结合CD137和OX40的抗体分子的制作方法

结合cd137和ox40的抗体分子
发明领域
[0001]
本申请涉及结合cd137和ox40并能激动cd137和ox40的抗体分子。抗体分子包含基于cdr的cd137结合位点和位于抗体分子的恒定域中的ox40抗原结合位点。本发明的抗体分子可用于例如疾病(例如癌症和感染性疾病)的治疗。
[0002]
发明背景
[0003]
哺乳动物的免疫系统是一个精细平衡的系统，有时会被诸如癌症之类的疾病破坏。检查点受体通过发挥共刺激或共抑制作用，在免疫系统对疾病的反应中发挥重要作用，而二者的平衡决定了免疫反应的命运(pardoll,2012)。共抑制剂抑制t细胞增殖并诱导抗炎细胞因子释放。它们可以减轻炎症，避免过度免疫反应造成器官/组织损害。另一方面，共刺激剂通过促进t细胞克隆扩增，效应子分化和存活，以促进保护性免疫应答的发展。
[0004]
一种行之有效的癌症免疫治疗方法可通过阻断共抑制受体功能或诱导共刺激受体活性的抗体靶向这些检查点受体，来触发免疫系统识别并杀死肿瘤细胞(pardoll,2012)。阻断共抑制受体活性的抗体已显示出良好的临床活性，目前已被批准用于治疗癌症(larkin等,2015)。诱导共刺激受体活性的抗体已在临床前模型系统中显示出巨大潜力(moran等,2013；schaer等,2014)，目前有几种药物正在临床试验中(mayes等.，2018；melero等,2013)。这些抗体旨在模拟这些共刺激受体的配体，因此也被称为激动剂抗体。
[0005]
几种t细胞共刺激受体是tnf受体超家族的成员，该家族是细胞表面表达的一大类蛋白质，参与免疫和非免疫细胞功能(bremer,2013)。对tnf家族受体及其同源配体之间形成的配合物的结构分析表明，在大多数情况下，对于三聚体的化学计量比，配合物为三聚体，并且tnfr家族配体通常以三聚体形式在细胞表面表达(wajant,2015)。对tnfr激活提出的模型是，与三聚体配体的相互作用诱导了单体受体的三聚化并启动信号转导。这预先假设tnfr家族成员以单体表达，只有配体的相互作用诱导了受体三聚体的形成。该模型最近受到了质疑(vanamee和faustman,2018)，这些单体在没有配体相互作用的情况下形成更高阶结构仍然是一个有争议的问题。预组装的受体二聚体或无活性的三聚体的存在需要多个受体复合物的额外簇聚(cluster)，这可以解释某些可溶、仅三聚体的tnf配体的活性比这些受体的膜结合形式低，受体膜结合形式可形成配体超簇聚并诱导tnf受体超簇聚，从而诱导更高水平的受体活化(m
ü
ller等,2008)。该理论也与以下观察一致：tnfr特异性抗体通常不具有或具有低激动活性，并且需要抗体-tnf受体复合物的二次交联以诱导足够的受体簇聚和活化，从而模拟tnf配体超簇聚(wajant,2015)。
[0006]
抗体-tnf受体复合物的二次交联可以在体外通过交联剂,例如蛋白a或g,或靶向tnf受体特异性激动剂抗体恒定域的二抗实现(vanamee和faustman,2018；wajant,2015)。然而，在体内，这种二次交联需要与存在于免疫细胞表面的fcγ受体相互作用，例如巨噬细胞、nk细胞或b细胞。抗体与fcγ受体的相互作用是复杂的，因为在人类中有6种fcγ受体，对4种人igg同种型具有不同的表达模式和亲和力(bruhns等,2009)。已证明fcγ受体对于靶向体内tnf受体超家族的激动剂抗体的最佳抗肿瘤活性是必需的(bulliard等,2013；bulliard等,2014)。然而，依赖tnfr激动剂抗体的fcγ受体介导交联以诱导受体强激活很
可能会限制其体内总活性，由于以下多种原因：1)结合抗体的细胞将需要与表达fcγ受体的细胞反式相互作用，这种相互作用的频率将限制表达tnfr的细胞的激活；2)与典型的治疗性抗体对其靶标的亲和力相比，fcγ受体对人igg的亲和力通常低得多(分别为微摩尔范围对纳摩尔范围)；和3)fcγ受体介导抗体的效应子功能，例如adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和adcp(抗体依赖性细胞吞噬作用)，因此有可能消除激动剂抗体想要激活的细胞(mayes等,2018)。
[0007]
使用一种同源抗原交联tnf受体激动剂的双价双特异性抗体代表了另外一种fcγ受体介导的交联。与tnf受体家族成员和另一个细胞表面表达的受体结合，同一细胞(顺式)或另一细胞(反式)，产生抗体的交联效果。如果第二个靶标以模拟tnf配体超簇聚的高水平表达，那么这种抗体交联的机制将导致tnf受体的超簇化。相比单特异性激动剂抗体，tnfr激动剂抗体的双特异性抗体方法具有几个理论优势：1)通过靶向第二抗原，例如检查点受体或与肿瘤相关的抗原，tnfr激动作用可针对于肿瘤微环境和外周环境的特定免疫细胞，作为双特异性抗体的第二特异性；2)双特异性抗体的交联结合结构域的亲和力可以设计为高于抗体对fcγ受体的亲和力，从而使交联更有效；3)可以通过突变选择性地无效抗体效应子功能，从而确保不会去除(depletion)目的活化细胞；4)可以在单个双重激动剂分子中实现两个单独的tnf受体的激动作用，结合不免疫细胞的活化作用从而增强对免疫反应的刺激；5)靶向共表达的受体可以导致单个细胞顺式激活，而无需两个细胞相互作用。
[0008]
几种tnf受体家族成员在免疫细胞中具有重叠的表达模式。特别地，ox40、cd137、gitr和cd27在活化的t细胞上表达，并且已经通过实验验证了ox40和cd137的共表达(ma等,2005)。
[0009]
ox40主要在活化的t细胞上表达，包括cd4+ t细胞、cd8+ t细胞、1型和2型t辅助细胞(th1和th2)和调节性t(treg)细胞，并在活化的自然杀伤细胞(nk)上表达。在抗原呈递细胞(apc)上表达的ox40及其配体ox40配体(ox40l)的相互作用，增加了t细胞的克隆扩增、分化和存活，并增强了记忆性t细胞的生成(croft等,2009)。ox40刺激可对t细胞产生直接影响，促进其增殖和存活，或者通过增强炎症细胞因子(例如il2和ifnγ)的产生而产生间接影响。ox40信号传导也可以调节treg的功能，尽管在这些细胞上它可以消除其抑制活性(takeda等,2004)。在癌症中，发现ox40在患有头颈部癌、黑色素瘤和结肠直肠癌的患者的肿瘤浸润t细胞中表达，其中高水平的ox40阳性淋巴细胞与患者更好的存活率相关(petty等,2002；vetto等,1997)。在小鼠中进行的临床前研究已经证明ox40激动剂抗体在几种同系肿瘤模型中的治疗效果，但是以靶向ox40作为单一疗法的效果却是可变的，并且似乎与肿瘤的免疫原性相关(等,2000)。这与以下观点一致：在肿瘤特异性t细胞上的ox40表达需要足够的引发作用，这可能是免疫原性差的肿瘤所不能提供的。在某些同系模型中，已经确定ox40抗体ox86的抗肿瘤活性是由于其以fcγ受体依赖性方式，去除表达高水平ox40的肿瘤内treg所产生的(bulliard等,2014)。
[0010]
ox40的激动剂抗体目前正在癌症的临床试验中，大多数显示出良好的安全性和有限的临床活性(curti等,2013)。为这些抗体选择的同种型是多变的，但几种研究药物是具有人igg1抗体功能的fcγ受体，目的可能是以去除treg为作用机理。这些缺乏明确临床活性的抗体，已促使ox40激动剂抗体与其他几种疗法的组合试验，包括pd1/pd-l1或ctla4抑制、抗vegf治疗和酪氨酸激酶抑制剂阿昔替尼(axitinib)。
[0011]
已经证明这种treg去除(treg depletion)机制在临床前模型中非常有效，并且可以靶向多种受体以消除treg，例如gitr(bulliard等,2014)和ctla4(simpson等,2013)。然而，在临床上，尚未证明靶向人类等效受体的抗体具有相同水平的抗肿瘤功效(glisson等，2016；tran等，2017)。其原因尚不清楚，但与小鼠同系肿瘤模型相比，人肿瘤中fcγ受体表达细胞(例如巨噬细胞)的较低水平可能是这些抗体作用机制缺乏临床转化性的部分原因(milas等,1987)。其他原因可能是，与小鼠treg相比，在人treg中这些标记物表达水平不同(aspeslagh等,2016)。
[0012]
cd137也在活化的t细胞上表达，包括cd4+、cd8+、th1、th2和treg，但是其表达谱还包括b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞和树突状细胞(dc)(bartkowiak和curran,2015)。像ox40一样，cd137及其配体之间的相互作用会触发细胞内信号通路的激活，从而导致t细胞存活、增殖并诱导细胞毒活性。与cd4+ t细胞相比，cd137的刺激优先刺激cd8+ t细胞，并通过产生炎性细胞因子导致cd8+ t的增殖、存活和细胞毒效应功能，并且还有助于记忆cd8+ t细胞的分化和维持。还已证明cd137在肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的肿瘤反应性亚群上特异性表达，其为体内激动作用及其在过继转移的til选择中的应用提供了部分原理(weigelin等,2016)。cd137单一疗法在多种临床前免疫原性肿瘤模型中有效，例如mc38、ct26和b细胞淋巴瘤。然而，为了更有效地治疗已建立的肿瘤，cd137与其他药物的组合使用，例如化疗、细胞因子和其他检查点调节剂，已显示出在减少肿瘤生长方面的增强有益作用(bartkowiak和curran,2015)。在临床前模型中通过激动剂抗体靶向cd137也与肝脏炎症和转氨作用有关，是由增加的依赖于髓样细胞所产生的il27的cd8+ t细胞的积累所引起的(bartkowiak等,2018)。
[0013]
cd137激动剂抗体目前正在癌症的临床试验中，由于cd137激动剂抗体剂量限制性高度肝脏炎症，临床开发进展缓慢，这很可能与小鼠中的观察结果类似(sanchez-paulete等,2016)。乌鲁单抗(urelumab，bms-663513)是首个进入临床试验并显示出临床活性的cd137激动剂抗体，由于其在剂量超过1mg/kg时有致命肝毒性而终止试验(segal等,2017)。乌鲁单抗是一种人igg4抗体，能够在不存在交联的情况下激活cd137(us 8,137,667b2)，尽管按照超聚簇介导的全受体激活理论，交联后活性会提高。相反，当测试剂量至10mg/kg时，埃托米鲁单抗(utomilumab,pf-05082566)未观察到剂量限制性毒性(tolcher等,2017)。埃托米鲁单抗是一种人igg2抗体，仅能在交联时激活cd137(us 8,337,850b2)。两种抗体的其他临床实验正在进行中，测试单一疗法以及放射疗法和化疗与现有的靶向和免疫肿瘤疗法的组合。由于乌鲁单抗对肝毒性的影响，该抗体的剂量必须非常低，在这些水平上还没有观察到临床活性的早期迹象。
[0014]
许多公司对几种靶向cd137或ox40的双特异性分子的开发处于早期阶段。cd137刺激的肿瘤靶向性正通过以下方法被测试：大基因公司(macrogenes)使用靶向her2和epha2的cd137激动剂dart分子，罗氏公司使用fapα或靶向cd20的cd137配体融合蛋白，而辉瑞制药公司使用靶向her2的cd137激动剂抗运载蛋白(anticalin)分子。aligator生物科学公司通过测试ox40和ctla4的双重靶向作用，以特异性地去除高水平表达两种靶标的肿瘤内treg。
[0015]
已证明在体内共刺激ox40和cd137既能刺激cd4+和cd8+ t细胞，又能诱导经历抗原的和未经历抗原的旁邻cd4+ t细胞的细胞毒功能(qui等,2011)。有趣的是，双重共刺激
能够诱导移植的cd4+ t细胞，以减少接种黑素瘤同源肿瘤模型(b16-f10)的免疫缺陷小鼠的肿瘤生长，从而突出了该疗法诱导cd4+ t细胞的肿瘤杀伤活性能力(qui等,2011)。目前正在进行一项i期剂量递增临床试验，研究ox40激动剂(pf-04518600)与cd137激动剂(埃托米鲁单抗-pf-05082566)组合使用的效果(nct02315066)，以评估这种组合的安全性，一项ib/ii期临床试验也正在进行中(nct02554812)，研究同样的tnfr激动剂和pd-1阻断剂(通过阿维单抗，avelumab)组合。这些研究着眼于简单的单特异性激动剂抗体的组合，这些抗体需要fcγ受体交联才能产生激动作用，因此可能低估了靶向这些受体组合的临床活性。
[0016]
ox40和cd137的双重共刺激最近也已在小鼠中使用双特异性抗体方法进行测试，通过化学偶联两种靶向ox40和cd137的现有抗体(ryan等,2018)。称为欧索单抗(orthomab)的分子能够体外诱导cd4+和cd8+ t细胞增殖以及炎性细胞因子il-2和ifnγ的产生。在体内欧索单抗还能够减少黑色素瘤同系肿瘤模型(b16-f10)中的肿瘤生长。预测欧索单抗的二价双特异性可使其在与两个靶标结合时，有效交联分子，从而导致ox40和cd137受体聚集并因此活化t细胞。这些结果证实了在单个分子中靶向ox40和cd137的双特异性抗体方法。欧索单抗分子的生产过程会产生多个更高级的分子和所需的抗体二聚体，需要通过几轮大小排阻步骤进一步纯化。除了作为验证特定靶标组合的研究工具外，这种制备工艺不太可能使这种方法可应用。此外，这种双特异性抗体的结构，两个大分子通过一个小的化学接头连接，很可能在体内不稳定，并且没有药代动力学数据说明这一点。不幸的是，欧索单抗的体内抗肿瘤作用仅与ox40或cd137激动剂抗体的活性进行了比较，而不是与它们的组合进行比较，因此不清楚该分子是由于其双特异性还是由于欧索单抗作为靶向ox40和cd137的单药激动剂抗体组合而发挥作用。
[0017]
因此，建立了在一个单一的二价、双特异性和稳定分子中组合tnf受体家族成员ox40和cd137的激动剂的理论基础，并具有产生ox40和cd137的非fcγ受体依赖性超簇的潜力，从而激活cd4+和cd8+ t细胞以产生有效的抗肿瘤免疫反应。基于靶向ox40或cd137途径的单克隆抗体产生的临床前组合数据，该分子还具有作为组合伴侣提高癌症治疗标准的效果的潜力，从而为患者带来益处。
[0018]
发明说明
[0019]
本发明人已经认识到，能结合cd137和ox40的抗体分子与双靶标结合时，能够诱导ox40和/或cd137的簇聚和信号转导，能非常有效地激活免疫细胞，例如在肿瘤微环境中。另外，本发明人认识到将cd137的活化限制在cd137和ox40共表达的位置上，将非常有效地活化免疫细胞，而不会引起与已知的抗cd137激动剂分子有关的毒性。预期这可用于例如治疗癌症和其他疾病的免疫疗法。
[0020]
如上文背景部分所述，人们认为ox40配体或cd137配体分别与ox40或cd137的起始连接引发了一系列事件，导致受体三聚化，随后是受体簇聚、活化和随后启动的强效抗肿瘤t细胞活性。对于有效地实现ox40或cd137的活化的治疗剂，需要以模式三聚体配体桥联的方式将几种受体单体桥联在一起。
[0021]
本发明人已经分离了抗体分子，其包含基于互补决定区(cdr)的cd137抗原结合位点和位于抗体分子恒定域中的ox40抗原结合位点。本发明人已经表明，当两个靶标共同表达时，这样的抗体分子能够同时结合两个靶标。这一意义的共表达包括cd137和ox40在同一细胞(例如免疫细胞)上表达的情况，以及cd137和ox40在不同的细胞(例如肿瘤微环境中相
邻的两个不同的免疫细胞)上表达的情况。因此，本发明的抗体分子被认为能够顺式结合在单个细胞上表达的两个靶标，并且能够反式结合在不同细胞上表达的两个靶标。
[0022]
本发明人进一步表明，包含基于cdr的cd137抗原结合位点和位于抗体分子恒定域中的ox40抗原结合位点的抗体分子，能够双价结合两个靶标。具体地，本发明人表明，当使这种抗体分子与ox40和cd137结合，所得的复合物交联并进行质谱分析时，显示19％的复合物包含两个ox40部分和两个cd137部分，表明抗体分子双价地结合两个靶标。
[0023]
此外，发明人已经表明，当这些抗体分子与两个靶标结合时，它们能够在体外诱导ox40和cd137的簇聚和信号传导。通过这种作用方式，这样的抗体分子被称为“双重激动剂”，即由于与ox40和cd137双重结合进行交联，导致抗体分子能够通过受体诱导信号传导。
[0024]
如实施例所示，ox40优先在cd4+ t细胞上表达，而cd137优先在cd8+ t细胞上表达。本发明人已经证明了抗体分子能够在cd4+ t细胞上诱导ox40的激动作用。在这些情况下，认为抗体分子通过其基于cdr的抗原结合结构域结合cd137以交联抗体分子，并且同时ox40抗原结合结构域能够结合、簇聚和激活在cd4+ t细胞上表达的ox40。类似地，本发明人已经证明了抗体分子能够在cd8+ t细胞上诱导cd137的激动作用。在这些情况下，认为抗体分子通过基于cdr的抗原结合结构域结合ox40以交联抗体分子，并且ox40抗原结合结构域同时能够结合、簇聚和激活在cd8+ t细胞上表达的cd137。
[0025]
此外，发明人已经表明，当cd137和ox40共表达时，包含如上所述的两个抗原结合位点的抗体分子，已被修饰以减少或消除与fcγ受体的结合，能够通过受体诱导信号传导，表明不需要fcγ受体交联即可发生激动作用。由于本发明的抗体分子的活性不需要fcγ受体介导的交联，因此通过ox40或cd137受体的信号转导预期位于存在两个靶标的位置，例如在肿瘤微环境中。因此，基于两个特异性靶标的表达，抗体分子能够自动地驱动激动作用，而无需额外的交联剂。
[0026]
此外，由于adcc需要fcγ受体结合，因此预期与fcγ受体的结合的减少也将导致adcc的减少，使得靶标免疫细胞不会被本发明的抗体分子去除。本发明人认为这很重要，因为抗体分子被设计以激活表达cd137和/或ox40的免疫细胞，以促进免疫应答。因此，这些免疫细胞的去除是不期望的。发明人证明具有此处所定义特点的抗体分子能够激活和诱导免疫细胞，特别是表达cd137和/或ox40的t细胞的增殖。
[0027]
本发明人还表明，包含如上详述的cd137和ox40抗原结合位点的抗体分子能够抑制小鼠体内的肿瘤生长。此外，与两个单特异性抗体分子的组合相比，使用双特异性抗体分子观察到更有效的肿瘤生长抑制，其中两个抗体分子之一包含基于cdr的cd137抗原结合位点，另一个分子包含基于cdr的ox40抗原结合位点，证明ox40和cd137的同时结合和激动可提高抗肿瘤功效。此外，在ct26小鼠肿瘤模型中，该抗体分子被证明能够诱导完全的肿瘤消退并建立针对肿瘤细胞再次攻击的保护性免疫记忆。因此，预期本发明的抗体分子将在人类患者中显示出治疗癌症的功效。由于这些抗体分子的adcc活性废除，因此可以预期它们通过激动靶标免疫细胞而不是大量去除这些有益t细胞(记忆和效应细胞)来抑制肿瘤的生长。
[0028]
如小鼠体内研究中所观察到的，本文所述抗体分子诱导的t细胞的活化和增殖是全身性的，而不是肿瘤局部的。此外，在一项初步剂量范围的研究中，给予食蟹猴本发明抗体分子，观察到外周中央记忆和效应记忆cd4+和cd8+ t细胞的增殖和活化增加。因此，除了
在肿瘤微环境中靶向t细胞外，抗体分子有望靶向表达ox40和cd137的外周记忆t细胞以驱动肿瘤反应性t细胞的扩增，从而提供抗肿瘤作用。
[0029]
因此，除了实际肿瘤本身的部位以外，还可以认为受肿瘤影响的解剖学位置，包括产生肿瘤特异性免疫反应的人体其他部位(例如周围的淋巴结)。
[0030]
如上文背景部分所述，由于治疗中存在受剂量限制的高度肝炎(乌鲁单抗)或低临床疗效(埃托米鲁单抗)，cd137激动剂分子的临床进展至少在一定程度上受到了阻碍。
[0031]
不希望被理论所束缚，存在于肝脏中的t细胞被认为可能具有被抗cd137激动剂分子激活的潜力，从而导致肝脏炎症。cd8+ t细胞被证明在脓毒症/病毒感染后，促进肝脏炎症和细胞凋亡(wesche-soldato等，2007)。小鼠中的抗cd137激动剂抗体治疗已被证明导致cd137依赖性t细胞浸润到肝脏中(dubrot j等，2010)。综合这些研究的结果，表明高活性的抗cd137激动剂抗体(如乌鲁单抗)可能导致活化的cd8+ t细胞浸润到肝脏中，从而导致肝脏炎症。埃托米鲁单抗的活性可能太低，以至于无法观察到这种作用。或者，用乌鲁单抗治疗观察到的剂量限制的肝毒性可能是由于该抗体结合至特定表位。
[0032]
本发明人进行了广泛的筛选程序，以分离以高亲和力结合二聚体人cd137的抗体分子，即期望以高亲和力结合cd137。考虑到使用的筛选方案，预期抗体分子结合单体cd137的亲和力比观测到对二聚cd137的亲和力低。
[0033]
如本文所指，“亲和力”可以指抗体分子与其同源抗原之间的结合相互作用的强度，通过k
d
测定。对于本领域技术人员而言显而易见的是，其中抗体分子能够与抗原形成多重结合相互作用(例如，其中抗体分子能够与抗原二价结合并且任选地抗原是二聚体)，如通过k
d
测得的亲和力也可能受到亲合力(avidity)的影响，其中亲合力是指抗体-抗原复合物的整体强度。
[0034]
免疫细胞(例如t细胞)在激活时cd137的表达上调。不希望受到理论的束缚，据认为由于cd137在活化的免疫细胞上的高表达，cd137将在此类细胞表面上以二聚体、三聚体和更高阶多聚体的形式存在。相反，幼稚的免疫细胞，例如幼稚的t细胞，在其细胞表面表达低水平或可忽略的cd137，因此，任何存在的cd137可能都是单体形式。因此，期望以高亲合力结合cd137的抗体分子将优先结合活化的免疫细胞，例如活化的t细胞，而不是幼稚的免疫细胞。
[0035]
鉴于以上所述，因此预期在没有通过与ox40接触交联的情况下，本发明的抗体分子将在很大程度上不能激活cd137。此外，如上所述，本发明人开发的抗体分子的fcγ受体介导的交联被减少或消除，期望以此避免在很少或没有共表达ox40的位点激活cd137。已表明与fcγ受体结合的障碍不影响抗体分子的抗肿瘤活性。不希望被理论所束缚，相信当将这种抗体分子施用于患者时将显示出减毒性。这是因为cd137激活将主要限于ox40和cd137共表达的位点，其中ox40和cd137以足以驱动cd137簇聚和激活的水平共表达。本发明人已经表明，在食蟹猴中的初步剂量范围发现研究中，本发明的抗体分子的具有高达30mg/kg的良好剂量耐受性。
[0036]
本发明人已经表明，即使在没有交联的情况下，本发明的抗体分子也能够诱导低水平的ox40簇集和活化。与cd137激动剂抗体不同，ox40激动剂抗体在临床上未显示任何剂量限制毒性(dlt)，因此，在没有交联的情况下，ox40激动剂活性预计不会成为临床治疗的问题。相反，取决于待治疗的病症，在不存在交联的情况下，抗体分子的低水平的ox40激动
剂活性可能是有利的。不希望被理论所束缚，认为包含具有该特性的ox40抗原结合位点的抗体分子,在没有交联的情况下，通过诱导肿瘤反应性t细胞的有限活化和扩增在癌症治疗中起作用，进而导致产生更大的肿瘤反应性t细胞库(pool)，其可被在肿瘤微环境中的交联fcab分子进一步激活。
[0037]
本发明的抗体分子被修饰以减少或消除与fcγ受体结合的另一个优点是这些抗体分子的抗肿瘤活性不依赖于表达ox40的调节性t细胞(treg)去除。treg位于外周环境，具有潜在的保护作用，并可以减少由于过度刺激免疫系统而引起的自身免疫的影响(vignali da等，2008)。因此，据推测，treg去除可能对减少小鼠模型中的肿瘤生长具有显著作用(bulliard等，2014；simpson等，2013)。但是只有有限的证据表明，在人类肿瘤中，treg的去除可以通过adcc实现，而且，如果确实在人类中发生treg的去除，似乎不会像在小鼠模型中所观察到的那样产生显著的抗肿瘤活性(powell等，2007年；nizar s等，2009年；glisson bs等，2016年；tran b等，2017年)。因此，如果抗体分子未大量去除treg，但仍具有抗肿瘤活性，则可能表明该抗体分子具有独立于fcγ受体介导treg去除的抗肿瘤活性。
[0038]
进一步显示抗体分子能够以高亲和力结合人和食蟹猴cd137以及人和食蟹猴ox40。这种交叉反应性是有利的，因为它允许在临床前进展期间在食蟹猴中进行抗体分子的剂量和安全性测试。
[0039]
本发明人鉴定的抗体分子的另一个特征是cd137的抗原结合位点和ox40的抗原结合位点都包含在抗体结构本身内。特别地，抗体分子不需要经由接头或其他手段将其他蛋白质与抗体分子融合以产生与其两个靶标均二价结合的分子。这具有许多优点。具体地，由于本发明人鉴定的抗体分子不包含任何额外的融合部分，因此它们可以使用与产生标准抗体的方法相似的方法来产生。由于接头可能随时间降解，导致抗体分子的异质群体，因此该结构也有望提高抗体的稳定性。在仅有一种融合蛋白的抗体群体中，这些抗体可能无法作为双重激动剂，并无法与ox40和cd137同时结合而发生交联通过受体传递信号。接头的裂解或降解可在将治疗剂给药于个体之前或之后发生(例如，通过酶促裂解或个体的体内ph)，从而导致在个体循环时的有效性降低。由于发明人鉴定的抗体分子中没有接头，因此预期抗体分子在给药之前和之后均保留相同数目的结合位点。此外，从分子的免疫原性的观点来看，本发明人鉴定的抗体分子的结构也是优选的，因为当将分子施用给个体时，融合蛋白或接头或两者的引入可诱导免疫原性，从而导致治疗效果降低。
[0040]
因此，本发明提供：
[0041]
[1]与cd137和ox40结合的抗体分子，包括
[0042]
(a)基于互补决定区(cdr)的cd137抗原结合位点；和
[0043]
(b)位于抗体分子的ch3结构域的ox40抗原结合位点；
[0044]
其中基于cdr的抗原结合位点包含如以下所示cdr1-6：
[0045]
(i)分别为seq id no：1、2、3、4、5和6[fs30-10-16]；
[0046]
(ii)分别为seq id no：1、2、16、4、5和6[fs30-10-3]；
[0047]
(iii)分别为seq id no：1、2、21、4、5和6[fs30-10-12]；
[0048]
(iv)分别为seq id no：25、26、27、4、5和28，[fs30-35-14]；或
[0049]
(v)分别为seq id no：33、34、35、4、5和36，[fs30-5-37]；和
[0050]
其中ox40抗原结合位点包含分别位于ch3结构域的ab、cd和ef结构环中的第一序
列、第二序列和第三序列，其中第一、第二和第三序列分别具有在seq id no：51、52和53中所示序列[fs20-22-49]。
[0051]
[2]与cd137和ox40结合的抗体分子，包括
[0052]
(a)基于互补决定区(cdr)的cd137抗原结合位点；和
[0053]
(b)位于抗体分子的ch3结构域的ox40抗原结合位点；
[0054]
其中基于cdr的抗原结合位点包含如以下所示cdr1-6：
[0055]
(i)分别为seq id no：7、8、9、10、11和6[fs30-10-16]；
[0056]
(ii)分别为seq id no：7、8、17、10、11和6，[fs30-10-3]；
[0057]
(iii)分别为seq id no：7、8、22、10、11和6[fs30-10-12]；
[0058]
(iv)分别为seq id no：29、30、31、10、11和28，[fs30-35-14]；或
[0059]
(v)分别为seq id no：37、38、39、10、11和36，[fs30-5-37]；和
[0060]
其中ox40抗原结合位点包含分别位于ch3结构域的ab、cd和ef结构环中的第一序列、第二序列和第三序列，其中第一、第二和第三序列分别具有在seq id no：51、52和53中所示序列[fs20-22-49]。
[0061]
[3]根据[1]或[2]的抗体分子，其中：
[0062]
(i)第一序列位于抗体分子的ch3结构域的14至18位；
[0063]
(ii)第二序列位于抗体分子的ch3结构域的45.1至77位；和/或
[0064]
(iii)第三序列位于抗体分子的ch3结构域的93至101位；和
[0065]
其中氨基酸残基是根据imgt编号方案编号的。
[0066]
[4]根据[1]至[3]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含seq id no：54[fs20-22-49]所示的ch3结构域序列。
[0067]
[5]根据[1]至[4]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[1]或[2]的(i)至(iv)中任一项中列出的cdr 1-6。
[0068]
[6]根据[1]至[5]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[1]或[2]的(i)至(iii)中任一项中列出的cdr 1-6。
[0069]
[7]根据[1]至[6]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[1]或[2]的(i)中列出的cdr 1-6。
[0070]
[8]根据[1]至[7]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含重链可变(vh)结构域和/或轻链可变(vl)结构域，优选vh结构域和vl结构域。
[0071]
[9]根据[1]至[8]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链，优选免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
[0072]
[10]根据[8]或[9]的抗体分子，其中所述抗体分子包含vh结构域和/或vl结构域，优选vh结构域和vl结构域，如下列出：
[0073]
(i)分别为seq id no：12和14，[fs30-10-16]；
[0074]
(ii)分别为seq id no：18和14，[fs30-10-3]；
[0075]
(iii)分别为seq id no：23和14，[fs30-10-12]；
[0076]
(iv)分别为seq id no：170和172，[fs30-35-14]；或
[0077]
(v)分别为seq id no：40和42，分别为[fs30-5-37]；
[0078]
[11]根据[10]的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[10]的(i)至(iv)中任一项
中列出的vh结构域和vl结构域。
[0079]
[12]根据[10]或[11]的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[10]的(i)至(iii)中任一项中列出的vh和vl结构域。
[0080]
[13]根据[10]至[12]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含在[10]的(i)中列出的vh结构域和vl结构域。
[0081]
[14]根据[1]至[13]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子是人igg1分子。
[0082]
[15]根据[1]至[14]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子包含以下抗体的重链和轻链：
[0083]
(i)分别在seq id no：95和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-16；
[0084]
(ii)分别在seq id no：99和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-3；
[0085]
(iii)分别在seq id no：103和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-12；
[0086]
(iv)分别在seq id no：105和107中列出的fs20-22-49aa/fs30-35-14；或
[0087]
(v)分别在seq id no：109和111中列出的fs20-22-49aa/fs30-5-37。
[0088]
[16]根据[15]的抗体分子，其中所述抗体分子包含[15]的(i)至(iv)任一项中列出的轻链和重链。
[0089]
[17]根据[15]的抗体分子，其中所述抗体分子包含[15]的(i)至(iii)任一项中列出的轻链和重链。
[0090]
[18]根据[15]的抗体分子，其中所述抗体分子包含[15]的(i)中列出的轻链和重链。
[0091]
[19]根据[1]至[18]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子结合人cd137和人ox40。
[0092]
[20]根据[19]的抗体分子，其中所述人cd137由seq id no：127所示的序列组成或包含seq id no：127所示的序列。
[0093]
[21]根据[19]或[20]的抗体分子，其中所述人ox40由seq id no：130所示的序列组成或包含seq id no：130所示的序列。
[0094]
[22]根据[1]至[21]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子结合食蟹猴cd137和食蟹猴ox40。
[0095]
[23]根据[22]的抗体分子，其中所述食蟹猴cd137由seq id no：129所示的序列组成或包含seq id no：129所示的序列。
[0096]
[24]根据[23]或[24]的抗体分子，其中所述食蟹猴ox40由seq id no：131所示的序列组成或包含seq id no：131所示的序列。
[0097]
[25]根据[5]至[7]，[11]至[13]和[16]至[18]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子结合人cd137和人ox40，并且抗体分子结合人cd137的亲和力(k
d
)在抗体分子结合人ox40的亲和力(k
d
)的2倍以内。
[0098]
[26]根据[19]至[25]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子能够同时结合人cd137和人ox40。
[0099]
[27]根据[1]至[26]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子能够在细胞表面表达的cd137存在下激活免疫细胞上的ox40。
[0100]
[28]根据[1]至[27]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子与免疫细胞上的
ox40结合和与cd137的结合引起ox40在免疫细胞上的簇聚。
[0101]
[29]根据[1]至[28]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子能够在细胞表面表达的ox40存在下活化免疫细胞上的cd137。
[0102]
[30]根据[1]至[29]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子与免疫细胞上的cd137结合，并且与ox40的结合引起免疫细胞上cd137的簇聚，其中ox40在同一免疫细胞或在单独的细胞上表达。
[0103]
[31]根据[27]至[30]中任一项的抗体分子，其中所述免疫细胞是t细胞。
[0104]
[32]根据[1]至[31]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子已被修饰以减少或消除抗体分子的ch 2结构域与一种或多种fcγ受体的结合。
[0105]
[33]根据[1]至[32]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子不结合一个或多个fc受γ体。
[0106]
[34]根据[32]或[33]的抗体分子，其中所述fc受体选自下组：fcγri，fcγriia，fcγriibγ和fcγriii。
[0107]
[35]根据[1]至[34]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子能够诱导t细胞的增殖。
[0108]
[36]一种缀合物，其包含[1]至[35]中任一项的抗体分子和生物活性分子。
[0109]
[37]一种缀合物，其包含[1]至[36]中任一项的抗体分子和可检测标记。
[0110]
[38]一种或多种核酸分子，编码[1]至[35]中任一项的抗体分子。
[0111]
[39]一种或多种核酸分子，编码[1]至[4]，[8]至[10]，[14]至[15]和[19]至[35]中任一项的抗体分子，其中所述一种或多种核酸分子包含以下的重链核酸序列和/或轻链核酸序列：
[0112]
(i)分别在seq id no：96和98中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-16；
[0113]
(ii)分别在seq id no：100和102中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-3；
[0114]
(iii)分别在seq id no：104和102中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-12；
[0115]
(iv)分别在seq id no：106和108中列出的fs20-22-49aa/fs30-35-14；或
[0116]
(v)分别在seq id no：110和112中列出的fs20-22-49aa/fs30-5-37。
[0117]
[40]一种或多种载体，其包含[38]至[39]中任一项的一种或多种核酸分子。
[0118]
[41]一种重组宿主细胞，其包含根据[38]至[39]中任一项所述的一种或多种核酸分子或根据[40]所述的一种或多种载体。
[0119]
[42]一种根据[1]至[35]中任一项所述的抗体分子的制备方法，其包括在用于产生所述抗体分子的条件下培养[41]的重组宿主细胞。
[0120]
[43]根据[42]的方法，其进一步包括分离和/或纯化抗体分子。
[0121]
[44]一种药物组合物，其包含[1]至[37]中任一项的抗体分子或缀合物和药学上可接受的赋形剂。
[0122]
[45]根据[1]至[37]中任一项的抗体分子或缀合物，用于通过疗法来治疗人或动物体的方法。
[0123]
[46]一种治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向所述个体施与治疗有效量的根据[1]至[37]中任一项所述的抗体分子或缀合物。
[0124]
[47]根据[45]所述使用的抗体分子或缀合物，其中所述抗体分子或缀合物用于治
疗个体的癌症或感染性疾病。
[0125]
[48]根据[46]的方法，其中所述疾病或病症是个体中的癌症或传染病。
[0126]
[49]根据[1]至[37]中任一项所述的抗体分子或缀合物的用途，用于制备治疗癌症或传染病的药物。
[0127]
[50]根据[47]使用的抗体分子或缀合物，[48]的方法或根据[49]的抗体分子或缀合物的用途，其中所述癌症是实体癌，任选地，所述实体癌是选自黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
[0128]
[51]根据[47]使用的抗体分子或缀合物，[48]的方法或根据[49]所述的抗体分子或缀合物的用途，其中所述感染性疾病是持续性病毒感染，任选地其中所述持续性病毒感染选自人免疫缺陷病毒(hiv)、eb病毒(epstein-barr virus)、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒。
[0129]
[52]根据[47]所述的抗体分子或缀合物，[48]的方法或根据[49]所述的抗体分子或缀合物的用途，其中所述传染病是持续性细菌感染，任选地，所述持续性细菌感染细菌感染是金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、流感嗜血杆菌(hemophilus influenza)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、苍白螺旋体(treponema pallidum)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)或肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的持续感染。
[0130]
[53]根据[47]使用的抗体分子或缀合物、[48]的方法或根据[49]的抗体分子或缀合物的用途，其中所述传染病是持续性真菌感染，任选地其中所述持续性真菌注射是念珠菌的持续感染，例如白色念珠菌(candida albicans)、隐球菌(格特(gattii)和新型细球菌(neoformans))，篮状菌属(青霉菌)马尔尼菲、小孢子菌等，例如奥氏小孢子菌(microsporum audouinii)和断发毛癣菌(trichophyton tonsurans)。
[0131]
[54]根据[47]使用的抗体分子或缀合物、[48]的方法或根据[49]所述的抗体分子或缀合物的用途，其中所述传染病是持续性寄生虫感染，任选地，所述持续性寄生虫感染是疟原虫(例如恶性疟原虫(plasmodium falciparum))或利什曼原虫(例如杜氏利什曼虫(leishmania donovani))的持续感染。
[0132]
[55]根据[45]、[47]和[50]至[54]中任一项使用的抗体分子或缀合物，其中所述治疗包括将所述抗体分子或缀合物与第二治疗剂组合施予所述个体。
[0133]
[56]根据[46]、[48]和[50]至[54]的方法，其中所述方法进一步包括向个体施予治疗有效量的第二治疗剂。
[0134]
[57]根据[47]或[50]所述的用于治疗个体癌症的方法中的抗体分子或缀合物，其中所述方法将所述抗体分子或缀合物与结合pd-1或pd-l1的抗体组合施予所述个体。
[0135]
附图简要说明
[0136]
图1显示了fcab fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49、fs20-22-85、fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108和fs20-31-115，以及野生型(wt)fcab的ch3结构域的序列比对。指出了与wt序列相比，fcabs的ch3结构域中存在的ab、cd和ef结构环的位置，以及任意的氨基酸取代、缺失(以波浪号“～”表示)或插入。根据imgt、imgt外显子(连续编号)、eu和kabat编号系统给出残基编号。
[0137]
图2显示了在存在和不存在交联的情况下，人cd137 t细胞活化试验中cd137mab和
ox40/cd137 mab2的活性。图2a和b显示在浓度递增的抗cd137mab的存在下，以及在存在(图2a)或不存在(图2b)交联抗体的情况下il2的释放。g1aa/20h4.9在存在和不存在交联抗体的情况下均显示活性，而仅在存在交联抗体的情况下才观察到g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16抗体的活性。图2c和d显示了在浓度递增的以mab2形式包含抗人ox40 fcab(fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs 30-35-14)的抗cd137 fs30 mab的存在下，在存在(图2c)或不存在(图2d)交联剂的情况下，il-2的释放。包括如下对照：抗cd137抗体g2/mor7480.1(阳性对照)；抗ox40 mab g1/11d4和mab
2 fs20-22-49aa/4420(阴性对照)；抗fitc mab g1/4420(同型阴性对照)。图2c显示在存在交联的阳性对照mab(g2/mor7480.1)和抗cd137 fs30 mab2(fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs 30-35-14)，但不存在阴性对照mab和mab2(g1/4420、fs20-22-49aa/4420和g1/11d4)的情况下，do11.10-hcd137细胞的活化呈浓度依赖性增加，小鼠il-2的释放增加证明了这一点。图2d显示在不存在交联的情况下，阳性对照g2/mor7480.1、mab2fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs 30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs30-35-14，以及阴性对照g1/4420，fs20-22-49aa/4420和g1/11d4没有显示出弱的t细胞活化作用，测量的il-2的低水平证明了这一点。
[0138]
图3显示在葡萄球菌肠毒素a(sea)分析中cd137 mab、ox40 fcab和ox40/cd137 mab2的活性。在表示的mab/mab2的存在下，以及在存在和不存在交联剂的情况下测量il-2的释放(fitc-右旋糖酐用于抗fitc mab和ox40/fitc模式mab2对照，抗人ch2抗体用于其他所有分子测试)。图3a显示在mab g1/4420(抗fitc；同型对照)、g1aa/mor7480.1(抗cd137)、g1aa/fs30-10-16(抗cd137)、g1aa/20h4.9(抗cd137)、g1aa/11d4(抗ox40)、fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模式(mock)mab2)和fs20-22-49aa/4420加g1aa/fs30-10-16的组合以及浓度为3.7nm的mab2fs20-22-49aa/fs30-10-16存在下，il-2的释放。结果表明，与同型对照相比，在没有人工交联剂的情况下，只有ox40/cd137 mab2增强了t细胞的活化，而靶向ox40的抗体g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420和抗cd137抗体g1aa/20h4.9与同型对照相比，仅在存在人工交联剂的情况下显示出t细胞活化增加，而抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16即使在人工交联剂的存在下，也没有显示出统计学上的显著活性。图3b显示了在存在和不存在人工交联剂(抗人ch2抗体)的情况下，在浓度升高的ox40/cd137 mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16中的il-2释放。结果表明，在不存在抗人ch2抗体的情况下，由ox40/cd137 mab2诱导的t细胞的活化与在该人工交联剂存在下进行测试时的活化相当。图3c和d显示了在浓度递增的mab和mab2存在下，在存在(图3d)和不存在(图3c)人工交联剂(fitc-右旋糖酐用于抗fitc单克隆抗体和ox40/fitc模式mab2对照，抗人ch2抗体用于所有其他测试分子)的情况下，il-2的释放。对照如下：g1/4420(抗fitc)、g1/11d4(抗ox40)、g2/mor7480.1(抗cd137)、g1/11d4以及g2/mor7480.1组合，以及fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模式mab2)。结果显示，当ox40与对照g1/11d4结合时，无论是单独使用还是与抗cd137 mab g2/mor7480.1和fs20-22-49a/4420交联时，t细胞的活化有浓度依赖性的增加。在存在和不存在人工交联剂的情况下，ox40/cd137 mab2具有相当的活性，其活性与交联的ox40 fcab(fs20-22-49aa/4420xlink)相似。仅抗cd137对照抗体(g2/mor7480.1)在具有交联和
不具有交联下均几乎看不到活性。
[0139]
图4显示了在人类pan-t细胞活化试验中cd137 mab、ox40 fcab和ox40/cd137mab2的活性。在表示的mab/mab2的存在下，以及在存在和不存在交联剂的情况下测量il-2的释放(fitc-右旋糖酐用于抗fitc mab和ox40/fitc模式mab2对照，抗人ch2抗体用于其他所有分子测试)。图4a显示了在浓度为3.7nm的mab和mab2存在的下il-2的释放。结果表明，在没有人工交联剂的情况下，只有ox40/cd137 mab2增强了t细胞的活化。靶向ox40的抗体g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420和抗cd137抗体g1aa/20h4.9仅在交联剂存在下显示出增加的t细胞活化。即使在存在人工交联剂的情况下，也未检测到抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16的活性，证实了sea分析的结果，如图3a所示。图4b显示在存在和不存在人工交联剂(抗人ch2抗体)的情况下，通过ox40/cd137 mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16浓度的增加，诱导il-2释放。在存在和不存在人工交联剂的情况下，ox40/cd137 mab2具有相当的活性。图4c显示在浓度递增的ox40/cd137 mab2和对照的存在下，在不存在人工交联剂的情况下的il-2释放，而图4d显示在浓度递增的单剂对照g1/4420、g1/11d4、g2/mor7480.1和fs20-22-49aa/4420的存在下，在人工交联剂(fitc-右旋糖酐或抗人ch2抗体，视情况而定)的存在下的il-2释放。结果表明，在没有人工交联剂的情况下，ox40/cd137 mab2具有亚纳摩尔或个位数的纳摩尔的活性。如预期的那样，无论是否存在交联剂，g1/4420对照均无活性。在不存在交联剂的情况下，对照g1/11d4、fs20-22-49aa/4420、g2/mor7480.1以及g1/11d4和g2/mor7480.1的组合几乎没有或没有活性。当通过抗人ch2抗体或fitc-右旋糖酐交联时，单药抗ox40和抗cd137对照在t细胞活化中表现出浓度依赖性的增加，因此证明该测定法能够通过ox40或cd137受体检测t细胞上的信号传导。
[0140]
图5显示了人ox40/cd137 mab2在cd4+和cd8+ t细胞活化分析中的活性。图5a和b显示了在浓度不断增加的mab和mab2存在下，cd4+ t细胞活化测定中的il-2释放，如文所述。在存在(图5b)或不存在(图5a)人工交联剂(fitc-右旋糖酐用于抗fitc mab和ox40/fitc模式mab2对照，抗人ch2抗体用于其他所有分子测试)的情况下，对mab和mab2进行了测试。结果表明，在不存在人工交联剂的情况下，ox40/cd137mab2能够激活cd4+ t细胞。cd4
+ t细胞被交联的抗ox40对照g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420(单独或与g1aa/fs30-10-16结合)激活，但没有被单剂抗cd137对照g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16激活。未交联的抗ox40对照fs20-22-49aa/4420，在cd4+ t细胞存在下也表现出低水平的活性，抗体交联后活性大大增加。因此当抗体通过人工交联剂或fab结合片段交联至cd137时，fs20-22-49aa/4420模式mab2和fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2共有的抗ox40 fcab，能够通过ox40的激动作用活化cd4+ t细胞。图5c和d显示在浓度增加的mab和mab2的存在下，在cd8+ t细胞活化测定中il-2释放。在存在(图5d)或不存在(图5c)人工交联剂的情况下检测mab和mab2(有关详细信息，请参见图5a和b的图例)。结果表明，在不存在人工交联剂的情况下，ox40/cd137 mab2能够激活cd8+ t细胞。在人造交联剂存在下，cd8+ t细胞的活化在下组中观测：抗cd137对照g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16(单独或与fs20-22-49aa/4420组合使用)中，以及在抗ox40对照fs20-22-49aa/4420中，在g1aa/11d4中，有较小程度上的活化。因此，当抗体通过人工交联剂或fcab结合片段交联至ox40时，g1aa/fs30-10-16对照mab和fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2共同的抗cd137 fab臂被证明能够激动cd8+t细胞上表达的cd137，而抗ox40 fcab被fs20-22-49aa/4420模式mab2和fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2共
