工程改造的细胞的产生及其用途的制作方法

本公开涉及表达至少一种抗原衍生肽和至少一种免疫调节分子的遗传修饰的树突细胞或其前体，其医疗用途和制备方法。本发明还涉及产生生成il-10的cd49b⁺lag-3+tr1细胞或抗原特异性foxp3⁺t细胞的体外方式，以及相关医疗用途和药物组合物。

背景技术：

鉴定旨在选择性控制抗原(ag)特异性致病t细胞反应和促进/恢复t-细胞介导的疾病中的耐受性的新型方法代表了管理人类中自身免疫疾病和器官移植的宏伟目标之一。与此一致，一种新型的疫苗接种(也称为“反向疫苗接种(inversevaccination)”或“致耐受性疫苗接种(tolerogenicvaccination)”)旨在诱导或恢复无反应情况的免疫状态，这可能是针对外来ag(即蛋白质疗法、过敏原或转基因)抑或针对自体ag(1)。致耐受性策略的总体目标是通过ag特异性teff细胞的删除/抑制/偏离来抑制不良反应，以及支持ag特异性t调节性细胞(treg)——叉头框p3(foxp3)表达型treg(foxp3⁺treg)(2)或生成il-10的t调节性1型(tr1)细胞(3)的诱导和/或扩增。人们已经提出了许多不同的反向疫苗接种方法：

i).使用靶向不同细胞群(即抗cd3、抗cd20、抗cd52、ctla-4ig)的单克隆抗体或促炎性细胞因子(即抗tnfα，抗il-1β)或者使用免疫调节化合物(即雷帕霉素(rapamycin)，霉酚酸酯(mycophenolatemofetil))的非ag特异性免疫疗法，

ii).使用自体ag或过敏原的ag特异性免疫疗法。

作为致耐受性策略的作用物，调节性细胞已被提议作为细胞治疗的工具。越来越多的证据表明树突细胞(dc)的不同子集，无论是自然产生的或者是实验诱导的，在维持组织稳态和促进耐受性中起到关键作用(参见(4-7))，从而作用为调节性细胞。dc的调节性能力取决于其未成熟状态，并且其可以通过免疫介导物、遗传操作或来自其他免疫细胞的信号诱导。致耐受性dc(toldc)呈递ag和初免ag特异性t细胞，并且还可以诱导ag特异性treg(8)。更好的理解toldc以及调节其诱导、活动和可塑性的机制的生物学以及开发适合于体外生成toldc的方案为将其用途转化成免疫介导的疾病中的免疫疗法提供了可能性(8-12)。dc代表选择的致耐受性细胞满足促进/恢复ag特异性耐受性的目标，因为它们i)促进ag特异性treg；ii)调节ag特异性致病t细胞；iii)生成富含抗炎介导物的致耐受性微环境，其支持长期ag特异性无反应情况的维持。到目前为止完成的原理论证性临床试验证明了基于toldc的免疫治疗在自身免疫疾病中以及在器官移植后预防移植物排斥中的安全性和可行性(10、11、13-15)。然而，输注的dc的稳定性以及其至耐受性的维持对于改善成功的基于dc的细胞疗法的安全性和疗效仍然是待解决的问题。

最佳toldc应当在未激活的状态或者在抗炎细胞因子或抑制性分子丰富的微环境中呈递ag。为了稳定这些条件，发明人提出了使用基于本领域先进的慢病毒载体(lv)技术的新型策略，其将确保生成稳定和有效的致耐受性dc。慢病毒载体(lv)将转导人dc前体(16)并诱导强而持久的抗肿瘤t细胞反应(17)。此外，lv介导的dc转导并不会在dc激活中导致重大改变(18)，这支持了lv介导的稳定且有效的ag呈递以产生免疫原性或致耐受性dc的可能性。因此，到目前为止，lv已被用于遗传修饰dc，用于基于dc免疫原性的疗法。用编码肿瘤相关ag的lv转导的dc产生肿瘤特异性cd8⁺t细胞(17)。只有在lv介导的ag已及ii类mhc呈递途径时，通过lv转导的dc对cd4⁺t进行初免才会发生。将编码与卵白蛋白(ova)融合的不变链(invariantchain)(ii)的lv(lv.iiova)体内注射转导的dc，所述转导的dc获得了在ii类mhc的竞争中呈递编码的ova并促进ova特异性cd4⁺t细胞的能力(19)。将lv直接体内给予转导的dc提供一些优点：它不需要细胞操纵，并且载体本身触发急性炎症，这提供了佐剂效果；然而，它不能提供高特异性的细胞靶向。相反，体外lv介导的dc转导可以通过减少脱靶转导和通过转移的细胞的有限生命来显著改善安全性。此外，体外给予生成的lv转导的dc允许重复细胞给予。

