瘘管故障预测的辅助方法及其用途的试剂盒与流程

本发明涉及以来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度作为指标的瘘管故障的发生容易性的辅助预测方法、其用途的试剂盒。
背景技术：
：为了进行血液透析，需要将血液以200ml/min左右的高流量导出到体外。因此，通常将血管从动脉连接到静脉，增加静脉的血流量，之后从静脉导向血液的体外循环。瘘管是指从动脉连接到静脉的血管部位。在长期进行透析时，已知会产生由于瘘管部位的血管形成血栓或血管的内侧变得肥厚等而无法确保透析所需要的血流量的瘘管故障这一现象。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2010/082665号小册子专利文献2：日本特开第2013-158291号非专利文献非专利文献1：jvascaccess.2017jul14；18(4)：295-300非专利文献2：clinjamsocnephrol.2010aug；5(8)：1447-50非专利文献3：jlipidres.2012sep；53(9)：1987-92技术实现要素：发明所要解决的课题在发生瘘管故障时，需要通过利用中空球等的扩张而进行短路血管的狭窄内腔部位的狭窄除去或者形成新的瘘管，对血液透析患者的负担非常大。关于瘘管故障发生的抑制，如非专利文献1所述，报告了他汀给药对于瘘管故障的抑制是有效的。另一方面，非专利文献2中报告了，他汀疗法与瘘管故障的抑制不相关。如此，尚不清楚瘘管故障与他汀的关系、以及瘘管故障的发生机理，截至目前，尚无有效的预测法的报告。若能够利用简便的方法辅助预测瘘管故障的发生容易性并采取预防措施，则可减轻血液透析患者的负担。用于解决课题的手段本发明人确立了下述假说：在瘘管故障、特别是短路血管狭窄的发生机理中，yap(yes相关蛋白,yes-associatedprotein)/taz(具有pdz结合基序的转录共激活因子,transcriptionalcoactivatorwithpdz-bindingmotif)的激活起到了主要作用，位于yap/taz通路及其上游的甲羟戊酸通路参与其中。此外本发明人发现，通过以血液透析患者的血清中的甲羟戊酸浓度作为指标，能够预测短路血管狭窄的发生，从而完成了本发明。本发明包括下述发明。[1]一种辅助预测瘘管故障的发生容易性的方法，其包括下述步骤：在来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度为预先设定的临界值以上的情况下或经时性地增大的情况下，确定为容易发生瘘管故障。[2]如[1]所述的方法，其中，临界值被设定为4～9ng/ml的范围内的值。[3]如[2]所述的方法，其中，在甲羟戊酸浓度为9ng/ml以上的情况下，确定为瘘管故障的发生容易性为每年超过1次的频率。[4]如[1]所述的方法，其中，临界值被设定为来自1年以上未发生瘘管故障的血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度的1.2倍以上的值。[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，来自血液透析患者的样品为血清或血浆。[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，甲羟戊酸浓度使用酶进行测定。[7]如[6]所述的方法，其中，酶为羟甲基戊二酰辅酶a还原酶。[8]如[6]或[7]所述的方法，其中，甲羟戊酸浓度使用酶循环法进行测定。[9]一种试剂盒，其是用于辅助预测瘘管故障的发生容易性的试剂盒，其包含用于测定来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度的试剂。[10]如[9]中所述的试剂盒，其中，试剂包含酶。[11]如[10]中所述的试剂盒，其中，酶为羟甲基戊二酰辅酶a还原酶。[12]一种用于预防瘘管故障或用于使瘘管故障延迟发生的治疗方法，其包括下述步骤：在来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度为预先设定的临界值以上的情况下或经时性地增大的情况下，确定为容易发生瘘管故障的步骤；以及在诊断为容易发生瘘管故障的患者中，阻断从甲羟戊酸通路向yap/taz通路的信号传递的步骤。