有，当抗体通过人工交联剂或fab结合片段交联至cd137时，通过ox40的激动作用而激活cd8+ t细胞。图5e和f分别显示在存在3.7nm的mab/mab2的存在下，和存在或不存在人工交联剂下，cd4+和cd8+ t细胞活化试验中的il-2释放(有关详细信息，请参见图5a和b的图例)。图5e显示ox40/cd137 mab2在不存在人工交联剂的情况下能够激活cd4+ t细胞。cd4+ t细胞被交联的抗ox40对照g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420激活，但未被单剂抗cd137对照g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16激活。抗ox40对照fs20-22-49aa/4420在未交联时也显示出低水平的活性，在抗体交联时活性大大提高。因此，当抗体通过人工交联剂或fab结合片段交联至cd137时，fs20-22-49aa/4420模式mab2和fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2共有的抗ox40 fcab，能够通过ox40的激动作用活化cd4+ t细胞。图5f显示ox40/cd137 mab2在人工交联剂不存在时，能够激活cd8+ t细胞。在存在人工交联剂的情况下，在抗cd137对照g1aa/20h4.9和g1aa/fs30-10-16(单独或与fs20-22-49aa/4420组合使用)中观察到cd8+ t细胞活化，但在抗cd137对照g1aa/mor7480.1或交联的抗ox40对照g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420中未观察到活化。在不存在人工交联剂的情况下，在抗cd137对照g1aa/20h4.9中也观察到cd8+ t细胞的活化。因此，当抗体通过人工交联剂或fcab结合片段交联至ox40时，g1aa/fs30-10-16对照mab和fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2共有的抗cd137 fab能够激动cd8+ t细胞上表达的cd137。
[0141]
图6显示，与cd8+ t细胞相比，cd4+ t细胞表达较低水平的cd137和较高水平的ox40。该图显示了用g1aa/mor7480.1或g1aa/11d4处理的cd4+或cd8+ t细胞的几何平均荧光强度(gmfi)。g1aa/mor7480.1与cd137的结合是cd137表达的量度，而g1aa/11d4与ox40的结合是ox40表达的量度。
[0142]
图7显示了在t细胞活化测定中抗小鼠cd137 mab和mab2的活性。
[0143]
图7a和b显示了在不存在(图7a)和存在(图7b)人工交联剂(抗人ch2抗体或fitc-葡聚糖，视情况而定)时，在浓度递增的结合小鼠ox40和小鼠cd137受体(fs20m-232-91aa/lob12.3)的mab2和对照抗体存在下，il-2的释放。对照是抗体g1/4420(抗fitc)、g1aa/ox86(抗mox40)、g1aa/lob12.3(抗mcd137)、g1aa/ox86加g1aa/lob12.3组合和fs20m-232-91aa/4420(mox40/fitc模式mab2)。结果表明，在没有交联剂的情况下，对照g1aa/ox86、fs20m-232-91aa/4420、g1aa/lob12.3，以及g1aa/ox86和g1aa/lob12.3的组合均没有活性。当通过抗人ch2抗体或fitc-葡聚糖交联时，g1aa/ox86、fs20m-232-91aa/4420和g1aa/ox86加g1aa/lob12.3对照，表现出t细胞活化中浓度依赖性的增加。交联时，观察到g1aa/lob12.3对照的活性略有增加。无论是否存在人工交联剂，ox40/cd137 mab2均显示出良好的活性。图7c和d显示了在不存在(图7c)或存在(图7d)交联抗体(克隆mk1a6)的情况下，不同的抗小鼠cd137抗体(g1aa/lob12.3和g1aa/3h3)在cd3刺激的do11.10-mcd137细胞中的活性。在存在和不存在交联抗体的情况下都观察到了g1aa/3h3的活性，而仅在存在交联抗体的情况下才观察到了g1aa/lob12.3抗体的活性。因此，g1aa/3h3抗体被称为“交联不依赖”，而g1aa/lob12.3抗体被称为“交联依赖”。
[0144]
图8显示了在100倍过量的人靶向ox40模式mab2(fs20-22-49aa/4420)、抗人cd137抗体(g1aa/fs30-10-16)或其组合的存在下，测试人ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16的活性22-49aa/4420)的竞争实验。重复的数据显示为平均值的正负标准差(sd)。统计检验采用单因素方差分析和dunnett的多重比较检验。误差条上方的星号表示与
同型对照(g1/4420)处理的样品相比的显著差异(***p<0.0002)。结果显示，与ox40/cd137 mab2在抗ox40和抗cd137抗体不存在时结合两个受体相比，与fs20-22-49aa/4420模式mab2竞争结合ox40和与g1aa/fs30-10-16 mab竞争结合cd137失败后，ox40/cd137 mab2的活性大大降低。靶向ox40的模式mab
2 fs20-22-49aa/4420和抗cd137 mab g1aa/fs30-10-16的组合进一步降低了ox40/cd137 mab2的活性。这些结果表明，为了使ox40/cd137 mab2通过ox40和cd137的簇聚和激动作用诱导t细胞活化，需要mab2与两个受体双重结合。
[0145]
图9显示了在100倍过量的靶向ox40模式mab
2 fs20m-232-91aa/4420、抗cd137 mab g1/lob12.3或阴性对照mab g1aa/4420(抗fitc)存在下，检测小鼠ox40/cd137 mab
2 fs20m-232-91aa/lob12.3活性的竞争实验。结果表明，与mab2在抗ox40和抗cd137抗体不存在时结合两个受体相比，与g1/lob12.3 mab竞争结合cd137失败后，mab2的活性大大降低，以及与fs20m-232-91aa/4420模式mab2竞争结合ox40失败后，mab2的活性降低到一个低水平。如所预期的，当存在过量的阴性对照mab时，与不存在抗ox40和抗cd137抗体时，观察到的mab2具有相似的活性水平。这些结果表明，为了使mab2通过ox40和cd137的簇聚和激动作用诱导t细胞活化，需要mab2与两个受体双重结合。
[0146]
图10显示了在ct26同系肿瘤模型中抗小鼠ox40/cd137 mab2的抗肿瘤活性。图10a显示了用g1/ox86(无lala突变的抗ox40阳性对照)、g1/lob12.3(不含lala突变的抗cd137阳性对照)、g1/4420(igg对照)、g1/ox86和g1/lob12.3的组合、抗ox40 mab g1aa/ox86和抗cd137 mab g1aa的组合/lob12.3(均具有lala突变)、fs20m-232-91/lob12.3(无lala突变的ox40/cd137 mab2)和fs20m-232-91aa/lob12.3(具有lala突变的ox40/cd137 mab2)处理时，balb/c小鼠的平均ct26肿瘤体积(加或减平均标准误差)。结果表明，与通过抗ox40抗体g1/ox86、抗cd137抗体g1/lob12.3、以及这两种抗体的组合(g1/ox86加g1/lob12.3)以及含lala的抗ox40和抗cd137抗体(g1aa/ox86加上g1aa/lob12.3)的组合处理相比，在有和没有lala突变(分别为fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3)的ox40/cd137 mab2处理中，肿瘤生长减少。图10b显示了通过腹膜内注射3mg/kg同型对照(克隆g1aa/4420)、mox40/fitc模式mab2(克隆fs20m-232-91aa/4420)、抗mcd137 mab(克隆g1aa/lob12.3)，mox40/fitc模式mab2和抗mcd137 mab或mox40/cd137 mab2(克隆fs20m-232-91aa/lob12.3)的组合，单个ct26荷瘤小鼠的肿瘤体积(随时间变化)。水平虚线表示0mm3在y轴上的位置。定性地，mox40/cd137 mab2以及mox40/fitc模式mab2和抗mcd137 mab的组合抑制了ct26肿瘤在部分动物中的生长。图10c显示了图10b中分别表示的ct26荷瘤小鼠的平均肿瘤体积(正负平均值的标准误差)。与同型对照组相比，用mox40/cd137 mab2处理组的早期肿瘤生长阶段有所延迟(第10-22天)。抗mcd137 mab和mox40/fitc模式mab2作为单一药物或组合药物对早期肿瘤生长率没有影响。图10d显示了图10b和10c中所示的相同的ct26荷瘤小鼠的卡普兰-梅尔存活图。生存分析表明，以mox40/cd137 mab2处理，而不是以抗mcd137 mab和mox40/fitc模式mab2作为单一药物或组合药物处理，与同型对照相比，生存率在统计学上显著提高。(使用对数秩(mantel-cox)检验进行成对比较；****p≤0.0001，ns＝无统计学意义。)
[0147]
图11显示了在b16-f10同系肿瘤模型中抗小鼠ox40/cd137 mab2的抗肿瘤活性。用fs20m-232-91aa/lob12.3(ox40/cd137 mab2)或g1/4420(igg对照)处理小鼠。绘制平均肿瘤体积加上或减去标准误差的平均值。结果表明，与用g1/4420对照抗体处理的小鼠相比，
ox40/cd137 mab2在b16-f10同系模型中能够显著降低肿瘤的生长。
[0148]
图12显示了sea分析中ox40/cd137 mab2与抗pd-1或抗pd-l1抗体组合的活性。测试的mab2为fs20-22-49aa/fs30-10-16。对照是在存在或不存在fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2下进行测试的g1/4420(抗fitc)、g1aa/s1(抗pd-l1；图12a)、g1aa/5c4(抗pd-1；图12b)。结果显示，与单独用mab2处理的t细胞相比，当存在fs20-22-49aa/fs30-10-16时，t细胞的激活呈浓度依赖性增加，且在fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2中添加g1aa/s1或g1aa/5c4时，il-2释放(最大响应)增加。当仅用对照抗体处理t细胞时，未观察到活性。分组g1/4420加fs20-22-49aa/fs30-10-16，和g1aa/s1加fs20-22-49aa/fs30-10-16(图12a)或g1/4420加fs20-22-49aa/fs30-10-16和g1aa/5c4加fs20-22-49aa/fs30-10-16(图12b)之间通过两因素方差分析和杜基(tukey’s)多重比较测试进行统计学测试，星号表示p值(*p<0.032，**p<0.0021，***p<0.0002，****p<0.0001)。
[0149]
图13显示了在ct26小鼠肿瘤模型中，单独和组合测试的抗小鼠ox40/cd137mab2和pd-1拮抗剂的抗肿瘤活性。通过(图13a)同型对照抗体(g1aa/4420和migg1/4420)组合，和(图13b)抗小鼠pd-1抗体，(图13c)抗小鼠ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2)，或(图13d)抗小鼠pd-1抗体和抗小鼠ox40/cd137 mab
2 fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2组合处理ct26荷瘤小鼠，显示了其肿瘤体积。对于每个处理组，显示了在研究终止时、细胞接种后60天、肿瘤消退(定义为肿瘤体积小于或等于62.5mm3)的小鼠比例。结果显示，抗pd-1拮抗剂抗体和fs20m-232-91aa/lob12.3的组合产生了最高的动物比例，在15只动物中有7只(47％)具有完全的肿瘤消退反应(图13d)。在研究结束时，通过抗pd-1抗体(图13b)或fs20m-232-91aa/lob12.3(图13c)进行单药处理的小鼠的肿瘤消退率分别为0％和7％。图13e示出了如图13a-d所述处理的ct26荷瘤小鼠的卡普兰-梅尔存活图。生存分析表明，与同型对照抗体相比，fs20m-232-91aa/lob12.3和抗pd-1抗体的组合具有统计学上显著的生存获益(对数秩(mantel cox)检验，p<0.0001)。与同型对照抗体相比，单药治疗未观察到明显的生存差异。
[0150]
图14显示了在ct26同系肿瘤模型中抗小鼠ox40/cd137 mab2的剂量依赖性抗肿瘤活性。图14a显示了通过腹膜内(ip)注射10mg/kg同型对照抗体(g1aa/4420)或0.1、0.3、1、3或10mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3处理ct26荷瘤小鼠的肿瘤体积。对于每个处理组，显示了在研究终止时、细胞接种后67天、肿瘤消退(定义为肿瘤体积小于或等于62.5mm3)的小鼠比例(请参见各图的右上角)。结果显示，在研究结束时，0.3、1、3或10mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3导致动物中肿瘤消退的比例分别为4％(1/25)、4％(1/25)、8％(2/25)和4％(1/25)。同型对照组和0.1mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3组的动物均未显示出肿瘤消退。图14b显示了如图14a所述处理的ct26荷瘤小鼠的卡普兰-梅尔存活图。生存分析表明，与同型对照相比，在所有测试剂量水平下fs20m-232-91aa/lob12.3均具有统计学上显著的生存获益。比较1和3mg/kg组以及3和10mg/kg组，生存率无统计学差异。除非另有说明，否则成对比较在每组与10mg/kg同型对照之间进行，通过对数秩(mantel-cox)试验进行；*p≤0.05，***p≤0.0005，****p≤0.0001，ns＝无统计学意义。
[0151]
图15显示了在ct26同系肿瘤模型中包含不同抗cd137 fab克隆的ox40/cd137 mab2抗体的抗肿瘤功效的比较。图15a显示了用g1/4420(igg对照)、fs20m-232-91aa/lob12.3(有交联依赖性cd137激动剂克隆lob12.3的ox40/cd137 mab2)和fs20m-232-91aa/
3h3(有非交联依赖性的cd137激动剂克隆3h3的ox40/cd137 mab2)处理balb/c小鼠的平均ct26肿瘤体积。显示了平均肿瘤体积加上或减去平均值的标准误差。结果表明，与同型对照抗体(g1/4420)处理相比，ox40/cd137 mab2抗体(fs20m-232-91aa/lob12.3或fs20m-232-91aa/3h3)中的任何一种处理均导致肿瘤生长减少，并且在用fs20m-232-91aa/lob12.3或fs20m-232-91aa/3h3处理的小鼠中未观察到降低水平的差异。图15b显示了如图15a所述处理的ct26荷瘤小鼠的卡普兰-梅尔存活图。生存分析显示，与同型对照抗体相比，使用ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3或fs20m-232-91aa/3h3)进行处理均具有统计学上显著的生存获益(对数秩(mantel cox)测试；p<0.05)，但在用ox40/cd137 mab2处理的小鼠之间未观察到差异。
[0152]
详细描述
[0153]
现在就参考附图讨论本发明的诸方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用纳入本文。
[0154]
本发明涉及与cd137和ox40均结合的抗体分子。具体地，本发明的抗体分子包含基于cdr的cd137抗原结合位点和位于抗体分子的恒定域中的ox40抗原结合位点。除非上下文另外要求，否则术语“cd137”和“ox40”可以指人cd137和人ox40、小鼠cd137和小鼠ox40和/或食蟹猴cd137和食蟹猴ox40。除非上下文另外要求，术语“cd137”和“ox40”优选是指人cd137和人ox40。
[0155]
术语“抗体分子”描述了天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。抗体分子可以是人的或人源化的，优选是人的。抗体分子优选是单克隆抗体分子。抗体的例子是免疫球蛋白同种型，例如免疫球蛋白g，以及它们的同型亚类，例如igg1、igg2、igg3和igg4及其片段。抗体分子可以被分离，在没有污染物的意义上，如抗体能够结合其他多肽和/或血清成分。
[0156]
因此，如本文所用，术语“抗体分子”包括抗体片段，条件是所述片段包含基于cd137的cdr抗原结合位点和位于恒定结构域的ox40抗原结合位点。除非上下文另外要求，否则本文所用的术语“抗体分子”等同于“抗体分子或其片段”。
[0157]
可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组dna技术的技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将cdr或可变区和/或提供ox40抗原结合位点的恒定域序列引入不同的免疫球蛋白中。例如在ep-a-184187、gb2188638a或ep-a-239400的实施例中描述了将一种免疫球蛋白的cdr引入另一种免疫球蛋白的方法。类似的技术可以用于相关的恒定域序列。或者，可以使产生抗体分子的杂交瘤或其他细胞发生基因突变或其他改变，这可能改变或不改变所产生的抗体的结合特异性。
[0158]
由于抗体可以以多种方式修饰，因此术语“抗体分子”应解释为涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能性等价物和同源物，包括任何包含免疫球蛋白结合结构域的多肽，无论是天然的还是全部或部分合成的。因此，包括与另一种多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达如ep-a-0120694和ep-a-0125023中所述。
[0159]
包含cdr序列和ch3结构域的抗体片段的实例是微抗体，其包含连接至ch3结构域的scfv(hu等，1996)。
[0160]
本发明的抗体分子与cd137和ox40结合。在这种情况下，结合可以指特异性的结合。术语“特异性”可以指，抗体分子除了其特异性结合配偶体(此处为cd137和ox40)以外将不与任何分子显著结合。术语“特异性”也适用于抗体分子对特定抗原决定簇具有特异性，
例如cd137和ox40上的抗原决定簇，这些抗原决定簇由多种抗原携带的，在这种情况下，抗体分子将能够与多种携带该表位的抗原结合。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体分子不结合tnfrsf1a、tnfrsf1b、gitr、ngfr、cd40和/或dr6,或不显示任何显著结合。
[0161]
用于构建和使用的抗体及其方法是本领域众所周知的，例如在holliger和hudson(2005)中所述的。可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组dna技术的技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将一个抗体分子的cdr或可变区引入不同的抗体分子(ep-a-184187、gb 2188638a和ep-a-239400)。
[0162]
基于cdr的抗原结合位点是抗体可变区中的抗原结合位点。基于cdr的抗原结合位点可以由三个cdr形成，例如三个轻链可变域(vl)cdr或三个重链可变域(vh)cdr。优选地，基于cdr的抗原结合位点由六个cdr，三个vl cdr和三个vh cdr形成。不同cdr对抗原结合的贡献可以在不同的抗原结合位点中变化。
[0163]
抗原结合位点的三个vh结构域cdr可以位于免疫球蛋白vh结构域内，并且三个vl结构域cdr可以位于免疫球蛋白vl结构域内。例如，基于cdr的抗原结合位点可以位于抗体可变区中。
[0164]
抗体分子可具有针对第一抗原的一个或优选多于一个，例如两个，基于cdr的抗原结合位点。因此，抗体分子可包含一个vh和一个vl结构域，但优选包含两个vh和两个vl结构域，即两个vh/vl结构域对，就如天然存在的igg分子一样。
[0165]
基于cdr的抗原结合位点可以包含抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12或fs30-35-14或fs30-5-37，优选抗体fs30-10-16的三个vh cdr或三个vl cdr，优选三个vh cdr和三个vl cdr。
[0166]
这些抗体的vh和vl结构域序列如下所示：
[0167]
(i)seq id no：fs30-10-16的vh和vl结构域序列分别显示于seq id no：12和14中；
[0168]
(ii)seq id no：fs30-10-3的vh和vl结构域序列分别显示于seq id no：18和14中；
[0169]
(iii)seq id no：fs30-10-12的vh和vl结构域序列分别显示于seq id no：23和14中；
[0170]
(iv)seq id no：fs30-35-14的vh和vl结构域序列分别显示于seq id no：170和172中；和
[0171]
(v)seq id no：fs30-5-37的vh和vl结构域序列分别显示于seq id no：40和42中。
[0172]
技术人员可以毫无困难地从上面所列出的抗体的vh和vl结构域序列中确定cdr的序列。cdr序列可根据，例如kabat(kabat等，1991)或国际immunogenetics(imgt)(lefranc等，2015)确定。
[0173]
根据imgt编号的抗体分子的vh结构域cdr1、cdr2和cdr3序列可以是分别位于抗体分子的vh结构域的位置27-38、56-65和105-117位的序列。
[0174]
根据kabat编号的抗体分子的vh结构域cdr1、cdr2和cdr3序列可以是分别位于vh结构域的31-35、50-65和95-102位的序列。
[0175]
根据imgt编号的抗体分子的vl结构域cdr1、cdr2和cdr3序列可以是分别位于vl结构域的27-38、56-65和105-117位的序列。
[0176]
根据kabat编号的抗体分子的vl结构域cdr1、cdr2和cdr3序列可以是分别位于vl结构域的24-34、50-56和89-97位的序列。
[0177]
例如，抗体分子可以包含以下的vh结构域cdr1、cdr2和cdr3的序列：
[0178]
(i)分别为seq id no：1、2和3，[fs30-10-16]；
[0179]
(ii)分别为seq id no：1、2和16[fs30-10-3]；
[0180]
(iii)分别为seq id no：1、2和21，[fs30-10-12]；
[0181]
(iv)分别为seq id no：25、26和27，[fs30-35-14]；或
[0182]
(v)分别为seq id no：33、34和35，[fs30-5-37]，
[0183]
其中cdr序列是根据immunogenetics(imgt)编号方案定义的。
[0184]
抗体分子可包含以下的vh结构域cdr1、cdr2和cdr3的序列：
[0185]
(i)分别为seq id no：7、8和9，[fs30-10-16]；
[0186]
(ii)分别为seq id no：7、8和17[fs30-10-3]；
[0187]
(iii)分别为seq id no：7、8和22，[fs30-10-12]；
[0188]
(iv)分别为seq id no：29、30和31，[fs30-35-14]；或
[0189]
(v)分别为seq id no：37、38和39，[fs30-5-37]，
[0190]
其中cdr序列是根据kabat编号方案定义的。
[0191]
例如，抗体分子可以包含以下vl结构域的cdr1、cdr2和cdr3的序列：
[0192]
(i)分别为seq id no：4、5和6，[fs30-10-16]；
[0193]
(ii)分别为seq id no：4、5和6[fs30-10-3]；
[0194]
(iii)分别为seq id no：4、5和6，[fs30-10-12]；
[0195]
(iv)分别为seq id no：4、5和28，[fs30-35-14]；或
[0196]
(v)分别为seq id no：4、5和36，[fs30-5-37]，
[0197]
其中cdr序列是根据immunogenetics(imgt)编号方案定义的。
[0198]
例如，抗体分子可以包含以下vl结构域的cdr1、cdr2和cdr3的序列：
[0199]
(i)分别为seq id no：10、11和6，[fs30-10-16]；
[0200]
(ii)分别为seq id no：10、11和6[fs30-10-3]；
[0201]
(iii)分别为seq id no：10、11和6，[fs30-10-12]；
[0202]
(iv)分别为seq id no：10、11和28，[fs30-35-14]；或
[0203]
(v)分别为seq id no：10、11和36，[fs30-5-37]，
[0204]
其中cdr序列是根据kabat编号方案定义的。
[0205]
抗体fs30-10-16、fs30-10-3和fs30-10-12的vh和vl序列相同，除了根据imgt编号方案在vh的109位的残基(根据kabat编号方案在vh的97位的残基)。因此，抗体分子可包含抗体fs30-10-16的vh结构域cdr1、cdr2和cdr3序列和/或vl结构域cdr1、cdr2和cdr3序列，vh结构域序列和/或vl结构域序列，其中抗体分子任选地包含根据imgt编号方案的重链109位(根据kabat编号方案的重链97位)上的氨基酸取代，其中所述位置的残基优选选自下组：天冬酰胺(n)、苏氨酸(t)和亮氨酸(l)。
[0206]
基于cdr的抗原结合位点可包含抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14、或fs30-5-37，较佳地抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12或fs30-35-14，更佳地抗体fs30-10-16、fs30-10-3或fs30-10-12，最佳地抗体fs30-10-16的vh或vl结构域，优
选vh和vl结构域。
[0207]
抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14和fs30-5-37的vh结构域可分别具有如seq id no：12、18、23、170和40中所述的序列。抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14和fs30-5-37的vl结构域可分别具有如seq id no：14、14、14、172和42中所述的序列。
[0208]
本发明的抗体分子包含位于抗体分子恒定结构域的ox40抗原结合位点。所述恒定域可以是cl、ch1、ch2、ch3或ch4域，优选恒定域是ch1、ch2或ch3域，更优选为ch2或ch3域，最优选为ch3域。
[0209]
除非另有说明，否则在本文中恒定结构域的氨基酸残基位置根据immunogenetics(imgt)编号方案进行编号。imgt编号方案在lefranc等，发育与比较免疫学，29，185-203(2005)中描述。
[0210]
ox40抗原结合位点可包含分别位于恒定结构域的第一、第二和第三结构环中的第一、第二和第三序列。工程化抗体恒定结构域结构环以产生靶抗原的抗原结合位点在本领域中是已知的，并且在例如wozniak-knopp等，2010年，和专利公开号wo2006/072620和wo2009/132876中描述。优选地，第一、第二和第三结构环分别是抗体分子的ch3结构域的ab、cd和ef结构环。在ch3域中，ab、cd和ef结构环分别位于ch3域的11-18、43-78和92-101位残基。通过抗体恒定域的结构环序列的修饰以产生新的抗原结合位点，如wo2006/072620和wo2009/132876中所述。
[0211]
在一个优选的实施方案中，抗体分子的ox40抗原结合位点包含以下的第一、第二和第三序列：
[0212]
(i)分别为seq id no：51、52和53中列出的fs20-22-49；
[0213]
(ii)分别为seq id no：51、59和60中列出的fs20-22-38；
[0214]
(iii)分别为seq id no：51、52和60中列出的fs20-22-41；
[0215]
(iv)分别为seq id no：51、52和65中列出的fs20-22-47；或
[0216]
(v)分别为seq id no：51、52和68中列出的fs20-22-85。
[0217]
ox40抗原结合位点可包含fs20-22-49、fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47或fs20-22-85的ab、cd和ef结构环序列，其中ab、cd和ef结构环分别是位于ch3域的残基11-18、43-78和92-101，以及fs20-22-49、fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47或fs20-22-85的ch3域分别为seq id no：54、61、63、66和69。
[0218]
在一个更优选的实施方案中，抗体分子的ox40抗原结合位点分别包含在seq id no：51、52和53中所示的fs20-22-49的第一、第二和第三序列。例如，ox40抗原结合位点可以分别包含seq id no：56、57和58中所示的fs20-22-49的ab、cd和ef结构环序列。
[0219]
当抗体分子的ox40抗原结合位点包含fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49或fs20-22-85的第一、第二和第三序列，则第一、第二和第三序列分别优选地位于抗体分子ch3结构域的14至18、45.1至77和93至101位。
[0220]
当ox40抗原结合位点包含fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49或fs20-22-85的ab、cd和ef结构环序列时，ab、cd和ef结构环序列分别优选地位于抗体分子ch3结构域的11至18、43至78和92至101位。
[0221]
抗体分子可以在抗体分子的ch3结构域的91位处进一步包含亮氨酸(l)。特别地，
包含fs20-22-85的第一、第二和第三序列的ox40抗原结合位点的抗体分子可以在抗体分子的ch3结构域的91位处包含亮氨酸。
[0222]
在一个替代的实施方案中，抗体分子的ox40抗原结合位点包含以下的第一、第二和第三序列：
[0223]
(i)分别在seq id no：71、72和73中列出的fs20-31-58；
[0224]
(ii)分别在seq id no：71、72和76中列出的fs20-31-66；
[0225]
(iii)分别在seq id no：79、80和81中列出的fs20-31-94；
[0226]
(iv)分别在seq id no：84、85和76中列出的fs20-31-102；
[0227]
(v)分别在seq id no：84、88和89中列出的fs20-31-108；或
[0228]
(vi)分别在seq id no：84、92和89中列出的fs20-31-115。
[0229]
ox40抗原结合位点可包含fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108或fs20-31-115的ab、cd和ef结构环序列，其中ab、cd和ef结构环分别是位于ch3域的残基11-18、43-78和92-101，以及fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108或fs20-31-115的ch3域分别为seq id no：54、61、63、66和69。
[0230]
如果抗体分子的ox40抗原结合位点包含fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108或fs20-31-115的第一、第二和第三序列，则第一、第二和第三序列分别优选地位于抗体分子ch3结构域的14至18、45.1至77和92至101位。
[0231]
如果ox40抗原结合位点包含fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108或fs20-31-115的ab、cd和ef结构环序列时，ab、cd和ef结构环序列分别优选地位于抗体分子ch3结构域的11至18、43至78和92至101位。
[0232]
恒定结构域中的氨基酸残基位置，包括本文所述的氨基酸序列、取代、缺失和插入的位置，作为imgt编号的替代方法，可以根据imgt外显子编号(也称为连续编号)、eu编号或kabat编号进行编号。ch3结构域残基位置的imgt编号、imgt外显子编号、eu编号和kabat编号之间的一致性如图1所示。
[0233]
因此，例如，在本申请中，第一、第二和第三序列分别位于抗体分子的ch3结构域的14至18、45.1至77和93至101位，其中残基位置根据imgt编号方案编号，第一、第二和第三序列位于ch3域的18至22、46至50和74至82位，其中残基位置根据imgt外显子编号方案进行编号，如图1所示。
[0234]
在一个实施方案中，抗体分子包含ch3结构域，该ch3结构域包含、具有或由fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49、fs20-22-85、fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108或fs20-31-115的ch3结构域序列组成，其中fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49、fs20-22-85、fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108和fs20-31-115的ch3域序列如seq id no：54、61、63、66、69、74、77、82、86、90和93中所示。
[0235]
在一个优选的实施方案中，抗体分子包含ch3结构域，其分别包含，具有或由seq id no：54所示的fs20-22-49的ch3结构域序列组成。
[0236]
抗体分子的ch3结构域可任选地在ch3结构域序列的直接c末端包含额外的赖氨酸残基(k)。
[0237]
另外，本发明的抗体分子可以包含免疫球蛋白g分子的ch2结构域，例如igg1、
igg2、igg3或igg4分子的ch2结构域。优选地，本发明的抗体分子包含igg1分子的ch2结构域。ch2结构域可以具有如seq id no：48所示的序列。
[0238]
抗体分子的ch2结构域可包含一种或多种减少或消除ch2结构域结合一种或多种fcγ受体(例如fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriii)和/或补体的突变。发明人推测减少或消除与fc受体γ的结合将减少或消除抗体分子介导的adcc。类似地，减少或消除与补体的结合预期将减少或消除抗体分子介导的cdc。减少或消除ch2结构域与一种或多种fcγ受体和/或补体结合的突变是本领域已知的(wang等，2018)。这些突变包括bruhns等，2009年和hezareh等，2001年中所述的“lala突变”，该突变涉及将ch2域的imgt位置的1.3和1.2处的亮氨酸残基替换为丙氨酸(l1.3a和l1.2a)。或者，通过将ch2结构域中imgt位置的84.4位的天冬酰胺(n)突变为丙氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺(n84.4a、n84.4g或n84.4q)，从而将保守的n-链糖基化位点突变产生a-糖基抗体，以降低igg1效应子功能也是已知的(wang等，2018)。作为另一选择，已知补体激活(c1q结合)和adcc可通过将ch2结构域的imgt位置114位的脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸(p114a或p114g)而降低(idusogie等，2000；klein等，2016)。这些突变可以被组合，以产生具有进一步降低或没有adcc或cdc活性的抗体分子。
[0239]
因此，抗体分子可包含ch2结构域，其中ch2结构域包含：
[0240]
(i)1.3和1.2位的丙氨酸残基；和/或
[0241]
(ii)114位的丙氨酸或甘氨酸；和/或
[0242]
(iii)84.4位的丙氨酸，谷氨酰胺或甘氨酸；
[0243]
其中氨基酸残基是根据imgt编号方案编号的。
[0244]
在一个优选的实施方案中，抗体分子包含ch2结构域，其中ch2结构域包含：
[0245]
(i)1.3位的丙氨酸残基；和
[0246]
(ii)1.2位的丙氨酸残基；
[0247]
其中氨基酸残基是根据imgt编号方案编号的。
[0248]
例如，ch2结构域可以具有如seq id no：49所示的序列。
[0249]
在一个替代的优选实施方案中，抗体分子包含ch2结构域，其中ch2结构域包含：
[0250]
(i)1.3位的丙氨酸残基；
[0251]
(ii)1.2位的丙氨酸残基；和
[0252]
(iii)114位的丙氨酸；
[0253]
其中氨基酸残基是根据imgt编号方案编号的。
[0254]
例如，ch2结构域可以具有如seq id no：50所示的序列。
[0255]
在一个优选的实施方案中，与cd137和ox40结合的抗体分子，包括
[0256]
(a)基于cdr的cd137抗原结合位点；和
[0257]
(b)位于抗体分子的ch3结构域的ox40抗原结合位点；
[0258]
其中基于cdr的抗原结合位点包含抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14或fs30-5-37，优选fs30-10-16、fs30-10-3或fs30-10-12、更优选fs30-10-16或fs30-10-3，最优选fs30-10-16的三个vh cdr和三个vl cdr(cdr 1-6)，；和
[0259]
其中ox40抗原结合位点包含分别位于ch3结构域的ab、cd和ef结构环中的第一序列、第二序列和第三序列，其中第一、第二和第三序列分别具有fs20-22-49在seq id no：51、52和53中所示序列。
[0260]
在另一个优选的实施方案中，与cd137和ox40结合的抗体分子包括
[0261]
(a)基于cdr的cd137抗原结合位点；和
[0262]
(b)ch3结构域，其包含、具有或由seq id no：54所示序列[fs20-22-49]组成；
[0263]
其中基于cdr的抗原结合位点包含抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14或fs30-5-37，或fs30-5-37，优选fs30-10-16、fs30-10-3或fs30-10-12，更优选fs30-10-16或fs30-10-3，最优选fs30-10-16的三个vh cdr和三个vl cdr(cdr 1-6)。
[0264]
在另一个优选的实施方案中，与cd137和ox40结合的抗体分子包括
[0265]
(a)包含基于cdr的cd137抗原结合位点的vh结构域和vl结构域；和
[0266]
(b)ch3结构域，其包含、具有或由seq id no：54所示序列[fs20-22-49]组成；
[0267]
其中vh和vl结构域包含、具有或由抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14，或fs30-5-37，优选fs30-10-16、fs30-10-3或fs30-10-12、更优选fs30-10-16或fs30-10-3，最优选fs30-10-16的vh和vl组成。
[0268]
在另一个优选的实施方案中，与cd137和ox40结合的抗体分子包含重链，该重链包含、具有或由以下抗体的重链和轻链组成：
[0269]
(i)分别为seq id no：95和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-16；
[0270]
(ii)分别为seq id no：99和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-3；
[0271]
(iii)分别为seq id no：103和97中列出的fs20-22-49aa/fs30-10-12；
[0272]
(iv)分别为seq id no：105和107中列出的fs20-22-49aa/fs30-35-14；或
[0273]
(v)分别为seq id no：109和111中列出的fs20-22-49aa/fs30-5-37；
[0274]
其中抗体分子优选包含(i)至(iv)中列出的轻链和重链，更优选包含(i)至(iii)中列出的轻链和重链，最优选包含(i)中列出的轻链和重链。
[0275]
本发明的抗体分子还可包含变体第一、第二或第三序列，ab、cd或ef结构环序列、ch3结构域、ch2结构域、ch2和ch3结构域、cdr、vh结构域、vl结构域、轻链和/或重链序列如本文所公开的。合适的变体可以通过改变序列或突变以及筛选的方法获得。在一个优选的实施方案中，包含一个或多个变体序列的抗体分子保留了亲本抗体分子的一个或多个功能特征，例如对cd137和ox40的结合特异性和/或结合亲和力。例如，包含一个或多个变体序列的抗体分子优选以与(亲本)抗体分子相同的亲和力，或更高的亲和力结合cd137和/或ox40。亲本抗体分子是不包含已掺入变体抗体分子中的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的抗体分子。
[0276]
例如，本发明的抗体分子可以包含第一、第二或第三序列，ab、cd或ef结构环序列、ch3结构域、ch2结构域、ch2和ch3结构域、cdr、vh结构域、vl结构域、轻链和/或重链序列，其与本文公开的结构环、ch3结构域、ch2结构域、ch2和ch3结构域、cdr、vh结构域、vl结构域、轻链或重链序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
[0277]
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体分子包含ch3结构域序列，其与seq id no：54[fs20-22-49]中列出的ch3结构域序列具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
[0278]
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体分子包含ch2结构域序列，其与seq id no：48或49中列出的ch2结构域序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
[0279]
通常参考gap算法(威斯康星州gcg软件包，accelerys有限公司，圣地亚哥，美国)来定义序列同一性。gap使用needleman和wunsch算法比对两个完整序列，最大化地增加匹配数并最小化地减少缺口数。通常，使用缺口创建罚分为12，缺口延伸罚分为4的默认参数。可以优选使用gap，但是也可以使用其他算法，例如blast(使用altschul等，1990年中的方法)、fasta(使用pearson和lipman，1988年中的方法)或smith-waterman算法(smith和waterman，1981年)或tblastn程序，参见的altschul等，1990年，同上文，通常采用默认参数。特别地，可以使用psi-blast算法(altschul等，1997)。
[0280]
本发明的抗体分子还可包含第一、第二或第三序列，ab、cd或ef结构环序列，ch3结构域、ch2结构域、ch2和ch3结构域、cdr、vh结构域、vl结构域、轻链和/或重链，与在此公开的第一、第二或第三序列，ab、cd或ef结构环序列、ch3结构域、ch2结构域、ch2和ch3结构域、fcab、cdr、vh结构域、vl结构域、轻链或重链序列相比，具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个的改变。特别地，可以在vh和vl结构域序列之外的抗体分子的一个或多个框架区域和/或在ch3结构域的一个或多个框架区域中进行改变。例如，所述改变可以在本文所述序列之外的ch3结构域中，作为第一、第二和第三序列，或作为ab、cd或ef结构环序列。
[0281]
在一个优选的实施方案中，与seq id no：54、61、63、66、69、74、77、82、86、90或93中列出的ch3结构域序列相比，本发明的抗体分子可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个改变的ch3结构域序列。
[0282]
在一个优选的实施方案中，与seq id no：48或49中列出的ch2结构域序列相比，本发明的抗体分子可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个或更少，15个或更少，10个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，2个或更少，或1个改变的ch2结构域序列。
[0283]
在一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的优选实施方案中，该取代可以是保守取代，例如根据下表所示。在一些实施方案中，中间列中相同类别的氨基酸被彼此取代，即例如非极性氨基酸被另一非极性氨基酸取代。在一些实施方案中，最右边一列中同一行中的氨基酸被取代。
[0284][0285]
在一些实施方式中，取代在功能上可以是保守的。即，在一些实施方式中，与等效的未取代抗体分子相比，取代可能不影响(或不会实质上影响)包含取代的抗原结合分子的一种或多种功能特性(例如结合亲和力)。
[0286]
抗体分子优选结合人cd137和人ox40。优选地，抗体分子能够同时结合人cd137和人ox40，其中人cd137和人ox40被共表达。从这个意义上讲，共表达包括cd137和ox40在同一细胞，例如免疫细胞，如t细胞上表达的情况，以及cd137和ox40在不同的细胞(例如肿瘤微环境中相邻的两个不同的免疫细胞)上表达的情况。因此，据信本发明的抗体分子能够以顺式结合在单个细胞上的两个靶标，并且以反式结合在不同细胞上表达的两个靶标。
[0287]
抗体分子优选以8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.4nm或3.0nm或更高的亲和力(k
d
)结合二聚人cd137。优选地，抗体分子以0.3nm的亲和力(k
d
)或更高的亲和力结合人cd137。抗体分子可以以比单体cd137更高的亲和力结合二聚cd137。人cd137可以具有例如seq id no：127所示的序列。
[0288]
抗体分子优选以8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.4nm或3.0nm或更高的亲和力(k
d
)结合二聚人ox40。优选地，抗体分子以0.3nm的亲和力(k
d
)或更高的亲和力结合人ox40。抗体分子可以以比单体ox40更高的亲和力结合二聚ox40。人ox40可以具有例如seq id no：130所示的序列。
[0289]
抗体分子优选结合食蟹猴cd137和食蟹猴ox40。与食蟹猴cd137和ox40以及人cd137和ox40的结合是有益的，因为它允许在施予人之前测试食蟹猴中的抗体分子的功效和毒性。优选地，抗体分子能够同时结合食蟹猴cd137和食蟹猴ox40，其中食蟹猴cd137和食蟹猴ox40被共表达。
[0290]
抗体分子优选以10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.4nm或3.0nm或更高的亲和力(k
d
)结合二聚食蟹猴cd137。优选地，抗体分子以0.3nm的亲和力(k
d
)或更高的亲和力结合二聚体食蟹猴cd137。食蟹猴cd137可具有例如seq id no：129所示的序列。
[0291]
抗体分子优选以8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2.5nm、2nm、1.5nm或1.0nm或更高的亲和力(k
d
)结合二聚食蟹猴ox40。优选地，抗体分子以1nm的亲和力(k
d
)或更高的亲和力结合食蟹猴ox40。食蟹猴ox40可以具有例如seq id no：131所示的序列。
[0292]
抗体分子结合二聚食蟹猴ox40的亲和力(k
d
)优选在抗体分子结合二聚人ox40的亲和力k
d
的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍之内。优选地，抗体分子结合二聚食蟹猴ox40的亲
和力(k
d
)在抗体分子结合二聚人ox40的亲和力(k
d
)的5倍之内。
[0293]
抗体分子结合二聚食蟹猴cd137的亲和力(k
d
)优选在抗体分子结合二聚人cd137的亲和力k
d
的30倍、20倍、10倍、5倍、4倍或2倍之内。优选地，抗体分子结合二聚食蟹猴cd137的亲和力(k
d
)在结合二聚人cd137的亲和力(k
d
)的2倍以内。
[0294]
如本实施例所述，认为与人和食蟹猴抗原结合的相似性可能是有利的，因为希望在食蟹猴研究中mab2的行为可以推断到人中。在食蟹猴中进行抗体分子的功效和毒性研究被认为是有益的，这可以预示抗体分子在人类中的功效和毒性。
[0295]
抗体分子结合二聚人cd137的亲和力(k
d
)优选在抗体分子结合二聚人ox40的亲和力k
d
的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍之内。优选地，抗体分子结合二聚人cd137的亲和力(k
d
)在结合二聚人ox40的亲和力(k
d
)的2倍以内。
[0296]
抗体分子结合二聚食蟹猴cd137的亲和力(k
d
)优选在抗体分子结合二聚食蟹猴ox40的亲和力k
d
的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍或5倍之内。
[0297]
如本实施例所述，认为抗体分子对结合两个靶标，即cd137和ox40具有相似的亲和力可能是有利的，因为该抗体分子将更可能与表达两个靶标的细胞结合。