人们已经采用多种试剂来体外分化人toldc(20)。为了定义用于体内的最佳致耐受性dc，最近报道了体外分化的toldc的不同亚群的比较分析，该比较分析检测了它们的稳定性、细胞因子产生概况和抑制活性(20、21)。该结果表明，il-10调节的成熟dc是用于基于致耐受性dc的疗法的最适合的细胞。发明人团队对鉴定il-10作为促进有效致耐受性dc分化的关键因素做出了贡献，并且描述了命名为dc-10的细胞子集，其可以在il-10存在的情况下由外周血单核细胞诱导，并且特征在于分泌大量il-10的能力。dc-10是成熟骨髓细胞，其表达免疫调节分子，包括hla-g、ilt3和ilt4，它们是体外ag特异性tr1细胞的有效诱导物(22、23)。dc-10是稳定的细胞，因为它们即使在激活(24)时仍保持其致耐受性活性。有趣的是，用自体dc-10刺激过敏原特异性t细胞促进了它们向生成il-10的抑制性t细胞的转化(25)，这表明dc-10是将效应t细胞转化为treg的良好候选物。体内转移后，toldc中il-10转化的鼠骨髓衍生的dc的过表达防止过敏性接触性皮炎(26)。赋予dc致耐受性的其他候选方案是诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(id01)，色氨酸分解酶，在几种病理状态下的免疫调节剂。ido的表达已通过抗原呈递细胞中的几种手段促进，包括纤维蛋白原和骨髓dc((27)，wo2013/040552、wo2018037108和wo2017192786)。总之，这些方法不能促进经处理的细胞中ido的稳定且持久的过表达。

临床医生的主要目标之一是寻找替代性治疗，以预防器官移植后的移植物排斥。改进在同种异体器官移植后用于防止排斥的免疫抑制疗法治疗显示了限制急性排斥的益处，然而，与长期免疫抑制方案相关联的副作用(参见下述批准的药物表1)代表了慢性移植失败的主要原因之一。标准免疫抑制方案是有效的。然而，它们需要长期治疗，而这些长期治疗与许多副作用相关联，并且相较于普通群体，目前移植患者的预期寿命，包括肾移植患者的预期寿命仍然明显较短(vansandwijkms等,nethjmed.2013)。每天给予免疫抑制治疗，会造成14,000美元的年成本。

表1：批准的药物

基于调节性细胞免疫疗法的替代疗法在最近十年进入临床领域，其目标是减少免疫抑制(28)。在它们中，基于t调节性细胞(treg)的疗法。迄今为止，已经完成多达30个不同的临床试验，或者正在使用多克隆新分离的或体外扩增的treg进行，以预防移植物排斥(29)。使用基于treg的疗法正在进行的临床试验证明了该方法的安全性和一些临床益处。然而，几个未决问题仍待解决：

-多克隆体外扩增的treg介导体内泛免疫抑制(panimmunosuppression)的可能性(30)；出于该原因，正在进行临床前研究，以生成抗原特异性treg以限制该副作用；

-输注的treg在体内强炎性条件下不稳定并且采纳致病效应t表型和功能的可能性，从而可能介导移植物排斥；

长久持续的treg对阻碍针对感染和恶性肿瘤的免疫力的整体影响(29)。

基于treg的疗法的有趣替代和互补方法是基于骨髓调节性细胞(mrc)的疗法。相较于treg，mrc(即，mreg和toldc)通过不同的机制发挥免疫调节作用，包括耗尽ag特异性效应t细胞，促进组织修复和再生过程。此外，mrc以生理方式在体内诱导ag特异性treg。几乎没有已经经mrc(即，mreg或toldc)治疗的患者。因此，到迄今为止，在少量移植的患者上公开的数据证明了该方法的安全性，并且表明在肾移植的患者中输注供体衍生的mreg能够减少免疫抑制方案并体内诱导treg(31)。

因此，仍然需要用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、移植物抗宿主病的细胞疗法。

发明概述

通过未成熟的dc进行ag呈递是众所周知诱导外周免疫耐受性的天然机制(32)，发明人提出利用免疫调节调控来保证通过未成熟的遗传修饰的dc进行ag呈递。

在本发明中，令人惊讶地发现，遗传修饰的树突细胞或其前体对治疗应用特别有利，所述遗传修饰的树突细胞或其前体经包含下述组合的核酸修饰：i)编码嵌合蛋白的序列，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成；和ii)编码至少一种免疫调节蛋白的序列。

核酸可以还包含至少一个mirna靶序列。

mirna是小型非编码rna，其在转录后水平上负调节特定靶基因的表达(33)。当mirna与靶信使rna(mrna)序列在3'非翻译区(3'utr)部分互补时，它们降低靶mrna稳定性并抑制翻译。或者，当mirna与其mrna靶标几乎完美互补时，它们切割mrna，触发其大规模破坏，致使蛋白质表达缺失。mirna在不同组织和细胞类型中具有不同的表达谱，其差异性地调节基因的转录概况和细胞功能，从而提供基因表达的细胞特异性和发育阶段特异性调节(34)。mirna在控制免疫系统内许多过程中其重要作用，包括细胞分化和体内平衡，细胞因子反应，与病原体的相互作用和耐受性诱导。dc发育、分化和功能通过mirna的特定表达谱调控。具体地，mir-155和mir-146a表达与人和小鼠中的dc成熟相关联(35-38)。因此，通过将2xmir-155和2xmir146a靶序列(mir155t.mir146at)插入lv盒(lv.iiag)的3'utr区，其中所述lv盒编码与所需ag选定部分融合的不变链(ii)，发明人实现了转基因表达的遏制，因此实现了在进入激活程序的lv-dc中进行的ag呈递。

