1.本发明涉及一种口蹄疫病毒核酸荧光等温扩增检测技术及成套试剂盒，属于微生物检测技术领域。
背景技术：
2.口蹄疫是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease virus, fmdv) 引起的, 发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织将口蹄疫列为必须报告的动物烈性传染病, 严重危害畜牧业的发展及相关产品对外贸易。患口蹄疫的动物特征是:会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现水疱等症状。恶性口蹄疫还会导致迅速死亡。
3.发病或处于潜伏期的动物是主要的口蹄疫病毒传染源，该病毒可通过空气、分泌物和排泄物，以及被污染的饲料等多种途径传播。对口蹄疫的控制措施包括：强化灭活疫苗免疫接种；加强疫情监测和报告，建立有效的主动检测、预报、预警机制；建立健全应急机制，完善应急预案；严格对移动动物、动物产品的检疫监管。
4.口蹄疫病毒检测是开展疫病诊断和检疫的重要依据。病毒感染相关抗原（viaa）琼脂扩散试验主要用于疫情普查和活畜进出口检疫，仅能对动物是否存在口蹄疫病毒感染抗体进行检测，耗时一天以上。
5.当前各级兽医实验室在检测口蹄疫病毒时，主要采用普通rt-pcr方法和荧光rt-pcr方法，但普通rt-pcr检测操作容易造成病毒核酸扩增产物的污染，造成假阳性；而荧光rt-pcr技术则需要价格昂贵的荧光pcr仪，从核酸提取到完成全部检测过程，通常需要2个小时以上。近年来我国对动物及其产品检疫要求开展病原学检测，依据检测结果出具检疫证明，这就需要更快速、简便、准确、低廉并适合在现场应用的fmdv检测技术。
6.核酸等温扩增技术是一种新兴的基因检测技术,与广泛应用的普通rt-pcr和荧光rt-pcr相比，具有许多优点。该方法不需要贵重仪器（恒温即可）、操作简单、速度快、灵敏度高，因此得到越来越广泛的应用。但现有的核酸等温扩增方法，主要依靠肉眼观察反应溶液的颜色变化来判定结果，其主观性强、准确性差。
7.本发明采用荧光剂对双链dna扩增产物进行染色，用阅读仪检测荧光信号来判定结果，比眼观法提高了准确性；本发明采用免提取反应液，处理并释放样品中的病毒rna，直接进行扩增反应，不必提取样品中的rna，减少了操作步骤和成本，缩短了检测时间，消除了核酸提取过程中的交叉污染；本发明针对口蹄疫病毒基因设计了6条特异性引物，从而保证扩增反应的特异性。
8.本发明综合运用这些技术，最终建立了新的口蹄疫病毒核酸快速检测方法和试剂盒。本发明相比目前广泛使用的pcr和荧光pcr检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、操作简便、试剂与设备成本低等优点，适合在动物养殖、屠宰、检疫、监测的现场和基层单位使用，具有良好应用前景。
技术实现要素：
9.本发明的目的是建立免提取核酸的口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法及试剂盒，使检测过程简便易行，结果判读精确，不用借助昂贵仪器，降低检测成本，检测总时间缩短至50分钟，为口蹄疫病毒检测提供快速、灵敏、特异、低成本的技术手段。
10.为实现上述发明目的，本发明综合运用bst dna聚合酶等温扩增技术、组织样本核酸免提取技术和荧光指示剂，建立口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法，研制成试剂盒，具体内容如下：1.等温扩增引物设计：参考口蹄疫病毒基因组的核苷酸序列，筛选3d基因保守区域，设计6条引物：fmdf3 accctcgargctatcfmdb3 gcgtcaccgcacacfmdfip tggacggcaagtcctgttttctctcctttgcacgfmdbip taccggcgtctctttgattttcacccaacgcaggfmdlf caacttctcctgtatggtccfmdlb tgagattccaagctacagat2.引物溶液配制：将人工合成引物fmdf3、fmdb3、fmdfip、fmdbip用depc处理水稀释至20μmol/l，将人工合成引物fmdlf、fmdlb用depc处理水稀释至40μmol/l；将稀释后的引物按fmdf3:fmdb3:fmdfip:fmdbip:fmdlf:fmdlb=1:1:8:8:2:2的比例混匀。
11.3.制备阳性对照：以常规方法克隆口蹄疫病毒3d基因的核苷酸序列，构建pmd20-t-fmdv载体重组质粒，对质粒中的目的基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照。
12.4.10
×
等温扩增免提取缓冲液的配制：称取trisbase：24.23g，kcl：3.73g，(nh4)2so4：7g，mgso47h2o：2.465g，triton x-100：5ml，brij-58：5g，加depc处理水至400ml，盐酸调ph值至8.8（25℃），定容至500ml。高压灭菌冷却后，置于2~8℃保存备用。
13.5.荧光等温扩增免提取反应液的制备：取10
×
等温扩增免提取缓冲液2.5 ml、引物液5.5 ml、5 mol/l甜菜碱溶液4 ml、10 mmol/l dntp mixture 3.5 ml、100 mmol/l mgso
4 溶液1.5 ml、0.1%sybr greeni液0.5 ml、0.1%depc处理水4.5 ml，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
14.6.bst dna聚合酶的制备：bst dna聚合酶为外购商品（ neb 公司），浓度为8u/μl，1000μl/管。将bst dna聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
