做规模化处理。

(3)在合适的再生处理后，填料可反复使用，极大降低成本消耗。

本申请中，使用大孔吸附树脂，可以做规模化处理，在合适的再生处理后，填料可反复使用，极大降低成本消耗。2-5bv(bv指柱床体积，即树脂层实际装柱体积)95wt％乙醇冲柱即可完成再生，反复使用，实验室重复实验考察，可重复50次以上，吸附和解吸不受影响。

本申请所用的大孔吸附树脂可以处理大量的经醇提后分离得到的含有香叶基黄酮a的上清液。现有的硅胶柱层析等纯化手段，只能处理极少量的样品，且纯化时间较长。利用大孔吸附树脂，可实现工业级的量的处理，且处理时间周期较短。

可选地，步骤c)中，所述溶剂ii选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的至少一种。

可选地，步骤c)中，上清液经过大孔吸附树脂，经30～60wt％溶剂ii洗出得到香叶基黄酮a粗品。

可选地，步骤c)中，上清液经过大孔吸附树脂，70～100wt％溶剂ii部分洗出大麻二酚(cbd)为主的大麻素组分。

可选地，步骤d)中，所述溶剂iii选自非极性烷烃、卤化烷、酯、高级脂肪醇中的至少一种。

可选地，所述非极性烷烃选自石油醚、乙醚、正己烷、正庚烷中的至少一种。

可选地，所述卤化烷选自二氯甲烷、氯仿中的至少一种。

可选地，所述酯选自乙酸乙酯、醋酸丁酯中的至少一种。

可选地，所述高级脂肪醇选自正辛醇、仲辛醇、庚醇中的至少一种。

本申请中，高级脂肪醇是指“碳原子数为5-10之间的脂肪醇”。

可选地，所述溶剂iii选自正庚烷、正辛醇、正庚烷和乙酸乙酯的混合液中的一种。

可选地，步骤d)中，所述转溶的次数为1～3次，以无其他油膏样杂质为转溶终点。

可选地，以肉眼可见棕黄色不溶物残渣均一分散在转溶液或者其他辅助支持介质中，且无其他油膏样杂质即为转溶终点。

可选地，所述重结晶的溶剂选自卤化烷、酯、酮、甲醇/乙醇和水的二元体系中的至少一种。

可选地，所述卤化烷选自二氯甲烷、氯仿中的至少一种。

可选地，所述酯选自乙酸乙酯、醋酸丁酯中的至少一种。

可选地，所述酮选自丙酮、丁酮中的至少一种。

可选地，所述重结晶溶剂的用量以室温下溶解样品的饱和浓度直至可析出的极限浓度为准。

可选地，所述重结晶溶剂的用量为固体粗品的0.5直至5倍量(m/v)。

可选地，所述重结晶的条件为-20～10℃结晶4-24h。

可选地，将上述结晶后的样品过滤，用-20～0℃的同样的重结晶溶剂洗涤，得到不定形的香叶基黄酮a初品。

洗涤溶剂用量只需能把整个样品层润湿即可。

可选地，洗涤溶剂的用量为样品量的0.05至0.2倍量(m/v)。

可选地，步骤e)中，对重结晶后的香叶基黄酮a的表面进行喷淋溶剂iv形成液封薄膜，得到香叶基黄酮a初品。

可选地，所述溶剂iv选自乙酸乙酯、水、正庚烷中的至少一种。

实际应用中，只需在香叶基黄酮a的表面喷一层有机溶剂或水雾即可，操作简便，即可实现隔绝空气，保持成品本色的优良效果。

可选地，还包括，将步骤e)中得到的香叶基黄酮a初品经减压干燥得到香叶基黄酮a的成品。

可选地，所述减压干燥的条件为压力0.06-0.10mpa，温度30-60℃，时间6-36h。

本申请中，“cfla”代表香叶基黄酮a。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，以醇提，大孔树脂纯化和溶剂结晶的制备方法，可以实现生产放大，有极好的工业化制备前景。

2)本申请所提供的高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，转移率较高，且香叶基黄酮a纯度可以达到95％以上。

3)本申请所提供的高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，以液封膜隔绝空气，快速真空干燥，可保持成品本色。

4)本申请所提供的高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，使用大孔吸附树脂，可以做规模化处理，在合适的再生处理后，填料可反复使用，极大降低成本消耗。

附图说明

图1为实施例1花叶提取原液的液相色谱图；

图2为实施例1香叶基黄酮a成品的液相色谱图；

图3为实施例1香叶基黄酮a成品的¹hnmr(600mhz,dmso-d6)图；

图4为实施例1香叶基黄酮a成品的¹³cnmr(600mhz,dmso-d6)图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

本申请的花叶原料为7-9月的成熟大麻花叶，经农户初步干燥，为四氢大麻酚(thc)含量在0.3％以下的工业大麻。

本申请的实施例中产物分析方法如下：

利用氢谱¹hnmr和碳谱¹³cnmr分析，分析仪器为brukeram-600型核磁共振波谱仪(德国，bruker公司)，溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6，sigma)。