发明的效果关于瘘管故障发生的抑制，如非专利文献1所述，报道了他汀给药对于瘘管故障的抑制是有效的。另一方面，非专利文献2中报道了他汀疗法与瘘管故障的抑制不相关。如此，研究人员对于瘘管故障与他汀给药的关系存在争议，本发明人基于他汀给药可抑制瘘管故障这一想法，作为引起瘘管故障的机理，认为(1)短路血管内的血流发生乱流、(2)因乱流使短路血管的内膜肥厚、(3)由于内膜肥厚而发生瘘管故障，进一步推测，在上述(2)之前、之后或者同时在血管组织中发生yap/taz的激活，并对此进行了检证。进一步还认为，yap/taz的激活可能与甲羟戊酸通路的激活有关，本发明人确立了作为甲羟戊酸通路的控速阶段生成物的甲羟戊酸量的增加与瘘管故障发生相关这一假说，但尚不清楚该假说是否正确。若本发明人的假说正确，则应该具有血液透析患者的瘘管故障发生血管部位的甲羟戊酸浓度增大的关系，但在该确认之前令人惊讶地发现了不是血液透析患者的瘘管故障发生血管部位而是血清样品中的甲羟戊酸浓度增加与瘘管故障发生的关系，完成了本发明、即能够通过测定血液透析患者的样品、特别是血液、血清、血浆样品中的甲羟戊酸浓度来预测瘘管故障发生。根据本发明，通过将血液透析患者样品中的甲羟戊酸浓度作为指标能够辅助预测瘘管故障的发生容易性，进而能够在早期提供适当的预防治疗法。甲羟戊酸浓度的测定能够通过使用酶循环法而高灵敏度且简便地进行。附图说明图1示出了健康人10名、非透析的ckd患者13名、无瘘管故障的患者13名、有瘘管故障的患者64名的甲羟戊酸浓度(ng/ml)，误差条表示标准偏差。图2示出了未发生瘘管故障的组、瘘管故障发生频率为每年1次以下的组、以及瘘管故障发生频率每年超过1次的组的甲羟戊酸浓度(ng/ml)，误差条表示标准偏差。图3示出了在有无他汀给药的情况下总胆固醇与瘘管故障发生的关系的调查结果。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式(以下称为本实施方式)进行详细说明。需要说明的是，本发明并不限于以下的实施方式，可以在其要点的范围内进行各种变形来实施。第一实施方式提供一种辅助预测瘘管故障的发生容易性的方法，其包括下述步骤：在来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度为预先设定的临界值以上的情况下或经时性地增大的情况下，确定为容易发生瘘管故障。血液透析患者(也简称为“透析患者”)是指接受血液透析的人等哺乳动物。血液透析患者可以为随机抽取的血液透析患者。或者，血液透析患者可以为根据性别、年龄、体重、bmi、吸烟履历、饮酒履历、血清中性脂肪值、血清胆固醇值、颈动脉肥厚度等的检査数值、他汀等药剂的服用履历、透析年数、透析起因疾患例如糖尿病或iga肾病、瘘管形成部位、自体血管还是人工血管的短路血管种类等进行区分的组中的血液透析患者。本实施方式中的血液透析患者的样品是指由血液透析患者采集的任意样品。并非旨在特别限定，但作为血液透析患者的样品例，例如有毛发、体毛、指甲、汗液、体液、泪液、唾液、齿间液、唾液、血液、血球细胞、血清、血浆、透析液、血管摘除物、血管来源细胞、脏器摘除物、皮肤碎片等。这些之中，血液、血清、血浆、透析液出于容易采集等原因为优选的样品，特别优选血清、血浆。样品采集后不立即施行甲羟戊酸浓度测定步骤的情况下，优选保存样品。作为用于甲羟戊酸测定的样品的保存条件，只要为从样品采集后到样品测定为止的期间甲羟戊酸浓度不发生变动、例如不变动10％以上、优选不变动5％以上、更优选不变动3％以上的条件就没有特别限定。例如，关于保存温度，若为室温则可以为例如10～30℃、若冷蔵则可以为例如0～10℃、若冷冻则可以为例如-5～-120℃。另外，为了使甲羟戊酸浓度不变动，也可以加入防腐剂、稳定剂等添加物进行保存。样品中的甲羟戊酸浓度由每单位重量、每单位体积的样品中存在的甲羟戊酸的重量或摩尔数来表示。作为样品中包含的甲羟戊酸，认为有包含内酯形态、游离酸形态、盐形态等全部形态的情况、将各形态分开的情况，样品优选包含全部形态。另外，关于此处所说的样品中的甲羟戊酸浓度，不仅为如上所述的每单位重量、每单位体积的样品中甲羟戊酸量，还包含利用其他物质量进行了校正的甲羟戊酸量。