[0298]
例如，可以通过表面等离振子共振(spr)，如biacore来确定抗体分子与同源抗原，例如人ox40、人cd137、食蟹猴ox40或食蟹猴cd137的结合亲和力。抗体分子与细胞表面表达的ox40或cd137的结合亲和力可以通过流式细胞术确定。
[0299]
抗体分子对结合配体显示出具有活性范围。例如，抗体分子可能能够阻断，可能无法阻断或可能能够部分阻断cd137l与cd137的结合。
[0300]
优选地，抗体分子可能能够阻断，可能无法阻断或可能能够部分阻断cd137l与cd137的结合。更优选地，抗体分子能够部分阻断cd137l与cd137的结合。
[0301]
优选地，当两个靶标共表达时，与ox40和cd137两者的双重结合而交联的结果导致抗体分子能够诱导ox40和/或cd137的信号传导。通过这种方式作用，这样的抗体分子被称为“双重激动剂”，即抗体分子通过与ox40和cd137双重结合进行交联，能够通过受体诱导信号传导。因此，优选地，当ox40和cd137两者共表达时，抗体分子能够引起双重激动。如本文所述，预期这种双重激动剂是有利的。例如，据信这种双重激动剂可能能够引起对免疫应答的更强的刺激，因为它可以结合不同免疫细胞的激活，例如通过反式结合不同细胞上的两个靶标结合cd8+和cd4+ t细胞的活性。作为另一个例子，据信这种双重激动剂可以通过顺式结合中的两个靶点，这种双重激动剂可能会激活单个细胞共表达两个靶点，无需两个细胞相互作用。
[0302]
更优选地，双重激动剂应该能够通过同时与特定靶标(ox40和cd137)相互作用自主地驱动激动作用，而不需要额外的交联，例如交联剂或fcy受体。如本文所述，预期这种自主活性是有利的，因为其将限于两个靶标共表达的位置，因此有望在ox40很少或没有共表达的位置，降低与cd137激活相关的潜在毒性。
[0303]
抗体分子活化t细胞的能力可以使用t细胞活化测定法来测量。t细胞在活化时释放il-2。因此，t细胞活化测定可以测量il-2的释放，以确定抗体分子诱导的t细胞活化的水平。
[0304]
例如，通过在t细胞活化测定中测量通过t细胞实现il-2的半数最大释放所需的抗体分子的浓度，来确定抗体分子活化t细胞的能力。以下将其称为ec
50
。
[0305]
在一个优选的实施方案中，在t细胞活化测定中抗体分子的ec
50
，为在同一测定中fs20-22-49aa/fs30-10-16的ec
50
的50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍以内,其中fs20-22-49aa/fs30-10-16由seq id no：95所示的重链和seq id no：97所示的轻链构成。
[0306]
例如，抗体分子在t细胞活化测定中的ec
50
在交联时可以为30nm以下、25nm以下、20nm以下、14nm以下、10nm以下、5nm以下、4nm以下、3nm以下、2nm以下、1.5nm以下、1nm以下、0.5nm以下，优选1.5nm以下，更优选1nm以下。
[0307]
另外或可替代地，抗体分子活化t细胞的能力可以通过在存在抗体分子的情况下通过在t细胞活化测定中测量由t细胞释放的il-2的最大浓度来确定。
[0308]
在一个优选的实施方案中，在存在抗体分子的情况下，在t细胞活化测定中由t细胞释放的il-2的最大浓度,为在同一测定中，在存在fs20-22-49aa/fs30-10-16的情况下，由t细胞释放的il-2的最大浓度的20％或10％以内，其中fs20-22-49aa/fs30-10-16由seq id no：95所示的重链和seq id no：97所示的轻链组成。
[0309]
t细胞活化测定法优选包含共表达ox40和cd137的t细胞。在一个优选的实施方案中，t细胞活化测定法不包含除了cd137和ox40之外能够交联抗体分子的任何试剂。
[0310]
t细胞活化测定法可以是本文所述的t细胞测定法，例如本实施例中所述的pan-t细胞测定法、cd4+ t细胞测定法或cd8+ t细胞测定法。
[0311]
例如，t细胞活化测定可以是基于从人外周血单核细胞(pbmc)分离的t细胞的il-2释放测定。cd4+ t细胞活化测定或cd8+ t细胞活化测定可以是分别基于从人pbmc分离的cd4+ t细胞或cd8+ t细胞的il-2释放测定。如本实施例中所述，能够在cd4+和cd8+ t细胞测定中均能活化t细胞的抗体分子能够同时激活ox40和cd137(也称为“双重激动剂”)。例如，t细胞活化测定可包括从白细胞耗竭锥中分离人pbmc。分离pbmc的方法是本领域已知的，并在本实施例中描述。然后可以从pbmc分离t细胞。从pbmc分离t细胞(所有t细胞、cd4+ t细胞或cd8+ t细胞)的方法在本领域中也是已知的，并且在本实施例中进行了描述。
[0312]
活化测定可涉及例如在实验培养基如t细胞培养基中制备所需数目的t细胞。可以以1.0x106细胞/ml的浓度制备所需数量的t细胞。然后可以使用合适的t细胞活化试剂刺激t细胞，该试剂提供t细胞活化所需的信号。例如，t细胞活化试剂可以是包含cd3和cd28的试剂，如包含cd3和cd28的磁珠。分离的t细胞可以与t细胞活化试剂一起孵育过夜以活化t细胞。之后，可以洗涤活化的t细胞以将t细胞与t细胞活化试剂分离，并以合适的浓度例如2.0
×
106细胞/ml重悬于t细胞培养基中。然后可以将活化的t细胞添加到涂有抗人cd3抗体的板上。
[0313]
可以制备每种测试抗体分子的合适稀释液并将其添加到孔中。然后可以将t细胞与测试抗体在37℃，5％co2中孵育24小时。可以收集上清液并进行测定以确定上清液中il-2的浓度。用于确定溶液中il-2浓度的方法是本领域已知的，并且在本实施例中进行了描述。可以将人il-2的浓度对抗体分子的对数浓度作图。所得曲线可通过对数(激动剂)对响应方程拟合。
[0314]
抗体分子可以与生物活性分子或可检测标记物缀合。在这种情况下，抗体分子可以称为缀合物。此类缀合物可用于治疗本文所述的疾病。
[0315]
例如，生物活性分子可以是免疫系统调节剂，例如细胞因子，优选人细胞因子。例如，细胞因子可以是刺激t细胞活化和/或增殖的细胞因子。与抗体分子缀合的细胞因子的
实例包括il-2、il-10、il-12、il-15、il-21、gm-csf和ifn-γ。
[0316]
或者，生物活性分子可以是配体陷阱，例如细胞因子的配体陷阱，例如tgf-β或il-6。
[0317]
或者，生物活性分子可以是治疗性放射性同位素。
[0318]
放射免疫疗法用于,例如癌症治疗。适用于放射免疫疗法的治疗性放射性同位素是本领域已知的，包括钇-90、碘-131、铋-213、砹-211、镥-177、铼-188、铜-67、锕-225和碘-125和铽-161。
[0319]
可以与抗体分子偶联的合适检测标记在本领域中是已知的，包括放射性同位素，例如碘-125、碘-131、钇-90、铟-111和锝99；以及荧光染料，例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和花青染料衍生物，例如cy7和alexa750；发色染料，例如二氨基联苯胺；乳胶珠酶标记，例如辣根过氧化物酶；具有光谱隔离的吸收或发射特性的荧光粉或激光染料；化学部分，例如生物素，可以通过与特定的同源可检测部分结合来检测，例如抗生物素蛋白标记。
[0320]
抗体分子可通过任何合适的共价或非共价键，例如二硫键或肽键，与生物活性分子或可检测标记缀合。当生物活性分子是细胞因子时，细胞因子可以通过肽接头与抗体分子连接。合适的肽接头是本领域已知的，并且长度可以是5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15个氨基酸。
[0321]
在一些实施方案中，生物活性分子可以通过可裂解的接头与抗体分子缀合。接头可允许在治疗部位从抗体分子释放生物活性分子。接头可包括酰胺键(例如肽接头)、二硫键或腙类。肽接头可通过例如，位点特异性蛋白酶切割，二硫键可通过胞质溶胶的还原环境切割，而腙类可通过酸介导的水解切割。
[0322]
本发明还提供了一个或多个分离的核酸分子，其编码本发明的抗体分子。技术人员使用本领域众所周知的方法来制备这种核酸分子将没有困难。
[0323]
所述一个或多个核酸分子可以包含，例如seq id no：55或113、62、64、67、70、75、78、83、87、91或94所示的序列，它们分别编码fs20-22-49、fs20-22-38、fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-85、fs20-31-58、fs20-31-66、fs20-31-94、fs20-31-102、fs20-31-108和fs20-31-115。例如，一个或多个核酸分子可包含seq id no：55或113所示的序列，两者均编码fs20-22-49的ch3域。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包含seq id no：113所示的序列，它编码fs20-22-49的ch3域。优选地，一个或多个核酸分子包含seq id no：55所示的序列，它编码fs20-22-49的ch3域。
[0324]
核酸分子可以编码抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-35-14或fs30-5-37，优选抗体fs30-10-16、fs30-10-3、fs30-10-12或fs30-35-14，更优选抗体fs30-10-16、fs30-10-3或fs30-10-12，最优选抗体fs30-10-16的vh结构域和/或vl结构域，优选vh结构域和vl结构域。这些抗体的vh和vl结构域序列如下所示。
[0325]
例如，核酸分子可包含：
[0326]
(i)抗体fs30-10-16的vh结构域核酸序列，如seq id no：13所示,和/或抗体fs30-10-16的vl结构域核酸序列如seq id no：15所示；或
[0327]
(ii)抗体fs30-10-3的vh域核酸序列，如seq id no：19所示,和/或抗体fs30-10-3的vl结构域核酸序列如seq id no：20所示。
[0328]
(iii)抗体fs30-10-12的vh域核酸序列，如seq id no：24所示,和/或抗体fs30-10-12的vl结构域核酸序列如seq id no：20所示；
[0329]
(iv)抗体fs30-35-14的vh域核酸序列，如seq id no：171所示,和/或抗体fs30-35-14的vl结构域核酸序列如seq id no：32所示；或
[0330]
(v)抗体fs30-5-37的vh域核酸序列，如seq id no：41所示,和/或抗体fs30-5-37的vl结构域核酸序列如seq id no：43所示。
[0331]
一个或多个核酸分子可以编码抗体fs20-22-49aa/fs30-10-16、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-35-14、fs20-22-49aa/fs30-5-37，优选fs20-22-49aa/fs30-10-16、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、或fs20-22-49aa/fs30-35-14，更优选地，fs20-22-49aa/fs30-10-16、fs20-22-49aa/fs30-10-3或fs20-22-49aa/fs30-10-12，最优选地fs20-22-49aa/fs30-10-16的重链和/或轻链，优选重链和轻链。这些抗体的vh和vl结构域序列如下所示。
[0332]
例如，所述一个或多个核酸分子可包含：
[0333]
(i)抗体fs20-22-49aa/fs30-10-16的重链核酸序列，如seq id no：96所示和/或抗体fs20-22-49aa/fs30-10-16的轻链核酸序列如seq id no：98所示；或
[0334]
(ii)抗体fs20-22-49aa/fs30-10-3的重链核酸序列，如seq id no：100所示,和/或抗体fs20-22-49aa/fs30-10-3的轻链核酸序列如seq id no：102所示；
[0335]
(iii)抗体fs20-22-49aa/fs30-10-12的重链核酸序列，如seq id no：104所示,和/或抗体fs20-22-49aa/fs30-10-12的轻链核酸序列，如seq id no：102所示；
[0336]
(iv)抗体fs20-22-49aa/fs30-35-14的重链核酸序列如seq id no：106所示,和/或抗体fs20-22-49aa/fs30-35-14的轻链核酸序列，如seq id no：108所示；或
[0337]
(v)抗体fs20-22-49aa/fs30-5-37的重链核酸序列，如seq id no：110所示,和/或抗体fs20-22-49aa/fs30-5-37的轻链核酸序列，如seq id no：112所示。
[0338]
当核酸编码本发明的抗体分子的vh和vl结构域，或重链和轻链时，两个结构域或链可以通过两个不同的核酸分子编码。
[0339]
分离的核酸分子可以用于表达本发明的抗体分子。核酸通常将以重组载体的形式提供以用于表达。因此，本发明的另一方面提供了一种包含如上所述的核酸的载体。可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。优选地，载体包含合适的调控序列以驱动核酸在宿主细胞中的表达。载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。
[0340]
如本文所述的核酸分子或载体可以被引入宿主细胞。将核酸或载体引入宿主细胞的技术在本领域中是已经建立的，并且可以采用任何合适的技术。适用于产生重组抗体分子的一系列宿主细胞是本领域已知的，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞、例如cho、ns0或hek细胞，例如hek293细胞。
[0341]
本发明的另一方面提供了一种产生本发明的抗体分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码该抗体分子的核酸，并任选地分离和/或纯化由此产生的抗体分子。培养宿主细胞的方法是本领域众所周知的。该方法可以进一步包括分离和/或纯化抗体分子。纯化重组抗体分子的技术是本领域公知的，包括例如hplc，fplc或亲和色谱，例如利用a蛋白或l蛋白。在一些实施方案中，可以使用抗体分子上的亲和标签进行纯化。该方法还可包括将抗
体分子配制成药物组合物，任选地与如下所述的药学上可接受的赋形剂或其他物质一起。
[0342]
如上所述，cd137和ox40都在免疫系统细胞上表达，包括t细胞。例如，ox40在免疫系统的细胞上表达，包括活化的t细胞，特别是cd4+ t细胞、cd8+ t细胞、1型t辅助(th1)细胞、2型t辅助(th2)细胞和调节性t(treg)细胞和肿瘤浸润性t细胞以及活化的自然杀伤(nk)细胞cd137在免疫系统的细胞上表达，包括t细胞，特别是cd8+ t细胞、b细胞、nk细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til)。与cd8+ t细胞相比，cd137在cd4+ t细胞上的表达水平较低(请参见实施例14和图6)，但也已显示出它在诱导cd4+ t细胞的某些亚群的增殖和激活中的作用(wen等，2002)。
[0343]
已经显示ox40激活在增强t细胞活化、t细胞克隆扩增、t细胞分化和存活以及记忆t细胞的产生中起作用。已经显示cd137活化在增强cd8+ t细胞的增殖、存活和细胞毒性效应子功能以及cd8+ t细胞分化和记忆cd8+ t细胞的维持中起作用。还证明了cd137的激活可增强nk细胞介导的adcc以及b细胞的增殖、存活和细胞因子的产生。
[0344]
鉴于ox40和cd137的免疫应答增强活性，已经在癌症治疗的背景下研究了ox40和cd137激动剂分子，并且还有望应用于治疗传染病。
[0345]
因此，本文所述的抗体分子可用于治疗应用，特别是在癌症和感染性疾病的治疗中。
[0346]
本文所述的抗体分子可用于治疗人体或动物体的方法。本发明的相关方面提供了：
[0347]
(i)本文所述的用作药物的抗体分子，
[0348]
(ii)本文所述的抗体分子，用于治疗疾病或病症的方法，
[0349]
(iii)本文所述的抗体分子在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途；和，
[0350]
(iv)治疗个体疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本文所述的抗体分子。
[0351]
个体可以是患者，优选人类患者。
[0352]
治疗可以是达到某种期望的治疗效果的任何治疗或疗法，例如，抑制或延缓病情进展，并且包括降低进展速度、中止进展速度、改善、治疗或缓解(部分或全部)病情，预防、改善、延迟、减轻或抑制一种或多种病症和/或症状，或在无治疗的情况下延长个人或病人的生存期。
[0353]
还包括作为预防措施(即预防措施)的治疗。例如，如本文所述，可以地治疗易患疾病或诸如癌症之类的疾病的发生或再发生的个体。这种治疗可以预防或延迟个体中疾病的发生或再发生。
[0354]
所描述的治疗方法可以包括向个体施用除抗体分子之外至少一种其他的治疗。因此，本文所述的抗体分子可以单独或与一种或多种其他治疗联用施予个体。当抗体分子与另一种治疗组合施予个体时，附加治疗可与抗体分子同时、依次或与抗体分子分开给予患者。如果附加治疗与抗体分子同时进行，则该抗体分子和附加治疗可作为组合制剂给予个体。例如，附加疗法可以是用于待治疗疾病的已知疗法或治疗剂。
[0355]
虽然抗体分子可以单独给药，但抗体分子通常以药物组合物的形式给药，该药物组合物可包括除抗体分子外的至少一种组分。因此，本发明的另一方面提供了包含如本文所述的抗体分子的药物组合物。还提供了一种包括将抗体分子配制成药物组合物的方法。
[0356]
除抗体分子外，药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。本文所用的术语“药学上可接受的”属于化合物、材料、组分、组合物、和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适合与相关受试者(如人类)组织接触时使用，且无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理收益/风险比。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。载体或其他物质的确切性质将取决于给药途径，可以是输液、注射或任何其他合适的途径，如下所述。
[0357]
对于肠胃外，例如皮下或静脉内给药，例如通过注射、包含抗体分子的药物组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其不含热原并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。可以根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0358]
在一些实施方案中，可以在给药之前以冻干形式提供抗体分子以供重构。例如，冻干抗体分子在给药前可在无菌水中重构并与生理盐水混合。
[0359]
给药剂量可以是“治疗有效剂量”，这足以显示出对个体的益处。实际给药量、给药速度和时间，将取决于所治疗药物的性质和严重程度、所治疗的特定个体、个体的临床状况、疾病原因、分娩部位组成、抗体分子的类型、给药方法、给药时间表和其他医生已知的因素。治疗处方，例如剂量的决定等属于全科医生和其他医生的责任，并且可能取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。适当剂量的抗体分子是本领域众所周知的(ledermann等，1991；bagshawe等，1991)。可以使用本文所述的具体剂量，或在《医师手册》(2003)中指出的剂量，适用于所施予抗体分子。抗体分子的治疗有效量或合适剂量可以在动物模型中通过比较体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括待治疗区域的大小和位置，以及抗体分子的精确性质。
[0360]
对于全身性应用，典型的抗体剂量范围为100μg至1g，对于局部应用，典型的抗体剂量范围为1μg至1mg。可以施用最初的较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。这是成年个体单次治疗的剂量，可以针对儿童和婴儿按比例调整剂量，也可以针对其他抗体形式按分子量调整剂量。
[0361]
根据医生的判断，可以每天、每周两次、每周或每月一次的间隔重复治疗。个体的治疗方案可能取决于抗体组合物的药代动力学和药效学性质、给药途径和所治疗病症的性质。
[0362]
治疗可以是周期性的，并且两次给药之间的时间可以是大约两周或更久，例如，大约三周或更久、大约四周或更久、大约每月一次或更久、大约五周或更久，或者大约六周或更久。例如，治疗可以是每两到四周或每四到八周。合适的制剂和给药途径如上所述。
[0363]
在一个优选的实施方案中，本文所述的抗体分子可用于治疗癌症的方法。
[0364]
癌症的特征可能是恶性癌细胞的异常增殖。当提到特定类型的癌症，例如乳腺癌时，这是指相关组织(例如乳房组织)的恶性细胞的异常增殖。位于乳房中但是另一组织(例如卵巢组织)的恶性细胞异常增殖的结果的继发性癌症不是本文所指的乳腺癌，而是卵巢癌。
[0365]
该癌症可以是原发性或继发性癌症。因此，本文所述的抗体分子可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤和/或肿瘤转移。
[0366]
使用本文所述的抗体分子来治疗的癌症的肿瘤可以包含表达ox40和/或cd137的til，例如在它们的细胞表面。在一实施方案中，可能已经确定肿瘤包含表达ox40和cd137之一或两者的til。用于确定抗原在细胞表面上表达的方法是本领域已知的，并且包括，例如流式细胞术。
[0367]
例如，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以选自白血病，例如急性髓细胞性白血病(aml)、慢性髓细胞性白血病(cml)、急性淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病、白血病(cll)；淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；实体癌，例如肉瘤(例如软组织肉瘤)、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、黑素瘤、膀胱癌(例如膀胱尿路上皮癌)、脑癌(例如胶质母细胞瘤)、乳腺癌、子宫/子宫内膜癌症、卵巢癌(例如卵巢浆液性囊腺瘤)、前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(nsclc)、例如肺鳞状细胞癌和小细胞肺癌(sclc))、结直肠癌(例如结直肠癌)腺癌)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、食道癌(例如食道癌)、胰腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肾上腺癌、胃癌(例如胃腺癌)、睾丸癌(例如睾丸生殖细胞肿瘤)、胆囊癌和胆道癌(例如胆管癌)、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌。
[0368]
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症是实体癌。
[0369]
更优选地，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症是选自黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
[0370]
在另一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以是对用一种或多种检查点抑制剂，例如结合pd-1、pd-l1或ctla4的抗体的治疗有反应的癌症。与不响应检查点抑制剂治疗的肿瘤相比，此类肿瘤被认为具有更高的til水平和/或更高的肿瘤突变负荷。此类肿瘤也称为温或热肿瘤。
[0371]
这样的肿瘤的例子包括头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、黑素瘤、肺癌(例如鳞状肺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌[nsclc]或小细胞肺癌[sclc])、前列腺癌、子宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、肾癌、结直肠癌(msi或mss；例如结直肠腺癌)、食道癌、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、间皮瘤和尿路上皮癌。在一个优选的实施方案中，所述癌症是胃癌。该癌症还可以是先前未用化疗剂或放射治疗剂治疗的癌症，即，接受治疗的个体可能是未接受有关癌症的化疗或放射治疗剂治疗的癌症患者。在一个优选的实施方案中，本文所述的抗体分子用于治疗对个体中的一种或多种免疫检查点抑制剂有响应的癌症的方法，其中该方法包括用抗体分子组合抑制pd-1和pd-l1之间相互作用
的药物治疗该患者。
[0372]
或者，使用本文所述的抗体分子治疗的癌症可以是对一种或多种检查点抑制剂(例如结合pd-1、pd-l1或ctla4的抗体)的治疗无反应的癌症，例如胰腺癌或前列腺癌。这种肿瘤也被称为冷肿瘤。
[0373]
本发明人已经表明，对单独用抗pd-1或抗pd-l1抗体的治疗没有反应的肿瘤，对抗pd-1或pd-l1抗体与如本文所述抗体的组合治疗有反应。因此，本发明的抗体分子可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对仅用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，且其中所述方法包括将抗体分子与抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂组合施予个体。一种治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对单独使用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，并且其中所述方法包括将抗体分子与抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂联用施予个体，也被考虑。
[0374]
不希望受到理论的束缚，对仅用一种或多种检查点抑制剂处理无响应的癌症的治疗，通过化疗、放射疗法、免疫治疗剂(例如免疫刺激剂或抗肿瘤疫苗)处理，将导致癌细胞死亡，进而导致肿瘤中til的增加和免疫抑制受体的高表达，这反过来会使癌症响应检查点抑制剂的治疗，即把一个冷肿瘤转变为一个热肿瘤。因此，本发明的抗体分子可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对仅用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，且其中所述方法包括将抗体分子与化疗剂、放射治疗剂或免疫刺激剂或抗癌疫苗以及任选地抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂组合给予个体。一种治疗个体癌症的方法，其中所述癌症对单独用一种或多种检查点抑制剂的治疗无反应或难治，并且其中所述方法包括还考虑将所述抗体分子与化疗剂、放射治疗剂或免疫刺激剂或抗癌疫苗，以及任选地抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂组合给予所述个体。在一个优选的实施方案中，抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂是结合pd-1或pd-l1的抗体。
[0375]
在癌症的情况下，治疗可以包括抑制癌症的生长，包括完全的癌症缓解，和/或抑制癌症的转移，以及抑制癌症的复发。癌症生长通常是指许多指标中的任何一个，这些指标表明癌症内的状态已发展为更发达的形式。因此，用于测量抑制癌症生长的指标包括癌细胞存活率的降低、肿瘤体积或形态的降低(例如，使用计算机断层扫描(ct)、超声检查或其他成像方法确定)、肿瘤生长延迟，肿瘤脉管系统的破坏，迟发型超敏性皮肤测试的性能的改善、抗癌免疫细胞或其他抗癌免疫反应活性的增加，以及肿瘤特异性抗原水平的降低。在个体中激活或增强对癌性肿瘤的免疫应答可以改善个体抵抗癌症生长的能力，特别是在受试者中已经存在的癌症的生长，和/或降低在个体中癌症生长的倾向。
[0376]
在癌症治疗的背景下，本文所述的抗体分子可以与另一种抗癌疗法或治疗剂(例如已证明是合适的抗癌疗法或治疗剂，或可能适用于治疗癌症的问题)组合施用给个体。例如，可以将抗体分子与化疗剂、放射疗法、放射性核素、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、过继性细胞转移(act)疗法(例如过继性nk细胞疗法或嵌合抗原受体(car)t细胞疗法、自体til或γ/δt细胞疗法)或激素治疗剂组合施予个体。本文所述的抗体分子还可与佐剂或新佐剂(例如新佐剂激素疗法)、抗血管生成剂(例如抗vegf或抗vegfr2抗体)或细胞毒剂组合施予个体。
[0377]
不希望被理论所束缚，本文所述的抗体分子被认为可以充当抗癌疗法中的佐剂。具体地，与例如单独使用化疗或放射疗法相比，将抗体分子与化疗或放射疗法组合施予个
体被认为将引发针对癌症的更高的免疫应答。
[0378]
与本文所述的抗体分子组合施用的一种或多种化疗剂可以选自：紫杉烷类、细胞毒性抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、parp抑制剂、b-raf酶抑制剂、mek抑制剂、c-met抑制剂、vegfr抑制剂、pdgfr抑制剂、烷基化剂、铂类似物、核苷类似物、抗叶酸剂、沙利度胺衍生物、抗肿瘤化疗剂等。紫杉烷类包括多西紫杉醇、紫杉醇和纳布紫杉醇；细胞毒性抗生素包括放线菌素、博来霉素和蒽环类药物、如阿霉素、米托蒽醌和戊柔比星(valrubicin)；酪氨酸激酶抑制剂包括厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、plx3397、伊马替尼(imatinib)、考比替尼(cobemitinib)和曲美替尼(trametinib)；parp抑制剂包括吡拉帕尼(piraparib)；b-raf酶抑制剂包括维罗非尼(vemurafenib)和达布拉非尼(dabrafenib)；烷基化剂包括达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺和替莫唑胺(temozolomide)；铂类似物包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；核苷类似物包括阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和吉西他滨(gemcitabine)、以及抗叶酸药物包括甲氨蝶呤和培美曲塞(pemetrexed)。适用于本发明的其他化疗剂包括地法替尼(defactinib)、恩替司他(entinostat)、艾瑞布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)和长春碱(vinblastine)。与本文所述的抗体分子组合施用的化疗剂可以是氟嘧啶。例如，在要治疗的癌症是her2阴性的癌症，例如her2阴性胃癌的情况下，本文所述的抗体分子可以与铂、铂类似物和氟嘧啶组合施用。当待治疗的癌症是her2阳性的胃癌，例如her2阳性胃癌时，本文所述的抗体分子可以与铂或铂类似物、氟嘧啶和曲妥珠单抗(trastuzumab)组合施用。
[0379]
与本文所述的抗体分子一起给药的优选治疗剂是阿霉素、米托蒽醌、环磷酰胺、顺铂和奥沙利铂。
[0380]
与本文所述的抗体分子组合给药的放射疗法可以是体外放射疗法或近距放射疗法。
[0381]
与本文所述的抗体分子一起给药的放射性核素可以选自：钇-90、碘-131、铋-213、砹-211、镥-177、铼-188、铜-67、锕-225和碘-125和铽-161。
[0382]
与本文所述的抗体分子组合施用的免疫治疗剂可以是治疗性抗体分子、核苷酸、细胞因子或基于细胞因子的疗法。例如，治疗性抗体分子可以结合免疫调节分子，例如抑制性检查点分子或免疫共刺激分子、先天免疫系统的受体或肿瘤抗原，例如细胞表面肿瘤抗原或可溶性肿瘤抗原。治疗性抗体分子可以结合的免疫调节分子的例子包括ctla-4、lag-3、tigit、tim-3、vista、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、cd47、cd73、csf-1r、kir、cd40、hvem、il-10和csf-1。治疗性抗体分子可以结合的先天免疫系统的受体的实例包括tlr1、tlr2、tlr4、tlr5、tlr7、tlr9、rig-i样受体(例如rig-i和mda-5)和sting。治疗性抗体分子可以结合的肿瘤抗原的实例包括her2、egfr、cd20和tgf-β。
[0383]
本发明人已经表明，与单独施用本发明的抗体分子或施用抗pd-1或抗pd-l1抗体治疗相比，与抗pd-1或抗pd-l1抗体组合施用本发明的抗体分子导致小鼠肿瘤模型中t细胞活化增强和肿瘤消退。不希望受到理论的束缚，这些结果表明，将本发明的抗体分子与能够抑制pd-1和pd-l1之间的相互作用的试剂组合施用导致增强的抗肿瘤作用，此外这种组合给药可能适合治疗难治性或耐药性或在pd-1或pd-l1抗体单药治疗后复发的肿瘤。
[0384]
因此，本发明的抗体分子可以用于治疗个体癌症的方法中，其中该方法包括将抗体分子与能够抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂组合施用。本发明还提供了能够抑制pd1和pd-l1之间相互作用的试剂，例如结合pd-1或pd-l1的抗体分子，用于治疗个体的癌症的方法，其中该方法包括将能够抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂与本发明的抗体组合施用。一种治疗个体中癌症的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的本发明的抗体分子和治疗有效量的能够抑制pd-1和pd-l1之间相互作用的试剂。
[0385]
在一个优选的实施方案中，能够抑制pd-1和pd-l1的相互作用的试剂是结合pd-1或pd-l1的抗体分子。结合pd-1的抗体是本领域已知的，包括尼古鲁单抗(nivolumab)(5c4)和派姆单抗(pembrolizumab)结合pd-l1的已知抗体包括yw243.55.s1、度伐单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。本发明的抗体分子可以与这些已知的抗pd-1或pd-l1抗体之一组合施用，或与另一种抗pd-1或pd-l1抗体组合施用。制备与pd-1或pd-l1结合的替代抗体在技术人员使用常规方法的能力范围内。
[0386]
与本文所述的抗体分子组合施用的核酸可以是sirna。
[0387]
基于细胞因子或细胞因子的疗法可以选自下组：il-2，结合的il2的前药、gm-csf、il-7、il-12、il-9、il-15、il-18、il-21和i型干扰素。
[0388]
用于治疗癌症的抗肿瘤疫苗已经在临床中实施，并且在科学文献中进行了详细讨论(例如rosenberg，2000)。这主要涉及通过提升免疫系统对自体或同种异体癌细胞表达的不同细胞标记物的应答的策略，通过使用自体或异体癌细胞作为疫苗接种的方法，无论它们是否带有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。gm-csf在抗原呈递方面引起强烈应答，与上述策略一起使用时有显著效果。
[0389]
本文所述的抗体分子也可以与雷莫昔单抗(ramucirumab)和/或紫杉醇；伊立替康(irinotecan)和多烯紫杉醇(docetaxel)或紫杉醇；或派姆单抗(pembrolizumab)组合施予患有癌症的个体，特别是患有胃癌的个体。在msi-h和/或dmmr胃癌的治疗中优选用本文所述的抗体分子与派姆单抗组合治疗。
[0390]
鉴于ox40和cd137增强的免疫应答活性，ox40和cd137双重激动剂分子有望应用于传染病的治疗。因此，在另一个优选的实施方案中，本文所述的抗体分子可用于治疗传染病，例如急性或持续性传染病的方法。
[0391]
不希望被理论所束缚，ox40和cd137激动剂分子被认为可能通过通过诱导先天免疫细胞(如嗜中性粒细胞和单核细胞)的快速浸润和活化而增强针对由病原体引起的急性传染病的免疫应答，从而有助于清除引起急性传染病的病原体。因此，在另一个实施方案中，本文所述的抗体分子可用于治疗急性感染性疾病，例如急性细菌性疾病的方法。在优选的实施方式中，急性感染性疾病是由革兰氏阳性细菌如李斯特菌(listeria)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)或金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)属的细菌感染引起的急性细菌性疾病。
[0392]
传染病通常可通过免疫系统清除，但某些感染会持续很长时间，例如数月或数年，并且无法通过免疫系统有效抵抗。这种感染也称为持续性或慢性感染。
[0393]
优选地，本文所述的抗体分子用于治疗持续性传染病，例如持续性病毒、细菌、真菌或寄生虫感染，优选持续性病毒或细菌感染。
[0394]
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的持续性病毒感染是以
下人的持续性感染：人免疫缺陷病毒(hiv)、eb病毒(epstein-barr virus)、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒。
[0395]
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的持续性细菌感染是以下的持续性感染：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、流感嗜血杆菌(hemophilus influenza)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、苍白螺旋体(treponema pallidum)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)或肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)。
[0396]
cd137激动作用在治疗革兰氏阳性细菌感染方面是有益的。因此，在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的持续性细菌感染是革兰氏阳性细菌的持续性感染。在一个更优选的实施方案中，持续性细菌感染是选自以下的革兰氏阳性细菌的持续性感染：金黄色葡萄球菌、麻风分枝杆菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。
[0397]
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的持续性真菌感染是以下的持续性感染：念珠菌，例如白色念珠菌(candida albicans)、隐球菌(格特(gattii)和新型细球菌(neoformans))，篮状菌属(青霉菌)马尔尼菲、小孢子菌等，例如奥氏小孢子菌(microsporum audouinii)和断发毛癣菌(trichophyton tonsurans)。
[0398]
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的抗体分子治疗的持续性寄生虫感染是以下的持续性感染：疟原虫，例如恶性疟原虫(plasmodium falciparum)，或利什曼原虫，例如利什曼原虫(leishmania donovani)。
[0399]
在治疗持续性传染病的情况下，可以将抗体分子与第二种治疗方法或治疗剂组合施予个体，所述第二种治疗方法或治疗剂已被证明适合或预期适合治疗病原体。例如，可以将抗体分子与免疫治疗剂组合施予个体。与本文所述的抗体分子组合施用的免疫治疗剂可以是治疗性抗体分子。例如，治疗性抗体分子可以结合先天免疫系统的受体。治疗性抗体分子可以结合的先天免疫系统的受体的实例包括tlr1、tlr2、tlr4、tlr5、tlr7、tlr9、rig-i样受体(例如rig-i和mda-5)和sting。
[0400]
当抗体分子用于预防感染性疾病时，抗体分子可以与针对所述病原体的疫苗组合施用。不希望被理论所束缚，本文所述的抗体分子被认为可以在疫苗接种中充当佐剂。特别地，抗体分子与疫苗组合施予个体被认为比单独施予疫苗引发更大的针对病原体的免疫应答。
[0401]
在持续感染性疾病的治疗中，治疗可以包括消除感染、降低个体的致病负荷以及防止感染的复发。例如，治疗可包括预防、改善、延迟、减轻或阻止持续感染的一种或多种病症和/或症状。或者，治疗可包括预防传染病。
[0402]
以其特定形式或用于执行所公开的功能的手段，或用于获得所公开的结果的方法或过程来表示的，在前述说明书、或所附权利要求书或附图中公开的特征，可以单独地、或使用这些特征的任意组合，以实现本发明的各种形式。
[0403]
尽管已经结合上述示例性实施例描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，上述本发明的示例性实施例被认为是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。
[0404]
为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释是为了促进读者的理解。发明人不希望被这些理论任何解释束缚。
[0405]
本文使用的所有章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
[0406]
除非上下文另有要求，否则在整个说明书，包括所附权利要求书中的词语“包含”和“包括”以及诸如“包含有”、“含有”、和“包括有”等变体将理解为表明包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
[0407]
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当利用先行词“约”将数值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一实施方式。相对于数值的术语“约”是可选的，并且是指，例如+/-10％。
实施例
[0408]
本发明人旨在产生一种mab2，其在不存在人工交联剂或fcγ受体介导的交联的情况下能够激动ox40和cd137，并且能够产生增强的针对疾病(例如癌症)的免疫应答。在这种情况下，mab2是一种抗体分子，包含基于cdr的cd137抗原结合位点和位于抗体分子ch3域中的ox40抗原结合位点。
[0409]
为了实现该目的，本发明人首先使用筛选和亲和力成熟方法来鉴定能够在人和小鼠中分别结合ox40并诱导t细胞活化的fcab(参见实施例2和3)。发明人随后将来自这些fcab的ox40抗原结合位点引入了mab2形式，并显示出这些抗人ox40“模式”mab2中的几种，在交联时能够以高亲和力结合人和食蟹猴ox40并活化t细胞(参见实施例4)。其中，克隆fs20-22-49在交联上显示出最高的激动活性，在交联存在时有最低的ec
50
激动活性，因此提出其可作为ox40抗原结合位点用于研究对象mab2的开发。
[0410]
为了开发结合cd137并能够激动cd137的基于cdr的抗原结合位点，本发明人使用筛选方法来鉴定可以结合人cd137且仅在交联时能够活化t细胞的单克隆抗体(mab)(请参阅实施例5)。将从这些鉴定的mab的cdr随后克隆到包含fs20-22-49ox40抗原结合位点的mab2中。优化这些mab2的cdr序列，以产生以下mab2:fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16、fs20-22-49aa/fs30-35-14和fs20-22-49aa/fs30-5-37(请参阅实施例6)。所有这些mab2已证明对人cd137具有高水平的特异性，并且在t细胞活化测定中，在交联时活化cd137(参见实施例7)。在没有交联的情况下，mab2没有显示出显著的激活cd137的能力。
[0411]
已确定所选mab2中的fs20-22-49aa ox40抗原结合位点在交联时能够结合和激活ox40，fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-10-16、fs30-35-14和fs30-5-37基于cdr的cd137抗原结合位点在交联时分别能够结合和激活cd137，本发明人试图证明含有这些抗原结合域的mab2能够激活两个ox40和cd137(也称为“双重激动”)。这样的双重激动剂将能够i)与ox40结合以交联mab2并结合、簇聚并激活(激动)cd137，以及ii)与cd137结合以交联mab2并结合、簇聚并激活(激动)ox40。重要的是，双重激动剂应能够基于特定靶标(ox40和cd137)的表达而自主驱动激动剂，而无需其他交联剂。
[0412]
本发明人证明了所测试的mab2分子能够结合人cd137、人ox40、食蟹猴cd137和食
蟹猴ox40(参见实施例8)，并且所测试的mab2分子能够同时结合人cd137和人ox40(请参阅实施例9)。本发明人表明，mab2的ch2结构域中的lala突变降低了其与fcγ受体的结合，并且mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16在adcc生物测定中无法诱导adcc活化(参见实施例10)。
[0413]
本发明人还表明，测试的ox40/cd137 mab2分子与细胞表达的人和食蟹猴ox40和cd137结合中，没有观察到非特异性结合(参见实施例11)。
[0414]
然后，本发明人证明了，所测试的包含该lala突变的mab2分子，在不存在人工交联剂的t细胞活化测定中，使用葡萄球菌肠毒素a(sea；参见实施例12)，能够诱导t细胞活化。本发明人还证明了测试的mab2分子，在不存在人工交联剂的pan-t细胞活化试验中，可以诱导t细胞活化，并且该活性取决于同时结合ox40和cd137的mab2(请参阅实施例13和16)。发明人还证实，在不存在交联的情况下，fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2能够分别激活cd4+和cd8+ t细胞中的这些受体(参见实施例14)。
[0415]
由于抗人ox40/cd137 mab2不与小鼠蛋白结合，因此为了测试ox40/cd137 mab2对t细胞介导的抗肿瘤反应的潜能，制备了针对小鼠ox40和小鼠cd137的平行mab2，都带有或不带有lala突变(分别标记为fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3)。发明人表明，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2可以诱导t细胞活化而无需任何其他交联剂，并且该活性取决于同时结合ox40和cd137的mab2(参见实施例15和16)。
[0416]
本发明人证明了fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3 mab2在体内ct26同系肿瘤模型中具有抗肿瘤功效(参见实施例17)。发明人还证明了fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2对循环t细胞有作用，增加了活化和增殖t细胞的频率(参见实施例18和19)。发明人证明了fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2在体内b16-f10同系肿瘤模型中具有抗肿瘤功效(参见实施例20)。
[0417]
发明人对mab2进行了分析表征和初步稳定性评估(参见实施例21)。测试的所有五种mab2均显示出良好的分析表征和良好的稳定性。
[0418]
本发明人已经证明，在使用sea的t细胞活化测定中，fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2与抗pd-l1或抗pd-1抗体的联用可以导致体外t细胞的最大活性高于单独使用ox40/cd137 mab2所观测的最大活性。本发明人进一步表明，在ct26小鼠肿瘤模型中，与用任何一种单一药剂进行治疗相比，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2和抗pd-1抗体的体内组合治疗能够导致肿瘤活性增加，以提供生存获益并增强t细胞和nk细胞增殖的药效调节(参见实施例22)。
[0419]
本发明人已经证明，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2在体内ct26同系肿瘤模型中具有剂量依赖性的抗肿瘤活性，高达一定剂量水平，并且该活性在更高剂量下得以维持。发明人还显示，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2可以诱导在“完全应答”小鼠中保护性免疫记忆的建立，并防止再次接种ct26细胞(参见实施例23)。发明人已经证明，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2对循环t细胞具有作用，在不同剂量水平下显著增加了增殖(ki67+)cd4+和cd8+ t细胞的频率(参见实施例24)。发明人还进一步表明，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2能够增加活化(cd69+)和增殖(ki67+)cd8 t细胞的频率，并且cd4 t细胞的去除对fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2介导的外周药效反应有不利影响(参见实施例25)。发明人已经表明，与等效的人类测定法相比，fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2在原食蟹猴pbmc分析中具
有相似的功能活性，mab2在食蟹猴中的耐受性良好，剂量高达30mg/kg，并且能够在食蟹猴中诱导与药物相关的中枢记忆和效应记忆cd4+和cd8+ t细胞和nk细胞的增殖和活化的增加(参见实施例26)。
[0420]
发明人还表明，当在balb/c小鼠中进行研究时，与不依赖交联的cd137激动剂相比，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2在肝脏中诱导了t细胞浸润和增殖水平的中度和瞬时增加，其诱导升高和持续的肝t细胞浸润、增殖和活化(参见实施例27)。最后，在ct26同系小鼠肿瘤模型中，发明人表明，在用fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2或ox40/cd137 mab2治疗的小鼠之间，该ox40/cd137 mab2包含由相同的ox40 fcab和一个交联非依赖的抗cd137 fab克隆组成，与fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2的交联依赖的抗cd137 lob12.3克隆相比，尽管交联非依赖的fab克隆具有诱导t细胞水平和增殖的能力，但肿瘤的生长或存活没有差异(请参阅实施例28)。