本文所提供的方法设计成诱导对lv编码的ag的致耐受性反应(tolerogenicresponse)。lv介导的进入dc和其前体的基因转移的功效提供了一些临床上适用的机会，以利用dc的功能可塑性来为自身免疫和移植中的耐受性诱导设计特定的免疫疗法。

根据本发明的实施方式，lv-il-10工程改造的dc(dc^il-10)可以用于预防器官移植后的移植物排斥。

lv介导的dc中il-10基因转移(dc^il-10)具有克服基于treg的疗法的主要局限的可能性并且相较于其他mrcs更有效，因为它会产生这样的药物产品，所述药物产品能够：

-在效应t细胞中诱导同种异体特异性免疫无反应性；

-促进自我强化型外周调节，并以生理方式体内诱导同种异体特异性treg；

-在体内具有有限的生命周期(多至14天)，整体上限制对于针对感染和恶性肿瘤的免疫的长期影响；

-促进il-10的稳定过表达，确保生成富含il-10的具体微环境，其将调节t细胞、骨髓细胞和先天细胞，维持长期耐受性。

在本发明提供了用于通过调节性免疫细胞来诱导对抗原的耐受性或抑制对抗原的免疫反应的方法，其中免疫细胞通过新开发的致耐受性载体遗传修饰，优选编码ag衍生肽或抗原性肽(如表位)的lv，其允许表达ag衍生肽或抗原性肽和促致耐受性(pro-tolerogenic)分子。在一些实施方式中，将致耐受性细胞递送至个体，并且ag的呈递诱导对ag的耐受性和/或抑制对ag的免疫反应。在一些实施方式中，致耐受性细胞用于促进体外ag特异性treg，其适合于基于细胞的方法。

本发明提供了用于诱导个体中对ag耐受性的方法，所述方法包括用载体产生工程改造的免疫细胞，优选慢病毒载体(lv)，以提供ag衍生肽(表位)和促致耐受性分子的表达。发明人已经开发了几种基于lv的基因转移工具，其允许协同表达两种转基因(双向(bd)lv(39、40)，wo2004094642通过引用纳入)和/或靶向转基因表达到特定的细胞亚群，通过利用内源性mirna介导的转录后调节(mirna调节的lv(41、42)，wo2010125471通过引用纳入)。此外，发明人生成了这样的lv(pgk.ii-ag)，所述lv编码与ag融合的不变链(ii)并且受控于磷酸甘油酸激酶(pgk)遍在启动子(pgk.ii-ag)(43)，这确保了在i类mhc作为内源性ag的情况下稳定呈递编码的ag，同时也允许在ii类mhc作为外源性ag的情况下进行ag加工和呈递，导致cd4⁺和cd8⁺t细胞刺激。

本发明的优势在于：

-载体介导的dc前体或dc的转导允许稳定地表达编码的肽，其使所得dc在将ag呈递到t细胞中的作用更有效；

-纳入mirna靶序列允许编码的ag的转录后负调节，这能限制未成熟阶段的dc-ag.mirna的ag呈递，并防止炎性微环境中的ag呈递；

-载体介导的ido或il-10的稳定过表达确保ido或il-10富集的微环境中的ag呈递；

-人dc前体能用载体特别是lv稳定转导；

-可以使用具有多种特异性的工程改造的dc的群；

-可以将不同的工程改造的dc合并以使致耐受性活性最大化；

-dc-il-10/ag和dc-ag.mirna-t(或dc-ag.mirna，即包含mirna靶序列)促进ag特异性tr1细胞的体内分化；

-工程改造的dc是短期活细胞，允许多次dc注射；

-ii-ag构建体的高通用性生成，驱动特异性ag表达。

根据本发明，提供了t效应细胞的强抑制和/或t调节性细胞的强激活，如3种不同方法所示例。

根据本文所述lv的优选实施方式：

-启动子可以是遍在的(如pgk)

-当方法是dc-il-10/ag或dc-ido/ag时，载体可以是双向的。

根据优选的实施方式，基于本发明致耐受性dc的用途的临床方案将提供：

-经修饰的自体同源/同种异体dc将通过一至多个输注给予患者，以重建/诱导对特定抗原稳定的耐受性；

-通过使用编码抗原(根据已知的抗原文库)的不同片段和/或不同的促致耐受性分子的单种lv或者lv混合物的转导来修饰自体同源/同种异体dc，以重建/诱导覆盖多种特异性的致耐受性反应。

根据另一优选实施方式，dc-il-10/ag可以同时在体外使用，以生成t调节性1型细胞(tr1)，根据wo2007131575(通过引用纳入)中所述的方案，其对抗原具有特异性。这类抗原特异性tr1细胞可以根据wo2013192215(通过引用纳入)中所述方案体外纯化，然后与本发明经修饰的致耐受性dc的输注物组合输注到患者中，从而使对抗原的致耐受性反应最大化。