15.7.矿物油的制备：将液体石蜡油定量分装成小管，加贴标签。
16.8.阴性对照的制备：0.1%depc水溶液，无菌分装，加贴标签。
17.9.检测方法与步骤：（1）在0.2 ml反应管中，每管加入荧光等温扩增免提取反应液22μl和bst dna聚合酶1.0μl，再每管加入20μl矿物油。
18.（2）加样：每管底部加入1：5稀释的被检测动物血液或组织研磨液2.0μl，同时设置阳性及阴性对照管。盖紧管帽，瞬时离心，放入专用荧光恒温扩增仪或普通荧光pcr仪。
19.（3）经过优化的反应参数：采用64℃、50min，每1min采集一次fam通道荧光信号，共采集50次。当无tt（time threshold）值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当tt值≤
40.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性；当tt值＞40.0，且出现典型的扩增曲线，应重做，仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
20.10.本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对的组合产品，优选还包括荧光等温扩增免提取反应液（内含sybr greeni荧光剂）、bst dna 聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。优选的，所述bst dna聚合酶可加入所述荧光等温扩增免提取反应液中进行整合包装。本发明所述的试剂盒，其中还包含阳性对照和阴性对照；阳性对照为pmd20-t-fmdv重组质粒；所述阴性对照为无核酸水。本发明提供的试剂盒能够用于检测口蹄疫病毒，可以用于动物血液和组织中的口蹄疫病毒检测。
21.11.试剂盒验证方法：（1）将阳性对照质粒倍比稀释为10-1
～10-6
，按9中方法进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到10-3
。(2)检测非洲猪瘟病毒核酸、小反刍兽疫病毒核酸、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒核酸、伪狂犬病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，应无阳性交叉反应。
22.本发明选择口蹄疫病毒高度保守的3d基因片段作为检测靶基因，设计特异性引物建立fmdv特异性的荧光等温扩增检测方法。本发明采用bst dna聚合酶，具有扩增效率高、特异性好的优点；采用荧光染料指示反应结果，便于准确判定；无需提取样品dna,简化了检测操作；整个检测过程速度快，只需50min。且本发明一次可检测多个样品，适于大批样品的检测。
具体实施方式
23.以下对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.实施实例1：引物设计及口蹄疫病毒基因pmd20-t-fmdv重组质粒的构建1.引物设计：根据genbank上收录的口蹄疫病毒基因组的核苷酸序列(见表1)，筛选3d基因保守区域，设计6对共12条引物，并进行比较和筛选。
25.表1口蹄疫参考毒株病毒株名称genbank登录号病毒株名称genbank登录号sea-97lc483874.1154mn275118.101-a01lcmk341545.1k74mn116688.101-caplcmk341544.1nigmn103523.1dh-301mk088170.1k19mn116694.119-005mn250318.1k60mn116693.118cd-1610.2mn250317.1lung1mh559804.118-5490mn250316.1ves2mh559800.118-3766mn250315.1muk564mn095362.117-19073mn250314.1muk359mn095359.12186mn275121.1349(740)mn095357.12101mn275120.1sv2_d1lc485147.1171mn275119.1b14-112_a24mh426574.最终确定的等温扩增引物的核苷酸序列如下：
fmdf3 accctcgargctatcfmdb3 gcgtcaccgcacacfmdfip tggacggcaagtcctgttttctctcctttgcacgfmdbip taccggcgtctctttgattttcacccaacgcaggfmdlf caacttctcctgtatggtccfmdlb tgagattccaagctacagat2.pmd20-t-fmdv重组质粒构建：根据已发表的口蹄疫病毒3d基因序列(genbank: nc002657.1），委托上海奕跃生物科有限公司合成3d基因片段，克隆到pmd20-t载体，形成pmd20-t-fmdv质粒。按常规方法转化top10细菌感受态细胞（购买的产品），用氨苄抗性的琼脂平板筛选克隆菌，用常规pcr鉴定。将pcr鉴定为阳性的菌液提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果与参考模板的序列比对一致。
26.实施例2口蹄疫病毒荧光等温扩增反应体系的建立通过对口蹄疫病毒基因序列进行比对分析，设计并筛选引物，初步建立口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法，并对该检测方法的引物浓度、mg
2+
浓度、sybr greeni荧光染料用量、bst dna 聚合酶用量、反应温度等反应条件进行优化选择，从而确定该检测方法的最适条件：反应体系共25μl，包括荧光等温扩增反应液、bst dna聚合酶、模板三部分。其中，一个检测的反应液由2.5μl的10
