本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种检测t细胞活性的方法。
背景技术：
：t淋巴细胞(tlymphocyte)简称t细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。恶性肿瘤患者通常伴有不同程度，各种因素的免疫力低下，以至肿瘤的快速增生和远处转移。近些年大量的研究表明，通过增强恶性肿瘤患者的免疫力能大大增强肿瘤治疗的效果。补充特定血液成分如丙种球蛋白可以在一定程度上增强患者的免疫力，然而，针对肿瘤的免疫主要是t淋巴细胞介导的直接细胞毒性作用(即t淋巴细胞直接杀伤肿瘤细胞)。由于肿瘤组织有自我保护机制，会产生一些免疫抑制因素从而导致t细胞失活或者功能低下。现今流行的抗pd-1和ctla-4肿瘤免疫疗法就是对抗这种肿瘤特异性免疫抑制。针对肿瘤抗原的特异性的t细胞是肿瘤免疫疗法的关键，所以针对单个t细胞的基因检测可以初步分析失活/抑制的比例以及t细胞失活或者功能低下的分子学原因，然而，目前存在的最大问题就是，针对肿瘤患者免疫力低下的情况，没有统一的检验标准，尤其是针对肿瘤免疫的主要成分t细胞的检验。由于人体内t淋巴细胞的独特性和特异性，往往大体标本测序得不到有效的结果，从而无法选择最佳的治疗方案。技术实现要素：针对上述问题，本发明的目的是提供一种检测t细胞活性的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测t细胞活性的方法，包括：1)通过高通量流式细胞分选富集特异性t细胞亚群；2)基于富集的特异性t细胞亚群制备单细胞测序的转录组文库；3)对转录组文库进行二代基因测序；4)基于测序结果对t细胞活性进行分析。优选地，步骤1)还包括在进行高通量流式细胞分选之前，通过物理分离方法从外周静脉血和/或肿瘤组织中分离获取t细胞。优选地，从外周静脉血中分离获取t细胞的方法包括：1-1)梯度离心法从采集的静脉血中分离白细胞，获取白细胞以后用低温pbs溶液冲洗1-2次；1-2)将洗涤的白细胞用抗cd16/cd32抗体室温封闭30分钟；1-3)使用不同荧光染料标记的抗cd3，抗cd8以及抗cd4抗体孵育血中分离的白细胞30分钟。更优选地，步骤1-3)中，采用fitc染料标记的抗cd3抗体，apc染料标记的抗cd8抗体，pe染料标记抗cd4抗体。更优选地，还包括：将步骤1-3)荧光染料标记好的细胞用低温pbs溶液洗涤1-2次去除多余抗体，通过高通量流式细胞分选仪分选，富集出特定的cd4和cd8t淋巴细胞亚群。优选地，从肿瘤组织中分离获取t细胞的方法包括：2-1)将收集的肿瘤组织用无菌手术刀切成0.5cm×0.5cm的小块，并用0.25％胰酶在37度消化成单细胞，用低温pbs溶液冲洗1-2次；2-2)将洗涤的白细胞用抗cd16/cd32抗体室温封闭30分钟；2-3)使用不同荧光染料标记的抗cd3，抗cd8和抗cd4抗体室温孵育30分钟。更优选地，步骤2-3)中，采用fitc染料标记的抗cd3抗体，apc染料标记的抗cd8抗体，pe染料标记抗cd4抗体。更优选地，还包括：将步骤2-3)荧光染料标记好的细胞用低温pbs洗涤1-2次去除多余抗体，通过高通量流式细胞分选仪分选，富集出特定的cd4和cd8t淋巴细胞亚群。优选地，步骤2)中通过微流控技术制备单细胞测序的转录组文库。本发明的有益效果如下：本发明首先对外周静脉血和/或肿瘤组织中的t淋巴细胞进行富集和分选，再对特异性t淋巴细胞进行针对性单细胞测序，分析参与免疫抑制，免疫激活或免疫失活等相关基因，实现对t细胞活性和功能的分析，从而给临床诊断治疗提供第一手的资料，尤其适用于对恶性肿瘤患者t细胞活性的检测。同时，还可以比对外周循环血t淋巴细胞和肿瘤侵润t淋巴细胞的基因表达情况，从而得到更加确切的肿瘤免疫抑制的机理，为下一步临床诊断和治疗提供更加进一步的信息。此外，我们可以通过针对已上市或正在临床试验的靶向药物，进一步筛查相关基因及产物，从而为后续的临床诊断和治疗提供参考信息，来选择最合适的药物从而大幅提升抗肿瘤免疫力。具体实施方式为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。实施例本实施例中采用的外周静脉血及肿瘤组织均来自部分经临床和病理诊断确认的恶性黑色素瘤患者(合作医院已与患者签署知情同意书)。以下“室温”指25℃左右，22-28℃均可，“低温磷酸缓冲盐溶液/pbs”均是指4℃，ph7.4的1×pbs溶液。