然后，本发明提供了经核酸构建体修饰的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，所述核酸构建体包含：

-核酸序列a)，其编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成，所述序列a)与第一启动子操作性地连接并且任选地与第一转录调节序列操作性地连接，和

-核酸序列b)，其编码至少一种免疫调节蛋白，所述序列b)任选地操作性地连接第二启动子并且任选地连接第二转录调节序列。

前体细胞是树突细胞的前体细胞并且也经遗传修饰。

然后，遗传修饰的树突细胞或其前体组成型表达至少一种抗原衍生肽(或抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段)和至少一种免疫调节分子。这类经修饰的细胞呈递细胞表面或胞内的至少一种分子或者产生和/或分泌至少一种分子。

修饰可以通过转导、转化或电穿孔引入。

第一启动子和第二启动子可以是相同的或不同的。

启动子包括下述家族的启动子：磷酸甘油酸酯激酶1(pgk)，巨细胞病毒(cmv)，脾脏病灶形成病毒(sspv)，人延伸因子1α(ef1α)，骨髓相关蛋白8(mrp8)，骨髓特异性启动子(msp)，cag启动子，所述cag启动子由与鸡β-肌动蛋白启动子连接的cmv立即早期增强子组成，合成的骨髓特异性启动(146gp61)，小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)，cd11b，蛋白质-酪氨酸激酶(c-fes)，细胞色素b-245β链(cybb)和受体酪氨酸激酶(tek)。

第一转录调节序列和第二转录调节序列可以是相同的或不同的。

抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段还指抗原性肽或抗原性蛋白变体。

核酸还可以包含编码免疫显性肽和其可变侧接区的序列，所述侧接区各自由5-10个氨基酸组成。

优选地，所述序列a)在其3'端还包含至少一个mirna靶序列。

优选地，所述核酸构建体还包含编码vpx的序列。

优选地，所述核酸构建体还包含编码标志物的序列。优选地，为选择性标志物，优选地，标志物为gfp、δngfr、δcd19。

优选地，人不变链是lip33、lip41、lip35或lip43。

优选地，所述抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段衍生自自体同源抗原和/或无害抗原和/或过敏原。

优选地，所述抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段选自表2中所述的免疫显性肽的组或其变体。变体是抗原性变体。

在优选的实施方式中，所述免疫调节蛋白选自下组：il-10，吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)，pdl-1，pdl-2，ilt-3，ilt-4，ho-1，icos-lgal9，hvme，hla-g，hla-e，il-35，tgf-b，ctla-4ig，pge2，tnfrs，arg1，优选il-10，吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)或其混合物。

在优选的实施方式中，至少一种mirna靶序列选自靶向下述靶标的组：mir-15a，mir-16-1，mir-17，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-l，mir-21，mir-29a，mir-29b，mir-29c，mir-30b，mir-31，mir-34a，mir-92a-l,mir-106a，mir-125a，mir-125b，mir-126，mir-142-3p，mir-146a，mir-150，mir-155，mir-181a，mir-223和mir-424，优选mir155、mir146a或其混合物，优选所述mirna靶序列是重复的。优选地，mir155靶序列重复两次，并且mir146a靶序列重复两次。

优选地，遗传修饰的树突细胞或其前体是展现出至少一种下述特性的细胞：调节cd4⁺和cd8⁺t细胞反应；调节体外和/或体内抗原特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞增殖；有利于生成调节性dc；有利于扩增抗原特异性tr1和/或foxp3⁺treg细胞，具有致耐受性，在i类和ii类mhc的情况下呈递抗原。

优选地，将所述核酸构建体插入载体，优选慢病毒载体，更优选单向或双向载体。

在优选实施方式中，根据本发明的遗传修饰的树突细胞或其前体用于医疗用途，优选用于预防和/或治疗选自下组的病症：移植物抗宿主病，器官排斥，自身免疫疾病，过敏性疾病，炎性或自身炎性疾病，基因疗法诱导的免疫反应。