[0421]
在以下实施例中更详细地描述了这些实验。
[0422]
实施例1
–
抗原的选择和表征
[0423]
用于鉴定能够结合并激动ox40和cd137的mab2的选择和筛选方法需要使用各种ox40和cd137抗原。这些抗原的产生更详细地在下面描述。
[0424]
1.1ox40抗原
[0425]
用于选择对人和小鼠ox40特异的fcab，以及用于测试所选fcab与食蟹猴ox40的交叉反应性的ox40抗原，可在如下所述的内部制备或从商业来源获得。
[0426]
1.1.1重组、可溶性人、食蟹猴和小鼠ox40抗原的制备
[0427]
为了制备重组的可溶性二聚体ox40抗原，将ox40的胞外域与小鼠fc融合，从而改善了抗原的溶解性和稳定性。具体而言，使用ecori-hf和bgiii限制性内切酶将相关ox40(人、食蟹猴或小鼠)的胞外域克隆到pfuse-migg2afc2载体(invivogen货号pfuse-mg2afc2)中，以产生c端具有小鼠igg2a fc结构域的抗原。然后，通过在hek293-6e细胞(加拿大国家研究委员会)中瞬时表达产生重组ox40抗原，并使用mab select sure蛋白a柱(通用医疗公司，11003494)纯化，然后通过体积排阻色谱法(sec)纯化以确保产生的抗原是单一物种，不包含聚集体。
[0428]
为了制备重组ox40抗原的生物素化形式，按照制造商的实验方法，使用ez-link
tm
sulfo-nhs-ss-生物素试剂盒(赛默飞世尔科技，货号21331)对抗原进行生物素化。生物素化的ox40抗原用于以下所述的选择实验，但不用于结合亲和力测量。按照制造商的说明，使用pd-10脱盐柱(通用医疗公司，17-0851-01)，然后使用amicon 30k旋转柱(密理博公司，ufc903024)分两步进行生物素化ox40抗原的纯化。通过se-hplc分析表征重组抗原的生物物理特性，以确保不存在聚集体，并通过page来验证分子的大小。通过page确定的大小表明可溶性抗原是二聚体，因为它们的估计分子量是预测单体分子量的两倍。还通过凝胶移位分析法分析了重组抗原，其显示生物素化的程度在90％以上。通过elisa和表面等离子体共振(spr)确认生物素化的重组人(hox40-mfc)、小鼠(mox40-mfc)和食蟹猴(cox40-mfc)ox40抗原可以被ox40特异性抗体(针对人和食蟹猴ox40的抗体11d4[欧洲专利2242771]；针对食蟹猴ox40的多克隆羊抗人ox40抗体[安迪生物货号af3388]；针对人类ox40的抗体act35[百乐进公司货号35002]和针对小鼠ox40的抗体ox86[百乐进公司货号119408])结合。这些抗原在下面的表2中列出。
[0429]
1.1.2制备表达人、食蟹猴和小鼠ox40的细胞系
[0430]
使用spei-hf和noti-hf限制酶将人、食蟹猴和小鼠ox40(序列见表1)克隆到载体plvx-ef1a-ires-puro(clontech，货号631253)上。然后将载体转化到lenti-x 293t细胞系(clontech，货号632180)中，和lenti-x htx包装混合物(clontech货号631249)一起生成慢病毒。然后将慢病毒转导do11.10细胞(国家犹太健康局)。通过将细胞与5μg/ml嘌呤霉素(生命技术公司货号a11113803)孵育约2周,选择过表达ox40的细胞，然后通过连续稀释克隆细胞系。使用荧光标记的ox40特异性抗体(ox86；act35；和多克隆绵羊抗人ox40，如实施例1.1.1和表2中所述)，通过流式细胞术测试ox40在细胞系中的表达。选择表达人(do11.10-hox40)、小鼠(do11.10-mox40)或食蟹猴(do11.10-cox40)ox40的细胞系中，其中所有细胞的荧光值均比非转导细胞在流式细胞术分析高至少10倍。这些细胞系在下面的表2中列出。
[0431]
表1：ox40序列
[0432][0433]
1.1.3市售的ox40抗原
[0434]
测试了几种市售的ox40抗原。
[0435]
重组的带his标签的人ox40胞外结构域获自sino生物公司(货号10481-h08h-50)。然而，对该抗原的se-hplc分析表明，少于50％的抗原是单体的非聚集形式。因此，该抗原未用于后续分析中。
[0436]
重组人ox40/人fc(hox40-hfc)和重组小鼠ox40/人fc(mox40-hfc)的c端包含人igg1 fc结构域，可从安迪生物获得(hox40-hfc：货号3388-ox-050；mox40-hfc：货号1256-ox-050)并在内部进行生物素化处理。这些可溶性抗原的生物物理特性通过se-hplc分析来表征，以确保不存在聚集体，并通过page来验证分子的大小。通过page确定的大小表明可溶性抗原是二聚体，因为它们的估计分子量是预测单体抗原分子量的两倍。还通过凝胶移位分析法分析了可溶性抗原，其显示生物素化的程度在90％以上。elisa和spr用于确认生物素化的重组人(hox40-hfc)和小鼠(mox40-hfc)ox40抗原可以被ox40特异性抗体(11d4；act35；和ox86)结合，如实施例1.1.1和下面的表2中所述。
[0437]
表2：ox40抗原
[0438][0439][0440]
1.2 cd137抗原
[0441]
用于选择对人cd137特异的fcab以及用于测试所选fcab与食蟹猴ox40的交叉反应性的cd137抗原可在如下所述的内部制备或从商业来源获得。
[0442]
1.2.1重组、可溶性人和食蟹猴cd137抗原的制备
[0443]
由于发现几种商业上可获得的重组抗原不适合使用，例如，由于测试时存在不可接受的聚集体水平，因此内部生产了以下重组二聚体和单体抗原(表3)，用于抗cd137 mab的选择、筛选和进一步表征。
[0444]
表3：重组人和食蟹猴cd137抗原
[0445][0446]
使用ecori-hf和bamhi-hf限制酶将编码人cd137胞外域的dna以及avi序列和6个c端组氨酸残基克隆到修饰的pfuse载体(invivogen货号pfuse-mg2afc2)中来生产单体抗原。将载体转染到hek293-6e细胞中，并使用histrap
tm
excel镍柱(通用医疗公司，17-3712-06)和尺寸排阻色谱法(sec)纯化表达cd137，以确保抗原是单一种，不含聚集体。
[0447]
为了产生二聚体抗原，将编码与migg2a fc结构域以及avi序列融合的人或食蟹猴(cyno)cd137的胞外结构域的dna构建体克隆到修饰的pfuse载体中，并转染到hek293-6e细胞中。使用mabselect sure
tm
蛋白a柱(通用医疗公司，11003494)和尺寸排阻色谱法(sec)纯化重组cd137，以确保抗原是单一种且不包含聚集体。
[0448]
使用bira生物素-生物素蛋白连接酶反应试剂盒(avidity llc，bira500)制备二聚体和单体cd137抗原的生物素化版本，以产生用单个生物素分子标记的单体cd137抗原和用两个生物素分子标记的二聚cd137抗原，两个单体各一个。具体而言，将3mg cd137抗原与7.8μl bira酶混合物混合，使酶与底物的摩尔比为1:50。然后根据制造商的实验方法添加添加剂(142μl biomix a，142μl biomix b，142μl生物素)，并将反应混合物在室温下孵育2小时。为了维持生物素化抗原的完整性，立即通过amicon 30μm过滤器将反应混合物缓冲液交换为dpbs。
[0449]
通过sec进一步纯化cd137抗原，以确保去除bira酶并产生最终的高质量单分散蛋白制剂，且无高分子量聚集体。具体而言，将来自同一生产批次的抗原混合在一起，并通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)、sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和多角度光散射的尺寸排阻色谱(sec-mals)进行稳定性和纯度分析。通过链霉亲和素移位的sds-page凝胶确认了蛋白质的完全生物素化。通过表面等离子体共振(spr)在体外证实重组人cd137抗原结合抗人cd137阳性对照抗体20h4.9(美国专利号7288638)，并通过用流式细胞术检测表达人cd137配体的do11.10细胞。通过流式细胞术证实重组食蟹猴cd137抗原与表达食蟹猴cd137配体的do11.10细胞结合。为确保选择实验方案中使用的cd137抗原具有尽可能高的纯度，对抗原进行了彻底的蛋白质表征，以确保存在的蛋白质聚集体百分比不超过2％。
[0450]
1.2.2表达人、食蟹猴和小鼠cd137的细胞系的制备
[0451]
产生表达全长人或食蟹猴cd137的do11.10细胞(国家犹太健康局)，分别命名为do11.10-hcd137和do11.10-ccd137(参见表4)，以便在选择和进一步鉴定所选择的抗cd137
31的fcab显示出高水平的活性，当fcab与抗人ch2 mab交联时，它们的活性增加(克隆mk1a6(jefferis等，1985；jefferis等,1992)，内部生产)。这些被选择用于亲和力成熟。
[0464]
2.2抗人ox40 fcab的亲和力成熟
[0465]
fs20-22和fs20-31的亲和力成熟文库是通过使用ella生物科技的随机引物，随机化ch3域的ab环中的五个残基(14至18位残基)或cd环中的5个残基(45.1至77位残基)而创建的，使用除半胱氨酸以外的氨基酸的等摩尔分布，或通过随机分配ef环的部分(ch3域的92至94和97至101残基(所有残基均根据imgt编号方案进行编号))。
[0466]
用elisa法从亲和成熟产物中筛选出1410个fcab与人ox40结合，并且204种独特的阳性结合物被鉴定，在hek expi293细胞中亚克隆并表达为可溶性fcab，如上文实施例2.1中所述。
[0467]
在不存在和存在抗ch2交联的情况下，使用抗人ch2 mab克隆mk1a6(参见实施例2.1)，使用biacore 3000(通用医疗公司)测量了与hox40-mfc结合时可溶性fcab的解离率。与相关亲本fcab相比，解离率提高的fcab进一步筛选了与细胞表达的人ox40的结合以及在内部的人t细胞活化试验中的活性。所有的fcab结合细胞表达的人ox40。如下所述，在人t细胞活化测定中选择了来自fs20-22谱系的10个fcab和来自fs20-31谱系的18个fcab，它们显示出高水平的活性。
[0468]
对于fs20-22谱系，通过改组三个cd循环、六个ef循环以及亲本ab循环或亲和力成熟的ab循环，生成了两个循环改组库。对于fs20-31谱系，生成了一个循环改组的库，其中包含四个ab循环、七个cd循环和七个ef循环。
[0469]
如上文实施例2.1中所述，改组的序列在hek expi293细胞中表达为可溶性fcab，并在octet qk
e
系统(pallfort
é
bio)上使用dip和read
tm
链霉亲和素生物传感器(pallfort
é
bio，18-5050)筛选生物素化hox40-mfc抗原的结合情况。与亲本fcab相比，与hox40-mfc结合时解离率提高的fcab进行了测序，从fs20-22谱系得到35个独特的fcab，从fs20-31谱系得到62个。使用biacore 3000仪器(通用医疗公司)，使用抗人ch2 mab克隆mk1a6在存在和不存在ch2交联的情况下测试鉴定出与hox40-mfc抗原结合的独特fcab。
[0470]
对于fs20-22谱系，选择18个fcab以模拟(4420 lala)mab2形式表达，并基于结合至hox40-mfc时与ch2交联时的最慢解离速率上进一步表征，如上所述，当与hox40-mfc结合时，非交联和ch 2交联的解离速率以及与hox40-mfc的结合强度有最大差异。对于fs20-31谱系，选择与ch2交联的hox40-mfc结合时解离速率最慢的9个fcab和不与ch2交联的hox40-mfc结合时解离速率最慢的9个fcab用于表达，并进一步以模拟(4420 lala)mab2形式表征。由于这九种fcab的组中共有许多fcab，因此从fs20-31谱系中选择了在不存在ch2交联的情况下与hox40-mfc结合时显示缓慢解离速率的其他fcab，以便将用于表达和进一步表征的该谱系中于模拟mab2形式的fcab总数调整至18。使用来自t细胞活化测定的数据，进一步鉴定出来自fs20-22谱系的另外6个fcab和来自fs20-31谱系的8个fcab，它们在该测定中显示出高活性，因此以对照(4420 lala)mab2的形式表达并进一步的表征(请参见实施例4)。
[0471]
实施例3
–
抗小鼠ox40 fcab的选择和表征
[0472]
3.1.抗小鼠ox40 fcab的初始选择
[0473]
通过一个初始酵母文库进行筛选，所述文库展示了人igg1 ch1至ch3结构域，其中包含ch3域中的ab环(根据imgt编号方案为残基11-18)和ef环(根据imgt编号方案为残基
92-101)中的随机化，并在ab环的第16和17位残基(根据imgt编号方案)之间随机插入5个残基。酵母与融合至人igg fc结构域(mox40-hfc；表2)的生物素化重组鼠ox40孵育，并使用抗生蛋白链菌素包被的珠粒通过macs分选。然后在摩尔浓度过量五倍的hfc存在下，使用递减浓度的生物素化的mox40-hfc进行三轮facs筛选。用链霉亲和素-铝藻蓝蛋白(apc)(bd生物科学，349024)或抗生物素-apc(美天旎公司，130-090-856)对细胞染色，并使用facsaria(bd生物科学)细胞分选仪分选。如先前在实施例2.1中所述，根据抗原结合筛选来自富集群体的182个个体fcab，并将两种独特的阳性结合物亚克隆并表达为可溶性fcab。通过elisa表征了fcab与mox40-hfc的结合以及在室内小鼠nf-κb报告基因测定中的活性。在nf-κb报告基因检测中，只有一个fcab、fs20m-232具有活性，并显示与表达小鼠ox40的细胞结合，因此筛选该fcab用于亲和力成熟。
[0474]
3.2 mox40 fcab的亲和力成熟
[0475]
通过随机化fs20m-232 fcab的ab环中的七个残基(根据imgt编号方案，残基15
–
16.5)(库1)、cd环中的六个残基(根据imgt编号方案，残基45.1-78)(库2)或ef环中五个残基(根据imgt编号方案的残基92-94和97-98)(库3)，使用ella生物技术的随机引物，使用除半胱氨酸外的等摩尔分布的氨基酸，构建了三个噬菌体展示亲和力成熟文库。
[0476]
使用重组生物素化的mox40-mfc可选地捕获链霉亲和素包被的(赛默飞世尔科技，11205d)和中性亲和素包被的(赛默飞世尔科技，14203和a2666)免疫磁珠，在亲和力成熟文库上进行了三轮筛选。从50nm(第1轮)到10nm(第2轮)，到1nm(第3轮)降低的抗原浓度用于鉴定高亲和力结合剂。通过噬菌体elisa筛选与mox40-mfc结合的来自第三轮筛选的1655个个体噬菌体，并且如实施例2.1中所述，鉴定了98种独特的阳性结合物，亚克隆并在hek expi293细胞中表达的可溶性fcab。在小鼠nf-κb报告基因检测中进一步筛选fcab的细胞结合和活性。选择最活跃的fcab用于环改组。
[0477]
一个环改组的文库被制备，其中包含27个cd环(从亲和力成熟和wt序列中鉴定出的所有26个独特序列)和37个ef环(在噬菌体elisa和wt序列中与小鼠ox40的结合力最好)改组，包含fs20m-232 fcab ab环的克隆的改组。如上所述，在hek expi293细胞中将750个改组序列表达为可溶性fcabs(包含截短的铰链)。通过在octet qk
e
系统(pallfort
é
bio)上使用dip和read
tm
链霉亲和素生物传感器(pallfort
é
bio，18-5050)测量fcab与生物素化的mox40-mfc(表2)的结合以提高脱附率，筛选出含有fcab的hek上清液。如上所述，将11个独特的ab环随机化的fcab和60个独特的ef环随机化的fcab亚克隆，如上所述，在hek expi293细胞中表达为可溶性fcab。在小鼠t细胞活化试验中，以细胞结合和活性中最慢的解离速率进一步筛选这些fcab与43个改组的fcab。在小鼠t细胞活化测定中，当与抗人ch2 mab克隆mk1a6交联时，fs20m-232-91 fcab与生物素化的mox40-mfc结合时解离速率最慢，具有最高活性，因此被选作小鼠(替代)fcab，用于后续实验。
[0478]
实施例4
–
mab2形式的抗ox40 fcab的构建、表达和表征
[0479]
4.1模式mab2的构建和表达
[0480]
包含上述鉴定的抗人ox40和抗小鼠ox40 fcab的“模拟”mab2被制备，以允许以mab2形式表征这些fcab。这些模拟mab2通过抗ox40 fcab和抗fitc抗体4420的可变区(bedzyk等，1989；bedzyk等，1990)在人igg1骨架中制备(详情参见seq id no：114，seq id no：115，以及seq id no：116)或人igg1骨架中抗鸡卵蛋白溶菌酶(hel)抗体d1.3的可变区(braden
等，1996)(细节参见seq id no：117和seq id no：118)通过用存在于人igg1的未修饰的ch3结构域的序列中的xhoi和bamhi位点内的抗ox40 fcab的ch3结构域代替抗fitc和抗hel抗体的ch3结构域。模拟mab2包含抗fitc mab 4420的轻链(seq id no：116)或抗-hel mab d1.3(seq id no：118)，并且在重链的ch2域中还包含lala突变，以减少fc-γ受体相互作用和潜在的fc-γ受体诱导的交联。这些示例中提到的模拟mab2和mab2中存在lala突变，在其克隆名称的fcab部分的末尾用后缀“aa”表示。
[0481]
通过在hek293-6e细胞中瞬时表达产生模拟mab2，并使用mab select sure蛋白a柱进行纯化。
[0482]
4.2模拟mab2形式的抗人ox40 fcab与细胞表达的人和食蟹猴ox40的结合亲和力
[0483]
模拟(4420 lala)mab2形式的抗人ox40 fcab与细胞表达的人或食蟹猴ox40(表达人[do11.10-hox40]或食蟹猴ox40[do11.10-cox40]的do11.10细胞；参见表2)使用流式细胞仪测量。还通过流式细胞术通过测试与不表达ox40的hek细胞的结合来评估非特异性结合。
[0484]
在1xdpbs(gibco，14190-094)中一式三份地制备模拟(4420 lala)mab2和对照mab稀释液(2x最终浓度)。在pbs+2％bsa(西格马，a7906)中制备do11.10-hox40或do11.10-cox40或hek细胞悬液，并在v型底96孔板中(costar，3897)，以50升/孔接种4x106细胞/ml。将50μl模式(4420 lala)mab2或对照mab(抗人ox40 mab，11d4)稀释液添加到含有细胞的孔中(最终体积为100μl)，并在4℃下孵育1小时。洗涤板，然后在pbs+2％bsa中以1：1000稀释100μl/孔的二抗(抗人fc-488抗体，杰克逊免疫研究，109-546-098)，然后在黑暗中，4℃孵育30分钟。洗涤板，并以1μg/ml浓度在100μl的含有dapi(biotium，货号40043)的pbs中重悬。使用canto ii流式细胞仪(bd生物科学)读取板。排除死细胞，并测量fitc通道(488nm/530/30)中的荧光。在graphpad prism软件中使用log(激动剂)vs响应拟合数据。
[0485]
fcab(均以模拟[4420 lala]mab2形式测试)和阳性对照抗人ox40 mab、11d4，位于人igg1骨架中，并在重链ch2域中包含lala突变(g1aa/11d4；seq id no：173和175)中，以一定亲和力与人ox40结合。测试了来自fs20-22谱系的五个克隆和来自fs20-31谱系的六个克隆结合细胞表达的人和食蟹猴ox40的能力；这些克隆的结合亲和力在表5中列出。
[0486]
表5：模拟(4420 lala)mab2形式的抗ox40 fcab与细胞表达的人或食蟹猴ox40的结合亲和力
[0487][0488][0489]
4.3模拟mab2形式的抗ox40 fcab体外激活ox40
[0490]
活化的t细胞在其细胞表面表达ox40。三聚体ox40配体与ox40的结合导致受体的三聚。由于ox40配体在抗原呈递细胞的细胞表面上以簇的形式表达，因此ox40配体与ox40之间的相互作用导致ox40的簇化，这对于ox40信号转导和进一步的t细胞活化至关重要。激动ox40的抗体必须模拟ox40配体的簇聚活性。对于单特异性抗ox40抗体，fcγ受体与抗体的fc结构域结合并使其交联，从而导致ox40簇化。
[0491]
在交联剂存在下，在t细胞活化试验中测试了上述含有lala突变的模拟(4420)mab2形式的抗人ox40和抗小鼠ox40 fcab，在交联fcab时活化t细胞上表达ox40的能力。模拟(4420 lala)mab2形式的抗人ox40 fcab的人t细胞活化测定涉及从人外周血单核细胞(pbmc)分离t细胞并测定il-2的释放，其为t细胞活化的标志物。以与下文实施例13中所述类似的方式进行测定，并涉及使用抗人ch2 mab克隆mk1a6或fitc-右旋糖酐(西格马)，分别与阳性对照抗体(11d4)或以模拟(4420 lala)mab2形式的fcab交联。
[0492]
在t细胞活化试验中，以模拟(4420 lala)mab2形式的抗人ox40 fcab与fab靶标(fitc-右旋糖酐)交联时，显示出一系列活性。在抗cd3抗体存在的情况下，所有fcab均具有
共刺激t细胞并诱导人il2产生的能力。来自fs20-22和fs20-31谱系的fcab在交联和不交联时均表现出活性。特别地，来自这些谱系的fcab在不存在交联剂的情况下具有活性，该活性在交联时显著增加。由于这些fcab与食蟹猴ox40(与结合人ox40相比)具有很高的交叉反应性，因此有可能在该物种中进行毒理学研究。在fs20-22谱系的克隆中，克隆fs20-22-41、fs20-22-47、fs20-22-49和fs20-22-85交联时激动剂活性的ec
50
值最低，因此首选从该谱系中克隆。其中，克隆fs20-22-49在交联时的激动剂活性有最大的增加，并且在交联存在时的激动剂活性具有最低的ec
50
，因此是优选的克隆。
[0493]
如上所述，本发明人旨在在没有其他交联剂的情况下，产生能够激动ox40和cd137两者的mab2。以上实验证明fs20-22-49 fcab能够在存在其他交联剂的情况下激活ox40。为了生产不需要其他交联剂的双重激动剂，发明人选择生产抗cd137抗体，目的是将这些抗体的cdr用于最终靶向ox40和cd137的mab2分子。
[0494]
实施例5
–
抗人cd137抗体的选择和表征
[0495]
合成的天然噬菌粒文库展示了人类种系的fab结构域，其具有随机化(msm技术)的cdr1、cdr2和cdr3，用于初始选择抗人cd137 mab，所述抗人cd137 mab具有重组和细胞表面表达的cd137抗原，如实施例1.2中所述。
[0496]
使用链霉亲和素免疫磁珠(赛默飞世尔科技，11205d)和中性抗生物素蛋白结合蛋白与免疫磁珠(赛默飞世尔科技，31000)结合，分三轮筛选fab文库，以分离与生物素化人cd137-mfc-avi或人cd137-avi-his结合的噬菌体。为了确保fab与细胞表面表达的cd137结合，使用重组cd137抗原进行选择获得的第一轮输出，使用do11.10-hcd137细胞进行二轮进一步的选择，使用do11.10-ccd137细胞进行第四轮选择。
[0497]
通过噬菌体elisa筛选来自第3轮和第4轮输出的约2200个克隆与人和食蟹猴cd137-mfc-avi的结合。阴性对照包括生物素化的mfc。对阳性克隆(与cd137的结合信号比与mfc的结合信号高至少4倍的克隆)的可变区进行测序，从而鉴定出36种独特的vh/vl序列组合。利用重组cd137抗原和细胞表面表达cd137抗原鉴定的序列来自于这两种选择策略分离的多个克隆。根据噬菌体elisa，在36个克隆中有22个是食蟹猴(cyno)交叉反应性，但由于噬菌体elisa的灵敏度可能不足以检测弱的cyno交叉反应性结合物，因此将所有36个克隆重新形式化为igg1分子。对于每个克隆，将vh和vl域分别克隆到包含ch1、ch2(分别在ch2域和ch3域或cl域具有lala突变)的ptt5表达载体(加拿大国家研究委员会)中。将所得的具有lala突变(aa)的ptt5-fs30 vh和ptt5-fs30 vl载体瞬时共转染到hek293-6e细胞中。28个克隆表达为可溶性igg1分子。这些通过mab select sure蛋白a柱纯化，并进行进一步测试。
[0498]
使用人和食蟹猴cd137-mfc-avi，在elisa中分析抗cd137mab的结合。在测试的28个克隆中，有10个显示出与人cd137-mfc-avi的剂量依赖性结合，而不与人ox40-mfc-avi、mfc或链霉亲和素结合。在该组中，四个克隆fs30-5、fs30-10、fs30-15和fs30-16与食蟹猴cd137-mfc-avi有交叉反应性。由于获得的食蟹猴交叉反应性克隆数量少，因此按如上所述方法筛选并表达了其他克隆。这导致分离出了一个食蟹猴交叉反应性结合剂fs30-35。
[0499]
使用流式细胞术测试了抗人cd137单克隆抗体fs30-5、fs30-10、fs30-15和fs30-16与表达人或食蟹猴cd137(do11.10-hcd137或do11.10-ccd137)细胞的结合。还通过测试与不表达cd137的do11.10细胞和hek293细胞的结合来评估非特异性结合。将结合亲和力与
两个阳性对照mab，mor7480.1(美国专利号2012/0237498)和20h4.9(美国专利号7288638)的亲和力进行比较，将其可变域克隆并以人igg1形式表达，包括ch2域中的lala突变(g1aa形式)。
[0500]
与阳性对照mab相比，fs30-5、fs30-10、fs30-15和fs30-16克隆与人和食蟹猴cd137受体结合的ec
50
值的范围为0.15-0.57nm。与亲本do11.10或hek293细胞的结合没有观察到结合的特异性。在这些细胞中未观察到20h4.9阳性对照抗cd137抗体与食蟹猴cd137的结合。公开的数据(美国专利号7288638)显示igg1形式的20h4.9确实与pma(佛波十四烷酸酯)诱导的食蟹猴pmbc上的食蟹猴cd137结合。在本发明人的手中，g1aa形式的20h4.9与重组食蟹猴cd137结合，但是亲和力远低于对人cd137的亲和力(数据未显示)，这可以解释为抗体与do11.10-ccd137细胞缺乏结合。
[0501]
为了确定fs30 mab的生物物理特性，对它们进行了体积排阻色谱(sec)并分析了单体分数的百分比。测试的所有四个fs30 mab均显示单峰曲线，并且单体含量>97％。这种高水平的单体蛋白可以进行功能活性测试。
[0502]
然后在原代t细胞活化试验中分析抗cd137 mab的功能活性。体内，抗cd137 mab通过募集fcy受体诱导激动作用，从而导致mab和cd137受体聚集。为了模拟mab与簇状表面cd137受体分子的最大能力，在测定之前，使用抗人ch2抗体(克隆mk1a6，内部生产)交联fs30 mab。将t细胞活化与非交联的mab进行比较。阴性对照包含，抗鸡卵清溶菌酶(hel)抗体d1.3，其具有lala突变(g1aa/held1.3)的人igg1骨架。
[0503]
交联时，在t细胞活化试验中，fs30-5、fs30-10、fs30-15和fs30-16 mab显示出强效活性，ec
50
值小于10nm，il-2最高水平(e
max
)，类似于阳性对照抗cd137 mab(抗cd137 mor7480.1 mab、5637hil-2pg/ml；和抗cd137 20h4.9 mab，10232hil-2pg/ml)。fs30-6 mab(1512hil-2pg/ml)的e
max
显著低于阳性对照和其他fs30 mab的e
max
，表明t细胞活化的总体水平较低。不同于阳性对照抗cd137 20h4.9mab在没有交联时表现出活性(hil-2产生量为3174pg/ml)，fs30 mab无活性(当未交联时，如背景响应水平所示测定il-2)。
[0504]
实施例6
–
靶向人ox40和人cd137的mab2的构建和表达
[0505]
制备了包含与抗人cd137 fab配对的抗人ox40 fcab的mab2。选择靶向人ox40的fcab fs20-22-49与靶向cd137的fab配对，因为其在t细胞测定中的活性更高(参见实施例4.3)。
[0506]
6.1以mab2形式表达和表征mab
[0507]
制备了由igg1分子组成的mab2分子，该igg1分子包含fs30-5、fs30-10、fs30-15、fs30-16或fs30-35克隆的cdr，并在ch2结构域中包含lala突变，以及ch3结构域中的fs20-22-49人ox40受体结合位点。这些mab2分子是通过将fs20-22-49aa/held1.3，抗人ox40 mab2的vh结构域，替换为fs30克隆的相应vh结构域，并将生成的vh与fs30mab的相应轻链共转染而生成的。igg1分子的ch2结构域中的lala突变保留在所得的mab2分子中。这些mab2分子被命名为fs20-22-49aa/fs30-5、fs20-22-49aa/fs30-10、fs20-22-49aa/fs30-15、fs20-22-49aa/fs30-16和fs20-22-49aa/fs30-35。通过在hek293-6e细胞中瞬时表达产生mab2，并使用mab select sure蛋白a柱进行纯化。
[0508]
cd137属于细胞因子受体的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)(moran等，2013)。为了分析五个mab2分子的抗cd137 fab结合位点的特异性，使用spr检测了mab2与人cd137和
五个紧密相关的人tnfrsf成员(tnfrsf1a、tnfrsf1b、gitr、ngfr和cd40)的结合。目的是通过在1μm的浓度下，显示mab2与密切相关的抗原不结合，而在1nm的浓度下显示与cd137受体结合，从而证明1000倍的特异性。
[0509]
fs20-22-49aa/fs30-5、fs20-22-49aa/fs30-10、fs20-22-49aa/fs30-16和fs20-22-49aa/fs30-35 mab2显示出高水平的特异性(接近1000倍)，fs20-22-49aa/fs30-15 mab2对所有五个紧密相关的tnfrsf成员均显示出非特异性结合。该克隆表现出的非特异性结合平均比同浓度下与cd137受体的结合低约5-10倍，并得出结论，这是由于mab2分子的fab结合位点所致，当测试与cd137密切相关的相同的五个tnfrsf成员的结合时，如fs30-15 mab显示出相同的结合特性。基于此数据，在进一步的选择过程中省略了fs30-15克隆。
[0510]
6.2抗cd137单抗的序列优化
[0511]
fs30-5、fs30-10、fs30-16和fs30-35抗cd137单克隆抗体显示出对cd137的高亲和力和特异性，并在t细胞活化测定中具有活性，但它们包含cdr环中一种或多种潜在的翻译后修饰(ptm)的位点。决定对这些克隆进一步工程化改造，以确定哪些氨基酸残基可以在这些位点上被取代，同时保持或提高结合和活性。鉴定出的潜在ptm位点包括vh cdr3中的甲硫氨酸残基(fs30-5中的kabat位置m100d和m100h，fs30-10中的m97，fs30-16中的m100a和fs30-35中的m100f)，vh cdr2(fs30-16中的kabat位置d54g55)中潜在天冬氨酸异构化基序和vl cdr3中潜在的脱酰胺位(fs30-16中的kabat位置q90g91)。
[0512]
定点诱变通过使用五个fs20-22-49aa/fs30 mab2克隆作为模板和在编码甲硫氨酸、天冬氨酸或甘氨酸残基的位点包含简并密码子nnk的引物进行，以允许所有可能的氨基酸取代。排除了半胱氨酸残基和能够产生新的潜在ptm基序的氨基酸。表达并筛选结合do11.10-hcd137细胞的克隆。与亲本mab2克隆相比，选择在10nm时具有相似(两倍以内)或改善结合的克隆，以30-50ml规模表达，在蛋白a柱上纯化，并使用do11.10-hcd137细胞和作为交联剂的抗人ch2抗体mk1a6，在t细胞活化试验中进行筛选。
[0513]
将do11.10-hcd137细胞在pbs中洗涤一次，以1.0x106细胞/ml的浓度，在含10％fbs(生命技术公司)和5μg/ml嘌呤霉素(生命技术公司，a11113803))do11.10细胞培养基(rpmi培养基(生命技术公司)重悬。将96孔平板底包被在pbs中稀释的0.1μg/ml抗小鼠cd3抗体(赛默飞世尔科技，克隆17a2)，在37℃，5％co2下孵育2h，然后用pbs洗涤两次。do11.10-hcd137细胞以1x105细胞/孔加入平板中。在dpbs(gibco)中制备每种测试抗体的2μm稀释液，然后按1:10在do11.10细胞培养基(30μl+270μl)中进一步稀释，以获得200nm稀释液。将mk1a6交联剂与待交联的测试抗体样品以1：1的摩尔比加入孔中。在96孔板中，制备每种抗体或抗体/交联剂混合物的系列稀释液。将100μl稀释的抗体或抗体/交联剂混合物加入平板上的do11.10-hcd137细胞。将细胞在37℃，5％co2中孵育72小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用小鼠il-2elisa试剂盒(e生物科学或安迪生物)进行分析。使用装有gen5软件，biotek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。将小鼠il-2(mil-2)的浓度对抗体的对数浓度作图，所得曲线用对数(激动剂)对响应方程在graphpad prism中进行拟合。
[0514]
对于每个克隆，鉴定出保留或提高与细胞表面cd137结合的有限数量的氨基酸，以取代重链cdr3中的甲硫氨酸残基。fs20-22-49aa/fs30-16 mab2克隆包含三个潜在的ptm位
sidak的多重比较测试分析数据。
[0519]
对于五个测试的抗人cd137 mab2克隆，观察到了一系列的阻断活性。与阳性对照抗体类似，fs20-22-49aa/fs30-5-37显示出对受体-配体相互作用的完全抑制。包含fs30-10谱系(例如，fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16)的抗cd137 mab的fab区的所有mab2克隆，将cd137和cd137l之间的相互作用抑制到49-54％，因此其被认为是部分阻断剂。仅通过部分阻止cd137和cd137l之间的相互作用，这些mab可能无法完全抑制cd137l与它的受体的自然相互作用，因此即使结合了这些抗体之一，某些cd137信号传导仍可能通过这种机制发生。与阴性对照fs20-22-49aa/4420mab2分子类似，fs20-22-49aa/fs30-35-14克隆缺乏显著抑制受体-配体相互作用的能力，因此被认为是非阻断剂。
[0520]
总而言之，这种基于elisa的测定结果表明，所测试的抗cd137 mab组显示出一系列的配体阻断能力，包括完全、部分和非阻断活性。克隆fs20-22-49aa/fs30-10-3，fs20-22-49aa/fs30-10-12，fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs30-35-14显示了不同于阳性对照抗cd137 mab的阻断活性。由于鉴定了一系列的配体阻断活性，因此测试了每种抗体的功能活性。
[0521]
基于细胞的方法进一步测试了克隆fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16阻断cd137-cd137l相互作用的能力。类似于本试验中使用的阳性对照抗体(g1/mor7480.1),观察到一系列阻断活性，fs20-22-49aa/fs30-5-37显示出受体-配体相互作用的完全抑制。包含fs30-10谱系(例如，fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16)的抗cd137 mab的fab区的所有三个mab2克隆，将cd137和cd137l之间的相互作用抑制到46-76％，因此其被认为是部分阻断剂。因此，类似于基于elisa的阻断实验的结果,该实验的结果表明所测试的抗cd137 mab组显示出从完全阻断到部分阻断的一系列配体阻断能力。克隆fs20-22-49aa/fs30-10-3，fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16均显示出与阳性对照抗体不同的阻断活性。
[0522]
实施例7
–
人cd137 t细胞活化实验中mab和mab2克隆的结合特异性和功能活性
[0523]
7.1 mab2克隆的结合特异性
[0524]
cd137和ox40属于细胞因子受体的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)(moran等，2013)。为了分析抗cd137 fab以及五个mab2分子的ox40 fcab结合位点的特异性，通过表面等离子体共振(spr),测试fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16、fs20-22-49aa/fs30-35-14和fs20-22-49aa/fs30-5-37mab2与人cd137、人ox40和六个紧密相关的人tnfrs成员的结合力。目的是通过在1μm的浓度下，显示mab2与密切相关的抗原不结合，而在1nm的浓度下显示与cd137和ox40受体的结合，从而证明1000倍的特异性。抗cd137 mab mor7480.1和抗ox40 mab 11d4用作阳性对照。
[0525]
简而言之，cm5芯片上的流动池固定有大约1000ru的人cd137-mfc-avi(表3)、ox40-mfc(表2)、重组人tnfrsf1a-fc、重组人tnfrsf1b-fc、重组人gitr-fc、重组人ngfr-fc，重组人cd40-fc或重组人dr6-fc。预留流动池1作为空白固定。将五种mab2在1xhbs-ep缓冲液(通用医疗公司，产品代码br100188)中稀释至1μm和1nm，使其在芯片上流动3分钟，然后解离4分钟。注射30秒ph为1.5的10mm甘氨酸用于再生。以50-100nm的剂量注射阳性对照
mab，以证明每种抗原的包被。在结合阶段结束时确定结合水平并进行比较。
[0526]
所有选择的mab2对人cd137和ox40受体均显示出高水平的特异性，分别类似于或高于mor7480.1和11d4阳性对照。
[0527]
7.2 cd137激动剂抗体在人cd137 t细胞活化试验中的功能活性
[0528]
采用do11.10-hcd137细胞的t细胞活化试验，研究不同的抗cd137激动剂抗体的活性。测试了抗cd137激动剂抗体g1aa/mor7480.1(seq id no：125和120)，g1aa/20h4.9(seq id no：165和122)和g1aa/fs30-10-16(seq id no：154和97)以及igg1形式的抗fitc抗体4420(g1/4420；seq id no：115和116)作为同型阴性对照。在存在和不存在交联抗人ch2抗体mk1a6的情况下测试抗体分子(参见实施例2.1)。以小鼠il-2的产量作为t细胞活化的量度。
[0529]
将do11.10-hcd137细胞在pbs中洗涤一次，以1.0x106细胞/ml的浓度，在含10％fbs(生命技术公司)和5μg/ml嘌呤霉素(生命技术公司，a11113803)do11.10细胞培养基(rpmi培养基(生命技术公司)重悬。将96孔平板底包被在pbs中稀释的0.1μg/ml抗小鼠cd3抗体(赛默飞世尔科技，克隆17a2)，在37℃，5％co2下孵育2h，然后用pbs洗涤两次。do11.10-hcd137细胞以1x105细胞/孔加入平板中。在dpbs(gibco)中制备每种测试抗体的2μm稀释液，然后按1:10在do11.10细胞培养基(30μl+270μl)中进一步稀释，以获得200nm稀释液。在需要时，将mk1a6交联剂与测试抗体以1：1摩尔比添加到孔中。在96孔板中，制备抗体或抗体/交联抗体混合物的系列稀释液。将100μl稀释的抗体或抗体/交联抗体混合物添加入平板上的do11.10-hcd137细胞中。将细胞在37℃，5％co2中孵育72小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用小鼠il-2elisa试剂盒(e生物科学或安迪生物)进行分析。使用装有gen5软件，biotek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。将小鼠il-2(mil-2)的浓度对抗体的对数浓度作图，所得曲线用对数(激动剂)对响应方程在graphpad prism中进行拟合。
[0530]
测定的结果如图2c和d中所示。抗cd137抗体的活性对交联抗体的要求不同，在交联抗体存在下，所有三种抗cd137抗体均显示il-2产生呈浓度依赖性增加，但只有g1aa/20h4.9抗体在不存在交联抗体的情况下显示活性。因此，g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16需要添加交联抗体，即它们的活性是“交联依赖性的”，而g1aa/20h4.9在存在和不存在交联抗体的情况下均具有活性，即其活性是“交联非依赖性的”。
[0531]
7.3 mab2克隆在人类cd137 t细胞活化试验中的功能活性
[0532]
在t细胞活化试验中，使用do11.10-hcd137细胞测试了选定的fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16个mab2克隆的功能活性。igg1形式的抗fitc抗体4420(g1/4420；seq id no：115和116)用作同型阴性对照；抗ox40 mab g1/11d4(seq id no：174和175)和mab2克隆fs20-22-49aa/4420(seq id no：123和116)用作阴性对照；igg1(g1/mor7480.1；seq id no：119和120)和igg2(g2/mor7480.1；seq id no：124和120)形式的抗cd137抗体mor7480.1用作阳性对照，igg2形式为该抗体已在临床试验中测试的形式(gopal等，2017；tolcher等，2017)。将mab和mab2分子与抗人ch2抗体mk1a6交联(参见实施例2.1)，并且在一个实验中研究了非交联的mab和mab2分子的活性。以小鼠il-2的产生作为t细胞活化的量度。如实施例7.2中所述
进行实验。
[0533]
交联后，所有五个选定的mab2克隆在t细胞活化测定中均显示有效活性，平均ec
50
值小于15nm，平均e
max
值为约16000-20000pg/ml的il-2(表6和图2a)。在没有交联的情况下，未观察到测试的mab2克隆的活性(图2b)。仅当交联时，mor7480.1阳性对照抗体才观察到具有活性(对于g1/mor7480.1的ec
50
为3.3nm，e
max
为12575pg/ml，对于g2/mor7480.1的ec
50
为2.4nm，e
max
时为8547pg/ml)。缺乏活性的交联抗ox40 mab(g1/11d4)与非交联的含抗ox40 fcab的mab2分子观察到的低背景信号的组合表明，该试验的结果仅读出cd137活性，最有可能的原因是cd137受体表达水平高，而ox40受体表达水平无法被do11.10细胞检测到(数据未显示)。
[0534]
表6：mab2在人类cd137 t细胞活化试验中的活性
[0535][0536]
n/a：不适用，因为低信号无法确定ec
50
/e
max
[0537]
nm：未测量
[0538]
因此，在do11.10-hcd137 t细胞活化试验中，在交联情况下，包含抗人cd137单克隆抗体fs30-5-37、fs30-10-3、fs30-10-12、fs30-10-16和fs30-35-14的cdr的mab2在激活cd137方面显示出强力的活性。在没有交联的情况下，没有观察到明显的活性。这些含有来自抗人ox40 fcab fs20-22-49的ch3结构域的mab2，当在t细胞分析中进行交联时，也显示出高活性(参见实施例4.3)。将具有lala突变的mab2命名为fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16。
[0539]
选择这些mab2进行进一步分析，以便确定它们是否能够作为双重激动剂，基于特定靶标的表达并无需其他交联剂，自主激动ox40和cd137。
[0540]
实施例8
–
mab2对人和食蟹猴ox40和cd137的结合亲和力
[0541]
为了确定cd137的亲和力，根据制造商的条件，通过人抗体捕获试剂盒(通用医疗公司)将biacore cm5芯片(通用医疗公司)包被抗人fc，表面密度约为4000ru。捕获的测试抗体样品(mab
2 fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16，将抗cd137阳性对照g1/mor7480.1和抗hox40阴性对照g1/11d4)大约80ru。人或食蟹猴cd137(hcd137-mfc-avi或ccd137-mfc-avi)以70μl/min的流速，从200nm开始，在三倍稀释系列的系列浓度范围流动。缔合时间为2分钟，解离时间为8分钟。运行缓冲液为hbs-ep(通用医疗公司br100188)。以30μl/min的流速注入3m氯化镁，持续30秒，再生流动池。
[0542]
为了确定ox40的亲和力，根据制造商的条件，通过人fab捕获试剂盒(通用医疗公司28958325)将biacore cm5芯片包被抗人fab，表面密度约为8000ru。捕获测试抗体样本(fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-将10-16 mab2，g1/mor7480.1(阴性对照)和g1/11d4(阳性对照))至约80ru，然后将人或食蟹猴ox40抗原(hox40-mfc或cox40-mfc)，以70μl/min的流速，从200nm开始，在三倍稀释系列的系列浓度范围流动。缔合时间为2分钟，解离时间为8分钟。运行缓冲液为hbs-ep。以30μl/min的流速注入ph 2.1的甘氨酸-hcl，持续30秒，再生流动池。
[0543]
通过对有意作为空白(无抗体结合)的流动池的双重参考来分析数据。通过1：1的langmuir模型拟合结合动力学，以产生结合的缔合(k
a
)和解离(k
d
)速率。平衡结合常数(k
d
)通过将解离速率除以每个样品的缔合速率来计算。使用biaevaluation软件3.2版进行数据分析。结果显示在表7中。
[0544]
表7：通过spr测定了mab2对人和食蟹猴cd137和ox40的结合亲和力
[0545]
[0546][0547]
nb
–
未检测到结合。nm
–
未测量。
[0548]
对ox40/cd137 mab2的结合亲和力表明，这些分子与两个受体都具有高亲和力。这些分子对人ox40的亲和力相似，这是可以预期的，因为这些分子都共有ox40 fcab。对食蟹猴ox40的亲和力是人ox40的5倍之内。与人cd137的亲和力范围为4-0.2nm，与食蟹猴cd137的交叉反应性也是可变的，因为每个分子中的抗cd137 fab都不同。fs20-22-49aa/fs30-10-16对人cd137的亲和力更高，类似对食蟹猴cd137的亲和力。与人和食蟹猴抗原结合的相似性可能是有利的，因为希望mab2在食蟹猴研究中的特性可以推断给人类。
[0549]
同样，fs20-22-49aa/fs30-10-16对人ox40和人cd137具有相似的亲和力，因此，预计当两个靶标共表达时，mab2能与两个靶标同样有效地结合。
[0550]
结合ox40和cd137，同时驱动两个靶标的簇聚和激活的mab2有望充当双重激动剂。已知ox40和cd137都存在于t细胞上(ma等，2005)。不希望受到理论的束缚，认为对结合两个靶标有相似亲和力的mab2，作为双重激动剂可能是有利的，因为mab2将更可能与表达两个靶标的细胞结合。以远高于一个靶标的亲和力优先结合另一个靶标的mab2可能无法充当双重激动剂，因为它可能优先结合不表达两个靶标的细胞。
[0551]
实施例9
–
mab2与ox40和cd137的同时结合
[0552]
9.1与人ox40和人cd137同时结合的mab2[0553]
在biacore 3000上，通过spr测试ox40/cd137 mab
2 fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3和fs20-22-49aa/fs30-10-16同时结合ox40和cd137的能力。使用g1/mor7480.1作为对照。根据制造商的说明，将生物素化的人cd137(hcd137-mfc-avi-bio)在hbs-ep缓冲液中稀释至100nm，并以表面密度约为1000ru固定在链霉亲和素(sa)芯片(通用医疗公司br100032)上，并且用于背景扣除的流动池在没有任何蛋白质固定的情况下激活和灭活。抗体在hbs-ep缓冲液中稀释至100nm，以30μl/min的流速，与100nm的人ox40(hox40-mfc)或hbs-ep缓冲液共同注射。对于每个结合步骤，随后解离3分钟。每次循环后，以30μl/min的流速注入15μl的甘氨酸2.5(通用医疗公司)，再生传感器芯片。所有测试的mab2均能够同时结合ox40和cd137。对照mab，g1/mor7480.1仅结合至cd137。
[0554]
9.2靶向鼠受体的mab2与鼠ox40和鼠cd137的同时结合
[0555]
制备包含抗小鼠ox40 fcab和抗小鼠cd137 fab的mab2，以测试其同时结合鼠ox40
和鼠cd137的能力。选择小鼠ox40靶向fcab fs20m-232-91，因为在t细胞测定中，其具有较高的活性，并且选择以人igg1同种型形式(g1/lob12.3；南安普敦大学)的抗小鼠cd137抗体lob12.3(fabarae等，2002)与fs20m-232-91 fcab配对，因为它显示了与表达小鼠cd137细胞的良好结合，并其在文献中广泛用作具有体外和体内活性的激动性cd137抗体。包含fs20m-232-91 ch3结构域和抗小鼠cd137抗体lob12.3的fab和lala突变的mab2被命名为“fs20m-232-91aa/lob12.3”，而包含fs20m-232的mab
2-91 ch3结构域和无lala突变的抗小鼠cd137抗体lob12.3的fab称为
‘
fs20m-232-91/lob12.3'。
[0556]
使用biacore 3000仪器(通用医疗公司)，通过spr测试fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2同时与其两个靶标结合的能力。g1/lob12.3用作阳性对照。根据制造商的说明，将重组小鼠cd137(mcd137-hfc；安迪生物，货号937-4b-050)在ph 5.0乙酸钠(通用医疗公司)中稀释至200nm，并固定在biacore cm5芯片上，表面密度约为1000ru，并且在没有任何蛋白质固定的情况下，流动池被激活和灭活，用于背景扣除。mab2和阳性对照在hbs-ep缓冲液中稀释至100nm，以30μl/min的流速，与100nm的人ox40(mox40-mfc)或hbs-ep缓冲液共同注射。对于每个结合步骤，随后解离3分钟。每次循环后，以20μl/min的流速注入ph 1.7的30％甘氨酸-hcl水溶液，再生传感器芯片。mab2能够同时结合ox40和cd137。g1/lob12.3 mab仅与cd137结合。