大体实验设计顺序为：患者采血和/或取肿瘤组织——分离获取单细胞——t细胞分选与富集——微流控液滴单细胞文库的制备——二代基因测序——数据库分析与对比具体步骤如下：一、分离获取单细胞(一)针对静脉血1、使用真空抗凝采集管采集静脉血10ml，放置于冰上或4度冰箱备用。2、上述全血于室温300g20分钟离心，去上清，加入生理盐水稀释至20ml。在新离心管中加入10mlficoll溶液，再将稀释的血液缓缓倒入ficoll溶液的上层。血液和ficoll溶液间有明显的分层。室温500g离心20分钟，弃上清，小心吸取中间层乳白色外周血白细胞。获取的白细胞以后用低温磷酸缓冲盐溶液(pbs)冲洗1-2次。将洗涤的白细胞用抗cd16/cd32抗体室温封闭30分钟。3、然后使用fitc染料标记的抗cd3，apc染料标记的抗cd8以及pe染料标记的抗cd4抗体孵育血中分离的白细胞30分钟。(二)针对肿瘤组织1、将收集的肿瘤组织用无菌手术刀切成0.5cm×0.5cm的小块，并用0.25％胰酶在37度消化成单细胞。2、用低温pbs洗涤1-2次，将洗涤的白细胞用抗cd16/cd32抗体室温封闭30分钟。3、然后使用fitc染料标记的抗cd3，apc染料标记的抗cd8以及pe染料标记的抗cd4抗体室温孵育30分钟。二、t细胞分选与富集将荧光染料标记好的细胞用低温pbs洗涤1-2次去除多余抗体，通过bdaria系列流式细胞分选仪分选，富集出特定t淋巴细胞亚群(cd4和cd8细胞)。三、微流控液滴单细胞文库的制备对收集的t淋巴细胞亚群分别进行基于微流控液滴技术的单细胞转录组进行单独标记，并建立文库。具体步骤为，流式分选富集的单细胞与带有dna条形码的水凝胶珠，以及cdna合成酶等成分，通过微量注射技术，在微通道，通过油相与水相的分离，包裹在液滴中。从而完成单细胞测序的第一步。再下一步就是通过各级pcr反应，将测序引物连接到已标记的转录组mrna上。以上仅为简述，本领域技术人员可采用常规技术手段实现，在此不做限定。四、二代基因测序通过使用illumina二代测序仪对获得的转录组文库进行深度测序。五、t细胞活性分析得到测序结果以后，通过生物信息学方法，对t细胞激活/失活信号通路中的基因进行分析对比，从而了解肿瘤患者t细胞的活化状态。此对于患者后期免疫治疗的效果和预后提供一个参考依据。本申请主要是针对恶性肿瘤患者t细胞活性的程度而采取的单细胞测序，其独特之处是针对t淋巴细胞的单细胞测序来获知患者t细胞失活/失能/衰竭的比例，并通过对这些失活/失能/衰竭t细胞的基因组进行研究，并与当今靶向药物数据库进行对比，从而为下一步选择靶向药物或者提高患者自身抗肿瘤免疫力提供基础。例如，基于不断扩大的t细胞功能基因库(此基因表达库可基于大量的文献资料，如dynamictuningoflymphocytes：physiologicalbasis，mechanisms，andfunction.annu.rev.immunol.2015.33：677-713：molecularandcellularinsightsintotcellexhaustion.nat.rev.immunol.2015.15：486-499.等等建立。)，通过对比测序结果与此基因库进行对比，能获得肿瘤患者t细胞失活/失能/衰竭的比例，程度以及机制。基于t细胞活化基因名单，则可以针对性地快速了解t细胞活性，如下表所示。表1.t细胞活化基因名单cd40lgil12ail12bil3cd80ifngtgfb1cd1dcsf2cd28il5cd3gcxcl8il13faslgcd3eicoslgcd4cd7socs1cd81cd5il4rag1cd276il18cd81tlr9il2ripk2tlr1cxcr5vav1il1btnfrsf14aicdabcl2dpp4fascd27il6nos2ms4a1il2raccl3il7blmcxcr4cd86cxcr3adail12rb1il10ccr4il15cd3dirf4lag3blnkccr5ccr2apccd8bil4rcd47ccr3map3k7egr1tlr4ptprcil11ccr1tlr6cx3cl1tlr2nck1micbil12rb2foxp3cd274il18r1cd40lckcd2pd1ctla4与此同时，将测序得到的基因靶点状况，与已知上市或临床实验的抗肿瘤药物数据库进行比对，对可能有效的靶向药物/靶向治疗进行选择。总之，在针对恶性肿瘤患者t淋巴细胞进行单细胞测序而获知患者t细胞活性的基础上，综合各项数据，可以给临床医师提供进一步的诊断和治疗依据。当前第1页12