关于甲羟戊酸浓度，例如样品为血液、血清、血浆的情况下，也包含将样品中的甲羟戊酸浓度通过例如单独或组合除去样品中的白蛋白浓度或葡萄糖浓度或钠浓度等而进行了校正的甲羟戊酸浓度。关于甲羟戊酸浓度，例如在样品为红血球提取液的情况下，也包含将提取液中的甲羟戊酸浓度通过例如除以血红蛋白浓度等而进行了校正的甲羟戊酸浓度。关于甲羟戊酸浓度，例如在样品为血管组织提取液的情况下，也包含将提取液中的甲羟戊酸浓度通过例如除以提取液中的总蛋白浓度等而进行了校正的甲羟戊酸浓度。作为甲羟戊酸浓度的测定方法，只要为能够测定来自透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度的方法就没有特别限定，作为其示例，例如可以举出lc-ms法、gc-ms法、免疫法、酶法、利用放射性同位素的酶法、酶循环法等。专利文献1所述的酶循环法简便、且具有能够测定来自透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度的程度的高灵敏度，作为甲羟戊酸浓度的测定方法是优选的。此外，在专利文献1所述的基于酶循环法的甲羟戊酸测浓度定中使用专利文献2所述的校正试样时，操作法、精度更为优异，因而优选。作为酶循环方法中使用的酶，有羟甲基戊二酰辅酶a还原酶等。用于测定甲羟戊酸浓度的试剂可例示出专利文献1所述和非专利文献2所述的使用酶循环法的试剂等。以往，专科医生几乎不可能诊断出瘘管故障的发生容易性，但本实施方式的方法中，通过以血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度作为指标，能够辅助预测血液透析患者的瘘管故障的发生容易性。本说明书中的专科医生是指肾脏内科医生等对于透析具有足够的知识的临床医生。瘘管故障是指由于血管的内侧肥厚等而无法确保透析所需要的血流量的现象，例如通过下述情况进行判断：i)透析时的来自短路血管的血流量的降低、回血的静脉压的上升；ii)基于血管造影检査(angiography)、超声波等的短路血管的狭窄的确认；iii)由专科医生进行的止血困难状况的确认等目视和/或触诊；或者iv)i)至iii)的组合；等等。瘘管狭窄可以通过图像诊断进行确定诊断，因此ii)的步骤是最重要的。瘘管故障有时也被称为血管通路功能障碍(vascularaccessdysfunction)或血管通路功能丧失(vascularaccessfailure)。有无瘘管故障的判断方法在本领域技术人员、即专科医生间是公知的，是通用的认识，下面进行具体例示。上述i)中所说的血流量的降低是指与短路血管制作时的血流量相比为例如90％以下或75％以下的状态、或者透析时的血流量为例如180ml/min以下或150ml/min以下。回血的静脉压的上升是指例如流速200ml/min的情况下为200mmhg以上。上述ii)中所说的短路血管的狭窄是指狭窄部的内腔径与非狭窄部相比为例如1/2以下或1/3以下。由血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度预测瘘管故障的发生容易性是指对于在样品采集时未发生瘘管故障的血液透析患者在一定期间后是否容易发生瘘管故障进行判定。关于此处所说的一定期间后，只要为血液透析患者利用同一短路血管持续进行血液透析的期间就没有特别限定，例如优选3年、2年、1年、半年的期间。另外，测定血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度进行预测瘘管故障的发生容易性的检査的频率例如为每3个月、每6个月、每12个月等等，可从血液透析患者的qol、医疗经济的方面等出发适当地选定。此处所说的样品采集时没有特别限制，包括：例如按照上午8点、午后1点的方式进行时间设定的条件下；例如早晨空腹时、饭后8小时以上、饭后12小时以上的条件下；例如透析开始时、透析结束时的条件下；等等。样品为血液、血清、血浆的情况下，采集部位存在各种部位，例如可以从透析部位、其上游或下游的血管部位、远离透析部位的腕静脉、脚静脉进行采集，或者也可以将指尖末梢血作为样品。另外，在从2个以上的部位采集样品的情况下，也可以进行除去这些样品的甲羟戊酸浓度、取差值、取平均值等运算，将所得到的数值用于瘘管故障发生的预测。