优选地，自体免疫疾病选自下组：1型糖尿病，自身免疫性肠病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，多发性硬化，自身免疫性肌炎，牛皮癣，爱迪生氏病(addison’sdisease)，格雷夫斯氏病(grave’sdisease)，干燥综合征，桥本氏甲状腺炎，重症肌无力，血管炎，恶性贫血，乳糜泻，自身免疫性肝炎，斑秃(alopeciaareata)，寻常型天疱疮，白癜风，再生障碍性贫血，自身免疫性葡萄膜炎，斑秃(alopeciaareata)，肌萎缩性侧索硬化症(卢伽雷氏病(lougehrig's))，强直性脊柱炎，抗gbm肾炎，抗磷脂综合征，骨关节炎，自身免疫性活动性慢性肝炎，自身免疫性内耳疾病(aied)，巴洛病(balodisease)，白塞氏病(behcet'sdisease)，伯杰氏病(berger'sdisease)，大疱性类天疱疮，心肌病，慢性疲劳免疫功能障碍综合征，查格-施特劳斯综合征(churgstrausssyndrome)，瘢痕性类天疱疮，冷凝集素病，结肠炎颅动脉炎，crest综合征，克罗恩病，代戈氏病(dego'sdisease)，皮肌炎和jdm，德维克疾病(devicdisease)，湿疹，基本混合性冷球蛋白血症，嗜酸性筋膜炎，纤维肌痛–纤维肌炎，纤维化性牙槽炎，巨细胞动脉炎，肾小球肾炎，古德帕斯病(goodpasture'sdisease)，格林-巴利综合征，桥本氏甲状腺炎，肝炎，休斯综合征，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，川崎病，扁平苔藓，狼疮状肝炎，狼疮/sle，莱姆病，美尼尔氏病(meniere'sdisease)，混合性结缔组织病，肌炎：青少年肌炎(jm)，青少年皮肌炎(jdm)，和青少年多发性肌炎(jpm)，骨质疏松症，睫状体扁平部炎(parsplanitis)，寻常天疱疮，多腺自身免疫综合征，风湿性多肌痛，多发性肌炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，银屑病，雷诺氏综合征，瑞特氏综合征(reiter'ssyndrome)，风湿热，类风湿关节炎，巩膜炎，硬皮病，粘血综合征，斯蒂尔氏病(still'sdisease)，僵人综合征(stiffmansyndrome)，西登哈姆氏舞蹈病(sydenham'schorea)，高安氏动脉炎(takayasuarteritis)，颞动脉炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎，韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis)和威尔逊氏综合征，优选地，自身免疫疾病是血管炎，如难性抗磷脂抗体综合征(catastrophicanti-phospholipidsyndrome)(也称为亚瑟斯综合征(asherson’ssyndrome))，巨细胞动脉炎和抗anca血管炎或重症肌无力，难治性乳糜泻，自身免疫性葡萄膜炎，如白塞氏病，寻常型天疱疮，巨细胞心肌炎，格雷夫斯病，爱迪生氏病，肉芽肿性多血管炎(granulomatosiswithpolyangiitis)。

优选地，过敏性疾病是哮喘，特应性过敏症或特应性皮炎。

优选地，炎性或自身炎性疾病是慢性炎性疾病，优选慢性炎性疾病选自下组：炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻。

在优选实施方式中，本发明的遗传修饰的树突细胞或其前体用于预防针对蛋白质替代疗法的免疫反应，优选用于治疗溶酶体储存障碍或血友病。

本发明还提供了核酸构建体，其包含：

-核酸序列a)，其编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成，所述序列a)与第一启动子操作性地连接并且任选地与第一转录调节序列操作性地连接，和

-核酸序列b)，其编码至少一种免疫调节蛋白，所述序列b)任选地操作性地连接第二启动子并且任选地连接第二转录调节序列。

如上所示，第一启动子和第二启动子可以是相同的或不同的。

如上所示，第一转录调节序列和第二转录调节序列可以是相同的或不同的。

优选地，人不变链是lip33、lip41、lip35或lip43。

本发明还提供了包含如上所定义的核酸构建体的载体，优选所述载体是慢病毒载体，优选所述载体是单向或双向载体，优选所述载体使用表达vpx的包膜病毒颗粒产生，和/或所述载体使用包装细胞产生，其中所述包装细胞经遗传工程改造以减少cd47的表达。

优选地，载体是表达载体。

本发明还提供了产生如上所定义的遗传修饰的树突细胞或其载体的体外方法，其包括下述步骤：

a.由对象分离pbmc；

b.由所述分离的pbmc分离cd14⁺细胞；

c.用有效量的vpx孵育所述分离的cd14⁺细胞；

d.用本发明的载体转导所述分离的cd14⁺细胞。

优选地，步骤d在有效量的至少一种试剂存在的情况下进行，优选所述试剂是il-4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)或il-10，优选il-4的量、gm-csf的量或il-10的量为1-1000ng。

优选地，pbmc分离自外周血或白细胞去除术。

同样优选地，载体是慢病毒载体，优选所述慢病毒载体的量为1-100moi。

优选地，在培养的第0天添加有效量的vpx，并持续约1小时至8小时，优选约6小时至8小时。

本发明还提供了可以通过上述方法获得的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞。

本发明还提供了产生生成il-10的cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞的体外方法，其包括步骤：

a)由对象的血液样品分离pbmc；

b)将所述分离的pbmc在适宜的培养条件下暴露于有效量的如上所定义的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞。

优选地，pbmc:遗传修饰的树突细胞或其前体的比例为约5:1-10:1。

本发明还提供了通过如上所定义的方法可以获得的生成il-10的cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞，优选用于医疗用途。

优选地，所述生成il-10的cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞将以1x10⁴至20x10⁷之间不同的浓度范围输注，优选3x10⁵至20x10⁶个细胞。

本发明还提供了产生生成抗原特异性foxp3⁺t细胞的体外方法，其包括步骤：

a)由对象的血液样品分离pbmc；

b)将所述分离的pbmc在适宜的培养条件下暴露于有效量的如上所定义的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞。