利用高效液相色谱对花叶提取原液和香叶基黄酮a成品进行分析，分析仪器为安捷伦1260液相色谱仪(美国，agilent)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.5％甲酸-水为流动相b，按a(％):b(％)＝70:30进行等度洗脱；检测波长为210nm。

图1中，cbg代表大麻萜酚，cbd代表大麻二酚，thcv代表四氢次大麻酚，cbn代表大麻酚，thc代表四氢大麻酚。

本申请中所用花叶原料中香叶基黄酮a的含量通过以下方法测定：

标品配置：准确称取cfla工作对照品(标准品为实验室自制并标化)，以甲醇溶解配置浓度为0.1000mg/ml的标品试液。

花叶供试品制备：称取花叶5.0000g，以5倍花叶质量体积(w/v)正己烷室温搅拌脱脂20min，挥去正己烷，加入15倍花叶质量体积(w/v)75％甲醇-水溶液超声提取15min，取0.45微米针头式滤器续滤液进液相检测。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.5％甲酸-水为流动相b，按a(％):b(％)＝70:30进行等度洗脱；检测波长为210nm。

原料cfla含量＝(cfla供试品液相峰面积*标品浓度*供试品提取液体积)/cfla标品峰面积*花叶原料扣水干料质量)*100％

本申请中所用花叶原料中香叶基黄酮a的含量实测质量分数为万分之2.3。

本申请的实施例中香叶基黄酮a成品纯度通过液相色谱图计算，其纯度与液相百分峰面积一致。

香叶基黄酮a(cfla)成品的转移率计算如下：

cfla转移率＝(cfla成品质量*纯度)/(花叶原料扣水干料质量*0.00023)*100％

实施例1按照以下方法制备香叶基黄酮a

1)将大麻花叶粉碎至10～20目,混匀取样，测得水分12.56％，称取300kg投入提取罐。

2)将上述花叶原料质量5倍体积(w/v)的95wt％乙醇水溶液冷浸2h，搅拌速度100rpm，提取2次，合并浓缩至乙醇浓度50～70wt％，沉降过夜或离心，得上清液。

3)将上述清夜，经过大孔吸附树脂hpd700(用量为158kg)，30wt％乙醇洗5bv(bv指柱床体积，即树脂层实际装柱体积)，合并，经刮板浓缩器60℃减压浓缩(0.06～0.08mp)，得目标组分香叶基黄酮a粗品4.45kg；70wt％乙醇洗脱，减压浓缩，得到以cbd为主的大麻素组分浸膏备用。

4)将上述目标组分香叶基黄酮a粗品，转移至反应釜，以等量(m/v)正己烷4.5l，在40℃下，搅拌溶解，通过三效过滤器，将不溶物，再次移至反应釜，同条件下反复转溶共计3次，由三效过滤器初步烘干，除去表面有机溶剂，最终得到棕黄色的剩余不溶物52.28g。

5)将上述的不溶物，以2倍(m/v)丙酮100ml溶解，置-20℃孵育结晶4h后，通过布氏漏斗过滤，并以-10℃冷丙酮20ml分三次洗涤，抽干，得棕黄色不定形的香叶基黄酮a初品。

6)将上述的香叶基黄酮a初品，快速转移至真空干燥箱，在30℃，0.10mpa下，减压干燥36h，即得棕黄色香叶基黄酮a成品38.73g。

所得棕黄色香叶基黄酮a成品记为样品1，转移率为61.91％。图1为花叶提取原液的液相色谱图；图2为样品1的液相色谱图；其色谱纯度为96.45％。

图3为样品1的¹hnmr(600mhz,dmso-d6)图，¹hnmr归属如下：¹hnmr(600mhz,dmso-d6)δ13.21(s,1h),10.76(s,1h),9.93(s,1h),7.52(s,2h),6.93(d,j＝8.2hz,1h),6.86(d,j＝2.4hz,1h),6.54(s,1h),5.17(t,j＝6.8hz,1h),5.01(s,1h),3.89(s,3h),3.22(d,j＝6.7hz,2h),1.98(d,j＝5.9hz,2h),1.91(s,2h),1.72(s,3h),1.56(s,3h),1.50(s,3h)。

图4为样品1的¹³cnmr(600mhz,dmso-d6)图，¹³cnmr归属如下：¹³cnmr(600mhz,dmso-d6)δ181.92,163.49,161.90,158.49,155.18,150.74,148.12,134.24,130.72,124.19,122.14,121.75,120.36,115.87,111.05,110.21,103.63,103.25,93.34,56.04,39.36,26.28,25.53,21.07,17.59,16.01。

将样品1的核磁谱图和文献“younghaechoi,arnohazekamp，nmrassignmentsofthemajorcannabinoidsandcannabiflavonoidsisolatedfromflowersofcannabissativa，phytochem.anal.15,345–354(2004).”比对，符合的很好。证明所获得的样品1是香叶基黄酮a。