瘘管故障的发生容易性的预测可以通过以样品中的甲羟戊酸浓度作为指标来进行。例如在甲羟戊酸浓度为一定浓度以上的情况下或经时性地增大的情况下，确定为容易发生瘘管故障。并非旨在进行限定，但以样品中的甲羟戊酸浓度作为指标的瘘管故障的发生容易性的预测可以包括下述的步骤1)至3)。步骤1)测定样品中的甲羟戊酸浓度以及取得样品一定期间后发生瘘管故障或未发生瘘管故障的病例数。步骤2)通过基于步骤1)中得到的数据单纯地作图、或者进行roc曲线等数据处理，将样品中的一定浓度的甲羟戊酸浓度设定为临界值。步骤3)样品中的甲羟戊酸浓度为临界值以上时，预测为容易发生瘘管故障。作为上述步骤2)中的临界值，例如在样品为血清或血浆的情况下，该临界值可以设定在例如4～9ng/ml、优选5～8ng/ml、更优选5.5～7.5ng/ml之间。例如作为如实施例1那样以每年1次和高于此的频率预测瘘管故障的发生容易性的情况下的临界值，设定为6.5ng/ml，若为6.5ng/ml以上则预测为容易发生瘘管故障。另外，例如作为如实施例2那样以每年超过1次的频率预测瘘管故障的发生容易性的情况下的临界值，可以设定为9ng/ml。通过像这样设定具体的临界值，能够对于以往即使是专科医生也不容易判断的瘘管故障的发生容易性进行机械性地判断。或者，作为指标，除了上述临界值以外、或者代替该临界值，还可以通过与来自1年以上未发生瘘管故障的血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度进行比较来预测瘘管故障的发生容易性。例如，可以将与1年以上未发生瘘管故障的透析患者相比为1.2倍以上、优选为1.4倍以上、更优选为1.7倍以上的、甲羟戊酸浓度高的血液透析患者确定为容易发生瘘管故障。在经过上述步骤或任意经过专科医生的诊断而确定为容易发生瘘管故障的情况下，可以执行用于其预防或用于延迟其发生的治疗方法的处方。本发明人确立了下述假说：位于yap/taz通路及其上游的甲羟戊酸通路参与瘘管故障发生，认为若利用阻断从甲羟戊酸通路向yap/taz通路的信号传递的方法，则可构成用于预防瘘管故障或延迟瘘管故障的发生的治疗法。因此，对于被诊断为容易发生瘘管故障的患者，可以进一步实施包括阻断从甲羟戊酸通路向yap/taz通路的信号传递的步骤的治疗方法。关于阻断从甲羟戊酸通路向yap/taz通路的信号传递的方法，例如考虑了在这些通路中起到重要作用的酶的阻断剂的处方。作为这样的酶，可以举出例如hmgcoa还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、法尼基二磷酸合成酶、rhoa等。作为hmgcoa还原酶的阻断剂，例如可以举出他汀，作为法尼基二磷酸合成酶的阻断剂，例如可以举出双磷酸盐。通过执行这些阻断剂的处方，可以构成预防或治疗方法。第二实施方式中提供一种用于辅助预测瘘管故障的发生容易性的试剂盒，其包含用于测定来自血液透析患者的样品中的甲羟戊酸浓度的试剂。试剂盒只要包含用于测定甲羟戊酸浓度的试剂就没有特别限定，例如优选为能够使用日立制7170s型等市售的生物化学自动分析装置进行测定的检查试剂盒。另外，试剂盒可以在使用时制备，优选在制造后能够在冷蔵或冷冻条件下保存例如1周、1个月、3个月、6个月、1年、2年的期间。另外，作为试剂盒的形态，可以为液态品、冷冻品、冷冻干燥品的试剂或这些试剂的组合。此外还可以使用对试剂盒的稳定性、操作性、测定时间、测定精度等进行了改良的试剂盒。以下通过实施例等更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于以下的实施例等。[实施例1][实施例1]<血液透析患者中的甲羟戊酸浓度与瘘管故障发生的关系>在2014年～2017年的期间，由77名血液透析患者中采集血清样品，冷冻保存在-20℃或-70℃。77名患者中包含他汀非给药组54名和给药组23名，下述表1、表2、表3中记载了概况。