一种通过piR-31925对弱精症诊断试剂盒及应用的制作方法

一种通过pir-31925对弱精症诊断试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于医疗诊断领域，涉及人精浆中pirna分子的分离、定性和定量分析。更具体地，本发明是一种检测弱精症病人精浆中pir-31925的方法，通过弱精症病人精浆中pir-31925的变化，体外诊断弱精症。


背景技术：

2.近年来，由于受到各种因素的影响，导致不育症患者在不断增加，不育症会给患者的身心与生活质量造成严重影响，给家庭带来沉重负担。随着人们生活压力不断增加，环境污染、生活与饮食方式等发生较大改变，这些因素均与不育症的发生有着密切联系。
3.在不育症患者中，大多数为少弱精症患者，其精子活性较低，更甚者无活动能力。在男性中，少精弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。弱精症的原因比较多，是否造成不育，要看弱精症的程度。
4.如果是轻度的弱精症一般对生育没有大的影响，如果是严重的弱精症要做进一步的检查，看看引起弱精症的原因，有没有前列腺炎导致的弱精症，有没有免疫因素导致的弱精症，查明弱精症的原因后针对病因治疗弱精症。目前，主要依靠常规精液分析进行诊断，常规精液分析是判断男性生育能力及诊断弱精症的临床指标，但具有步骤复杂，样本不易存放等缺点。寻找灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放的诊断技术非常重要。
5.小分子非编码rna(small non-coding rna)，主要包括trna、snrna、snorna、microrna(mirna)、sirna和piwi-interacting rna(pirna)等非编码蛋白质的rna分子。随着对rna研究的深入，已知小分子非编码rna在基因的转录、转录后调控以及引导染色质修饰复合物中起到了重要的作用。pirna是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约26～31nt的小分子非编码rna，并且与piwi蛋白家族成员相结合，在精子形成中起着重要的作用，可以作为不孕不育症的潜在药物靶点和诊断标记物。


技术实现要素：

6.精液作为男性生殖系统的主要代谢产物，可以反映出整个生殖系统的生理病理状况，其检测结果对男性生殖健康具有指导意义。已知，精浆中稳定存在多种pirna，在精子形成中发挥重要作用。
7.为寻找弱精症标记物并对其进行准确检测，本发明人基于已有的研究
8.(1)研究弱精症患者的精浆中的pirna的特异性变化；
9.(2)通过用于检测精浆中pirna的生物芯片测定弱精症精浆中pirna的变化；
10.(3)将筛选到的在弱精症及正常生理状态下表达差异较大的pir-31925应用于精浆pirna检测技术，制备应用于弱精症诊断等领域的诊断试剂盒。
11.通过上述对精浆中pirna与弱精症的相关性研究，申请人提出了以精浆中pir-31925作为弱精症检测标记物，建立一种体外检测精浆中稳定存在的特定pirna的方法，通过检测pir-31925的特异性变化来进行弱精症的早期诊断，同时可以进一步进行药性判断，
用药指南，个体化治疗等研究。
12.因此，本发明的目的是提供一种弱精症标记物。
13.本发明的另一个目的是提供一种用于检测弱精症的探针。
14.本发明的另一个目的是提供上述弱精症标记物的用途，包括制备相应的试剂盒。
15.本发明的另一个目的是提供检测上述弱精症标记物的方法。
16.本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。
17.本发明提供一种弱精症标记物，所述标记物是精浆中稳定存在且可检测到的与piwi蛋白结合的核糖核酸成熟体(mature piwi-rna)中的一种，pir-31925，该序列由下列核苷酸组成：attggtggttcagtggtagaattctcgcctg
18.上述精浆来源于人体。
19.本发明还提供一种用于检测弱精症的探针组合，也及预测、诊断和评价弱精症的pir-31925的探针组合，所述探针组合包括以下序列：
20.所述的pir-31925片段扩增试剂包括：
21.正向引物：5
′-
tggtggttcagtggtagaattct-3
′
22.反向引物：5-agtgcagggtccgaggtatt-3’23.所述的pir-31925片段表达检测试剂包括：
24.探针：5
′-
acctatgctggtccgctct-3
′
25.另一方面，本发明提供了一种上述标记物的检测方法，所述检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法(rt-pcr)和实时荧光定量聚合酶链式反应方法(quantitative real-time pcr)。首先，所述检测方法为rt-pcr方法，例如包括以下步骤的rt-pcr方法：1)提取受试者的精浆总rna，通过rna逆转录反应得到cdna样品，逆转录引物包括以下序列：
[0026]5′-
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccaggcg-3
′
[0027]
然后，所属检测方法为quantitative real-time pcr方法，例如包括以下步骤的quantitative real-time pcr方法：1)提供受试者的精浆总rna，通过rna逆转录反应得到cdna样品；2)用pir-31925设计引物；3)加入荧光探针进行pcr反应；4)检测比较精浆样本对于正常精浆中pir-31925的量的变化。
[0028]
上述精浆来源于人体。
[0029]
本发明提供了一种用于检测弱精症标记物的试剂盒，也即预测、诊断和评价弱精症的试剂盒，该试剂盒包括检测上述标记物的工具。优选地，其中所述工具包括上述用于检测弱精症标记物的pir-31925探针；更优选地，所属工具还包括聚合酶、脱氧核糖核苷酸。
[0030]
精浆中的pirna的检测技术，巧妙地将精浆中的pirna的独特性质与常规分子生物学检测技术结合为一体，临床适应性极强。由于器官组织的生理状态变化会引起精浆中的pirna组成的变化，因此精浆中pirna可以作为标记物实现弱精症的早期诊断。筛选出的pir-31925作为新型弱精症标记物，具有灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，可广泛应用于疾病普查等相关工作。
附图说明
[0031]
图1左右柱分别为正常组与弱精症患者组精浆中pir-31925的quantitative real-time pcr结果。
[0032]
具体实施方法
[0033]
以下参照具体的实例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0034]
精浆中pirna的定量检测实验，具体步骤为：
[0035]
(1)收集正常人及某些病人的精浆
[0036]
(2)使用trizol试剂先提取100μl精浆的总rna。
[0037]
(3)rna逆转录反应得到cdna。逆转录的反应体系包括：1μl amv、2μl dntp、4μl amv buffer、5μl rri、1μl特异性引物、9.5μl depc、2μl rna。反应步骤为16℃反应15分钟，42℃反应60分钟，85℃反应5分钟，4℃保存。
[0038]
(4)进行quantitative real-time pcr反应。反应体系为：0.3μl rtaq、0.4μl dntp、1.2μl mg2+、2μl 10
×
buffer、14.5μl ddh2o、0.4μl特异性引物、0.3μl特异性探针、1μl cdna。反应步骤：95℃反应5分钟一个循环；95℃反应15秒，60℃反应1分钟，40个循环。
[0039]
(5)数据处理方法为δδct法，ct设为反应达到阈值时的循环数，则pir-31925相对内参的表达量可以用方程2^δct表示，其中δct＝ct样品-ct内参。
[0040]
如图所示，pir-31925在弱精症病人中表达显著降低，说明其可以作为一种新的弱精症诊断标记物。