[0557]
实施例10-mab2与fcγ受体的结合
[0558]
从文献中知道，靶向tnfr家族成员的激动性抗体需要通过fcγ受体进行交联，以驱动靶标的簇聚和激活以实现体内活性(wajant，2015年)。然而，这对于旨在成为双重激动剂的抗体可能不是期望的。因此，决定通过插入lala突变来降低mab2与fcγ受体结合的能力。
[0559]
人igg1同型抗体能够结合fcγ受体。当它们与fcγ受体结合时，这可以导致它们诱导表达靶标的细胞的效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(adcc)，导致细胞裂解。由于ox40/cd137 mab2的预期机制是在不杀死细胞情况下激活细胞表达ox40和cd137，因此减少由mab2诱导的adcc是期望的。
[0560]
同样，由于ox40/cd137 mab2旨在起双重激动剂的作用，因此它们的预期作用机制是，通过与在同一细胞上共表达或在不同细胞上表达的ox40和cd137双重结合的交联结果，通过受体信号传递，因此通过fcγ受体交联的能力不是功能必须的。
[0561]
此外，众所周知，靶向cd137的抗体已在临床上显示出肝脏毒性(segal等，2017)，尽管毒性机理尚不清楚，但它可能依赖于fcrγ介导的抗-cd137抗体交联和肝或外周中表达cd137的细胞的激活。通过fcγr介导的交联防止cd137激动可以降低本发明的ox40/cd137 mab2的任何毒性风险，因为这些分子仅通过与ox40和cd137的双重结合而交联。
[0562]
通过spr进行的结合用于确认，mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16中lala突变的存在降低了对fcγ受体，特别是hfcγr1(安迪生物，货号1257-fc-050/cf)、hfcγr2a(安迪生物，货号1330-cd-050/cf)、hfcγr2b(安迪生物，货号1460-cd-050/cf)和hfcγr3a(安迪生物，货号13650-cd-050/cf)4325-fc-050/cf)的结合亲和力。抗hox40单克隆抗体g1aa/11d4和g1/11d4(分别具有和不具有lala突变)和抗cd137单克隆抗体g1aa/20h4.9和g1/20h4.9(分别具有和不具有lala突变)，均为higg1同型形式，和higg4同型形式的抗hcd137 mab g4/20h4.9，用作对照抗体。
[0563]
在biacore 3000仪器(通用医疗公司)上测试结合力。以2μm的浓度，将生物素化的带组氨酸标签的人ox40(bps生物科学货号71310)和人cd137(内部生产)抗原包被在sa芯片(通用医疗公司货号br100398)上。将人ox40和人cd137分别包被在单独的流动池上，而另一个流动池留空以进行背景扣除。再生条件为，在20μl/min流速下，在ph2.0的12μl 10mm甘氨酸-hcl水溶液中。在hbs-p(0.01m hepes ph 7.4，0.15m nacl，0.005％v/v表面活性剂p20，通用医疗公司，br-1003-68)中，将抗体(参阅表8)和人fcγr(参阅表8)稀释至100nm(抗体)或500nm(人fcγr)，以20μl/min的流速共同注入，并解离5分钟。
[0564]
通过参照空白流动池并在抗体缔合后比对曲线，使用biaevaluation软件3.2rc1版进行数据分析。通过从抗体缔合阶段结束时的绝对响应中减去fcγr的缔合阶段结束时的绝对响应，来生成缔合阶段结束时的结合响应的值，以归一化抗体结合ox40和cd137受体的效果。
[0565]
测量在fcγri解离阶段结束时的结合响应的数值，以证明在不完全消除结合该fcγr的情况下，lala突变在增加fcγri结合的解离速率中的作用。这些数值是通过从fcγr解离阶段结束时的绝对响应中减去fcγr缔合阶段结束时的绝对响应而生成的。抗cd137抗体的数值取自包被cd137-his抗原的流动池，抗ox40抗体的数值取自包被ox40-his抗原的流动池，ox40/cd137 mab2的数值取自包被ox40-his抗原的流动池和包被cd137-his抗原的流动池。结果显示在表8中。
[0566]
表8：通过spr测定抗体对人fc受体γ的结合响应
[0567][0568]
如预期的那样，没有lala突变的mab2和对照抗体均以igg1和igg4形式与每个fcγ受体结合。与没有lala突变的igg1形式的对照抗体和igg4形式的对照抗体相比，在缔合阶段结束时(结合速率)，包含lala突变的igg1形式的mab2和对照抗体对除fcγri以外的每个受测fcγ受体的结合显著降低。与不包含lala的igg1抗体相比，高亲和力fcγ受体，fcγri对包含lala的higg1的抗体的结合率仅略有下降，因此引入突变后不会显著改变。但是，fcγri的解离阶段结束时结合响应的下降幅度更大(与不含lala的抗体小于60ru相比，包含lala的抗体各自超过200ru)表明，包含lala突变的抗体对fcγri离解速率要比不包含lala的抗体快。
[0569]
总体而言，与野生型人igg1相比，含有lala突变的ox40/cd137 mab2降低与fcγ受体的结合，类似于其他含lala的higg1抗体，且低于igg4对照抗体水平。由于adcc活性需要fcγ受体结合，因此预期由lala突变引起的与fcγ受体结合的减少也会导致adcc减少，从而使靶细胞不会因结合mab2而被去除。这被认为是重要的，因为ox40/cd137 mab2是激动性抗体，因此不希望去除靶细胞，因为这些是mab2旨在刺激的细胞。
[0570]
fcγriiia在免疫效应细胞，例如自然杀伤(nk)细胞上表达，并已显示出在介导adcc中的重要作用(chan等，2015)。为了确定由spr数据证实的fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2与fcγriiia的结合减少是否转化为低或可忽略的adcc通路激活，使用表达fcγriiia的工程jurkat细胞作为效应细胞，而过表达人ox40或人cd137的raji细胞作为靶细胞，进行
adcc生物测定。与在测定中使用的阴性和阳性对照抗体观察到的响应相比，观察到mab2在表达ox40或cd137的raji细胞中均不诱导adcc活化。
[0571]
已知其他激动性抗体依赖于抗体的fcγ受体交联，以形成更高阶的结构(stewart等，2014；wajant，2015)，导致细胞表面受体的簇聚和活化以发挥其激动作用。由于本发明的mab2的活性不需要fcγ受体介导的交联，因此细胞的激动作用将定位于两个靶标都存在的位点。由于ox40/cd137 mab2中的lala突变导致与fcγ受体的结合减少，因此无法预料仅通过cd137结合的fcγ受体交联驱动的激活是可能的。因此，在不表达ox40的情况下，mab2不太可能激活表达cd137的细胞。由于存在已知与靶向人类cd137相关的肝毒性风险(例如，如用乌鲁单抗(bms-663513)治疗中所见(segal等，2017))，期望通过降低fcγ受体诱导的含有lala突变的mab2的交联的可能性，降低mab2治疗后产生肝毒性的几率，因为cd137只在ox40也表达的地方被激活。当前的cd137诱导的肝毒性理论表明，表达cd137的髓系细胞是引起用cd137激动剂治疗的小鼠中肝脏炎症的细胞类型(bartkowiak等，2018)。
[0572]
已知巨噬细胞表达能潜在介导cd137靶向抗体交联的fcγri，但是，这些细胞不表达ox40。因此，包含lala突变的本发明的mab2理论上应该不能激活表达cd137但不表达ox40的肝巨噬细胞。与需要fcγ受体交联以实现活性的cd137激动剂或不需要交联以实现活性的cd137激动剂相比，本发明的ox40/cd137 mab2被认为降低了肝毒性风险。对于ox40，虽然fcab在没有交联的情况下仍然观察到一些残留活性，这可能导致在没有cd137结合的情况下ox40的某些激活，因为迄今为止在ox40激动剂的临床研究中，尚未报道剂量限制性毒性，因此这不被认为有风险。
[0573]
实施例11-mab2与表达ox40或cd137的细胞结合
[0574]
11.1.mab2与表达人或食蟹猴ox40或cd137的细胞结合
[0575]
使用流式细胞仪测定mab
2 fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12和fs20-22-49aa/fs30-10-16与细胞表达的人或食蟹猴ox40和cd137的结合亲和力。这些mab2抗体和对照抗体g1/4420(fitc)、g1/11d4(ox40)、g1/mor7480.1(cd137)和fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模式mab2)(全部为igg1同种型)的稀释液(2x最终浓度)，在1x dpbs(gibco，14190-094)中制备。在pbs+2％bsa(西格马，a7906)中制备do11.10-hox40、do11.10-cox40、do11.10-hcd137、do11.10-ccd137或hek细胞悬液，并在v型底96孔板中(costar，3897)，以50升/孔接种4x106细胞/ml。将50μl抗体稀释液添加到含有细胞的孔中(最终体积为100μl)，并在4℃下孵育1小时。洗涤板，然后在pbs+2％bsa中以1：1000稀释100μl/孔的二抗(抗人fc-488抗体，杰克逊免疫研究，109-546-098)，然后在黑暗中，4℃孵育30分钟。洗涤板，并以1μg/ml浓度在100μl的含有dapi(biotium，货号40043)的pbs中重悬。使用canto ii流式细胞仪(bd生物科学)分析平板，并使用flowjo分析数据。通过在uv(405nm/450/50)通道上的较高荧光来鉴定死细胞，并从分析中排除。fitc通道(488nm/530/30)中的几何平均荧光强度(gmfi)用于测量抗体结合。在graphpad prism软件中使用log(激动剂)比响应(三个参数)拟合gmfi数据，以生成ec
50
值。
[0576]
表9：通过流式细胞术确定抗ox40/cd137 mab2对表达人或食蟹猴ox40或cd137的do11.10细胞的结合亲和力。
[0577][0578]
nb：未观察到结合。
[0579]
结果证实，所测试的ox40/cd137 mab2结合在do11.10细胞上表达的人和食蟹猴ox40和cd137。mab2和阳性对照(人igg1骨架中的抗人ox40 mab，g1/11d4；在人igg1骨架中的抗人cd137 mab g1/mor7480.1)以一定范围的亲和力结合人和食蟹猴ox40和cd137(参阅表9)。没有观察到与在hek细胞系表面上表达的其他蛋白质的交叉反应性，因为该细胞系对于任何测试的抗体都无法检测到结合。因此，ox40/cd137mab2与人ox40和人cd137特异性结合，未观察到非特异性结合。
[0580]
11.2 fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2及其组成部分与表达人或食蟹猴ox40或cd137的细胞的结合
[0581]
比较mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16及其组成部分，即ox40 fcab(以ox40/fitc模拟mab2的形式；fs20-22-49aa/4420)和cd137 fab(以igg1形式；fs30-010-016)，与细胞表达的人或食蟹猴ox40和cd137的亲和力，方法与实施例11.1中所述相同。但是，在该实验中，不是使用hek细胞来分析非特异性结合，而是使用了非转导的do11.10细胞。将g1/4420抗fitc抗体用作对照。重复该实验3次以提高所计算ec
50
值的可靠性。表10中显示了所测试分子的ec
50
平均值。
[0582]
表10：通过流式细胞术确定抗ox40/cd137 mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16及其组成部分对表达人或食蟹猴ox40或cd137的do11.10细胞的结合亲和力。
[0583][0584]
平均：平均数；sd：标准偏差；nb：未观察到结合。
[0585]
结果证实ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)以亚纳摩尔亲和力结合do11.10细胞上表达的人和食蟹猴ox40和cd137，mab2的ox40 fcab部分结合人和食蟹猴的ox40的亲和力，与结合ox40/cd137 mab2相当，并且mab2的cd137 fab部分结合人和食蟹猴的cd137的亲和力，与结合ox40/cd137 mab2相当。对于ox40/cd137 mab2，其组成部分或同型对照抗体(g1/4420)，未观察到与非转导do11.10细胞的非特异性结合。结果表明，fs20-22-49aa/fs30-10-16 ox40/cd137 mab2和fs20-22-49aa ox40 fcab对细胞表达的食蟹猴ox40的亲和力大于(由更低的ec
50
值所示)过去观察到的结果(实施例11.1和表9)，与spr测定的亲和力结果相似(实施例8和表7)。由于表10中详述的平均ec
50
值是三个独立实验的产物，因此可以更好地表示被测分子对do11.10细胞上表达的人和食蟹猴ox40和cd137的亲和力。
[0586]
11.3 mab2与表达小鼠ox40或cd137的细胞结合
[0587]
使用流式细胞仪测定了fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2与细胞表达的小鼠ox40和cd137的结合亲和力。fs20m-232-91aa/lob12.3和对照抗体g1/4420(fitc)、g1/lob12.3(cd137)、g1/ox86(ox40)和fs20m-232-91aa/hel d1.3(ox40/hel模式mab2)的稀释液(2x最终浓度)，在1xdpbs(gibco，14190-094)中制备。在pbs+2％bsa(西格马，a7906)中制备do11.10-mox40，do11.10-mcd137或hek细胞悬液，并在v型底96孔板中(costar，3897)，以50升/孔接种4x106细胞/ml。将50μl抗体稀释液添加到含有细胞的孔中(最终体积为100μl)，并在4℃下孵育1小时。洗涤板，然后在pbs+2％bsa中以1：1000稀释100μl/孔的二抗(抗人fc-488抗体，杰克逊免疫研究，109-546-098)，然后在黑暗中，4℃孵育30分钟。洗涤板，并以1μg/ml浓度在100μl的含有dapi(biotium，货号40043)的pbs中重悬。使用canto ii流式细胞仪(bd生物科学)分析平板，并使用flowjo分析数据。通过在uv(405nm/450/50)通道上的较高荧光来鉴定死细胞，并从分析中排除。fitc通道(488nm/530/30)中的几何平均荧光强度(gmfi)用于测量抗体结合。在graphpad prism软件中使用log(激动剂)比响应(三个参
数)拟合gmfi数据，以生成ec
50
值。结果显示在表11中。
[0588]
表11：通过流式细胞术确定抗小鼠ox40/cd137 mab2对表达小鼠ox40或cd137的do11.10细胞的结合亲和力。
[0589][0590]
nb：未观察到结合。
[0591]
结果证实，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2结合在do11.10细胞上表达的小鼠ox40和cd137。mab2和阳性对照(人igg1骨架中的抗小鼠ox40 mab，ox86；人igg1骨架中的抗小鼠cd137 mab lob12.3)以一系列的亲和力结合小鼠ox40和/或cd137(参阅表11)。没有观察到与在hek细胞系表面上表达的其他蛋白质的交叉反应性，因为该细胞系对于任何测试的抗体都检测到未结合。
[0592]
因此，抗小鼠ox40/cd137 mab2与小鼠ox40和小鼠cd137特异性结合，未观察到非特异性结合。
[0593]
实施例12
–
在葡萄球菌肠毒素a(sea)分析中靶向共表达受体的ox40/cd137 mab2的活性
[0594]
肿瘤浸润淋巴细胞上的ox40表达可能伴随cd137的表达，因为这两个分子通常在活化的t细胞上共表达(ma等，2005)。靶向这两种共表达受体的mab2激动ox40和cd137，可以诱导预活化t细胞的增殖和炎性细胞因子的产生。
[0595]
为了被完全激活，t细胞需要两个信号，第一个信号是抗原特异性的，由t细胞受体提供，该t细胞受体与mhc(主要组织相容性复合物)分子相互作用，mhc分子在抗原呈递细胞(apc)膜上显示肽抗原；以及第二个信号，抗原非特异性信号-共刺激信号-由apc膜上表达的共刺激分子与t细胞之间的相互作用提供。
[0596]
为了测试ox40/cd137 mab2的活性，建立了使用葡萄球菌肠毒素a(sea)超抗原作为第一个信号的t细胞活化试验。sea使apc表面的mhc ii类分子和t细胞的tcr交联，从而为t细胞活化提供了第一个信号。为了使其完全活化，t细胞还必须通过对照分子或适当交联的mab2接收第二个共刺激信号。该测定是用从血液中分离的pbmc进行的，与用分离的t细胞进行的测定相比，应该更能表现在体内预期发生的情况。
[0597]
在存在或不存在人工交联剂的情况下，使用sea刺激试验来建立不同的ox40和cd137激动剂抗体，以及ox40/cd137 mab2抗体的活性，以比较不同的ox40/cd137 mab2克隆，并对在一组10个pbmc供体中的ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16建立代表性的ec
50
值。
[0598]
12.1ox40和cd137激动剂抗体对sea刺激的pbmc的活性
[0599]
为了建立sea分析对不同ox40和cd137激动剂抗体的敏感性，测试了表12中列出的mab2抗体(fs22-20-49aa/fs30-10-16)和对照抗体的活性。g1/4420(抗fitc)、g1aa/mor7480.1(抗cd137)、g1aa/fs30-10-16(抗cd137)、g1aa/20h4.9(抗cd137)、g1aa/11d4(抗cd137)ox40)和fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模拟mab2)作为对照。以il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0600]
表12：所测试抗体和mab2的详细信息
[0601][0602]
从血小板捐赠的副产物，白细胞耗竭锥(leucocyte depletion cones)(nhs血液和移植服务)中分离出外周血单核细胞(pbmc)。简而言之，用pbs冲洗白细胞锥细胞(leucocyte cone)内容物，并通过ficoll梯度(ge生命科学货号17144002)密度离心。通过离心和回收未穿过ficoll梯度的细胞来分离pbmc。用pbs进一步洗涤pbmc，并根据制造商的说明通过添加10ml红细胞裂解缓冲液(e生物科学)裂解剩余的红细胞。计数pbmc并将其重悬于t细胞培养基中(含有10％fbs(生命技术公司)、1x青霉素链霉素(生命技术公司)、丙酮酸钠(gibco)、10mm hepes(gibco)、2mm l-谷氨酰胺(gibco)和50μm 2-巯基乙醇(gibco)的rpmi培养基(生命技术公司))。然后将sea(西格马货号s9399)以200ng/ml的浓度添加到
pbmc中，并以2x105细胞/孔(100μl/孔)的浓度将细胞添加到平板中。
[0603]
在dpbs(gibco)中制备每种测试抗体的2μm稀释液，然后按1:10在t细胞培养基(30μl+270μl)中进一步稀释，以获得200nm稀释液。将人工交联剂(抗人ch2抗体(克隆mk1a6，内部生产)或fitc-葡聚糖(西格马)(参见表12)与测试抗体以1：1摩尔比添加至有需要的孔中。在96孔板中，制备测试抗体的系列稀释液，然后将100μl稀释的抗体混合物添加到平板上的活化t细胞中。
[0604]
将细胞在37℃，5％co2中孵育120小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用人的il-2elisa试剂盒(e生物科学或安迪生物)进行分析。使用装有gen5软件，biotek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。将人il-2(hil-2)的浓度对测试抗体的对数浓度作图，所得曲线用对数(激动剂)对响应方程在graphpad prism中进行拟合。表13显示了在存在或不存在与人工交联剂交联的情况下，在sea测定中观察到的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图3a显示了sea分析中，由单一浓度(3.7nm)的受试抗体诱导的il-2释放水平。选择抗体能诱导产生最高水平的il-2的浓度用于该分析。统计分析是通过两因素方差分析和tukey的多重比较测试完成的。误差条上方的星号表示与同型对照(g1/4420)处理的样品相比的显著差异(*p<0.032，**p<0.0021，***p<0.0002，****p<0.0001)。图3b显示在存在或不存在人工交联剂的情况下，在sea分析中由ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)诱导的il-2释放图。
[0605]
表13：ox40和cd137激动剂抗体和mab2的sea分析
[0606]
[0607][0608]
nad＝未检测到活性。
[0609]
结果表明，只有ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)能够在不存在人工交联剂的情况下增加il-2的水平，并且添加人工交联剂不会增加ox40/cd137 mab2的活性，无论是ec
50
还是最大响应。仅在存在人工交联剂的情况下，才观察到靶向ox40的抗体g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420和抗cd137抗体g1aa/20h4.9的活性，并且与同型对照相比，即使在存在人工交联剂的情况下，抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16也未检测到具有统计学意义的活性。抗ox40抗体g1aa/11d4诱导的抗il-2水平高于抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16，并且有与抗cd137抗体g1aa/20h4.9诱导的相当的il-2水平，尽管观察到g1aa/11d4抗体比g1aa/20h4.9抗体具有更高的效力，如其明显较低的ec
50
值所示。这些结果表明，sea实验对ox40激动性比cd137激动性更敏感。这可能与在cd4+ t细胞上优先表达ox40和在cd8+ t细胞上优先表达cd137有关(croft，2014年，内部数据显示在图
6中)，并且因为在人类pbmc中，通常cd4+ t细胞比cd8+ t细胞多。
[0610]
12.2不同的ox40/cd137 mab2克隆对sea刺激的pbmc的活性
[0611]
在sea分析中测试了五个不同的ox40/cd137 mab2克隆的活性。该测定中使用的mab2和对照抗体的详细信息在表14中提供。g1/4420(抗fitc)、g1/11d4(抗ox40)、g2/mor7480.1(抗cd137)、g1/11d4以及g2/mor7480.1组合，以及fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模拟mab2)被用作对照。如实施例12.1中所述进行测定。
[0612]
表14：所测试抗体和mab2的详细信息
[0613][0614][0615]
表15显示了在存在或不存在与人工交联剂交联的情况下，在sea测定中观察到的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图3c和d显示了sea分析的il-2释放图。
[0616]
表15：靶向ox40和cd137的mab2的sea分析
[0617]
[0618][0619]
nad＝未检测到活性。
[0620]
图3c，d和表15显示，未交联或交联的抗fitc抗体g1/4420或未交联的抗ox40抗体(g1/11d4单独或与g2/mor7480.1组合使用)均未观察到il-2的产生，如预期所示。仅当人工交联剂存在时(对于单独的g1/11d4，ec
50
为0.13nm；当与g2/mor7480.1组合使用时ec
50
为0.11nm)，通过抗ox40阳性对照抗体结合激活ox40时，t细胞产生il-2。在本试验中没有交联的情况下(ec
50
为8.53nm)，以模拟mab2形式(4420 lala)fs20-22-49aa/4420的靶向ox40的fcab，表现出一定的激动活性，但是当通过fab臂与fitc-葡聚糖结合而交联时，其活性增加，表现为ec
50
降低(0.31nm)和il-2产生的最大量增加(最大响应)，如il-2产生增加所示。
[0621]
单独使用交联的cd137靶向抗体g2/mor7480.1时未观察到活性，而交联时ox40靶向抗体g1/11d4和cd137靶向抗体g2/mor7480.1的组合活性与单独使用交联的ox40靶向抗体g1/11d4类似。
[0622]
在此sea t细胞活化试验中，无论是否存在人工交联剂，五个ox40/cd137 mab2克隆(参见表15)的活性均相当。在存在人工交联剂的情况下，ox40/cd137 mab2的活性也与交联的fs20-22-49aa/4420模拟mab2相当。该sea分析的这些结果表明，由于mab2的抗cd137 fab臂的接合提供了交联，因此ox40/cd137 mab2能够通过ox40信号传导，而无需人工交联剂。
[0623]
尽管在该测定中未检测交联的靶向cd137抗体g2/mor7480.1的活性，但可以预期cd137在t细胞上的表达水平足以使mab2发生交联。假定该表达处于这样的水平：五个mab2克隆中的每一个克隆与cd137结合时，也都可以与ox40结合，并驱动其激活程度远高于非交联的fs20-22-49aa/4420模式mab2诱导的低活性水平。
[0624]
在没有人工交联剂的情况下，用ox40/cd137 mab2观察到的t细胞活化也表明，这些分子将能够激活体内表达ox40和cd137的t细胞。
[0625]
12.3 ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16对来自10个pbmc供体的sea刺激pbmc的活性
[0626]
在sea分析中，使用来自10个不同供体的pbmc测试了ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16，以建立其活性准确的ec
20
、ec
30
和ec
50
值。在没有人工交联剂的情况下，试验按实施例12.1中所述进行。从每个供体的原始数据计算平均值加上或减去标准偏差(sd)。为了计算ec
50
值，将原始数据拟合为逻辑函数(4个参数：最大响应(top)，基线响应(bottom)，斜率(hill slope)和ec
50
)：
[0627][0628]
y轴显示了作为log
10
(c)的函数测得的响应(il-2水平)，其中c表示测试物质的浓度。
[0629]
来自拟合的每个参数估计值都有一个标准误差，它表示该估计值的精度。由于给定实验的不同供体和/或重复试验的精度水平(例如，取决于每种情况下的数据质量)，因此每个供体和/或重复试验的参数计入加权平均值。在参数正态性假设下，权重定义为参数标准误差平方的倒数。
[0630]
此外，通过将数据拟合到类似的方程来计算log
10
(ec
20
)和log
10
(ec
30
)值：
[0631][0632][0633]
所有逻辑拟合均使用graphpad prism进行，加权平均使用microsoft excel进行。加权平均和加权平均的标准误差的公式如下：
[0634]
[0635][0636]
其中加权标准偏差估计为：
[0637][0638]
在表16中显示了在sea测定中针对ox40/cd137 mab2观察到的il-2释放的ec
20
、ec
30
和ec
50
值。
[0639]
表16：sea分析中ox40/cd137 mab2的ec
20
、ec
30
和ec
50
值
[0640][0641][0642]
这些结果表明，ox40/cd137 mab2具有与来自不同供体的pbmc相当的活性。
[0643]
实施例13
–
人ox40/cd137 mab2在泛-t细胞活化试验中的活性
[0644]
以实施例12中描述的sea t细胞活化测定法使用pbmc和超抗原sea刺激t细胞。为了评估ox40和cd137激动剂对分离的t细胞的作用，建立了t细胞活化测定法。在该测定中，分离t细胞并使用固定在塑性表面上的抗cd3抗体刺激。固定的抗cd3抗体能够簇聚t细胞的tcr，从而提供t细胞活化所需的第一信号，而测试分子则提供第二信号。
[0645]
使用t细胞刺激试验，在可在存在或不存在交联剂的情况下，建立不同的ox40和
cd137激动剂抗体以及ox40/cd137 mab2抗体的活性，以比较不同的ox40/cd137mab2克隆，并对在一组9个pbmc供体中的ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16建立代表性的ec
50
值。
[0646]
13.1 ox40和cd137激动剂抗体在泛-t细胞活化试验中的活性
[0647]
为了建立t细胞活化实验对不同ox40和cd137激动剂抗体的敏感性，测试了表17中列出的mab2抗体(fs20-22-49aa/fs30-10-16)和对照抗体在实验中的活性。g1/4420(抗fitc)、g1aa/mor7480.1(抗cd137)、g1aa/fs30-10-16(抗cd137)、g1aa/20h4.9(抗cd137)、g1aa/11d4(抗cd137)ox40)和fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模式mab2)作为对照。以il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0648]
表17：所测试抗体和mab2的详细信息
[0649][0650][0651]
如实施例12.1中所述分离人pbmc。然后根据制造商的说明，使用pan t细胞分离试剂盒ii(美天旎生物技术公司)从pbmc中分离t细胞。
[0652]
通过涡旋重悬人t-活化剂cd3/cd28免疫磁珠(生命技术公司11452d)。使用t细胞培养基(含有10％fbs(生命技术公司)、1x青霉素链霉素(生命技术公司)、丙酮酸钠(gibco)、10mm hepes(gibco)、2mm l-谷氨酰胺(gibco)和50μm 2-巯基乙醇(gibco)的rpmi培养基(生命技术公司))，将磁珠清洗两次。
[0653]
在t-25烧瓶中，t细胞培养基中，所需数量的t细胞浓度为1.0x106细胞/ml，以细胞对磁珠2：1的比例用洗涤过的人t-活化剂cd3/cd28免疫磁珠刺激t细胞，在37℃，5％co2中孵育过夜以活化t细胞。从免疫磁珠洗脱活化的t细胞，并以2.0
×
106细胞/ml的浓度重悬于t细胞培养基中。将96孔平板底包被在pbs中稀释的2.5μg/ml抗人cd3抗体(安迪生物克隆
uhct1)，在37℃，5％co2下孵育2h，然后用pbs洗涤两次。将活化的t细胞以2x105细胞/孔添加到平板中。
[0654]
制备2μm每种测试抗体的稀释液(有关详细信息参见表17)，并以1：1摩尔比与交联剂(抗人ch2抗体(克隆mk1a6，内部生产))或fitc-葡聚糖(西格马)(见表17)添加至有需要的孔中，如上文实施例12.1中所述。在96孔板中，制备测试抗体的系列稀释液，然后将100μl稀释的抗体混合物添加到平板上的活化t细胞中。
[0655]
t将细胞在37℃，5％co2中孵育72小时。然后收集上清液，测量il-2释放，并如实施例12.1中所述制备数据。表18显示了在存在或不存在与交联剂交联的情况下，在t细胞活化测定中观察到的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图4a显示了t细胞活化测定中，由单一浓度(3.7nm)的受试抗体诱导的il-2释放水平。选择这些抗体诱导最高水平的il-2产生的浓度来进行分析。统计分析是通过两因素方差分析和tukey的多重比较测试完成的。误差条上方的星号表示与同型对照(g1/4420)处理的样品相比的显著差异(*p<0.032，**p<0.0021，***p<0.0002，****p<0.0001)。图4b显示在t细胞活化测定中在存在或不存在交联剂的情况下，由ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)诱导的il-2释放图。
[0656]
表18：ox40和cd137激动剂抗体和mab2的t细胞活化测定
[0657]
[0658][0659]
nad＝未检测到活性。
[0660]
结果表明，只有ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)能够在不存在人工交联剂的情况下增加il-2的水平，并且添加人工交联剂不会增加ox40/cd137mab2的活性，无论是ec
50
还是最大响应。仅在存在人工交联剂的情况下，才观察到靶向ox40的抗体g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420和抗cd137抗体g1aa/20h4.9的活性，即使在存在人工交联剂的情况下，抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16也未检测到活性。ox40激动剂抗体fs20-22-49aa/4420诱导的il-2水平高于所有三种cd137激动剂抗体。抗ox40抗体g1aa/11d4诱导的抗il-2水平高于抗cd137抗体g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16，并且有与抗cd137抗体g1aa/20h4.9诱导的相当的il-2水平，尽管观察到g1aa/11d4抗体比g1aa/20h4.9抗体具有更高的效力，如其较低的ec
50
值所示。这些结果表明，t细胞活化测定对ox40激动性比cd137激动性更敏感。正如实施例12.1中推测的那样，这可能与在cd4+ t细胞上优先表达ox40和在cd8+ t细胞上优先表达cd137有关(croft，2014年，内部数据显示在图6中)，并且因为在人类pbmc中，通常cd4+ t细胞比cd8+ t细胞多。
[0661]
13.2在泛-t细胞活化试验中ox40和cd137激动剂抗体的活性的多细胞因子分析
[0662]
为了更好地了解ox40和cd137刺激对t细胞活化测定的影响，分析了多种细胞因子的水平。使用了表19中列出的抗体和mab2抗体(fs20-22-49aa/fs30-10-16)和对照抗体。在存在人工交联剂的情况下，测试了对照抗体g1/4420(抗fitc)，g1aa/fs30-10-16(抗cd137)和fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模拟mab2)，在没有人工交联剂的情况下测试了ox40/cd137 mab2。所有抗体均以单一浓度(10nm)使用。如实施例13.1中所述进行测定。
[0663]
表19：所测试抗体和mab2的详细信息
[0664][0665]
按照制造商的说明，使用促炎性v-plex试剂盒(msd，γk15049d-1)确定孵育后收集的上清液中的细胞因子il-2、il-6、il12p70、il-13、tnfα、ifn和il-10的水平。结果显示ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)和交联的ox40靶向抗体(fs20-22-49aa/4420)增加il-2、il-6、il-12p70、il-13和tnfα细胞因子的释放，并减少t细胞il-10的释放。未检测到抗cd137抗体(g1aa/fs30-10-16)的活性。
[0666]
13.3不同的ox40/cd137 mab2克隆在泛-t细胞活化试验中的活性
[0667]
在下面的表20中提供了该测定法测试的分子及其相应的交联剂的详细信息。g1/4420(抗fitc)、g1/11d4(抗ox40)、g2/mor7480.1(抗cd137)、g1/11d4以及g2/mor7480.1组合，以及fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模拟mab2)被用作对照。在没有人工交联剂的情况下测试所有分子。在人工交联剂的存在下，还另外测试了单剂对照g1/4420、g1/11d4、g2/mor7480.1和fs20-22-49aa/4420。如实施例13.1中所述进行测定。
[0668]
表20：已测试抗体和mab2的详细信息
[0669][0670]
表21显示了在没有交联的情况下在t细胞活化测定中测试的所有分子的ec
50
值和il-2释放的最大响应。表22显示了在存在交联剂的情况下，另外测试的单药对照g1/4420、g1/11d4、g2/mor7480.1和fs20-22-49aa/4420的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图4c和d显示了t细胞活化测定的il-2释放图。
[0671]
表21：在不存在交联剂的情况下，靶向共表达受体的mab2的t细胞活化测定
[0672][0673]
nad＝未检测到活性。
[0674]
nd＝未确定
[0675]
表22：交联剂存在下的单剂对照
[0676]
[0677][0678]
nad＝未检测到活性。
[0679]
nd＝未确定
[0680]
表21和图4c显示未交联的ox40/cd137 mab2具有活性(ec
50
值介于0.2019至1.201nm之间)，因此能够与两个靶标结合，从而导致它们中的一个或两个簇聚而诱导t细胞活化。如预期所示，未交联或交联的抗fitc抗体g1/4420或与未交联的抗ox40抗体(单独使用g1/11d4或与g2/mor7480.1组合使用)中均未观察到il-2产生。当在交联剂存在下(对于单独的g1/11d4，ec
50
为0.05nm；当与g2/mor7480.1组合时，ec
50
为0.02nm)，当抗ox40阳性对照抗体靶向ox40受体时，t细胞产生il-2。
[0681]
在没有交联的情况下，模拟mab2形式(4420 lala)fs20-22-49aa/4420的靶向ox40的fcab具有一定的激动活性(ec
50
为5.02nm，最大响应为1508pg/ml hil-2)，如在sea分析中所示，当模拟mab2通过其fab臂与fitc-葡聚糖结合而交联时，该活性进一步增强。
[0682]
仅使用非交联的抗cd137抗体g2/mor7480.1未观察到活性，但是当交联时，它能够诱导t细胞活化，表明与sea t细胞活化测定法不同(实施例12)，该测定法能够通过该抗cd137克隆以及上面确认的ox40信号来测定cd137信号。在实施例13.1中，与相同的igg1形式抗cd137克隆(g1aa/mor7480.1)相比，该交联抗体观察到活性差异，在不存在或存在人工交联剂的情况下，均未检测到活性，这可以用t细胞供体的可变性来解释，其中一些供体对cd137的刺激的反应可能比其他更好。
[0683]
在实施例7.1中所述的使用do11.10-hcd137细胞的人cd137 t细胞活化测定中，测试ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs30-35-14)和g2/mor7480.1对照，可有效诱导il-2生产。因此，假设ox40/cd137 mab2的抗cd137 fab臂也能够激动t细胞表达的cd137，从而在本实施例的初次t细胞活化试验中产生可检测的il-2信号。
[0684]
13.4在9个pbmc供体的t细胞的泛-t细胞活化测定中，ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16的活性
[0685]
在t细胞活化试验中，使用来自9个不同供体的pbmc，对ox40/cd137 mab2克隆fs20-22-49aa/fs30-10-16进行了测试，以建立其活性准确的ec
20
、ec
30
和ec
50
值。在没有人工交联剂的情况下，试验按实施例13.1中所述进行。
[0686]
对于每个供体，如实施例12.3中所述，从原始数据计算平均值加上或减去标准偏差(sd)。还按照实施例12.3中所述的方法计算了在t细胞测定中，对于ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)观察到的il-2释放量的ec
20
、ec
30
和ec
50
值，并显示在表23中。
[0687]
表23：t细胞活化试验中ox40/cd137 mab2的ec
20
、ec
30
和ec
50
值
[0688] ec
50
(nm)ec
30
(nm)ec
20
(nm)供体10.1700.2030.280供体20.0670.1030.153供体30.1670.1580.193供体40.2510.2260.223供体50.1750.1820.222供体60.1160.1770.264供体70.1140.2970.467供体80.1210.2830.448供体90.1990.1740.194加权平均0.1790.0670.04095％的置信区间0.154-0.2080.049-0.0900.026-0.061
[0689]
这些结果表明，ox40/cd137 mab2对来自不同供体的t细胞具有相当的活性。
[0690]
实施例14
–
人ox40/cd137 mab2在cd4+和cd8+ t细胞活化试验中的活性
[0691]
根据它们在免疫系统中的功能，t细胞可以分为cd4+和cd8+ t细胞。cd4+ t细胞被称为t辅助细胞，并产生可调节免疫应答的细胞因子，而cd8+ t细胞被称为t杀伤细胞并直接消除靶细胞。已观察到ox40的表达高于cd4+ t细胞上cd137的表达，反之亦然，已观察到cd137的表达高于cd8+ t细胞上ox40的表达(croft，2014年，参见图6)。尽管表达水平存在差异，但cd4+和cd8+ t细胞共表达两种受体(ma等，2005)。
[0692]
为了进一步探索ox40/cd137 mab2在这两个t细胞群体中的活性，在分离的cd4+和cd8+ t细胞活化测定中，分离了cd4+和cd8+ t细胞，以测试下面表24中列出的分子分别激活每个t细胞群的能力。在该测定中，利用ox40和cd137的共表达来确定ox40/cd137 mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16的交联。g1/4420(抗fitc)、g1aa/11d4(抗ox40)、g1aa/mor7480.1(抗cd137)g1aa/fs30-10-16(抗cd137)、fs20-22-49aa/4420(ox40/fitc模式mab2)，和fs20-22-49aa/4420和g1aa/fs30-10-16的组合作为对照。以il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0693]
表24：所测试抗体和mab2的详细信息
[0694][0695]
为了分离人cd4+和cd8+ t细胞，首先如实施例13.1中所述，分离pbmc。然后按照制造商的方法，分别使用cd4+ t细胞分离试剂盒(人类)(美天旎公司，130-096-533)和cd8+ t细胞分离试剂盒(人类)(美天旎公司，130-096-495)，从pbmc中分离cd4+和cd8+ t细胞。
[0696]
如实施例13.1中所述，在t细胞培养基中使用人t-活化剂cd3/cd28免疫磁珠，cd4+或cd8+t细胞在需要的浓度为1.0x106细胞/ml的条件下活化过夜。
[0697]
从免疫磁珠洗脱活化的cd4+或cd8+ t细胞，并以2.0
×
106细胞/ml的浓度重悬于t细胞培养基中。通过与2.5μg/ml(用于cd4+ t细胞活化测定)或10μg/ml(用于cd8+ t细胞活化测定)抗人cd3孵育，将96孔平板底包被在pbs中稀释的抗人cd3抗体(安迪生物，克隆uhct1)，在37℃，5％co2下孵育2h，然后用pbs洗涤两次。分别将活化的cd4+或cd8+ t细胞以2x105细胞/孔加入平板中。
[0698]
制备每种测试抗体的2μm稀释液(有关详细信息参见表24)，并以1：1摩尔比与交联剂(抗人ch2抗体或fitc-葡聚糖)(西格马)(见表24)添加至有需要的孔中，如上文实施例6中所述。在96孔板中，制备测试抗体的系列稀释液，然后将100μl稀释的抗体混合物分别添加到平板上的活化cd4+或cd8+ t细胞中。
[0699]
t将细胞在37℃，5％co2中孵育72小时。收集上清液，测量il-2释放，并如实施例12.1中所述制备数据。表25显示了在存在或不存在与交联剂交联的情况下，在分别的t细胞
活化测定中观察到的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图5a至c分别示出了cd4+或cd8+ t细胞活化测定的il-2释放图。
[0700]
收集上清液后，在pbs中洗涤t细胞，在4℃下，用在pbs中按1/1000稀释的alexa fluor 488标记的抗人fc二抗(杰克逊免疫研究，货号109-546-098)染色1小时。然后将细胞用pbs洗涤一次，并在含有1μg/ml的dapi(biotium，货号89139-054)的100μl/孔pbs中重悬。然后在bd facscanto ii流式细胞仪(bd生物科学)上分析细胞。图6显示了用g1aa/mor7480.1或g1aa/11d4处理的cd4+或cd8+ t细胞在488通道中的几何平均荧光强度。
[0701]
表25：靶向共表达受体的mab2的cd4+和cd8+ t细胞活化测定
[0702]
[0703]
[0704][0705]
nad＝未检测到活性。
[0706]
nd＝未确定
[0707]
表25和图5b显示，cd4+ t细胞可以被交联的抗ox40对照g1aa/11d4和fs20-22-49aa/4420激活(单独或与g1aa/fs30-10-16组合)，但未被单试剂抗cd137对照g1aa/mor7480.1和g1aa/fs30-10-16激活。图5c显示，另一方面，cd8+ t细胞被交联的抗cd137对
mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)是否可以通过预激活的t细胞诱导炎性细胞因子的产生。抗体g1/4420(anti-fitc)、g1aa/ox86(anti-mox40)、g1aa/lob12.30(anti-mcd137)、g1aa/ox86和g1aa/lob12.3组合以及fs20m-232-91aa/4420(mox40/fitc模式mab2)作为对照(详细信息参见表26)，以il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0715]
表26：所测试抗体和mab2的详细信息
[0716][0717][0718]
为了分离t细胞，从4-8周龄的雌性balb/c小鼠(charles river)收集脾脏。对小鼠进行人道安乐死并通过解剖分离脾脏。通过使用5ml塑料注射器，将脾脏推入70μm细胞过滤器(corning)，分离脾细胞。用1ml dulbeccos磷酸盐缓冲盐水(dpbs)(gibco)将细胞过滤器洗涤10次，并将洗脱液收集在50ml试管中。根据制造商的说明，通过添加10ml红细胞裂解缓冲液(e生物科学)来裂解洗脱液中存在的红细胞。按照制造商的说明，使用pan t细胞分离试剂盒ii(小鼠)(美天旎生物技术公司)从洗脱液中的脾细胞中分离t细胞，然后将其活化，并用于与如实施例13.1中所述的人t细胞活化测定法基本相同的实验方案中，并使用小鼠t-活化剂cd3/cd28免疫磁珠(生命技术公司)来活化t细胞，使用抗小鼠cd3抗体(biolegend克隆145-2c11)进行平板包被，小鼠il-2elisa试剂盒(e生物科学或安迪生物)用于测量il-2释放。
[0719]
表27显示了在存在或不存在测试的mab2和mab的情况下，在t细胞活化测定中观察到的ec
50
值和il-2释放的最大响应。图7a和b显示了t细胞活化测定的il-2释放的代表性图。
[0720]
表27：靶向共表达受体的mab2的t细胞活化测定
[0721][0722][0723]
nad＝未检测到活性。
[0724]
表27和图7b表明，当靶向ox40受体并且抗ox40抗体交联时，t细胞的活化增加。如预期所示，交联或未交联的抗fitc抗体g1/4420或与未交联的抗ox40抗体(单独使用g1aa/
ox86或与g1aa/lob12.3组合使用)中均未观察到t细胞活化。当在交联剂存在下(对于单独的g1aa/ox86，ec
50
为1.72nm；当与g1aa/lob12.3组合时，ec
50
为1.72nm)，当抗ox40抗体g1aa/ox86靶向ox40受体时，t细胞产生il-2。
[0725]
在没有交联的情况下，模拟mab2形式(fs20m-232-91aa/4420)中的靶向ox40的fcab没有激动活性，但是当通过fab臂与fitc-右旋糖酐的结合而交联时，显示出有效的t细胞活化。在没有任何其他交联剂的情况下，当将靶向ox40的fcab与抗cd137 fab(lob12.3)配对时，mab2显示出t细胞活性。这表明，mab2通过结合同一细胞表面上共表达的受体而交联。
[0726]
单独用交联的cd137靶向抗体g1aa/lob12.3观察到边际活性，与单独使用交联的靶向ox40的抗体g1aa/ox86相比，当交联时，ox40靶向抗体g1aa/ox86和cd137靶向抗体g1aa/lob12.3组合的活性可表明该测定法对lob12.3检测cd137激动剂的敏感性较低。这与实施例13.3中所述的人t细胞测定相反，在该实施例中，对于交联的抗cd137对照g2/mor7480.1观察到更强的cd137特异性信号(il-2释放的最大响应)。对于抗小鼠cd137和抗人cd137对照抗体而言，这种功能活性的差异可能与它们对各自的cd137靶标具有不同的亲和力有关。这也可能反映了细胞的来源(人pbmc与小鼠脾细胞)或小鼠与人系统中靶标生物学之间的细微差异。
[0727]
该数据表明，通过同时结合两个受体，fs20m-232-91aa/lob12.3 ox40/cd137 mab2可以诱导t细胞活化，而无需任何其他交联剂。
[0728]
由于抗人ox40/cd137 mab2分子没有小鼠交叉反应性，并且抗小鼠ox40/cd137 mab2在功能上与平行体外实验系统中的人抗体相当，因此抗小鼠分子被认为是合适的替代物，以推测ox40/cd137 mab2体内诱导抗肿瘤免疫的潜力。
[0729]
15.2抗小鼠cd137抗体在小鼠cd137 t细胞活化试验中的活性
[0730]
由于在实施例15.1的泛-t细胞试验中检测到小鼠ox40/cd137 mab2的抗cd137 fab克隆(lob12.3)活性很低或没有活性，因此为了解不同的抗cd137激动剂抗体的活性，使用do11.10-mcd137细胞进行了t细胞活化测定。测试了抗cd137激动剂抗体g1aa/lob12.3(参见表26)和g1aa/3h3(seq id no：166和167)，igg1形式的抗fitc抗体4420(g1/4420；seq id no：115和116)作为同型阴性对照。在存在和不存在交联抗人ch2抗体mk1a6的情况下测试mab分子(参见实施例2.1)。以小鼠il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0731]