优选地，遗传修饰的树突细胞或其前体细胞表达至少吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)。

本发明还提供了根据如上所定义的方法可以获得的抗原特异性foxp3⁺t细胞，优选用于医疗用途。

优选地，所述原特异性foxp3⁺t细胞以1x10⁴至20x10⁷之间不同的浓度范围输注，优选3x10⁵至20x10⁶个细胞。

本发明还提供了这样的药物组合物，所述药物组合物包含本发明遗传修饰的细胞或如上所定义的生成il-10的cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞或如上所定义的抗原特异性foxp3⁺t细胞或其任何组合和药物上可接受的运载体。

优选地，组合物还包含治疗剂。

所述治疗剂可以是本领域技术人员已知将治疗本发明的至少一种病症的任何试剂，诸如但不限于，免疫抑制剂，类固醇，雷帕霉素，霉酚酸酯，利妥昔单抗，甲氨蝶呤，氟达拉滨，抗炎性试剂，抗过敏试剂。

其他治疗剂包括但不限于：免疫抑制剂(例如，针对其他淋巴细胞表面标志物的体抗体(例如，cd40，α-4整合素)或者针对细胞因子的抗体)，其他融合蛋白(例如，ctla-4-igtnfr-ig)，tnf-a阻断剂，如依那西普(enbrel)，类克(remicade)，希敏佳(cimzia)和修美乐(humira)，环磷酰胺(ctx)(即revimmune^tm)，甲氨蝶呤(mtx)(即)，贝利单抗(belimumab)(即)，或其他免疫抑制药物(例如，环孢菌素a，fk506样化合物，雷帕霉素化合物或类固醇)，抗增殖剂，细胞毒性试剂或可能有助于免疫抑制的其他化合物。

在一些实施方式中，其他治疗剂通过不同的途径起抑制或减少t细胞激活和细胞因子产生的作用。在一个这类实施方式中，其他治疗剂是ctla-4融合蛋白，如ctla-4ig(阿巴西普(abatacept))。ctla-4ig与t细胞上的协同刺激受体cd28竞争结合抗原呈递细胞上的cd80/cd86(b7-1/b7-2)，并因此起抑制t细胞活性的作用。在一些实施方式中，其他治疗剂是ctla-4ig融合蛋白，称之为贝拉西普(belatacept)。

贝拉西普包含2个氨基酸取代(l104e和a29y)，它们在体内显著增加其与cd86的亲和力。在另一实施方式中，其他治疗剂是maxy-4。

在另一个实施方式中，第二疗法是诱导ido表达的第二试剂。诱导ido表达的第二疗法述于johnson,等,immunotherapy,1(4):645-661(2009)和美国专利号6,395,876和6,451,840中。在一实施方式中，诱导ido表达的第二疗法是加载有表达载体的纳米颗粒，所述表达载体编码id01或id02多肽。

在另一实施方式中，第二治疗剂优选治疗慢性转移排斥或gvhd，从而使治疗方案有效地靶向急性或慢性抑制排斥或gvhd。在另一个实施方式中，第二治疗剂是tnf-a阻断剂。

在另一实施方式中，第二治疗剂增加血清中腺苷的量，参见例如wo08/147482。在一些实施方式中，第二治疗剂是cd73-ig，重组cd73或增加cd73表达的另一试剂(例如，细胞因子或单克隆抗体或小分子)，参见例如wo04/084933。在另一实施方式中，第二治疗剂是干扰素β。

在一些实施方式中，将组合物与增加treg活性或产生的化合物联用或在其之后使用。

示例性treg增强试剂包括但不限于，糖皮质激素氟替卡松，沙美特罗(salmeteroal)，il-12的抗体，γενγ，和il-4；维生素d3，和地塞米松，和其组合。抗体或其促炎分子可以与公开的组合物组合或交替使用。例如，抗体可以结合il-6、il-23、il-22或il-21。

本文所用术语“雷帕霉素化合物”包括中性三环化合物雷帕霉素，雷帕霉素衍生物，雷帕霉素类似物，和其它大环内酯化合物，据信它们具有与雷帕霉素相同的作用机制(例如，抑制细胞因子功能)。语言“雷帕霉素化合物”包括与雷帕霉素具有结构相似性的化合物，例如，具有相似大环结构的化合物，其已经被修饰，以提高其治疗效力。本领域已知示例性的雷帕霉素化合物。

表述“fk506样化合物”包括fk506，和fk506衍生物和类似物，例如，与fk506具有结构相似性的化合物，例如，具有相似大环结构的化合物，其已经被修饰，以提高其治疗效力。本领域已知fk506样化合物的示例。优选地，本文所用表述“雷帕霉素化合物”不包括fk506样化合物。