[表1][表2]透析患者他汀非给药组他汀给药组服药率(％)抗血小板凝集剂阿司匹林25.947.8氯吡格雷7.434.8其他11.14.3抗凝剂华法林20.413降压剂钙通道阻滞剂44.460.9ace-i/arb33.373.9β-阻滞剂27.817.4抗糖尿病剂dpp-4抑制剂18.547.8胰岛素16.713[表3]透析患者他汀非给药组他汀给药组检査数值总蛋白(g/dl)7.0±0.76.7±0.7白蛋白(g/dl)3.6±0.53.6±0.6总胆固醇(mg/dl)180.3±44.6148.7±31.5中性脂肪(mg/dl)120.7±99.1104.6±55.8hdl胆固醇(mg/dl)48.6±17.050.5±19.3ldl胆固醇(mg/dl)103.8±30.475.5±21.4高灵敏度crp(mg/dl)0.51±0.790.78±1.61红血球沉降速度(mm/h)39.3±22.542.2±23.7关于甲羟戊酸浓度的测定，于2018年按照非专利文献3所述的方法进行了测定。血液透析患者被分成有无发生瘘管故障的组，将其与甲羟戊酸浓度的关系示于图1。关于有无发生瘘管故障，通过由专科医生对于实际上进行透析而确认到了瘘管血流的降低或回血时的静脉压上升的患者进行血管造影并进行瘘管狭窄的诊断来确定。为进行参考，图1中还示出了10名健康人、13名非透析ckd患者的甲羟戊酸浓度。由图1可知，透析患者中，瘘管故障发生组的甲羟戊酸浓度为9.28ng/ml，瘘管故障未发生组的甲羟戊酸浓度为6ng/ml，明显更低。可知将临界值设定为5.5～7.5ng/ml之间的6.5ng/ml来预测瘘管故障的发生容易性时，为有效的检査方法。另外，同样由图1可知，与健康人的甲羟戊酸浓度4.57ng/ml相比，非透析ckd患者的甲羟戊酸浓度为6.63ng/ml、血清甲羟戊酸浓度明显增高。关于临界值，可以通过基于更多的病例数进行设定来设定更高精度的临界值。[实施例2]<血液透析患者中的甲羟戊酸浓度与瘘管故障发生频率的关系>实施例1中，将77名患者在2014年～2017年的期间的瘘管故障发生频率分成未发生、每年1次以下、每年超过1次的3组，将其与甲羟戊酸浓度的关系示于图2。由图2可知，未发生瘘管故障的组中的甲羟戊酸浓度平均为6ng/ml，每年1次以下的组中为8.21ng/ml，每年超过1次的组中为9.4ng/ml，可知在瘘管故障发生频率高的组中，甲羟戊酸浓度更高。由图2可知，通过以8.2～9.4ng/ml之间的例如9.0ng/ml作为临界值，能提供对更容易发生瘘管故障的患者进行检査的方法。与实施例1同样地，关于实施例2的临界值，也可以通过基于更多的病例数进行设定来设定更高精度的临界值。[参考例1]<血液透析患者中的总胆固醇浓度与瘘管故障发生的关系>由于甲羟戊酸浓度为胆固醇生物合成的指标，因此确认了是否可以与甲羟戊酸浓度高同样地通过总胆固醇浓度高来预测瘘管故障发生。将实施例1的血液透析患者分成有无瘘管故障发生的组，在表4、表5中示出了与总胆固醇浓度的关系。未发生瘘管故障的组中的总胆固醇浓度为141.0±18.0mg/dl(8名平均)，与之相对，发生了瘘管故障的组中为174.1±5.1mg/dl(69名平均)。根据该结果，看似与甲羟戊酸浓度同样地可由总胆固醇浓度高来预测瘘管故障的发生容易性，更详细地分成他汀给药组和非给药组对于与总胆固醇浓度的关系进行确认。其结果，他汀非给药组中，未发生瘘管故障的组中的总胆固醇浓度为184.7±35.0mg/dl(3名平均)、发生了瘘管故障的组中为180.0±6.4mg/dl(51名平均)，胆固醇浓度高似乎与瘘管故障的发生不相关。另外，在其他集团中在有无他汀给药的情况下对于总胆固醇与瘘管故障发生的关系进行调查，作为调查结果示于图3中。根据这些结果，与甲羟戊酸浓度不同，总胆固醇浓度高时，不能确认其与瘘管故障发生的关系。[表4]未发生瘘管故障总胆固醇(mg/dl)甲羟戊酸(ng/ml)他汀(－)n＝3184.7±35.06.87±1.42他汀(+)n＝5114.8±9.04.68±0.79合计n＝8141.0±18.05.50±0.77[表5]发生瘘管故障总胆固醇(mg/dl)甲羟戊酸(ng/ml)他汀(－)n＝51180.0±6.49.55±0.67他汀(+)n＝18158.2±6.78.16±1.36合计n＝69174.1±5.19.19±0.61工业实用性根据本发明，能够辅助预测血液透析患者的瘘管故障的发生容易性，因此以往由专科医生进行的诊断变得简便，与瘘管故障关联的病情的诊断、预防、治疗等变得有效。当前第1页12