如实施例6.2中所述进行测定，但是使用do11.10-mcd137细胞代替do11.10-hcd137细胞。使用装有gen5软件，biotek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。将小鼠il-2(mil-2)的浓度对抗体的对数浓度作图，所得曲线用对数(激动剂)对响应方程在graphpad prism中进行拟合。
[0732]
结果显示在图7c和d中。抗cd137抗体对交联抗体诱导活性的需求不同。鉴于观察到g1aa/lob12.3需要添加交联抗体才能发挥活性，即其活性为交联依赖性，而g1aa/3h3在存在和不存在交联抗体的情况下均具有活性，因此具有交联非依赖性的活性。
[0733]
实施例16-ox40/cd137 mab2的活性需要ox40和cd137双重结合
[0734]
16.1人ox40/cd137 mab2[0735]
不存在其他交联剂的情况下，在sea(实施例12)中，人泛-t细胞(实施例13)和人
cd4+和cd8+ t细胞(实施例14)实验中，其中t细胞共表达ox40和cd137，靶向ox40/cd137的mab2显示出活性。为了测试该活性是否需要ox40/cd137 mab2同时与两个受体结合，在存在100倍过量的靶向ox40的fs20-22-49aa/4420模式mab2，抗cd137 mab g1aa/fs30-10-16，fs20-22-49aa/4420模式mab2与g1aa/fs30-10-16 mab的组合，或同型对照mab g1/4420下，进行了t细胞竞争试验以评估mab
2 fs20-22-49aa/fs30-10-16激活分离的t细胞的能力。以il-2的产生作为t细胞活化的量度。
[0736]
如实施例13中所述分离t细胞。然后如实施例13所述活化分离的t细胞，并用抗cd3抗体包被平板。向活化的t细胞中添加2nm ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)，然后以2x105细胞/孔的浓度加入100μl的平板中。因此，ox40/cd137 mab2的最终浓度为1nm。
[0737]
在dpbs(gibco)中制备每种测试抗体的2μm稀释液，然后在t细胞培养基(30μl+270μl)中以1:10的比例稀释以获得200nm的稀释液，然后将每种稀释抗体的100μl添加到平板上活化的t细胞中。
[0738]
孵育t细胞，收集上清液，并如实施例13中所述测量il-2释放。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。使用单因素方差分析进行统计分析，并使用graphpad prism软件包进行dunnett的多重比较检测。
[0739]
图8显示了竞争实验的il-2释放。在与没有抗ox40和抗cd137抗体的情况下mab2能够结合两种受体相比，在与fs20-22-49aa/4420模拟mab2竞争结合ox40和与g1aa/fs30-10-16 mab竞争结合cd137失败后，mab2的活性大大降低。靶向ox40的模拟mab
2 fs20-22-49aa/4420和抗cd137 mab g1aa/fs30-10-16的组合进一步降低了ox40/cd137 mab2的活性。这些结果表明，为了使mab2通过ox40和cd137的簇聚和激动作用诱导t细胞活化，需要mab2与两个受体双重结合。
[0740]
16.2小鼠ox40/cd137 mab2[0741]
在t细胞测定(其中t细胞共表达两种受体)中，小鼠靶向ox40/cd137的mab2在没有其他交联剂的情况下显示出活性。为了测试该活性是否需要ox40/cd137 mab2同时与两个受体结合，进行了竞争分析，在存在100倍过量的靶向ox40模式mab2的fs20-22-49aa/4420、抗cd137 mab g1aa/lob12.3、或阴性对照mab g1aa/4420(fitc)下，进行了t细胞竞争试验以评估fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2激活分离的t细胞的能力。如实施例15.1中所述分离t细胞。然后激活分离的t细胞，并按照实施例13.1中所述的方法(人pan-t细胞活化试验)用抗cd3抗体包被平板，但是使用小鼠t-激活剂cd3/cd28免疫磁珠(生命技术公司)活化t细胞和抗小鼠cd3抗体(biolegend克隆145-2c11)用于平板包被。向活化的t细胞中补充有2nm ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)，并以2x105细胞/孔添加到平板中。
[0742]
在dpbs(gibco)中制备每种测试抗体的2μm稀释液，然后在t细胞培养基(30μl+270μl)中以1:10的比例稀释以获得200nm的稀释液，然后将每种稀释抗体的100μl添加到平板上活化的t细胞中。
[0743]
孵育t细胞，收集上清液，并按照实施例12.1中所述测量il-2的释放，但是使用小鼠il-2elisa试剂盒(e生物科学或安迪生物)测量il-2的释放。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(gen5软件，biotek)。使用单因素方差分析进行统计分析，并使用graphpad prism软件包进行dunnett的多重比较检测。图9显示竞争实验的il-2释放的代表性图。
[0744]
图9显示当过量引入竞争ox40或cd137的抗体时，由ox40/cd137 mab2诱导的il-2产生量减少。为了确保靶向相同的表位，使用的竞争抗体是mab2组成部分(模拟(4420)mab2形式的fcab和无fcab的fab)。这些竞争性抗体的添加减少了ox40/cd137 mab2诱导的il-2释放量，表明该分子需要双重结合才能发挥其活性。这表明ox40/cd137 mab2活性取决于同时结合ox40和cd137，从而簇聚并激动两个受体。
[0745]
实施例17-ox40/cd137 mab2在ct26同系肿瘤模型中的活性
[0746]
17.1带有或不带有lala突变的ox40/cd137 mab2的抗肿瘤活性比较
[0747]
使用ct26 balb/c同系小鼠结直肠肿瘤模型用于体内测试抗小鼠ox40/cd137mab2的抗肿瘤活性。先前已证明ct26肿瘤模型对ox40和cd137激动剂抗体均敏感(sadun等，2008年)，从ct26肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(til)有望同时表达ox40和cd137。测试的抗体在表28中详述。
[0748]
表28：所测试抗体和mab2的详细信息
[0749][0750]
将具有或不具有lala突变(分别为fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3)的mab2抑制肿瘤生长的能力，与同型对照mab g1/4420(抗fitc)、单药mab g1/ox86(无lala突变的抗ox40对照)或g1/lob12.3(无lala突变的抗cd137对照)、g1/ox86加g1/lob12.3的组合、或g1aa/ox86(具有lala突变的抗ox40 mab)加g1aa/lob12.3(具有lala突变的抗cd137 mab)的组合相比较。
[0751]
在研究开始之前，让8-10周龄的balb/c雌性小鼠(charles river)(每只重约20g)适应1周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识。每个组有12只小鼠。首先扩增，建立ct26结肠癌细胞系(atcc，crl-2638)，然后使用impact i方案通过idexx生物研究对病原体进行预筛选，结果表明该病原体不含病原体。将ct26细胞(约3-5x106)从-150℃解冻，并添加到含10％fcs(gibco，10270-106)的20ml dmem(gibco，61965-026)的t175组织培养瓶中。使用异氟烷(abbott laboratories)将小鼠麻醉，在每只动物的左侧胁腹皮下注射1x106细胞，以产生肿瘤。接种肿瘤细胞后第10天，测量肿瘤大小，并根据肿瘤体积将小鼠随机分为研究组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
[0752]
注射前24小时内，通过sec-hplc分析对抗体进行分析，并检查杂质。在pbs中将抗体稀释至最终浓度为0.1mg/ml，然后以200μl/小鼠的剂量腹膜内(ip)注射抗体，对于20g小鼠，最终剂量为1mg/kg。在肿瘤接种后第13、15和17天(每两天三剂)进行注射。每周在麻醉的情况下，对动物进行3次健康检查，在此期间进行了肿瘤的精确测量。通过卡尺进行肿瘤体积测量，以确定肿瘤的最长轴和最短轴。以下公式用于计算肿瘤体积：
[0753]
lx(s2)/2
[0754]
(其中l＝最长轴；s＝最短轴)
[0755]
根据英国动物(科学程序)法案和欧盟指令eu86/609，当肿瘤体积达到人道终点时，试验在第27天终止。
[0756]
为了进行统计测试，使用混合模型以对数尺度分析肿瘤体积。将一个单独的模型拟合到每对感兴趣的治疗组中。该模型是：
[0757]
log
10
(体积)＝a+b
×
(天数-开始天数
′
)+ε
[0758]
a和b分别是截距和斜率；它们对于每只小鼠都是不同的，包括对组的固定效应和对动物的随机效应：
[0759]
a＝a0+a1t+ε
a
[0760]
b＝b0+b1t+ε
b
[0761]
t是一个虚拟变量，代表一组的值为0，另一组的值为1的治疗组。随机效应以正态分布分布：
[0762]
ε
a
～n(0，σ
a
),ε
b
～n(0，σ
b
)
[0763]
其中σ
a
和σ
b
分别是截距和斜率中动物间差异性的标准偏差。动物内差异性也以标准偏差σ正态分布:
[0764]
ε～n(0，σ)
[0765]
对于每对处理，将上述模型拟合到数据中。对a1于b1和，计算与零差的p值(双边)；p值低于0.05表明治疗组之间有统计学上显著差异。
[0766]
结果显示在图10a中。绘制平均ct26肿瘤体积加上或减去标准误差的平均值。结果表明，与通过抗ox40抗体(g1/ox86)、抗cd137对照(g1/lob12.3)、以及这两种抗体的组合(g1/ox86+g1/lob12.3)，或含lala的抗ox40和抗cd137抗体(g1aa/ox86+g1aa/lob12.3)的组合处理相比，在有和没有lala突变(分别为fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3)的ox40/cd137 mab2处理中，肿瘤生长减少。
[0767]
结果表明，与对照抗体(g1/4420)相比，ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20-232-91/lob12.3)具有统计学上显著的抗肿瘤作用。靶向ox40和cd137的抗体(g1/ox86加g1/lob12.3或g1aa/ox86加g1aa/lob12.3)的组合，以及单药对照(g1/ox86或g1/lob12.3)，没有显著抑制肿瘤生长的活性。
[0768]
在ox40/cd137 mab2的人igg1骨架的fc区中引入lala突变，预期可防止表达ox40-或cd137-的细胞的adcc和adcp，以及当与表达这些受体的细胞上的ox40或cd137结合时，防止fcγ受体介导的mab2交联。因此，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2的活性被认为是通过ox40和cd137的共同结合，从而导致通过一个或两个受体进行信号传导，而不是通过fc介导的效应子功能或fcγ受体介导的交联来驱动的。随后，预期这将导致表达ox40-和cd137-的t细胞活化，最终导致t细胞介导的抗肿瘤活性。
mab作为单药或组合药，或同型对照(g1aa/4420)的抗肿瘤活性进行比较。
[0775]
按照实施例17.1中所述的相同方法，在balb/c雌性小鼠中皮下建立ct26肿瘤。在接种ct26细胞后的第10天，将荷瘤小鼠随机分为每组25只小鼠的研究组，并接受抗体治疗。
[0776]
在pbs中将抗体稀释至最终浓度为0.3mg/ml，然后将200μl体积腹膜内注射到每只小鼠中，以使20g小鼠的最终剂量为3mg/kg(每种抗体的固定剂量为60μg)。从肿瘤接种后的第10天开始，每两天注射一次(q2d)，总共三剂。如前所述通过卡尺测量来确定肿瘤体积。细胞接种后第64天终止研究，根据肿瘤的大小和病情达到人道终点时，将动物撤离研究。
[0777]
每个动物随时间推移的肿瘤体积数据显示在图10b中，平均结果显示在图10c中，与同型对照抗体(g1aa/4420)相比，表明fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2抑制了早期ct26肿瘤的生长速率(在第10天到22天之间)。在用抗小鼠cd137 mab，小鼠ox40/fitc模式mab2或其组合治疗的组中未观察到明显的肿瘤生长抑制作用。
[0778]
遵循先前描述的相同的混合模型方法，与同型对照相比，分析直至第22天的肿瘤体积数据(接种细胞后，表29)，显示fs20m-232-91aa/lob12.3导致平均肿瘤生长率具有统计学显著(p＝0.003)的降低。相比之下，与同型对照相比，用抗小鼠cd137 mab，小鼠ox40/fitc模式mab2或其组合治疗不会导致肿瘤生长速率有显著的差异。使用混合模型方法比较整个研究期间(64天)的肿瘤生长率，与同型对照相比，所有治疗组的肿瘤生长率都有统计学上的显著降低(分析未显示)。
[0779]
表29：使用混合效应模型分析成对比较平均ct26肿瘤生长率
[0780]
[0781][0782]
ns＝无统计学意义；tgr＝肿瘤生长率；ci＝置信区间
[0783]
注意：为了比较早期肿瘤的生长速度，在混合效应模型中使用了接种后前22天的肿瘤体积数据。对于每个成对比较，参与计算p值的组中至少有一个包含超过50％显著性的非对数正态分布的肿瘤生长率。
[0784]
生存分析显示，与使用对数秩(mantel-cox)测试的同型对照相比，fs20m-232-91aa/lob12.3导致有统计学上显著改善(p≤0.0001)的存活率(图10d)。与同型对照相比，接受抗小鼠cd137 mab，小鼠ox40/fitc模式mab2或其组合的荷瘤小鼠在存活率上无统计学差异。
[0785]
总而言之，结果表明，对其fcab组分和fab组分或单独的任一组分的组合，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2具有更大且非等效的抗肿瘤活性。
[0786]
实施例18-ox40/cd137 mab2在ct26同系肿瘤模型中的药效反应
[0787]
18.1ox40/cd137 mab2与抗ox40和抗cd137对照mab的药效学反应比较
[0788]
在负载ct26同系肿瘤的小鼠中评估了ox40/cd137替代mab2的药效学反应。为此，从接种了fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2、同型对照(g1/4420)、单药抗小鼠ox40对照(g1/ox86)、单药抗小鼠cd137对照(g1/lob12.3)或这些抗ox40和抗cd137对照(g1/ox86加g1/lob12.3)的组合的荷瘤ct26的小鼠中采集血样，并通过流式细胞仪进行分析用于t细胞活化和增殖标记。
[0789]
按照实施例17中所述的相同方案，研究开始准备8-10周龄，每只体重约20g的balb/c雌性小鼠(charles river)，并接种ct26结肠癌细胞系(atcc，crl-2638)。接种肿瘤细胞后第10天，测量肿瘤大小，并根据肿瘤体积将小鼠随机分为每组10只小鼠的研究组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
[0790]
在pbs中将抗体稀释至最终浓度为0.1mg/ml，然后以200μl/小鼠的剂量注射抗体，对于20g小鼠，最终剂量为1mg/kg。在肿瘤接种后第10、12和14天通过腹膜内(ip)注射将抗体施予小鼠。
[0791]
在给药的第10天前1小时，第11天(首次给药后24小时)，第15天(第三次给药后24小时)通过尾静脉收集血液到含edta的试管中，在17天和24天，通过心脏穿刺收集血液。根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(e生物科学货号00-4300-54)中裂解两次。通过染料1((cd4-e450(克隆gk1.5)、ki67-fitc(克隆sola15)、foxp3-pe(克隆fjk-16s)、cd69-pecy5(克隆h1.2f3)、cd3-pecy7(克隆145-2c11)、cd8-apc(克隆53-6.7)，可固定的死活细胞鉴定染料780，试剂均由ebioscience提供；以及cd45-v500(克隆30-f11)，由bd bioscience提供)或染料2(cd49b-e450(克隆dx5)、f4/80-pe(克隆6f12)、cd69-pecy5(克隆h1.2f3)、cd19-pecy7(克隆1d3)、cd3-apc(克隆145-2c11)、和可固定的死活细胞鉴定染料780，试剂均由ebioscience提供；cd45-v500(克隆30-f11)，由bd bioscience提供；和抗-hfc-488(多克隆)，由杰克逊免疫研究提供)，在fc阻断剂存在下(ebioscience，目录号14-0161-86，以1:100的量)染色细胞用于流式分析。然后将细胞用pbs洗涤一次，并将用染料2染色的样品重悬于200μl pbs中，并在facs canto ii上运行。对于用染料1染色的样品，首先将细胞用100μl抗体混合物1(除ki67和foxp3抗体外)在4℃染色30分钟。然后按照制造商的说明，将细胞固定并用e生物科学foxp3染色试剂盒(e生物科学货号00-5523-00)通透化。简而言之，将200μl的固定溶液加入到每个孔中，并在黑暗中于4℃放置过夜。然后在200μl通透缓冲液中洗涤细胞。然后再次旋转细胞，并在存在fc阻断剂(均以1：100稀释)下，将其重悬于含有ki67和foxp3抗体的100μl通透缓冲液中，并在4℃的黑暗环境中孵育30分钟。然后将细胞用通透缓冲液洗涤一次，并重悬于200μl pbs中。然后在bd facs cantoii细胞仪中分析细胞。用flowjox，excell和graphpad prism分析数据。确定了随时间推移观察到的总t细胞以及cd4+和cd8+亚群的t细胞活化和增殖。
[0792]
该实验表明ox40/cd137 mab2对循环t细胞有影响，与所有对照治疗组相比，增加了活化t细胞(cd45+cd3+cd69+)和cd4+ t细胞(cd45+cd3+cd4+cd69+)和增殖t细胞(cd45+cd3+ki67+)，cd4+t细胞(cd45+cd3+cd4+ki67+)和cd8+ t细胞(cd45+cd3+cd8+ki67+)的频率，并且与用抗-ox40对照或单独的抗-cd137对照，或同型对照治疗相比，也增加了活化的cd8+ t细胞(cd45+cd3+cd8+cd69+)的频率。对于用抗ox40和抗cd137对照mab组合治疗的对照组，观察到活化的cd8+ t细胞(cd45+cd3+cd8+cd69+)的频率有类似增加。这些结果与体外观察的结果一致，在该结果中，ox40/cd137 mab2也显示了t细胞活化的增加，通过测量il-2的产生，il-2也被认为是一种参与t细胞增殖的细胞因子。
[0793]
18.2ox40/cd137 mab2及其组分fcab和fab部分的药效学反应比较
[0794]
将小鼠ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)的外周药效学反应，与其组分，特别是模拟(4420)mab2形式(fs20m-232-91aa/4420)的fs20m-232-91aa fab和不含fcab的mab(g1aa/lob12.3)的单特异性抗小鼠cd137 mab作为单药或组合药，或同型对照(g1aa/4420)的外周药效学反应进行比较。
[0795]
在实施例17.2中描述的同一研究中，在接种ct26细胞后的第16天，从每组10只小鼠的尾静脉中采集血样，并收集在含edta的试管中。按照实施例18.1中所述的相同方法，裂解红细胞，然后用存活力染料染色剩余的细胞，然后用实施例22.2.2中列出的试剂进行表面染色(抗小鼠cd4克隆gk1.5(bd生物科学，货号563790)代替抗cd4克隆rm4-5)，除抗ki67和抗foxp3抗体外，在存在fc阻断剂的情况下，用于本研究。然后按照制造商的说明使用e生物科学foxp3染色试剂盒(e生物科学)将细胞固定并过夜通透化。然后用抗ki67和抗foxp3
抗体对细胞进行细胞内染色。洗涤后，然后使用bd fortessa流式细胞仪分析细胞。使用flowjo、excel和graphpad prism 7软件进行数据分析。
[0796]
与同型对照相比，观察到fs20m-232-91aa/lob12.3显著增加了ki67
+
cd4
+
效应子(占总cd4
+
foxp3-细胞的百分比)和ki67
+
cd8
+
外周t细胞(占总cd8
+
细胞的百分比)在血液中的比例。相对于同型对照治疗的小鼠，抗小鼠cd137 mab和fs20m-232-91aa/4420模式mab2作为单一药剂或组合药剂，也能够诱导增殖的ki67
+
cd4
+
效应子和ki67
+
cd8
+ t细胞水平显著增加。但是，在用fs20m-232-91aa/lob12.3给药后，ki67
+
cd8
+
增殖t细胞的水平明显高于单独使用抗小鼠cd137 mab，单独使用fs20m-232-91aa/4420模拟mab2或其组合观察到的结果。
[0797]
总而言之，这些发现表明，相对于其fcab和fab组分的组合，或任一个单独的组分，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2能够诱导增强的外周药效学反应，关于ki67
+
cd8
+
增殖t细胞的频率增加。
[0798]
实施例19-ox40/cd137 mab2在ct26同系肿瘤模型中的作用机制
[0799]
ct26同系肿瘤模型用于确定体内抗小鼠ox40/cd137 mab2的抗肿瘤活性的作用机制(moa)。先前已证明ct26同系肿瘤模型对ox40和cd137激动剂抗体均敏感(sadun等，2008年)，从ct26肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(til)有望同时表达ox40和cd137。测试的抗体在表30中详述。
[0800]
表30.所测试抗体和mab2的详细信息
[0801][0802]
将具有或不具有lala突变(分别为fs20m-232-91aa/lob12.3和fs20m-232-91/lob12.3)的mab2激活和诱导t细胞在血液和肿瘤中增殖的能力，与同型对照mab g1/4420
(抗fitc)、单药mab g1/ox86(无lala突变的抗ox40对照)或g1/lob12.3(无lala突变的抗cd137对照)、g1/ox86加g1/lob12.3的组合、或g1aa/ox86(具有lala突变的抗ox40 mab)加g1aa/lob12.3(具有lala突变的抗cd137 mab)的组合相比较。
[0803]
在研究开始之前，让8-10周龄的balb/c雌性小鼠(charles river)(每只重约20g)适应1周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识。每个组有5只小鼠。首先扩增，储备ct26结肠癌细胞系(atcc，crl-2638)，然后使用impact i方案通过idexx生物研究对病原体进行预筛选，结果表明该病原体不含病原体。将ct26细胞(约3-5x106)从-150℃解冻，并添加到含10％fcs(gibco，10270-106)的20ml dmem(gibco，61965-026)的t175组织培养瓶中。使用异氟烷(abbott laboratories)将小鼠麻醉，在每只动物的左侧胁腹皮下注射1x106细胞，。接种肿瘤细胞后第10天，监测小鼠的健康状况，使用卡尺测量肿瘤，并根据肿瘤体积将小鼠随机分为研究组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
[0804]
在注射后的24小时内，通过sec-hplc分析对注射的抗体进行分析，并检查是否存在杂质。在pbs中将抗体稀释至最终浓度为0.1mg/ml，然后以200μl/小鼠的剂量注射抗体，对于20g小鼠，最终剂量为1mg/kg。在肿瘤接种后第10、12和14天通过腹膜内(ip)注射将抗体施予小鼠。通过卡尺进行肿瘤体积测量，每周三次，以确定肿瘤的最长轴和最短轴。第三次给药后第7天(接种肿瘤后第21天)，对小鼠实施安乐死，通过解剖分离肿瘤，并通过心脏穿刺收集血液。
[0805]
根据制造商的说明，使用小鼠肿瘤分离试剂盒(miltenyi 130-096-730)分离肿瘤。简而言之，通过向每个肿瘤中添加2.35ml rpmi 1640、100μl酶d、50μl酶r和12.5μl酶a，制备酶混合物，并将每个肿瘤置于温和的macs c管中，并将该管置于gentle macs分离器上并在m_tdk_1程序上运行，然后在37℃下，振荡(200rpm)孵育1h。使用70μm细胞过滤器(corning货号352350)过滤所得的细胞悬液，离心(在1500rpm下10分钟)，在pbs中洗涤一次，然后重悬于5ml pbs中。
[0806]
通过心脏穿刺将血液收集到装有edta的试管中。根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(e生物科学货号00-4300-54)中裂解两次。
[0807]
使用以下抗体和试剂对从肿瘤和血液中分离的细胞进行流式细胞术染色(染料1)：cd4-e450(克隆gk1.1)、ki67-fitc(克隆sola15)、foxp3-pe(fjk-16s)、cd69-pecy5(克隆h1.2f3)、cd3-pecy7(克隆145-2c11)、cd8-apc(克隆53-6.7)，可固定的死活细胞鉴定染料780和fc阻断剂(克隆93)，均由e生物科学提供；和cd45-v500(克隆30-f11)，由bd bioscience提供。用pbs洗涤细胞，然后与100μl抗体混合物1(除ki67和foxp3抗体以外的所有抗体)在4℃孵育30分钟。然后将细胞用pbs洗涤，然后按照制造商的说明，用e生物科学foxp3染色试剂盒(e生物科学货号00-5523-00)固定并通透化。简而言之，将200μl固定液添加到每个孔中，并在4℃的黑暗环境中放置过夜。然后在200μl通透缓冲液中洗涤细胞。然后再次旋转细胞，并在存在fc阻断剂(均以1：100稀释)下，将其重悬于含有ki67和foxp3抗体的100μl通透缓冲液中，并在4℃的黑暗环境中孵育30分钟。然后将细胞用通透缓冲液洗涤一次，并重悬于200μl pbs中。然后在bd facs cantoii细胞仪中分析细胞。
[0808]
用flowjox，excell和graphpad prism分析数据。使用单因素方差分析进行统计分析，以比较各组，然后使用graphpad prism软件包对tukey进行每对的多重比较测试。
[0809]
测定在用ox40/cd137 mab2或对照处理过的ct26细胞接种后的小鼠血液或肿瘤中
t细胞(cd45+cd3+)，增殖性t细胞(cd45+cd3+ki67+)和t调节细胞(cd45+cd3+cd4+foxp3+)的频率。与同型对照(g1/4420)相比，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2在血液中的增殖t细胞以及tregs的增加具有统计学上显著性。在肿瘤中，fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2有增加t细胞频率的趋势。
[0810]
与同型对照治疗相比，用抗cd137抗体g1/lob12.3以及该抗cd137抗体与抗ox40抗体g1/ox86组合治疗的小鼠的肿瘤中tregs水平有统计学显著的降低。但是，当将lala突变引入抗ox40和抗cd137抗体时，用这些抗体(g1aa/ox86加g1aa/lob12.3)的组合进行治疗不再降低肿瘤中treg的水平。包含lala突变(fs20m-232-91aa/lob12.3)的ox40/cd137 mab2不会降低treg的水平，但是野生型人igg1形式的没有lala突变的ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91/lob12.3)，的确显示肿瘤中treg水平有统计学显著的降低。
[0811]
这些数据表明，将lala突变引入人igg1消除了ox40/cd137 mab2去除treg的能力，因此，使用ox40/cd137 mab2的人igg1 lala变体(fs20m-232-91aa/lob12.3)观察到的抗肿瘤活性与treg去除无关。此外，在评估的时间点观察到fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2诱导外周t细胞增殖，这有望扩大引发抗肿瘤免疫反应的t细胞库。这些数据表明，在没有mab2与肿瘤中可能普遍存在或也可能不普遍存在的fcγ受体结合的情况下，人igg1含lala的ox40/cd137 mab2在癌症中具有抗肿瘤活性的潜力。
[0812]
实施例20
–
抗小鼠ox40/cd137 mab2在b16-f10同系肿瘤模型中的活性使用b16-f10同系肿瘤模型体内测试抗小鼠ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)的抗肿瘤活性。抗体g1/4420用作研究中的对照。先前尚未表明b16-f10同系肿瘤模型对ox40或cd137激动剂抗体敏感(hirschhorn-cymerman等，2009；wilcox等，2002)。但是，从b16-f10肿瘤分离的肿瘤浸润淋巴细胞(til)有望表达ox40和cd137。
[0813]
在研究开始之前，让8-10周龄的c57bl/6雌性小鼠(charles river)(每只重约20g)适应1周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识。每个组有10只小鼠。首先扩增，储备b16-f10结肠癌细胞系(atcc货号crl-6475)，然后使用impact i方案通过idexx生物研究对病原体进行预筛选，结果表明不含病原体。
[0814]
将b16-f10细胞从-150℃储存中解冻，并添加到含10％fcs(gibco，10270-106)的20ml dmem(gibco，61965-026)的t175组织培养瓶中。每只动物的左胁腹皮下注射了1x106细胞。接种肿瘤细胞后7-8天，将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。如前所述，对抗体进行分析和检查是否存在杂质，然后以pbs中0.1mg/ml的最终浓度，以200μl/小鼠的体积注射，对于20g小鼠，最终剂量为1mg/kg。在肿瘤接种后第8、10和12天通过腹膜内(ip)注射将抗体施予小鼠。通过使用卡尺进行测量来确定肿瘤体积(如实施例17中所述)，所有药物的剂量应在所讨论到期的当天给药。
[0815]
当达到人道终点时，根据肿瘤体积和状况将小鼠撤离研究。使用实施例17中描述的混合模型统计分析进行肿瘤生长的统计分析。研究结果显示在图11中。
[0816]
与注射对照抗体(g1/4420)的对照动物相比，ox40/cd137 mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)显示出显著的抗肿瘤活性。这是令人惊讶的，因为先前已经证明该模型对ox40或cd137刺激不敏感(hirschhorn-cymerman等，2009；wilcox等，2002)。重要的是，在lala突变存在下，观察到的ox40/cd137 mab2的活性，因此这不依赖于肿瘤treg去除。这表明ox40/cd137 mab2的moa在多种同系肿瘤模型中均具有抗肿瘤活性，即使是那些免疫浸润水平较
低的模型，例如b16-f10。
[0817]
实施例21-ox40/cd137 mab2的分析表征和初步稳定性评估
[0818]
21.1 mab2的表达、纯化和分析表征
[0819]
以实验室规模生产mab
2 fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12、fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs30-35-14，并使用se-hplc和sds-page，通过标准分析方法进行了表征。
[0820]
编码mab2的dna序列在hek293-6e(加拿大国家研究委员会)中瞬时表达。5天后，收集细胞培养液，并使用aktaxpress仪器(均为通用医疗公司)在预先装好的mabselect protein-a色谱柱上纯化。在50mm tris-hcl，250mm nacl ph 7.0中进行平衡，然后装载收获的细胞培养液。然后使用ph 7.0的50mm tris-hcl，250mm nacl洗涤树脂，然后使用ph为3.5的缓冲液洗脱mab2。使用pd-10脱盐柱(通用医疗公司，产品编号17085101)将mab2的缓冲液交换为配制前的缓冲液。
[0821]
使用运行agilent 1100系列hplc系统(agilent)，装配有tsk-gel supersw3000 4.6mm id x30.0 cm色谱柱(tosoh生物科学)的se-hplc进行分析，使用20mm磷酸钠，200mm氯化钠，ph 6.8作为流动相。使用chemstation软件(agilent)进行单体百分比的定量。se-hplc分析的结果总结在表31.中
[0822]
表31.通过se-hplc进行分析表征
[0823]
mab2se-hplc分析的单体百分比％fs20-22-49aa/fs30-5-3798.4％fs20-22-49aa/fs30-10-397.4％fs20-22-49aa/fs30-10-1295.9％fs20-22-49aa/fs30-10-1697.5％fs20-22-49aa/fs30-35-1497.3％
[0824]
基本按照制造商的说明，使用4-12％bis-tris蛋白凝胶和1x mops分离缓冲液(赛默飞世尔科技)进行sds-page分析。对于非还原性sds-page，在变性步骤之前，将样品置于烷基化试剂n-乙基马来酰亚胺(西格马-奥德里奇)中，并从变性混合物中除去2-巯基乙醇。通过考马斯亮蓝(expedeon)可视化蛋白带。
[0825]
蛋白质a纯化后，所有五种mab2均显示出有利的分析表征参数，当通过se-hplc测定时，单体纯度高于95％。sds-page分析显示了重组igg1的典型蛋白条带。因此，在非还原条件下，一条条带迁移到对应于预期分子量的区域，而在还原条件下，两条条带迁移到接近51kda和28kda分子量标记(marker)，分别对应于重链和轻链。没有观察到碎片(数据未显示)。
[0826]
21.2ox40/cd137 mab2的初步稳定性评估
[0827]
对mab
2 fs20-22-49aa/fs30-5-37、fs20-22-49aa/fs30-10-3、fs20-22-49aa/fs30-10-12，fs20-22-49aa/fs30-10-16和fs20-22-49aa/fs30-35-14进行初步稳定性评估。在进入初步稳定性评估之前，使用尺寸排阻色谱法(sec)进一步纯化mab2，使用superdex hiload 26/600 200pg色谱柱(通用医疗公司)，通过预制剂缓冲液平衡。将稳定性样品保存在5℃下，并在2和4周后通过标准分析方法使用se-hplc和毛细管电泳十二烷基硫酸钠(ce-sds)进行分析。
[0828]
使用运行agilent 1100系列hplc系统(agilent)，装配有tsk-gel supersw3000 4.6mm id x30.0cm色谱柱(tosoh生物科学)的se-hplc进行分析，使用20mm磷酸钠，200mm氯化钠，ph 6.8作为流动相。使用chemstation软件(agilent)进行单体含量的数据采集和定量。结果总结在表32中。
[0829]
在5℃下储存4周后，对于所有测试的mab2，通过se-hplc测定的单体含量与起始原料(t＝0)保持相当(在
±
0.9％之内)。因此，所有测试的mab2均显示出良好的稳定性。
[0830]
表32：通过se-hplc进行稳定性分析
[0831][0832][0833]
根据制造商的推荐，在2100生物分析仪毛细管电泳系统(安捷伦)上进行了ce-sds分析。为了减少ce-sds，添加了dtt，并将样品在70℃下变性5分钟。重链和轻链材料的数据采集和百分比定量使用2100expert软件(安捷伦)进行。纯度百分比计算为重链材料百分比与轻链材料百分比的总和。分析结果总结在表33中。
[0834]
所有测试的mab2的纯度(由ce-sds在还原条件下确定的重链材料和轻链材料的百分比之和确定)也与起始材料相当(在
±
1.0％之内)。因此，所有测试的mab2再次显示出良好的稳定性。
[0835]
表33.通过ce-sds进行稳定性分析
[0836][0837]
实施例22-ox40/cd137 mab2与抗pd-1或抗pd-l1抗体组合的活性
[0838]
在抗原呈递细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞、b细胞)、肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的细胞上表达的pd-l1，已知可通过与pd-1作用来抑制t细胞的活化、增殖以及效应子和细胞毒性功能。使用针对pd-1或pd-l1的单克隆抗体阻断这种相互作用，已显示可导致几种类型癌症患者的存活率提高。
[0839]
但是，在某些肿瘤中，抗pd-l1和抗pd-1抗体几乎没有作用。为了解与单独使用ox40/cd137 mab2、抗pd-l1抗体或抗pd-1抗体相比，联用是否会导致改善的效果，本发明人通过体外和体内中的研究测试了ox40/cd137 mab2与抗pd-l1或抗pd-1抗体的组合。
[0840]
22.1在葡萄球菌肠毒素a(sea)分析中，ox40/cd137 mab2组合pd-1或pd-l1阻断剂的活性
[0841]
如上文实施例12中所述，在t细胞活化试验中，使用葡萄球菌肠毒素a(sea)超抗原作为第一信号，测试了ox40/cd137 mab2的活性。为了测试ox40/cd137 mab2对t细胞刺激活性与pd-1和pd-l1之间相互作用阻断的组合效果，在sea分析中，将pd-1或pd-l1阻断抗体与ox40/cd137 mab2组合使用。
[0842]
sea分析中使用的抗体和mab2列在下面的表34中。测试了g1/4420(抗fitc)与fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2的组合，g1aa/s1(抗pd-l1)，g1aa/5c4(抗pd-1)单独或与fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2的组合。通过白介素2(il-2)的产生用作t细胞活化的量度。
[0843]
表34：所测试抗体和mab2的详细信息
[0844][0845]
5c4和yw243.55.s1(s1)抗体的可变域序列也分别在us 8,008,449 b2和us 2013/0045202 a1中公开。
[0846]
基本上如上文实施例12.1中所述，分离pbmc，并进行sea测定。g1/4420用作同型对照，并且在测定中不使用交联剂。
[0847]
ox40/cd137 mab2(fs20-22-49aa/fs30-10-16)与抗pd-l1(g1aa/s1)或抗pd-1抗体(g1aa/5c4)组合的活性，与单独使用fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2加同型对照(g1/4420)的活性，或单独使用pd-l1抗体(g1aa/s1)或pd-1抗体(g1aa/5c4)或同型对照(g1/
fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2，或(4)pbs中的10mg/kg抗小鼠pd-1抗体和1mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2。从肿瘤接种后的第10天开始，动物腹膜内(ip)注射g1aa/4420或fs20m-232-91aa/lob12.3注射，每2天一次，共3剂。从肿瘤接种后第10天起，ip注射migg1/4420或抗小鼠pd-1抗体，每4天一次，共4剂。通过卡尺测量确定肿瘤体积(如实施例17中所述)。肿瘤细胞接种后60天终止研究，根据肿瘤的大小和状况，当达到人道终点时，将动物撤离研究。表36总结了治疗组，测试分子，剂量和给药方案。
[0856]
表36.治疗组和测试分子的总结
[0857][0858]
如图13a-d所示，抗pd-1拮抗剂抗体和1mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3的组合导致了最高的动物比例，在15只动物中有7只(47％)在研究结束时(图13d)具有完全的肿瘤消退反应(定义为肿瘤体积≤62.5mm3)。研究结束时，同型对照抗体(图13a)，单药抗pd-1抗体(图13b)和1mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3(图13c)分别显示了0％，0％和7％的肿瘤消退。
[0859]
生存分析表明，与同型对照抗体相比，fs20m-232-91aa/lob12.3与抗pd-1抗体的组合具有统计学上显著的存活率(对数秩(mantel cox)测试，p<0.0001)(图13e)。与同型对照抗体相比，两种单药治疗之间均未观察到明显的生存差异。这些结果表明，在该模型中，与单一药物相比，用拮抗剂阻断pd-1/pd-l1抑制途径，并用抗ox40/cd137 mab2双重激动ox40和cd137，能够增加抗肿瘤活性并提供生存获益。
[0860]
22.2.2评估外周药效学反应
[0861]
在实施例22.2.1中描述的研究中，还检查了抗pd-1拮抗剂调节对fs20m-232-91aa/lob12.3的药效学反应的能力，并将其与单药治疗进行了比较。给药开始后6天(肿瘤细胞接种后16天)，从治疗组1、2、3和5中随机选择6只ct26荷瘤小鼠，从其尾静脉中收集血液到含edta的管中(表36)。根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(miltenyi biotech，#130-094-183)中裂解两次。用试剂cd4-buv395(克隆rm4-5)、cd8-buv737(克隆53-6.7)、cd44-bv510(克隆im7)和cd3e-bv786(克隆145-2c11)染色细胞以进行流式细胞分析，试剂均由bd bioscience)提供；cd69-fitc(克隆h1.2f3)、nkp46-pe(克隆29a1.4)、pd-1-apc(克隆j43)、cd45-alexa700(克隆30-f11)，以及可固定的死活细胞
鉴定染料780染色细胞，试剂均由ebioscience提供；以及cd62l-bv421(克隆mel-14)，由biolegend提供，在fc阻断剂存在下(ebioscience，目录号14-0161-86，以1：50)在4℃孵育30分钟。按照制造商的说明，使用ebioscience foxp3染色试剂盒(ebioscience，目录号00-5523-00)将细胞固定并过夜通透化。细胞在含有ki67和foxp3抗体(ki67-pe-cy7(克隆sola15)和foxp3-percp-cy5.5(克隆fjk-16s)，均由ebioscience提供)的100μl通透化缓冲液重悬，并在黑暗中，于室温下孵育30分钟。然后将细胞用透化缓冲液洗涤两次，并于加有0.5％bsa的pbs中重悬。然后在bd fortessa流式细胞仪中分析细胞。使用flowjo，excel和graphpad prism 7软件进行数据分析。
[0862]
如前所述，通过流式细胞术分析测定ki67+cd4+ t细胞(占cd45+cd3+cd4+的总数)，ki67+cd8+ t细胞(占cd45+cd3+cd8+的总数)和ki67+nkp46+nk细胞(占cd45+cd3-nkp46+的总数)增殖的频率。与同型对照相比，fs20m-232-91aa/lob12.3诱导了增殖的ki67+cd4+和ki67+cd8+ t细胞数量呈统计学上的显著增加，从而证实了先前的结果(实施例18)，以及增殖的ki67+nk细胞数量(成对比较mann-whitney非参数测试；对于所有三个免疫细胞群，p≤0.005)呈统计学上的显著增加。与同型对照相比，单药抗pd-1拮抗剂抗体对这三个免疫细胞群没有显著影响。与单药或同型对照相比，1mg/kg fs20m-232-91aa/lob12.3和抗pd-1抗体的组合导致增殖的ki67+cd4+ t细胞，ki67+cd8+ t细胞和ki67+nkp46+nk细胞有统计学上显著的较高水平(所有统计学上显著的比较，p≤0.005，除了该组合对增殖的ki67+cd4+ t细胞水平的影响与单独的fs20m-232-91aa/lob12.3比较，p≤0.05)。
[0863]
如上所述，通过流式细胞术分析确定了单药抗pd-1抗体，mab
2 fs20m-232-91aa/lob12.3以及抗pd-1抗体和fs20m-232-91aa/lob12.3的组合对外周血表达pd-1的t细胞(cd4+和cd8+ t细胞)和nk细胞的影响。与同型对照相比，单药抗pd-1抗体和fs20m-232-91aa/lob12.3增加了表达pd-1的cd4+和cd8+ t细胞的比例，与单独抗pd-1相比，fs20m-232-91aa/lob12.3治疗之后pd-1+细胞的中位频率更高。与同型对照相比，单独的fs20m-232-91aa/lob12.3增加了pd-1+nk细胞的频率。与单药或同型对照相比，该组合导致表达pd-1的cd4+和cd8+ t细胞(而非nk细胞)具有统计学上显著的较高水平(成对比较mann-whitney非参数检验；所有统计学上的比较，p≤0.005，除了该组合对表达pd-1的cd4+ t细胞频率的影响与单独的fs20m-232-91aa/lob12.3比较，p≤0.05)。
[0864]
与评估抗肿瘤活性的结果相一致，以拮抗剂同时阻断pd-1/pd-l1抑制途径，以及以抗ox40/cd137 mab2双重激动ox40和cd137导致增殖t细胞和nk细胞的药效调节增强，这支持了利用组合方法来驱动抗肿瘤免疫力。
[0865]
总之，与单独阻断pd-1/pd-l1相比，阻断pd-1/pd-l1轴并同时激动ox40和cd137产生了增强的效果。具体而言，与单独使用一种抗体的响应相比，抗pd-1或抗pd-l1抗体与抗ox40/cd137 mab2的组合产生了改善效果。在实施例22.1中描述的sea测定中，与ec
50
为0.1474nm的抗ox40/cd137 mab2相比，所测试的抗pd-1或pd-l1抗体均不具有任何活性。但是，将抗ox40/cd137 mab2与抗pd-1或抗pd-l1抗体组合测试时，ec
50
的值分别为0.2373nm和0.5961nm。此外，由任何一种组合的产生il-2的最大响应是单独的抗ox40/cd137 mab2的两倍以上。该体外数据表明，当在体系中使用抗pd-l1或抗pd-1抗体未观察到活性时，将这些抗体中的任一种与抗ox40/cd137 mab2组合使用均会导致活性的显著提高。
[0866]
如实施例22.2中所述，通过在ct26肿瘤模型中单独或与抗pd-1抗体组合使用抗小
鼠ox40/cd137 mab2的体内测试进一步支持了这种体外活性。这项研究的结果表明，在研究结束时，与单独使用ox40/cd137 mab2或抗pd-1抗体相比(没有动物无肿瘤)，抗pd-1抗体与ox40/cd137 mab2组合治疗的大部分动物中无肿瘤。此外，与单独的mab2或抗pd-1抗体相比，通过用该组合治疗，还观察到统计学上显著的生存获益(图13e)，并且增殖的t细胞和nk细胞的药效学调节得到增强。
[0867]
由于在体外或体内研究中均未观察到抗pd-1或抗pd-l1抗体的活性，但是在给二者中添加ox40/cd137 mab2时均观察到活性显著改善，这表明ox40/cd137 mab2与此类抗体的组合将导致增强的抗肿瘤功效，以及此类组合可能适用于治疗无反应的肿瘤，例如难治性或耐药性或在抗pd-1或抗pd-l1抗体单药治疗后复发的肿瘤。
[0868]
实施例23-抗小鼠ox40/cd137 mab2在ct26同系肿瘤模型中的的剂量依赖性抗肿瘤活性，以及针对ct26肿瘤细胞再攻击的保护性免疫记忆建立
[0869]
为了评估ct26同系小鼠结直肠肿瘤模型中，ox40/cd137替代mab2的剂量与抗肿瘤活性之间的关系，评估了0.1到10mg/kg中的五个不同剂量水平。
[0870]
按照如实施例17中所述相同的方案，在8-10周龄，体重约20g的balb/c雌性小鼠(charles river)中，每只动物的左侧胁腹皮下注射ct26结肠癌细胞。肿瘤细胞接种后10天，检测肿瘤，将没有建立肿瘤的动物移出研究。将剩余的小鼠随机分为六个治疗组，每组25只动物。
[0871]
在注射前，将同型对照抗体(g1aa/4420)和ox40/cd137替代mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)进行过滤，并在注射前用pbs稀释。每只动物每次给药时通过腹膜内给予200μl稀释的抗体，对20克的小鼠，给药的最终剂量为10mg/kg的g1aa/4420或0.1、0.3、1、3或10mg/kg的fs20m-232-91aa/lob12。从肿瘤接种后的第10天开始，每两天注射一次(q2d)，总共三剂。通如实施例17中所述的卡尺测量确定肿瘤体积。肿瘤细胞接种后67天，研究终止，根据肿瘤的大小和状况，当达到人道终点时，将动物撤离研究。
[0872]
在图14a中显示了在不同剂量水平下用g1aa/4420或fs20m-232-91aa/lob12.3处理的单个动物随时间推移的肿瘤体积。fs20m-232-91aa/lob12.3的0.3、1、3或10mg/kg剂量水平导致完全的肿瘤消退(第60天时界定为≤62.5mm3)，每组动物的消退分别为4％(1/25)、4％(1/25)、8％(2/25)和4％(1/25)。同型对照和0.1mg/kg替代mab2组中的所有动物均未出现完全的肿瘤消退。
[0873]
使用实施例17中所述的混合模型统计分析，对fs20m-232-91aa/lob12.3-和g1aa/4420治疗组之间的平均肿瘤生长率进行成对比较，与同型对照相比，观测所有测试剂量水平(0.1、0.3、1、3和10mg/kg)的统计学显著性差异(p<0.01)(表37)。以0.1至3mg/kg的剂量给药时，fs20m-232-91aa/lob12.3以剂量依赖性(平均log(tgr)分别为0.255529至0.156767)形式降低平均肿瘤生长率(tgr)。3mg/kg的fs20m-232-91aa/lob12.3的平均tgr与1mg/kg剂量水平的平均tgr无统计学差异(p＝0.18)。然而，与3mg/kg剂量组相比，将剂量水平提高到10mg/kg会导致更快的tgr(p<0.001)。
[0874]
表37：使用混合模型统计分析成对比较平均ct26肿瘤生长率
[0875][0876][0877]
缩写：ns＝无统计学意义；tgr＝肿瘤生长率
[0878]
注意：对于每个成对比较，参与计算p值的组中至少有一个包含超过50％的显著非对数正态分布的肿瘤生长率
[0879]
生存分析表明，与同型对照相比，使用对数秩检验(mantel-cox)在所有测试剂量下fs20m-232-91aa/lob12.3均具有统计学上显著的存活率(图14b)。1mg/kg组和3mg/kg组的比较显示其存活无统计学差异。
[0880]