其他合适的治疗剂包括但不限于，抗炎剂。抗炎剂可以是非甾族、甾族或其组合。一个实施方式提供了口服组合物，其包含约1％(w/w)至约5％(w/w)，特别是约2.5％(w/w)或抗炎剂。非甾族抗炎剂的代表性示例包括但不限于，昔康类(oxicam)，如吡罗昔康，异昔康，替诺昔康，舒多昔康；水杨酸盐，如阿司匹林，双水杨酸(disalcid)，贝诺酯(benorylate)，三水杨酸胆碱镁(trilisate)，萨法普林(safapryn)，索普林(solprin)，双氟尼柳(diflunisal)，和芬多沙尔(fendosal)；乙酸衍生物，如双氯芬酸，芬氯酸(fenclofenac)，吲哚美辛，舒林酸(sulindac)，托美汀(tolmetin)，伊索克酸(isoxepac)，呋喃芬酸(furofenac)，硫平酸(tiopinac)，齐多美辛(zidometacin)，阿西美辛(acematacin)，芬替酸(fentiazac)，佐美酸(zomepirac)，克林达那克(clindanac)，奥昔平酸(oxepinac)，联苯乙酸(felbinac)，和酮咯酸；芬尼特酸(fenamates)，如甲芬那酸(mefenamic)，甲氯芬那酸(meclofenamic)，氟芬那酸(flufenamic)，尼氟酸(niflumic)，和托芬那酸(tolfenamicacid)；丙酸衍生物，如布洛芬，萘普生，苯恶洛芬(benoxaprofen)，氟比洛芬，酮洛芬，非诺洛芬，芬布芬，吲哚洛芬，吡洛芬，卡洛芬，奥沙普嗪，普拉洛芬，咪洛芬(miroprofen)，硫恶洛芬(tioxaprofen)，舒洛芬，阿明洛芬，和噻洛芬(tiaprofenic)；吡唑，如苯基丁氮酮，羟基保泰松(oxyphenbutazone)，非普拉宗(feprazone)，阿扎丙酮(azapropazone)，和三甲保泰松(trimethazone)。还可以使用这些非甾族抗炎剂的混合物。

甾族抗炎剂的代表性示例包括但不限于：皮质类固醇，如氢化可的松，羟基去炎松，α-甲基地塞米松，磷酸地塞米松，二丙酸氯地米松，戊酸氯倍他索，地奈德(desonide)，去羟米松(desoxymethasone)，醋酸去氧皮质酮，地塞米松，二氯松，双乙酸二氟拉松，戊酸二氟可龙，氟氢缩松(fluadrenolone)，氟氯奈德(flucloroloneacetonide)，氟氢可的松，氟甲松新戊酸酯，肤轻松乙酸酯(fluosinoloneacetonide)，氟轻松醋酸酯(fluocinonide)，氟可丁(flucortinebutylesters)，氟可龙，醋酸氟泼尼定(氟甲叉龙)，氟氢缩松，哈西奈德(halcinonide)，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲基强的松龙，醋酸曲安奈德(triamcinoloneacetonide)，可的松，可托多松，氟轻松，氟氢可的松，双醋二氟松(difluorosonediacetate)，氟肾上腺酮(fluradrenolone)，氟氢可的松，双醋二氟松(diflurosonediacetate)，醋酸氟来曲龙(fluradrenoloneacetonide)，甲羟孕酮，安西非(amcinafel)，安西非特，倍他米松和其其余的酯，氯泼尼松，醋酸氯泼尼松(chlorprednisoneacetate)，氯可乐酮(clocortelone)，氯希尼酮(clescinolone)，二氯松，二氟泼尼酯(diflurprednate)，氟氯氰胺，氟尼缩松，氟米龙(fluoromethalone)，氟培龙(fluperolone)，氟泼尼龙，戊酸氢化可的松，氢化可的松环戊基丙酸酯，氢可松氨酯，甲泼尼松，帕拉米松(paramethasone)，泼尼松龙，强的松，二丙酸倍氯米松，曲安西龙。

本发明还提供了经核酸构建体修饰的遗传修饰的树突细胞或其前体，所述构建体包含编码il-10的核酸序列，所述序列操作性地连接启动子，并且任选地操作性地连接转录调节序列，和/或任选地操作性地连接标志物，优选选择性标志物。

本发明还提供了经核酸构建体修饰的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞，所述核酸构建体包含：

-核酸序列a)，其编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由与至少一种抗原性肽或蛋白质或其抗原性片段融合的人不变链组成，所述序列a)与第一启动子操作性地连接并且任选地与第一转录调节序列操作性地连接，和

-编码至少一种mirna靶序列的核酸序列，其任选地操作性地连接第二启动子并且任选地连接第二转录调节序列。

如上所示，第一启动子和第二启动子可以是相同的或不同的。

如上所示，第一转录调节序列和第二转录调节序列可以是相同的或不同的。

优选地，人不变链是lip33、lip41、lip35或lip43。

优选地，如上所定义的遗传修饰的树突细胞或其前体细胞用于器官和/或骨髓移植和/或用于预防和/或治疗移植物抗宿主病，或用于预防和/或治疗选自下组的疾病：自身免疫疾病，过敏性疾病，炎性疾病，基因疗法诱导的免疫反应。