实施例2按照以下方法制备香叶基黄酮a

1)将大麻花叶粉碎至20～40目,混匀取样，测得水分15.26％，称取600kg投入提取罐，加入120l石油醚，搅拌4h后，烘渣机减压烘干，得脱脂后的大麻花叶原料。

2)将上述花叶原料质量20倍体积(w/v)65wt％乙醇热回流提取2h，搅拌速度100rpm，提取1次，沉降或离心，得上清液。

3)将上述清夜，经过xad2大孔吸附树脂(255kg)层析柱，60wt％乙醇洗3.5bv，合并，经刮板浓缩器60℃减压浓缩，得目标组分香叶基黄酮a粗品7.19kg；90wt％乙醇洗脱，减压浓缩，得到以cbd为主的大麻素组分浸膏备用。

4)将上述目标组分香叶基黄酮a粗品，转移至反应釜，以1/2倍量(m/v)庚烷：乙酸乙酯(100：6，v/v)混合溶剂3.6l，在60℃下，搅拌溶解，通过三效过滤器，将不溶物以少量上述二元混合溶剂淋洗表面，由三效过滤器初步烘干，除去表面有机溶剂，最终得到棕黄色的剩余不溶物125.42g。

5)将上述的不溶物，以1/2倍(m/v)60wt％乙醇65ml溶解，置10℃孵育结晶24h后，快速通过布氏漏斗过滤，并以少量纯化水喷淋表面，形成液封薄膜，得鹅黄色不定形的香叶基黄酮a初品。

6)将上述的香叶基黄酮a初品，快速转移至真空干燥箱，在60℃，0.10mpa下减压干燥16h，即得鹅黄色香叶基黄酮a成品88.76g。

所得棕黄色香叶基黄酮a成品记为样品2，转移率为74.57％。样品2的液相色谱图显示其纯度为98.25％。样品2的¹hnmr(600mhz,dmso-d6)图和¹³cnmr(600mhz,dmso-d6)图和样品1的一致。

实施例3按照以下方法制备香叶基黄酮a

1)将大麻花叶粉碎至40～60目,混匀取样，测得水分10.14％，称取1200kg投入提取罐。

2)将上述花叶原料质量8倍体积(w/v)75wt％乙醇热回流提取1h，搅拌速度100rpm，提取2次，合并浓缩至乙醇度50wt％，沉降过夜或离心，得上清液。

3)将上述清夜，经过ads600大孔吸附树脂(216kg)层析柱，50wt％乙醇洗4bv，合并，经刮板浓缩器60℃减压浓缩，得目标组分香叶基黄酮a粗品11.63kg；90％高醇洗脱，减压浓缩，得到以cbd为主的大麻素组分浸膏备用。

4)将上述目标组分香叶基黄酮a粗品，转移至反应釜，以1/3倍量(m/v)正己烷4l，在60℃下，搅拌使之呈流膏，加入1/10倍量(m/m)硅藻土：硅胶(3：1，m/m)1.2kg混匀，通过预铺一层硅藻土的三效过滤器，随后，以等量(m/v)庚烷：乙酸乙酯(100：6，v/v)混合溶剂洗涤11.5l，由三效过滤器初步烘干固体混合物。

5)对上述的固体混合物，以等量(m/m)乙酸乙酯1.2l淋洗，置-10℃孵育结晶6h后，通过布氏漏斗过滤，并以少量-10℃冷乙酸乙酯100ml分三次洗涤，表面留有薄层乙酸乙酯形成液封膜，得鹅黄色不定形的香叶基黄酮a初品。

6)将上述的香叶基黄酮a初品，快速转移至真空干燥箱，在40℃，0.10mpa下，减压干燥24h，即得鹅黄色香叶基黄酮a成品152.50g。

所得棕黄色香叶基黄酮a成品记为样品3，转移率为60.92％。样品3的液相色谱图显示其纯度为99.08％。样品3的1hnmr(600mhz,dmso-d6)图和13cnmr(600mhz,dmso)图和样品1的一致。

对上述实施例总结到下表1中。

表1

实施例4大孔吸附树脂循环利用实验

将实施例1的大孔吸附树脂hpd700通过3bv(bv指柱床体积，即树脂层实际装柱体积)95wt％乙醇冲柱，重复实施例1的操作，实验结果和使用新鲜的大孔吸附树脂hpd700保持一致。重复使用50次，性能未见下降。

综上，可以看出，采用本申请所提供的高纯度香叶基黄酮a的分离纯化工艺，使用大孔吸附树脂，可以处理300kg以上的投量，产品转移率保持在60％以上，且香叶基黄酮a纯度可以达到95％以上，可实现工业化制备。大孔吸附树脂通过2-5bv95wt％乙醇冲柱即可完成再生，实验室重复实验考察，可重复50次以上，吸附和解吸不受影响。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。