总之，图14a和b和表37中显示的肿瘤体积和存活数据支持实施例17的发现，即在ct26小鼠肿瘤模型中ox40/cd137替代mab2可以在体内引发抗肿瘤活性。此外，观察到抗肿瘤活性从0.1mg/kg到1mg/kg有剂量依赖性的升高，并维持在较高的测试剂量水平(3mg/kg和10mg/kg)。
[0881]
为了测试ox40/cd137替代物mab2是否可以诱导针对ct26肿瘤细胞的保护性免疫记忆，在第一次接种后第84天，对来自上述本实例剂量研究的经历完全肿瘤消退的动物(完全应答者)再次皮下接种1x10
5 ct26细胞。还给未治疗的非肿瘤携带balb/c小鼠接种了ct26细胞作为对照组。如上所述监测肿瘤体积。首次接种细胞后第137天终止研究，根据肿瘤的大小和状况，当达到人道终点时，将动物撤离研究。在研究结束时，对照组中0％(0/4)的小鼠存活，与之相对，而完全应答动物中100％(4/4)的小鼠存活。这些结果表明，在一部分小鼠中，ox40/cd137替代mab2可以诱导肿瘤完全消退，并建立保护性免疫记忆，防止ct26细胞的再次攻击。
[0882]
实施例24-在ct26小鼠肿瘤模型中抗小鼠ox40/cd137 mab2的剂量依赖性药效学反应
[0883]
使用ct26同系小鼠结直肠肿瘤模型评估了ox40/cd137替代mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)的剂量水平、给药频率与外周药效学反应之间的关系。腹膜内(i.p.)单次注射fs20m-232-91aa/lob12.3，剂量水平分别为1、3、10或30mg/kg，或与腹膜内3次注射fs20m-232-91aa/lob12.3，以1mg/kg的剂量，每2天一次(q2d)做比较。如实施例18中所述，通过流式细胞术分析血液中免疫细胞亚群，评估了fs20m-232-91aa/lob12.3的药效学反应，特别是替代mab2对循环t细胞的作用。
[0884]
按照与实施例17中所述相同的方案，将8-10周龄，体重约20g的balb/c雌性小鼠(charles river)，在每只动物的左胁腹中皮下注射ct26结肠癌细胞。肿瘤细胞接种后10天，测量肿瘤，将没有建立肿瘤的动物从研究中移出。将剩余的小鼠随机分为六个治疗组，每组六只动物。
[0885]
注射前，将同型对照抗体(g1aa/4420)和fs20m-232-91aa/lob12.3过滤并在pbs中稀释。每只动物每次腹膜内施予200μl稀释抗体，对20克的小鼠，每次施予的最终剂量为30mg/kg的g1aa/4420或1、3、10或30mg/kg的fs20m-232-91aa/lob12.3。从肿瘤接种后的第10天开始，动物接受g1aa/4420(30mg/kg)或fs20m-232-91aa/lob12.3(1、3、10或30mg/kg)的单次腹膜内注射或总共3剂的fs20m-232-91aa/lob12(每剂1mg/kg)，每两天(q2d)给予1次。通过如实施例17中所述的卡尺测量确定肿瘤体积。从给药开始六天(细胞接种后16天)后，将动物处死。
[0886]
通过心脏穿刺将血液收集到含edta的试管中。按照制造商的说明，将未凝结的血液的红细胞在红细胞裂解缓冲液(miltenyi biotech，#130-094-183)中裂解两次。在fc阻断剂存在下(ebioscience，目录号14-0161-86)，用试剂cd4-buv395(克隆rm4-5)、cd8-buv737(克隆53-6.7)、cd44-bv510(克隆im7)和cd3e-bv786(克隆145-2c11)染色细胞以进行流式细胞分析，试剂均由bd bioscience)提供；cd69-fitc(克隆h1.2f3)、nkp46-pe(克隆29a1.4)、cd45-alexa700以及可固定的死活细胞鉴定染料780染色细胞，试剂均由ebioscience提供；以及cd62l-bv421(克隆mel-14)，由biolegend提供。按照制造商的说明，使用ebioscience foxp3染色试剂盒(ebioscience，目录号00-5523-00)将细胞固定并过夜
通透化。细胞在含有抗gzmb、抗ki67和抗foxp3抗体(gzmb-af647(克隆gb11)，由biolegend提供，和ki67-pe-cy7(克隆sola15)和foxp3-percp-cy5.5(克隆fjk-16s)，均由ebioscience提供)的100μl通透化缓冲液重悬，并在黑暗中，于室温下孵育30分钟。然后将细胞用透化缓冲液洗涤两次，并于加有0.5％bsa的pbs中重悬。然后在bd fortessa流式细胞仪中分析细胞。使用flowjo，excel和graphpad prism 7软件进行数据分析。
[0887]
通过流式细胞术分析，在第一次给药后六天，外周血中ki67+cd8+(总cd8+)和ki67+cd4+(总cd4+)增殖性t细胞频率。与同型对照相比，在fs20m-232-91aa/lob12.3单剂量为1和10mg/kg时，观察到ki67+cd4+增殖性t细胞频率的统计学上的显著增加。与同型对照相比，在fs20m-232-91aa/lob12.3的单剂量为1、3和10mg/kg剂量时，观察到ki67+cd8+增殖性t细胞频率的统计学上的显著增加。
[0888]
ki67+cd8+增殖性t细胞在单剂量水平为1mg/kg时趋向最高，而ki67+cd4+增殖性t细胞在单剂量水平为1和10mg/kg时趋向最高。相对于同型对照，将剂量水平提高至30mg/kg不会对ki67+cd8+和ki67+cd4+ t细胞产生显著影响。值得注意的是，在任何剂量水平下均未观察到明显的临床症状或体重减轻。
[0889]
比较多次给药组(fs20m-232-91aa/lob12.3在1mg/kg q2d三剂量下)和1mg/kg单剂量组，在ki67+cd8+和ki67+cd4+ t细胞中，无统计学上的显著性(不成对的mann-whitney检验，分别为p＝0.4848和p＝0.0931)。该数据表明，至少在本研究评估的六天内，多次给药并未对外周ki67+药效调节产生额外影响。
[0890]
与实施例18的结果一致，该实验表明ox40/cd137替代mab2对循环t细胞有作用，在剂量水平从1mg/kg到10mg/kg时，增殖性(ki67+)cd8+ t细胞的频率显著增加，以及在剂量水平为1mg/kg和10mg/kg时，增殖性(ki67+)cd4+ t细胞的频率显著增加。
[0891]
实施例25-在ct26小鼠肿瘤模型中cd4 t细胞去除对抗小鼠ox40/cd137 mab2药效学反应的影响
[0892]
已经证明与单独使用任何一种药剂相比，在小鼠中施用葡萄球菌肠毒素a后，靶向cd137和ox40的共刺激抗体的组合可协同增强特异性cd8+ t细胞的克隆扩增(lee等，2004)。从机制上来看，李等人证明cd4 t细胞在驱动增强的特异性cd8+ t细胞响应中起作用。通过ct26小鼠肿瘤模型和小鼠cd4 t细胞去除的抗体来测试，在响应ox40/cd137替代mab2的治疗中，宿主cd4 t细胞是否是外周cd8+ t细胞的活化和增殖所必需，或有助于外周cd8+ t细胞的活化和增殖。
[0893]
按照与实施例17中所述相同的方案，在8-10周龄，体重约20g的balb/c雌性小鼠(charles river)中，每只动物的左胁腹中皮下注射ct26结肠癌细胞。在第7天将动物随机划分为治疗组，每个时间点每组五只动物。
[0894]
如前所述分析抗体并检查杂质。同型对照抗体(g1/4420)和ox40/cd137替代mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)在pbs中稀释至最终浓度为0.1mg/ml。将抗小鼠cd4抗体(gk1.5；bioxcell，目录号be0003-1)在pbs中稀释至1mg/ml的终浓度。每只动物每次给药均接受200μl体积的稀释抗体，对20克的小鼠，最终剂量为1mg/kg(g1/4420或fs20m-232-91aa/lob12.3)或10mg/kg(gk1.5)。在细胞接种后第10、12和14天通过腹膜内(i.p.)注射将g1/4420和fs20m-232-91aa/lob12.3施用给动物。在第8、9、11、13和15天腹膜内注射gk1.5。
[0895]
细胞接种后第16天，将动物处死，并收集组织用于流式细胞术分析。通过心脏穿刺
将血液收集到含edta的试管中。按照实施例19中所述的相同方案，按照制造商的说明，将未凝结的血液的红细胞在红细胞裂解缓冲液(miltenyi biotech，#130-094-183)中裂解两次，并根据制造商的说明，使用肿瘤解离试剂盒，小鼠(miltenyi biotech，130-096-730)和gentlemacs dissociator(miltenyi biotech)解离肿瘤。使用70μm细胞过滤器(corning，目录号352350)过滤所得的肿瘤细胞悬液，在pbs中洗涤并重悬。通过将脾脏推入70μm细胞过滤器(corning)，通过在红细胞裂解缓冲液(milteny biotech)中孵育来裂解红细胞，洗涤剩余的脾细胞并将其重悬于pbs中，来制备脾脏的细胞悬液。
[0896]
在fc阻断剂存在下(ebioscience，目录号14-0161-86)，首先用试剂cd4-e450(克隆gk1.5)、cd69-pe-cy5(克隆h1.2f3)、cd3-pe-cy7(克隆145-2c11)、cd8-apc(克隆53-6.7)，以及可固定的死活细胞鉴定染料780染色细胞，试剂均由ebioscience提供；以及cd45-v500(克隆30-f11)染色细胞，由bd bioscience提供。然后按照制造商的说明，通过ebioscience foxp3染色试剂盒(ebioscience，目录号00-5523-00)将细胞固定并通透化。在fc阻断剂存在下(均为1：100)，将细胞在含有抗ki67和抗foxp3抗体(ki67-fitc(克隆sola15和foxp3-pe(克隆fjk-16s，均由ebioscience提供))的100μl通透化缓冲液中重悬，并在黑暗中，于4℃孵育30分钟。然后将细胞用通透化缓冲液洗涤一次，并于200ul pbs中重悬。在bd facscanto ii细胞仪上分析细胞。使用flowjo，excel和graphpad prism软件进行数据分析。通过graphpad prism软件中的双尾mann-whitney测试进行治疗组之间的成对比较。
[0897]
与同型对照治疗动物相比，单独使用fs20m-232-91aa/lob12.3进行治疗可诱导血液和脾脏中活化的cd69+和增殖的ki67+cd8+ t细胞比例，以及在肿瘤中增殖的ki67+cd8+ t细胞比例有统计学上的显著增加。
[0898]
与同型对照相比，fs20m-232-91aa/lob12.3与cd4+ t细胞去除的抗体gk1.的组合也可导致血液中增殖的ki67+cd8+ t细胞在统计学上的显著增加，但这一增幅显著低于在fs20m-232-91aa/lob12.3单药治疗的动物中观察到的。与单独使用fs20m-232-91aa/lob12.3和cd4+ t细胞去除抗体gk1.5治疗相比，单独使用fs20m-232-91aa/lob12.3治疗后，在脾脏和肿瘤组织中未观察到cd8+ t细胞增殖水平的统计学差异。
[0899]
在血液中，fs20m-232-91aa/lob12.3诱导活化的cd69+cd8+ t细胞的增加被gk1.5抗体抑制，因为同型对照组与fs20m-232-91aa/lob12.3加cd4去除组(分别占总cd8 t细胞的中位数1.6％和2.33％)之间没有观察到统计学上的显著差异。fs20m-232-91aa/lob12.3单药组与fs20m-232-91aa/lob12.3加cd4去除组的比较显示，脾脏中(分别为中位数频率的29.3％和6.45％，无去除和有去除)和肿瘤中(分别为中位数频率的86.4％和66.5％，无去除和有去除)激活cd8+ t细胞的频率显著降低。
[0900]
与实施例18中所述的先前发现一致，ox40/cd137替代mab2增加了活化的(cd69+)和增殖的(ki67+)cd8 t细胞的频率，并且本研究的结果表明，cd4+ t细胞去除对这种ox40/cd137 mab2介导的外周药效学反应有不利影响。此外，数据表明cd4+和cd8+ t细胞在体内介导抗ox40/cd137 mab2活性方面存在潜在的相互作用，并且cd4+ t细胞可能是体内cd8+ t细胞免疫与抗ox40/cd137 mab2最佳协同刺激所必需的。
[0901]
实施例26-ox40/cd137 mab2在基于食蟹猴细胞的测定中的功能活性以及ox40/cd137 mab2在食蟹猴中的药效学反应和耐受性
[0902]
26.1 ox40/cd137 mab2在基于食蟹猴细胞的测定中的功能活性
[0903]
进行初始pbmc测定，类似于实施例13中所述的初始t细胞测定，但是使用pbmc代替分离的活化的t细胞，以建立抗人fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2在内源性表达的人和食蟹猴受体上的相对效力。简而言之，分离食蟹猴或人pbmc，，在浓度递增的fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2或同型对照下，通过包被的抗-cd3抗体刺激三(食蟹猴)或四(人)天，以il-2的释放作为t细胞活化的量度。
[0904]
观察到mab2对食蟹猴pbmc的功能活性(平均值ec
50
＝0.28
±
0.15nm)类似于在等效的人体分析中观察到的活性(平均值ec
50
＝0.26
±
0.1nm；il-2)。因此，食蟹猴被认为是进行mab2毒性研究的药理学相关物种。
[0905]
26.2食蟹猴对ox40/cd137 mab2的耐受性和药效学反应
[0906]
进行了初步剂量范围研究，以评估抗人ox40/cd137 mab2fs20-22-49aa/fs30-10-16的耐受性，并评估主要白细胞群比例的潜在药效学变化以及诱导食蟹猴中对fs20-22-49aa/fs30-10-16的应答以及特定t细胞亚群的增殖和激活。
[0907]
简而言之，fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2是通过静脉输注以单次剂量或重复剂量的形式向食蟹猴施用的。通过评估标准毒理学参数，例如体重、食物去除、临床观察、血液学和血液化学，以分析研究期间的耐受性。
[0908]
根据临床化学和组织病理学结果确定，fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2的耐受性高达每周30mg/kg。
[0909]
与评估抗小鼠ox40/cd137 mab2对ct26同系小鼠肿瘤模型中循环t细胞的作用的研究结果一致(实施例18)，在中枢记忆和效应记忆cd4+和cd8+ t细胞中，以及在nk细胞中，观察到药物相关的细胞增殖和活化增加，其通过ki67和在某种程度上为cd69的表达增加来衡量的。
[0910]
综上所述，这些结果强烈表明，抗人fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2在食蟹猴中具有有效的体内药理活性，耐受性高达30mg/kg。此外，该研究中产生的药效学数据与实施例18中所述的小鼠药效学研究中观察到的ox40/cd137替代mab2的数据相符，并为用于人类癌症患者中，mab2结合ox40和cd137(例如fs20-22-49aa/fs30-10-16 mab2)的预期抗肿瘤功效和耐受性提供了进一步的证据。
[0911]
实施例27
–
ox40/cd137 mab2在balb/c小鼠中的肝药理学特性
[0912]
临床上已证明cd137激动剂抗体可在小鼠临床前模型中诱导肝t细胞浸润增加，并且一种cd137激动剂抗体在临床上1mg/kg以上的剂量可引起肝毒性(dubrot等,2010；segal等,2017)。因此，研究了抗小鼠ox40/cd137 mab2在balb/c小鼠中的作用，以确定与cd137激动剂抗体相比，是否增加了肝t细胞浸润。以血液和脾脏组织用作对照，研究t细胞水平以及t细胞增殖和活化。在表38中列出了测试抗体的详细信息。
[0913]
表38：所测试抗体和mab2的详细信息
[0914][0915]
mab2(fs20m-232-91aa/lob12.3)增加、激活和诱导血液、脾脏和肝脏中t细胞增殖的能力与单药mab(g1/ox86、g1/lob12.3、g1/3h3和g1/4420)和组合(g1/ox86和g1/lob12.3)对照进行了比较。在研究开始前，让重约20g，8-10周龄的balb/c雌性小鼠(charles river)休息一周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有6只小鼠。
[0916]
注射前24小时内，抗体通过sec-hplc分析，并检查杂质。在pbs中稀释抗体至最终浓度为1mg/ml，然后200μl/小鼠腹膜内(ip)注射抗体，最终剂量为20g小鼠10mg/kg。在研究的第0、2和4天(每两天一剂)进行注射。第三次注射后第7天和第14天，对每组3只小鼠实施安乐死，通过解剖分离脾脏和肝脏，并通过心脏穿刺收集血液。
[0917]
根据制造商的说明，使用miltenyi解离试剂盒(肝
–
美天旎公司，130-105-807；脾
–
美天旎公司，130-095-926)解离肝和脾。使用70m细胞过滤(康宁公司，目录号352350)过滤所得细胞悬液，离心(1500rpm下10分钟)，在pbs中洗涤一次，并重悬于5ml pbs中。
[0918]
通过心脏穿刺将血液收集到含有edta的试管中。根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(ebioscience，目录号00-4300-54)中裂解两次。
[0919]
从血液中分离的细胞通过实施例19(染色1)中详述的抗体组和试剂对进行流式细胞术染色。用pbs洗涤细胞，然后与100μl抗体混合物1(除ki67和foxp3抗体以外的所有抗体)在4℃温育30分钟。然后用pbs洗涤细胞，根据制造商的说明使用ebioscience foxp3染色试剂盒(ebioscience，目录号00-5523-00)固定并透化。简而言之，将200μl的固定溶液加入到每个孔中，并在黑暗中于4℃放置过夜。然后在200μl通透化缓冲液中洗涤细胞。然后再次旋转细胞，并在存在fc阻断剂(均以1：100稀释)下，将其重悬于100μl含ki67和foxp3抗体的通透化缓冲液中，并在黑暗中于4℃孵育30分钟。然后将细胞用通透化缓冲液洗涤一次，并重悬于200μlpbs中。然后在bd facscanto ii流式细胞仪中分析细胞。
[0920]
使用flowjox、excel和graphpad prism软件分析数据。使用单因素方差分析进行统计分析，以比较各组，然后使用graphpad prism软件包对tukey进行每对的多重比较测试。数据表示为亲本群落的百分比
[0921]
结果显示，在第7天和第14天时，与交联非依赖的cd137激动剂抗体(g1/3h3)诱导肝脏、脾脏和血液中t细胞水平升高，并且与同型对照抗体(g1/4420)相比，这些t细胞的增
殖和激活水平提高。交联依赖的cd137激动剂抗体(g1/lob12.3)在肝脏、脾脏和血液中的t细胞水平、(t细胞)增殖或激活均未表现出明显增加。在研究的第7天，ox40激动剂抗体(g1/ox86)不会诱导任何组织中的t细胞水平升高，但在肝脏、脾脏和血液中显示出t细胞增殖水平升高，并在第14日恢复至同型对照水平。在第7日，ox40和交联依赖的cd137激动剂抗体(g1/ox86和g1/lob12.3)的组合表现出肝脏t细胞浸润水平增加，第7日，在肝脏中以及第7日和第14日，在脾脏中(无显著性)和血液中，t细胞增殖增加；第14日，在肝脏和血液中以及第7日和第14日，在脾脏中，t细胞活化增加。在第7日，ox40/cd137 mab2显示出肝t细胞浸润水平(无显著性)和血液t细胞水平增加，到第14日又恢复到同型对照水平，并且在第7日，肝脏(无显著性)、脾脏和血液中t细胞增殖增加，到第14日也恢复到同型对照水平。这些结果表明，只有交联非依赖的cd137激动剂(g1/3h3)才能在肝脏、脾脏和血液中诱导升高和持续的t细胞浸润、增殖和活化，并表明与交联非依赖的cd137激动剂抗体相比，本发明的靶向ox40/cd137的抗体分子具有更低的肝毒性风险。这些结果提高了克隆3h3诱导的交联非依赖cd137激动与在该研究中观察到交联非依赖的克隆增加肝t细胞炎症之间关联的可能性。
[0922]
实施例28
–
在ct26同系肿瘤模型中比较含有不同抗cd137 fab克隆的ox40/cd137 mab2抗体
[0923]
在实施例27中，观察到不依赖交联的cd137激动剂抗体(g1/3h3)在balb/c小鼠中诱导升高和持续的t细胞浸润、增殖和活化的水平。为了测试这种增加的活性在ox40/cd137 mab2的背景下是否具有有益的抗肿瘤活性，使用ct26同系肿瘤模型比较了两种不同的抗小鼠ox40/cd137 mab2的体内活性：一种是其中cd137激动剂是交联依赖的克隆lob1.23，而另一种是其中cd137激动剂是交联非依赖性克隆3h3。先前已证明ct26同系肿瘤模型对ox40和cd137激动剂抗体均敏感，并且从ct26肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(til)同时表达ox40和cd137。
[0924]
28.1在ct26同系肿瘤模型中包含不同抗cd137 fab克隆的ox40/cd137 mab2抗体的抗肿瘤活性
[0925]
在ct26同系小鼠肿瘤模型中体内测定两种不同的ox40/cd137 mab2、fs20m-232-91aa/3h3(seq id no：169和167)和fs20m-232-91aa/lob12.3(参见表38)，并与同型对照抗体(g1/4420；请参阅表38)比较。此外，分析了两种ox40/cd137 mab2在血液中诱导的t细胞增殖和活化水平，并将其与同型对照抗体诱导的水平进行了比较。在研究开始前，让重约20g，8-10周龄的balb/c雌性小鼠(charles river)休息一周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识符。每个队列有10只小鼠。首先扩增，储存ct26结肠癌细胞系(atcc，crl-2638)，然后使用impact i方案通过idexx生物研究对预筛选病原体，结果表明不含病原体。将ct26细胞(约3-5x106)从150℃解冻存，并添加到含10％fcs(gibco，10270-106)的20ml dmem(gibco，61965-026)的t175组织培养瓶中。使用异氟烷(雅培实验室)将小鼠麻醉，在每只动物的左侧胁腹皮下注射1x106细胞。接种肿瘤细胞后第10天，监测小鼠的健康状况和肿瘤生长，将其分类并随机分为研究组。此时将没有肿瘤的任何小鼠从研究中移除。
[0926]
注射前24小时内，抗体通过sec-hplc分析，并检查杂质。在pbs中稀释抗体至最终浓度为0.1mg/ml，然后200μl/小鼠腹膜内(ip)注射抗体，最终剂量为20g小鼠1mg/kg。在肿瘤接种后的第10、12和14天(每两天一剂)进行注射。在麻醉下盲选动物进行每周3次健康检查，在此期间进行肿瘤的精确测量。通过卡尺测量确定肿瘤体积(如实施例17中所述)。肿瘤
细胞接种后35天终止研究，根据肿瘤体积和状况，当达到人道终点时，将动物撤离研究。表39中总结了治疗组、测试的分子、剂量和给药方案。第21天的肿瘤体积通过两因素方差分析(anova)和使用graphpad prism软件进行的tukey多重比较测试进行了统计学检验。使用graphpad prism软件通过对数秩检验(mantel-cox)进行生存率的统计学检验。
[0927]
表39：治疗组和测试分子的总结
[0928][0929]
如图15a和15b所示，与同型对照抗体相比，用两种ox40/cd137 mab2抗体中的任一种进行治疗均延迟了肿瘤生长并提高了存活率。在分别用fs20m-232-91aa/3h3 mab2和fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2处理的小鼠之间，未观察到肿瘤生长或存活率的差异。该数据表明，如实施例27中所述，尽管观察到交联非依赖的cd137激动剂(g1/3h3)的t细胞活化和增殖增加，但是与ox40/cd137 mab2中抗cd137 fab克隆是交联依赖性的克隆lob12.3(fs20m-232-91aa)相比，抗cd137 fab中交联非依赖性克隆3h3(fs20m-232-91aa/3h3)的ox40/cd137 mab2抗肿瘤活性没有增加。
[0930]
28.2在ct26同系肿瘤模型中评估包含不同抗cd137 fab克隆的ox40/cd137 mab2的外周药效学反应
[0931]
在上述实施例28.1中所述的扩展研究中，在给予第三剂五天后(即肿瘤接种后第19天)，从五只小鼠的尾静脉收集血液到含有edta的试管中。根据制造商的说明，将未凝结的血液中的红细胞在红细胞裂解缓冲液(ebioscience，目录号00-4300-54)中裂解两次。
[0932]
从血液中分离的细胞通过实施例19(染色1)中详述的抗体组和试剂对进行流式细胞术染色。用pbs洗涤细胞，然后与100μl抗体混合物1(除ki67和foxp3抗体以外的所有抗体)在4℃温育30分钟。然后用pbs洗涤细胞，按照制造商的说明用foxp3染色试剂盒(ebioscience，目录号00-5523-00)固定并透化。简而言之，将200μl的固定溶液加入到每个孔中，并在黑暗中于4℃放置过夜。然后在200μl透化缓冲液中洗涤细胞。然后再次旋转细胞，并在存在fc阻断剂(均以1：100稀释)下，将其重悬于100μl含ki67和foxp3抗体的透化缓冲液中，并在黑暗中于4℃孵育30分钟。然后将细胞用透化缓冲液洗涤一次，并重悬于200μlpbs中。然后在bd facscanto ii流式细胞仪中分析细胞。
[0933]
使用flowjox、excel和graphpad prism软件分析数据。使用单因素方差分析进行统计分析，以比较各组，然后使用graphpad prism软件包对tukey进行每对的多重比较测试。
[0934]
与同型对照抗体(g1/4420)和fs20m-232-91aa/lob12.3相比，fs20m-232-91aa/3h3诱导的血液t细胞水平的统计学显著增加。与g1/4420同型对照和fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2观察到的这些细胞类型的相对百分比相比，由fs20m-232-91aa/3h3诱导的这
些增加的t细胞水平伴随着cd4+ t细胞的相对百分比有统计学上的显著下降和cd8+ t细胞的相对百分比有统计学上的显著增加。两种ox40/cd137 mab2抗体也都诱导cd4+和cd8+ t细胞的增殖，但是fs20m-232-91aa/3h3诱导的水平显著高于fs20m-232-91aa/lob12.3 mab2诱导的水平。与同型对照相比，fs20m-232-91aa/3h3 mab2诱导的活化cd4+ t细胞水平升高。与同型对照治疗队列相比，用fs20m-232-91aa/lob12.3或fs20m-232-91aa/3h3处理的小鼠中活化的t细胞和活化的cd8+ t细胞水平的变化是适度的，没有统计学意义上的显著性，如fs20m-232-91aa/lob12.3处理的小鼠中活化的cd4+ t细胞水平的变化。这些结果表明，在ox40/cd137 mab2的背景下，交联非依赖的cd137激动剂克隆3h3具有活性，并且与交联依赖性cd137激动剂克隆lob12.3相比，在ox40/cd137 mab2的情况下，能够诱导t细胞水平增加和增殖，因此与在实施例27所述的balb/c小鼠研究中所观察到的克隆3h3作为单克隆抗体(mab)诱导t细胞水平增加和增殖是一致的。
[0935]
连同抗肿瘤活性数据，这些结果表明，在ox40/cd137 mab2的背景下，交联非依赖的cd137激动剂诱导的t细胞水平升高和增殖引起的抗肿瘤应答方面，没有额外好处。这些结果与实施例27的结果(其中观察到由克隆3h3诱导的交联非依赖cd137激动剂增加肝t细胞炎症)一起表明，使用ox40/cd137 mab2，其cd137激动剂依赖于结合ox40，可以提供一种安全有效的方法来刺激免疫系统抵抗癌症。
[0936]
序列表
[0937]
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[0938]
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–
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–
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–
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–
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–
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[0955]
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ccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgccagagatctgctggtgtacggcttcgactattggggccagggcacactggtcaccgtgtcctct
[0956]
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[0957]
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[0960]
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[0961]
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[0979]
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[0985]
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–
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[1000]
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[1004]
fs30-10-12 mab的轻链可变域的氨基酸序列(seq id no：14)
[1005]
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[1008]
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[1009]
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[1010]
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[1016]
fs30-35-14 mab(kabat)的cdr氨基酸序列
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–
dispyggatnyadsvkg(seq id no：30)
[1019]
vh cdr3
–
nlyelsaysygady(seq id no：31)
[1020]
vl cdr1
–
rasqsvsssyla(seq id no：10)
[1021]
vl cdr2
–
gassrat(seq id no：11)
[1022]
vl cdr3
–
qqyyysspit(seq id no：28)
[1023]
fs30-35-14 mab的重链可变域的氨基酸序列(seq id no：170)
[1024]
cdr imgt编号(粗体斜体)，cdr kabat编号(带下划线斜体)
[1025][1026]
fs30-35-14 mab的重链可变域的核酸序列(seq id no：171)
[1027]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtgcctataatatccattgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttagcgatatttctccgtatggtggcgcgaccaactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagaaacctctacgagttgagcgcttactcttacggggcggactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgtcg
[1028]
fs30-35-14 mab的轻链可变域的氨基酸序列(seq id no：172)
[1029]
cdr imgt编号(粗体斜体)，cdr kabat编号(带下划线斜体)
[1030][1031]
fs30-35-14 mab的轻链可变域的核酸序列(seq id no：32)
[1032]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatattattattcttctcctatcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
[1033]
fs30-5-37 mab(imgt)的cdr氨基酸序列
[1034]
vh cdr1
–
gftfssya(seq id no：33)
[1035]
vh cdr2
–
isgsggst(seq id no：34)
[1036]
vh cdr3
–
arsydkywgssiysgldy(seq id no：35)
[1037]
vl cdr1
–
qsvsssy(seq id no：4)
[1038]
vl cdr2
–
gas(seq id no：5)
[1039]
vl cdr3
–
qqyysyypvt(seq id no：36)
[1040]
fs30-5-37 mab(kabat)的cdr氨基酸序列
[1041]
vh cdr1
–
syams(seq id no：37)
[1042]
vh cdr2
–
aisgsggstyyadsvkg(seq id no：38)
[1043]
vh cdr3
–
sydkywgssiysgldy(seq id no：39)
[1044]
vl cdr1
–
rasqsvsssyla(seq id no：10)
[1045]
vl cdr2
–
gassrat(seq id no：11)
[1046]
vl cdr3
–
qqyysyypvt(seq id no：36)
[1047]
fs30-5-37 mab的重链可变域的氨基酸序列(seq id no：40)
[1048]
cdr imgt编号(粗体斜体)，cdr kabat编号(带下划线斜体)
[1049][1050]
fs30-5-37 mab的重链可变域的核酸序列(seq id no：41)
[1051]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgaattgcgcggccagtggctttaccttcagtagctatgccatgagctgggtgcgtcaggcgccgggcaaaggtctggaatgggttagcgcgattagcggtagtggcggtagcacgtactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagatcttacgacaaatactggggttcttctatttactctggcttggactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
[1052]
fs30-5-37 mab的轻链可变域的氨基酸序列(seq id no：42)
[1053]
cdr imgt编号(粗体斜体)，cdr kabat编号(带下划线斜体)
[1054][1055]
fs30-5-37 mab的轻链可变域的核酸序列(seq id no：43)
[1056]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatattattcttattatcctgtcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
[1057]
wt ch3结构域结构环的氨基酸序列
[1058]
wt ab环
–
rdeltknq(seq id no：44)
[1059]
wt cd环
–
sngqpenny(seq id no：45)
[1060]
wt ef环
–
dksrwqqgnv(seq id no：46)
[1061]
wt ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：47)
[1062]
ab，cd和ef环下划线标出
[1063]
gqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1064]
ch2结构域的氨基酸序列(seq id no：48)
[1065]
apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak
[1066]
具有lala突变的ch2结构域的氨基酸序列(seq id no：49)
[1067]
lala突变下划线标出
[1068]
apeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak
[1069]
具有lala突变和p114a突变的ch2域的氨基酸序列(seq id no：50)
[1070]
lala突变下划线；p114a突变粗体和下划线标出
[1071][1072]
fcab fs20-22-49 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1073]
fs20-22-49第一序列
–
ywdqe(seq id no：51)
[1074]
fs20-22-49第二序列
–
deqfa(seq id no：52)
[1075]
fs20-22-49第三序列
–
qyrwnpady(seq id no：53)
[1076]
fcab fs20-22-49 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：54)
[1077]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1078]
gqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngdeqfaykttppvldsdgsfflyskltvdqyrwnpadyfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1079]
fcab fs20-22-49 ch3结构域的核酸序列(seq id no：55)
[1080]
ggccagcctagggaaccccaggtttacaccttgcctccaagccgggacgagtactgggatcaaga
[1081]
ggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggcgacgagcagttcgcctacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattctttctgtactccaagctgacagtggaccagtacagatggaaccccgccgactacttctcttgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacacagaagtccctgtctctgtcccctggc
[1082]
fcab fs20-22-49 ch3结构域ab，cd和ef环序列的氨基酸序列
[1083]
fs20-22-49 ab环
–
rdeywdqe(seq id no：56)
[1084]
fs20-22-49 cd环
–
sngdeqfay(seq id no：57)
[1085]
fs20-22-49 ef环
–
dqyrwnpady(seq id no：58)
[1086]
fcab fs20-22-38 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1087]
fs20-22-38第一序列
–
ywdqe(seq id no：51)
[1088]
fs20-22-38第二序列
–
aekyq(seq id no：59)
[1089]
fs20-22-38第三序列
–
qyrwnpgdy(seq id no：60)
[1090]
fcab fs20-22-38 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：61)
[1091]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1092]
gqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngaekyqykttppvldsdgsfflyskltvdqyrwnpgdyfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1093]
fcab fs20-22-38 ch3结构域的核酸序列(seq id no：62)
[1094]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggcagaaaaataccagtacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaacccaggcgactatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
[1095]
fcab fs20-22-41 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1096]
fs20-22-41第一序列
–
ywdqe(seq id no：51)
[1097]
fs20-22-41第二序列
–
deqfa(seq id no：52)
[1098]
fs20-22-41第三序列
–
qyrwnpgdy(seq id no：60)
[1099]
fcab fs20-22-41 ch3域的氨基酸序列(seq id no：63)
[1100]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1101]
gqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngdeqfaykttppvldsdgsfflys
[1102]
kltvdqyrwnpgdyfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1103]
fcab fs20-22-41 ch3结构域的核酸序列(seq id no：64)
[1104]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaacccaggcgactatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccggga
[1105]
fcab fs20-22-47 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1106]
fs20-22-47第一序列
–
ywdqe(seq id no：51)
[1107]
fs20-22-47第二序列
–
deqfa(seq id no：52)
[1108]
fs20-22-47第三序列
–
qyrwspgdy(seq id no：65)
[1109]
fcab fs20-22-47 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：66)
[1110]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1111]
gqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngdeqfaykttppvldsdgsfflyskltvdqyrwspgdyfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1112]
fcab fs20-22-47 ch3结构域的核酸序列(seq id no：67)
[1113]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggagtccgggtgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1114]
fcab fs20-22-85 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1115]
fs20-22-85第一序列
–
ywdqe(seq id no：51)
[1116]
fs20-22-85第二序列
–
deqfa(seq id no：52)
[1117]
fs20-22-85第三序列
–
qyrwnpfdd(seq id no：68)
[1118]
fcab fs20-22-85 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：69)
[1119]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1120]
gqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngdeqfaykttppvldsdgsfflyskltldqyrwnpfddfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1121]
fcab fs20-22-85 ch3结构域的核酸序列(seq id no：70)
[1122]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagtt
cgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccttggatcagtataggtggaatccgtttgatgatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1123]
fcab fs20-31-58 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1124]
fs20-31-58第一序列
–
yysge(seq id no：71)
[1125]
fs20-31-58第二序列
–
qpend(seq id no：72)
[1126]
fs20-31-58第三序列
–
pywrwgsprt(seq id no：73)
[1127]
fcab fs20-31-58 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：74)
[1128]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1129]
gqprepqvytlppsrdeyysgevsltclvkgfypsdiavewesngqpendykttppvldsdgsfflyskltvpywrwgsprtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1130]
fcab fs20-31-58 ch3结构域的核酸序列(seq id no：75)
[1131]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactactctggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacgactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccttattggaggtggggtagtccgcgtactttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
[1132]
fcab fs20-31-66 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1133]
fs20-31-66第一序列
–
yysge(seq id no：71)
[1134]
fs20-31-66第二序列
–
qpend(seq id no：72)
[1135]
fs20-31-66第三序列
–
pywrwgvprt(seq id no：76)
[1136]
fcab fs20-31-66 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：77)
[1137]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1138]
gqprepqvytlppsrdeyysgevsltclvkgfypsdiavewesngqpendykttppvldsdgsfflyskltvpywrwgvprtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1139]
fcab fs20-31-66 ch3结构域的核酸序列(seq id no：78)
[1140]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactactctggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacgactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccgtattggaggtggggtgttccgcgtactttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
[1141]
fcab fs20-31-94 fcab ch3域结构环序列的氨基酸序列
[1142]
fs20-31-94第一序列
–
wehge(seq id no：79)
[1143]
fs20-31-94第二序列-irehd(seq id no：80)
[1144]
fs20-31-94第三序列
–
pywrwggpgt(seq id no：81)
[1145]
fcab fs20-31-94 fcab ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：82)
[1146]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1147]
gqprepqvytlppsrdewehgevsltclvkgfypsdiavewesngirehdykttppvldsdgsfflyskltvpywrwggpgtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1148]
fcab fs20-31-94 fcab ch3结构域的核酸序列(seq id no：83)