×ꢀ
thermopolbuffer、5.5μl的引物液、4μl 5 mol/l甜菜碱溶液、3.5μl dntp mix（10 mmol/l）、1.5μl的mgso4（100 mmol/l）、0.5μl的sybr greeni液及4.5μl 的depc处理水组成；一个检测的bst dna聚合酶由1μl 的bst dna聚合酶（8u/μl）组成；一个检测的模板为2.0μl样品组成；最后在25μl反应体系的基础上加20μl矿物油（液体石蜡油）。可以使用荧光恒温扩增仪或者常用的荧光pcr仪进行实验。
27.最终确定口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法的扩增条件是64℃、50 min，每分钟收集一次荧光。当无tt（time threshold）值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当tt值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性；当tt值＞40.0，且出现典型的扩增曲线，应重做，仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
28.实施例3口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒的组装1.按如下方法配制试剂盒的各组份：(1) 引物溶液配制：将人工合成引物fmdf3、fmdb3、fmdfip、fmdbip用depc处理水稀释至20μmol/l，将人工合成引物fmdlf、fmdlb用depc处理水稀释至40μmol/l；将稀释后的引物按fmdf3:fmdb3:fmdfip:fmdbip:fmdlf:fmdlb=1:1:8:8:2:2的比例混匀。
29.(2)制备阳性对照：以常规方法克隆口蹄疫病毒3d基因序列，构建pmd20-t-fmdv重组质粒，对质粒中的基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌获得的重组质粒菌，将其扩大培养，提取重组质粒。用nanodrop2000仪器测定重组质粒的含量，再计算出每微升体积中5'utr基因dna的拷贝数，用te缓冲液稀释至104拷贝数/μl，按照200μl/管的规格进行无菌定量分装，作为试剂盒的阳性对照。
30.(3)10
×
等温扩增免提取缓冲液的配制：称取trisbase：24.23g，kcl：3.73g，(nh4)2so4：7g，mgso47h2o：2.465g，triton x-100：5ml，brij-58：5g，加depc处理水至400ml，盐酸调ph值至8.8（25℃），定容至500ml。高压灭菌冷却后置于2~8℃保存备用。
31.(4)荧光等温扩增免提取反应液的制备：取10
×
等温扩增免提取缓冲液2.5 ml、引
物液5.5 ml、5 mol/l 甜菜碱溶液4 ml、10 mmol/l dntp mixture 3.5 ml、100 mmol/l mgso
4 溶液1.5 ml、0.1%sybr greeni液0.5 ml、0.1%depc处理水4.5 ml，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
32.(5)bst dna聚合酶的制备：bst dna聚合酶为外购商品（neb公司），8u/μl，1000μl/管。将bst dna聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
33.(6)矿物油的制备：将液体石蜡油定量分装成小管，加贴标签。
34.(7)阴性对照的制备：0.1%depc水溶液，无菌分装，加贴标签。
35.按以下要求组装成试剂盒：将荧光等温扩增免提取反应液、bst dna聚合酶、矿物油、阴性对照及阳性对照等按表2要求数量，用外包装盒包装，加贴签（包含标识名称、批号、生产日期、保存期和生产单位信息等）。
36.表 2 口蹄疫病毒荧光等温扩增检测试剂盒（免提取） 组成清单组份规格荧光等温扩增免提取反应液1100μl/管
×
1管bstdna聚合酶50μl/管
×
1管阴性对照1000μl/管
×
1管阳性对照200μl/管
×
1管矿物油1000μl/管
×
1管说明书1份/盒实施例4：口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒灵敏度验证用depc处理水将pmd20-t-fmdv重组质粒（dna含量为104拷贝/μl）作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为敏感性质控样品。按照试剂盒的“用法与判定”进行检测和判定。1:10、1:100、1:1000质控样品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性或阴性，1:100000为阴性。检测22份经临床诊断为口蹄疫病毒核酸阳性的样品，包括动物血液、扁桃体和脾脏组织，检测结果均为阳性。
37.实施例5：口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒特异性试验采用3个批次的口蹄疫病毒荧光等温扩增检测试剂盒，检测高致病性猪蓝耳病疫苗、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2 型、小反刍兽疫病毒和正常动物血液、扁桃体和脾脏组织10%悬液的核酸，均无阳性交叉反应。对45份临床诊断并鉴定为阴性的样品进行检测，结果全部为阴性，特异性为100%。
38.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。