[1149]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtgggaacatggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggatcagagaacatgattacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccatattggaggtggggcggcccaggcaccttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1150]
fcab fs20-31-102 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1151]
fs20-31-102第一序列
–
wasge(seq id no：84)
[1152]
fs20-31-102第二序列
–
qpevd(seq id no：85)
[1153]
fs20-31-102第三序列
–
pywrwgvprt(seq id no：76)
[1154]
fcab fs20-31-102 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：86)
[1155]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1156]
gqprepqvytlppsrdewasgevsltclvkgfypsdiavewesngqpevdykttppvldsdgsfflyskltvpywrwgvprtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1157]
fcab fs20-31-102 ch3结构域的核酸序列(seq id no：87)
[1158]
ggccagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtgggcatctggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccagaagttgattacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccgtattggaggtggggtgttccgcgtactttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
[1159]
fcab fs20-31-108 ch3结构域结构环序列的氨基酸序列
[1160]
fs20-31-108第一序列
–
wasge(seq id no：84)
[1161]
fs20-31-108第二序列
–
ekeid(seq id no：88)
[1162]
fs20-31-108第三序列
–
pywrwgakrt(seq id no：89)
[1163]
fcab fs20-31-108 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：90)
[1164]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1165]
gqprepqvytlppsrdewasgevsltclvkgfypsdiavewesngekeidykttppvldsdgsfflyskltvpywrwgakrtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1166]
fcab fs20-31-108 ch3域的核酸序列(seq id no：91)
[1167]
ggccagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtgggcatctggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggaaaaagaaatcgattacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccgtattggaggtggggtgctaagcgtactttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt
[1168]
fcab fs20-31-115 ch3域结构环序列的氨基酸序列
[1169]
fs20-31-115第一序列
–
wasge(seq id no：84)
[1170]
fs20-31-115第二序列
–
eqefd(seq id no：92)
[1171]
fs20-31-115第三序列
–
pywrwgakrt(seq id no：89)
[1172]
fcab fs20-31-115 ch3结构域的氨基酸序列(seq id no：93)
[1173]
第一，第二和第三序列下划线标出
[1174]
gqprepqvytlppsrdewasgevsltclvkgfypsdiavewesngeqefdykttppvldsdgsfflyskltvpywrwgakrtfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1175]
fcab fs20-31-115 ch3结构域的核酸序列(seq id no：94)
[1176]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtgggcatctggtgaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggaacaggaattcgattacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgccgtattggaggtggggtgctaagcgtactttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1177]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-16重链的氨基酸序列(seq id no：95)
[1178]
可变域(斜体)，lala突变(加粗下划线)
[1179][1180]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-16重链的核酸序列(seq id no：96)
[1181]
gaagttcagctgctggaatctggcggcggattggttcaacctggcggctctctgagactgtcttgtgccgcttccggcttcaccttctccagctacgacatgtcctgggtccgacaggctcctggcaaaggactggaatgggtgtccgacatcgaccccaccggctctaagaccgactacgccgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgccagagatctgctggtgtacggcttcgactattggggccagggcacactggtcaccgtgtcctctgcttctaccaagggacccagcgtgttccctctggctccttccagcaagtctacctctggcggaacagctgctctgggctgcctggtcaaggactactttcctgagcctgtgaccgtgtcttggaactctggcgctctgacatctggcgtgcacacctttccagcagtgctgcagtcctccggcctgtactctctgtcctctgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggaacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaagctgctggcggcccttccgtgtttctgttccctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggacccagaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacaccttgcctccaagccgggacgagtactgggatcaagaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggcgacgagcagttcgcctacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattctttctgtactccaagctgacagtggaccagtacagatggaaccccgccgactacttctcttgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacacagaagtccctgtctctgtcccctggc
[1182]
fs30-10-16轻链的氨基酸序列(seq id no：97)
[1183]
可变域(斜体)
[1184]
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqsysypvtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreak
vqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[1185]
fs30-10-16轻链的核酸序列(seq id no：98)
[1186]
gagatcgtgctgacccagtctcctggcacactgtcactgtctccaggcgagagagctaccctgtcctgtagagcctctcagtccgtgtcctcctcttacctggcctggtatcagcagaagcctggacaggctccccggctgttgatctacggcgcttcttctagagccacaggcatccctgaccggttctccggatctggctctggcaccgatttcaccctgaccatctctcggctggaacccgaggatttcgccgtgtactactgccagcagtcctacagctaccccgtgacctttggccagggcaccaaggtggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttccccccaagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccccagggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
[1187]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-3重链的氨基酸序列(seq id no：99)
[1188]
可变域(斜体)，lala突变(加粗下划线)
[1189][1190]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-3重链的核酸序列(seq id no：100)
[1191]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtagttacgatatgagctgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttagcgatattgatccgactggtagcaagaccgactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagagacctcaatgtgtacgggttcgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagtgctagcactaagggcccgtcggtgttcccgctggccccatcgtccaagagcacatcagggggtaccgccgccctgggctgccttgtgaaggattactttcccgagcccgtcacagtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcatactttcccggctgtgcttcagtcctctggcctgtactcattgtcctccgtggtcaccgtcccttcgtcctccctgggcacccagacctatatctgtaatgtcaaccataagccctcgaacaccaaggtcgacaagaaggtcgagccgaagtcgtgcgacaagactcacacttgcccgccttgcccagccccggaagctgccggtggtccttcggtgttcctcttcccgcccaagccgaaggataccctgatgatctcacggacccccgaagtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccggaagtgaaattcaattggtacgtggatggagtggaagtgcacaacgccaagaccaagccacgggaagaacagtacaactctacctaccgcgtggtgtccgtgctcactgtgctgcaccaagactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgcctgccccaattgagaaaactatctcgaaagccaagggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1192]
fs30-10-3的轻链的氨基酸序列(seq id no：97)
[1193]
可变域(斜体)
[1194][1195]
fs30-10-3的轻链的核酸序列(seq id no：102)
[1196]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatcttattcttatcctgtcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtactgtggccgctcctagcgtgttcatttttccgccatccgacgagcagctcaagtccggcaccgcctccgtggtctgcctgctcaacaacttctaccctcgcgaagctaaggtccagtggaaggtcgacaatgccctgcagtccggaaactcgcaggaaagcgtgactgaacaggactccaaggactccacctattcactgtcctcgactctgaccctgagcaaggcggattacgaaaagcacaaagtgtacgcatgcgaagtgacccaccagggtctttcgtcccccgtgaccaagagcttcaacagaggagagtgt
[1197]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-12重链的氨基酸序列(seq id no：103)
[1198]
可变域(斜体)，lala突变(加粗下划线)
[1199][1200]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-10-12重链的核酸序列(seq id no：104)
[1201]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtagttacgatatgagctgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttagcgatattgatccgactggtagcaagaccgactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagagacctcacggtgtacgggttcgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagtgctagcactaagggcccgtcggtgttcccgctggccccatcgtccaagagcacatcagggggtaccgccgccctgggctgccttgtgaaggattactttcccgagcccgtcacagtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcatactttcccggctgtgcttcagtcctctggcctgtactcattgtcctccgtggtcaccgtcccttcgtcctccctgggcacccagacctatatctgtaatgtcaaccataagccctcgaacaccaaggtcgacaagaaggtcgagccgaagtcgtgcgacaagactcacacttgcccgccttgcccagccccggaagctgccggtggtccttcggtgttcctcttcccgcccaagccgaaggataccctgatgatctcacggacccccgaagtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccggaagtgaaattcaattggtacgtggatggagtggaagtgcacaacgccaagaccaagccacgggaagaacagtacaactctacctaccgcgtggtgtccgtgctcactgtgctgcaccaagactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgcctgccccaattgagaaaactatctcgaaagccaagggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1202]
fs30-10-12的轻链的氨基酸序列(seq id no：97)
[1203]
可变域(斜体)eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqsysypvtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[1204]
fs30-10-12的轻链的核酸序列(seq id no：102)
[1205]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatcttattcttatcctgtcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtactgtggccgctcctagcgtgttcatttttccgccatccgacgagcagctcaagtccggcaccgcctccgtggtctgcctgctcaacaacttctaccctcgcgaagctaaggtccagtggaaggtcgacaatgccctgcagtccggaaactcgcaggaaagcgtgactgaacaggactccaaggactccacctattcactgtcctcgactctgaccctgagcaaggcggattacgaaaagcacaaagtgtacgcatgcgaagtgacccaccagggtctttcgtcccccgtgaccaagagcttcaacagaggagagtgt
[1206]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-35-14重链的氨基酸序列(seq id no：105)
[1207]
可变域(斜体)，lala突变(加粗下划线)
[1208][1209]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-35-14重链的核酸序列(seq id no：106)
[1210]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtgcctataatatccattgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttagcgatatttctccgtatggtggcgcgaccaactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagaaacctctacgagttgagcgcttactcttacggggcggactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgtcggctagcactaagggcccgtcggtgttcccgctggccccatcgtccaagagcacatcagggggtaccgccgccctgggctgccttgtgaaggattactttcccgagcccgtcacagtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcatactttcccggctgtgcttcagtcctctggcctgtactcattgtcctccgtggtcaccgtcccttcgtcctccctgggcacccagacctatatctgtaatgtcaaccataagccctcgaacaccaaggtcgacaagaaggtcgagccgaagtcgtgcgacaagactcacacttgcccgccttgcccagccccggaagctgccggtggtccttcggtgttcctcttcccgcccaagccgaaggataccctgatgatctcacggacccccgaagtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccggaagtgaaattcaattggtacgtggatggagtggaagtgcacaacgccaagaccaagccacgggaagaacagtacaactctacctaccgcgtggtgtccgtgctcactgtgctgcaccaagactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgcctgccccaattgagaaaactatctcgaaagccaagggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggc
tccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1211]
fs30-35-14的轻链的氨基酸序列(seq id no：107)
[1212]
可变域(斜体)
[1213][1214]
fs30-35-14的轻链的核酸序列(seq id no：108)
[1215]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatattattattcttctcctatcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtactgtggccgctcctagcgtgttcatttttccgccatccgacgagcagctcaagtccggcaccgcctccgtggtctgcctgctcaacaacttctaccctcgcgaagctaaggtccagtggaaggtcgacaatgccctgcagtccggaaactcgcaggaaagcgtgactgaacaggactccaaggactccacctattcactgtcctcgactctgaccctgagcaaggcggattacgaaaagcacaaagtgtacgcatgcgaagtgacccaccagggtctttcgtcccccgtgaccaagagcttcaacagaggagagtgt
[1216]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-5-37重链的氨基酸序列(seq id no：109)
[1217]
可变域(斜体)，lala突变(加粗下划线)
[1218][1219]
具有lala突变的fs20-22-49aa/fs30-5-37重链的核酸序列(seq id no：110)
[1220]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgaattgcgcggccagtggctttaccttcagtagctatgccatgagctgggtgcgtcaggcgccgggcaaaggtctggaatgggttagcgcgattagcggtagtggcggtagcacgtactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagatcttacgacaaatactggggttcttctatttactctggcttggactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagtgctagcactaagggcccgtcggtgttcccgctggccccatcgtccaagagcacatcagggggtaccgccgccctgggctgccttgtgaaggattactttcccgagcccgtcacagtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcatactttcccggctgtgcttcagtcctctggcctgtactcattgtcctccgtggtcaccgtcccttcgtcctccctgggcacccagacctatatctgtaatgtcaaccataagccctcgaacaccaaggtcgacaagaaggtcgagccgaagtcgtgcgacaagactcacacttgcccgccttgcccagccccggaagctgccggtggtccttcggtgttcctcttcccgcccaagccgaaggataccctgatgatctcacggacccccgaagtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccggaagtgaaattcaattggtacgtggatggagtggaagtgcacaacgccaagaccaagccacgggaagaacagtacaactctacctaccgcgtggtgtccgtgctcactgtgctgcaccaagactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgcctgccccaattgagaaaactatctcgaaagccaagggacagcctcgagaaccacaggtgta
caccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1221]
fs30-5-37轻链的氨基酸序列(seq id no：111)
[1222]
可变域(斜体)
[1223][1224]
fs30-5-37轻链的核酸序列(seq id no：112)
[1225]
gaaattgtgctgacccagtctccgggcacgttatctctgagccctggtgagcgcgccactctgtcatgccgggcttctcaaagtgttagcagtagctacctggcgtggtatcagcaaaaaccgggccaggccccgcgtctgctgatttacggtgcatccagccgtgccaccggcattccagatcgtttttccggtagtggttctgggacggacttcactctgacaatctcacgcctggaaccggaggattttgcggtgtattactgccagcaatattattcttattatcctgtcacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtactgtggccgctcctagcgtgttcatttttccgccatccgacgagcagctcaagtccggcaccgcctccgtggtctgcctgctcaacaacttctaccctcgcgaagctaaggtccagtggaaggtcgacaatgccctgcagtccggaaactcgcaggaaagcgtgactgaacaggactccaaggactccacctattcactgtcctcgactctgaccctgagcaaggcggattacgaaaagcacaaagtgtacgcatgcgaagtgacccaccagggtctttcgtcccccgtgaccaagagcttcaacagaggagagtgt
[1226]
fcab fs20-22-49 ch3结构域的替代核酸序列(seq id no：113)
[1227]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1228]
包含lala突变的抗fitc mab g1aa/4420重链的氨基酸序列(seq id no：114)
[1229]
cdr的位置标有下划线。lala突变的位置以粗体显示。
[1230][1231][1232]
没有lala突变的抗fitc mab g1/4420重链的氨基酸序列(seq id no：115)
[1233]
cdr的位置标有下划线。
[1234]
evkldetggglvqpgrpmklscvasgftfsdywmnwvrqspekglewvaqirnkpynyetyysdsvkgrftisrddskssvylqmnnlrvedmgiyyctgsyygmdywgqgtsvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst
yrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1235]
4420 mab轻链的氨基酸序列(seq id no：116)
[1236]
vl域(斜体)
[1237][1238]
具有lala突变的g1aa/held1.3抗体重链的氨基酸序列(seq id no：117)
[1239]
qvqlqesgpglvrpsqtlsltctvsgstfsgygvnwvrqppgrglewigmiwgdgntdynsalksrvtmlvdtsknqfslrlssvtaadtavyycarerdyrldywgqgslvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[1240]
held1.3 mab轻链的氨基酸序列(seq id no：118)
[1241]
vl域(斜体)
[1242][1243]
g1/mor7480.1的重链氨基酸序列(seq id no：119)
[1244]
vh域(斜体)
[1245][1246]
g1/mor7480.1，g1aa/mor7480.1和g2/mor7480.1 mab轻链的氨基酸序列(seq id no：120)
[1247]
vl域(斜体)
[1248][1249]
g1/20h4.9重链的氨基酸序列(seq id no：121)
[1250]
vh域(斜体)
[1251]
[1252]
g1/20h4.9和g1aa/20h4.9 mab轻链的氨基酸序列(seq id no：122)
[1253]
vl域(斜体)
[1254][1255]
fs20-22-49aa/4420(具有lala突变)的重链氨基酸序列(seq id no：123)
[1256]
vh域(斜体)；lala突变(粗体和下划线)
[1257][1258]
g2/mor7480.1的重链氨基酸序列(seq id no：124)
[1259]
vh域(斜体)
[1260][1261]
g1aa/mor7480.1的重链氨基酸序列(seq id no：125)
[1262]
vh域(斜体)lala(粗体和带下划线的)
[1263][1264][1265]
人cd137的氨基酸序列(seq id no：126)
[1266]
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
[1267][1268]
人cd137细胞外结构域的氨基酸序列(seq id no：127)
[1269]
lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspq
[1270]
食蟹猴cd137的氨基酸序列(seq id no：128)
[1271]
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
[1272][1273]
食蟹猴cd137胞外域的氨基酸序列(seq id no：129)
[1274]
lqdlcsncpagtfcdnnrsqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfktrkecsstsnaecdcisgyhclgaecsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassatppaparepghspq
[1275]
人ox40细胞外结构域的氨基酸序列(seq id no：130)
[1276]
lhcvgdtypsndrcchecrpgngmvsrcsrsqntvcrpcgpgfyndvvsskpckpctwcnlrsgserkqlctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppatqpqetqgpparpitvqpteawpgtspg
[1277]
食蟹猴ox40胞外域的氨基酸序列(seq id no：131)
[1278]
lhcvgdtypsnd
[1279]
rccqecrpgngmvsrcnrsqntvcrpcgpgfyndvvsakpckactwcnlrsgserkqpctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppptqpqetqgpparpptvpptpg
[1280]
do11.10-hox40和人ox40受体的氨基酸序列(seq id no：132)
[1281]
lhcvgdtypsndrcchecrpgngmvsrcsrsqntvcrpcgpgfyndvvsskpckpctwcnlrsgserkqlctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppatqpqetqgpparpitlplakpglaklplaglplakpgla
[1282]
do11.10-mox40和小鼠ox40受体的氨基酸序列(seq id no：133)
[1283]
vtarrlncvkhtypsghkccrecqpghgmvsrcdhtrdtlchpcetgfyneavnydtckqctqcnhrsgselkqnctptqdtvcrcrpgtqprqdsgyklgvdcvpcppghfspgnnqackpwtnctlsgkqtrhpasdsldavcedrsllatllwetqrptfrpttvqsttvwprtselpspptlvtpegpafavllglglgllapltvllalyllrkawrlpntpkpcwgnsfrtpiqeehtdahftlaki
[1284]
do11.10-cox40和食蟹猴ox40受体的氨基酸序列(seq id no：134)
[1285]
klhcvgdtypsndrccqecrpgngmvsrcnrsqntvcrpcgpgfyndvvsakpckactwcnlrsgserkqpctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppptqpqepqpgaplflplpgla
[1286]
人ox40-mfc的氨基酸序列(seq id no：135)
[1287]
il-2前导序列(带下划线)，ox40细胞外结构域(斜体)，小鼠igg2a fc结构域(粗体)
[1288][1289]
小鼠ox40-mfc的氨基酸序列(seq id no：136)
[1290]
il-2前导序列(带下划线)，ox40细胞外结构域(斜体)，小鼠igg2a fc结构域(粗
体)
[1291][1292]
食蟹猴ox40-mfc的氨基酸序列(seq id no：137)
[1293]
il-2前导序列(带下划线)，ox40细胞外结构域(斜体)，小鼠igg2a fc结构域(粗体)
[1294][1295]
与cd137-mfc-avi重组抗原一起使用的人cd137序列的氨基酸序列(seq id no：138)
[1296]
slqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspq
[1297]
与cd137-mfc-avi和cd137-avi-his重组抗原一起使用的食蟹猴cd137序列的氨基酸序列(seq id no：139)
[1298]
slqdlcsncpagtfcdnnrsqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfktrkecsstsnaecdcisgyhclgaecsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassatppaparepghspq
[1299]
与cd137-mfc-avi重组抗原一起使用的小鼠cd137序列的氨基酸序列(seq id no：140)
[1300]
avqnscdncqpgtfcrkynpvckscppstfssiggqpncnicrvcagyfrfkkfcssthnaececiegfhclgpqctrcekdcrpgqeltkqgcktcslgtfndqngtgvcrpwtncsldgrsvlktgttekdvvcgppvvsfspsttisvtpeggpgghslslqvl
[1301]
与cd137-mfc-avi重组抗原一起使用的mfc-avi的氨基酸序列(seq id no：141)
[1302]
小鼠fc域(斜体)avi标签(粗体)
[1303][1304]
截短的fcab铰链区的氨基酸序列(seq id no：101)
[1305]
tcppcp
[1306]
fcab fs20-22-49 ch3结构域的替代核酸序列(seq id no：143)
[1307]
ggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagtt
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[1308]
fs20-22-49/fs30-5-37重链aa(无lala)(seq id no：144)
[1309]
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[1310]
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[1311]
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[1312]
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[1313]
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[1314]
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[1315]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtagttacgatatgagctgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttag
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[1316]
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[1317]
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[1318]
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[1319]
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agagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1320]
fs20-22-49/fs30-10-16重链aa(无lala)(seq id no：150)
[1321]
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[1322]
fs20-22-49/fs30-10-16重链dna(无lala)(seq id no：151)
[1323]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtagttacgatatgagctgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttagcgatattgatccgactggtagcaagaccgactatgcggatagcgtgaaaggccgttttaccatttctcgcgacaacagcaagaacacgctgtacctgcagatgaactcactgcgtgccgaagatacggccgtgtattactgtgcgagagacctcttggtgtacgggttcgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagtgctagcactaagggcccgtcggtgttcccgctggccccatcgtccaagagcacatcagggggtaccgccgccctgggctgccttgtgaaggattactttcccgagcccgtcacagtgtcctggaacagcggagccctgacctccggagtgcatactttcccggctgtgcttcagtcctctggcctgtactcattgtcctccgtggtcaccgtcccttcgtcctccctgggcacccagacctatatctgtaatgtcaaccataagccctcgaacaccaaggtcgacaagaaggtcgagccgaagtcgtgcgacaagactcacacttgcccgccttgcccagccccggaactgctgggtggtccttcggtgttcctcttcccgcccaagccgaaggataccctgatgatctcacggacccccgaagtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccggaagtgaaattcaattggtacgtggatggagtggaagtgcacaacgccaagaccaagccacgggaagaacagtacaactctacctaccgcgtggtgtccgtgctcactgtgctgcaccaagactggctgaacgggaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgcctgccccaattgagaaaactatctcgaaagccaagggacagcctcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagtactgggaccaggaagtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggggatgaacagttcgcatacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggatcagtataggtggaatcctgctgattatttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacactcagaagagcttgtccctgtcgcccgga
[1324]
fs20-22-49/fs30-35-14重链aa(无lala)(seq id no：152)
[1325]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfsaynihwvrqapgkglewvsdispyggatnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarnlyelsaysygadywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeywdqevsltclvkgfypsdiavewesngdeqfaykttppvldsdgsfflyskltvdqyrwnpadyfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1326]
fs20-22-49/fs30-35-14重链dna(无lala)(seq id no：153)
[1327]
gaagtgcaactgctggagtccggtggtggtctggtacagccgggtggttctctgcgtctgagttgcgcggccagtggctttaccttcagtgcctataatatccattgggtgcgtcaggctccgggcaaaggtctggaatgggttag
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[1328]
g1aa/fs30-10-16mab(带有lala)的重链氨基酸序列(seq id no：154)
[1329]
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssydmswvrqapgkglewvsdidptgsktdyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardllvygfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1330]
g1aa/fs30-10-16mab轻链的氨基酸序列(seq id no：97)
[1331]
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqsysypvtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqssvcskvskqskvssqskvssqskvssqskvssqskvssqskvssqskvssqskvssqskvcsqskvssqskvssqskvssqskvssqskyspss
[1332]
g1aa/ox86mab(带有lala)的重链氨基酸序列(seq id no：155)
[1333]
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[1334]
g1/ox86和g1aa/ox86mab轻链的氨基酸序列(seq id no：156)
[1335]
divmtqgalpnpvpsgesasitcrssqslvykdgqtylnwflqrpgqspqlltywmstrasgvsdrfsgsgsggtyftlkisrvraedagvyycqqvreypftfgsgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvkkvthcskqcsqnskes
[1336]
fs20m-232-91aa/4420(具有lala)的重链氨基酸序列(seq id no：157)
[1337]
evkldetggglvqpgrpmklscvasgftfsdywmnwvrqspekglewvaqirnkpynyetyysdsvkgrftisrddskssvylqmnnlrvedmgiyyctgsyygmdywgqgtsvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdelfdpmyyynqvsltclvkgfypsdiavewesngeplwdykttppvldsdgsfflyskltvwrdrwedgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[1338]
fs20m-232-91aa/4420的轻链氨基酸序列(seq id no：116)
[1339]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylrwylqkpgqspkvliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpwtfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqnskcskeskesksskeskes
[1340]
人cd137-avi-his的氨基酸序列(seq id no：158)
[1341]
细胞外结构域cd137(粗体)；avi标签(斜体)；his标签(带下划线)
[1342][1343]
g1/ox86 mab(无lala)重链的氨基酸序列(seq id no：159)
[1344]
qvqlkesgpglvqpsqtlsltctvsgfsltgynlhwvrqppgkglewmgrmrydgdiyynsvlksrlsisrdtsknqvflkmnslqtddtaiyyctrdgrgdsfdywgqgvmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[1345]
抗pd-1 mab g1aa/5c4重链的氨基酸序列(seq id no：160)
[1346]
可变域(粗体)
[1347][1348]
抗pd-1 mab g1aa/5c4轻链的氨基酸序列(seq id no：161)
[1349]
可变域(粗体)
[1350][1351]
抗pd-l1 mab g1aa/s1重链的氨基酸序列(seq id no：162)
[1352]
可变域(粗体)
[1353][1354]
抗pd-l1 mab g1aa/s1轻链的氨基酸序列(seq id no：163)
[1355]
可变域(粗体)
[1356][1357]
小鼠cd137的氨基酸序列(seq id no：164)
[1358]
细胞外结构域(斜体)；跨膜和胞内结构域(粗体)
[1359][1360]
g1aa/20h4.9 mab重链的氨基酸序列(seq id no：165)
[1361]
vh域(斜体)
[1362][1363]
g1aa/3h3 mab重链的氨基酸序列(seq id no：166)
[1364]
vh域(斜体)
[1365][1366]
g1aa/3h3和g1/3h3 mab和fs20m-232-91aa/3h3 mab2的轻链的氨基酸序列(seq id no：167)
[1367]
vl域(斜体)
[1368][1369]
g1/3h3 mab重链的氨基酸序列(seq id no：168)
[1370]
vh域(斜体)
[1371][1372]
重链fs20m-232-91aa/3h3(带有lala)的氨基酸序列(seq id no：169)
[1373]
vh域(斜体)
[1374][1375]
抗ox40 mab g1aa/11d4重链的氨基酸序列(seq id no：173)
[1376]
vh域(斜体)
[1377][1378]
抗ox40 mab g1/11d4重链的氨基酸序列(seq id no：174)
[1379]
vh域(斜体)
[1380][1381]
抗ox40 mab g1aa/11d4和g1/11d4轻链的氨基酸序列(seq id no：175)
[1382]
vl域(斜体)
[1383][1384]
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本说明书中提及的所有文件均通过引用整体并入本文。
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