仍然优选地，遗传修饰的细胞获自采用单一载体或载体的混合物(例如，慢病毒载体)的转导，所述载体编码抗原的不同片段(根据已知的抗原文库)。

在优选实施方式中，遗传修饰的树突细胞或其前体用于预防针对自身抗原的免疫反应，优选对于自身免疫和自身炎性疾病的治疗。

在优选实施方式中，遗传修饰的树突细胞用于预防针对同种异体抑制的免疫反应，优选对于器官移植的治疗。

本领域技术人员将意识到的是，对于编码蛋白质或多肽的核酸，可以在核酸中进行导致保守氨基酸取代的突变，以提供功能上等同的变体，或蛋白质或肽的同源物。在一些方面中，公开包括导致核酸保守氨基酸取代的序列改变。

通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。

图1.慢病毒载体设计。双向lv构建体，设计用于转导dc前体。clip＝ii类相关的不变链肽；li＝不变链；pgk＝磷酸甘油酸激酶。

图2.通过lv.iiova介导的基因转移进入骨髓衍生的dc来生成lv.dc。骨髓(bm)细胞在gm-csf存在的情况下分化成dc，并在第2天用指定的lv转导。作为对照，使用未转导的dc(unt)。在分化的第8天，通过facs分析cd11c、cd80和cd86的表达。指示阳性细胞的百分比。

图3.dc-il-10/ova展现出低刺激活性。骨髓(bm)细胞用gm-csf分化成dc，并在第2天用lv-iiova、lv-il-10/ova、lv-ido/ova转导。作为对照，生成未转导的dc(unt)。用指定的dc刺激efluor标记的otiicd4⁺t细胞，并在3天后通过染料稀释测量增殖。

图4.dc-il-10/ova促进抗原特异性低反应性。骨髓(bm)细胞用gm-csf分化成dc，并在第2天用lv-il-10/ova转导。作为对照，生成dc-ova。用lv-dc刺激otiicd4⁺t细胞7天。培养后，用dc-ova生成的细胞[t(dc-ova]和用dc-il-10/ova生成的细胞[t(dc-il-10/ova]经efluor标记并用dc-ova刺激，并且在4天后通过染料稀释测量增殖。

图5.mir155和mir146a的激活依赖性上调通过dc-ovamirna限制ova表达和呈递。骨髓(bm)细胞用gm-csf分化成dc，并在第2天用lv.ova.mirna或lv-iiova转导。dc保持未激活或用lps激活24小时。作为对照，使用经ova肽脉冲的dc和未转导的dc(dcunt)。用指定对的dc(经lps激活或未经lps激活)刺激efluor标记的otiicd4⁺t细胞。3天后，通过染料稀释测量增殖。

图6.lv-dc的给予促进ova特异性t细胞的扩增。通过注射骨髓细胞获得嵌合小鼠，所述骨髓细胞来自ot-ii/fir-tiger(5％)和cd45.1(95％)，其接受4个dc注射(dc-il-10/ova、dc-ido/ova、dc-ova.mirna)和dc-ova或dc-gfp作为对照(a)。最后一次dc注射后5周，处死小鼠，并通过facs确定脾脏中cd45.2otiifirtigercd4t细胞的百分比(b)。*p<0.05，曼-惠特尼u检验。

图7.通过dc-il-10/ova和dc-ovamirna诱导生成il-10的tr1细胞。通过注射骨髓细胞获得嵌合小鼠，所述骨髓细胞来自ot-ii/fir-tiger(5％)和cd45.1(95％)，其接受4个指定lv-dc注射。最后一次dc注射后5周，处死小鼠，并通过facs确定脾脏中cd49b⁺lag-3⁺tr1(a)、生成il10的tr1细胞(gfp⁺)(b)的百分比。*<0.05，曼-惠特尼u检验。

图8.通过lv-dc体内激活t细胞的低增殖反应性。通过注射骨髓细胞获得嵌合小鼠，所述骨髓细胞来自ot-ii/fir-tiger(5％)和cd45.1(95％)，其接受4个lv-dc注射。最后一次lv-dc注射后5周，处死小鼠，并用efluor670对纯化自脾脏的cd4⁺t细胞染色，并用dc-ova再刺激(t:dc比为10:1)。4天后，通过染料稀释测量增殖。数据以刺激指数报告[(分裂的t细胞dc-ova％)/(分裂的t细胞未处理的dc％)]。**<0.005，*<0.05，曼-惠特尼u检验。

图9.生成允许ova特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞增殖的lv构建体。骨髓细胞(bm)细胞用gm-csf分化成dc，并在第2天用编码iiova315-363和iiova242-363的lv转导，所述iiova315-363包含被otiicd4⁺t细胞识别的表位，并且iiova242-363包含被otiicd4⁺和oticd8⁺t细胞识别的表位(a)。dc^gfp和未转导的dc(dc^ut)为对照。用指定dc刺激efluor标记的otiicd4⁺或oticd8⁺t细胞。3天后，通过染料稀释测量增殖(b)。

图10.dc-il-10/insb促进分离自糖尿病nod小鼠的cd4⁺t细胞中的低反应性。分离自nod小鼠的骨髓(bm)在gm-csf存在的情况下分化成dc，并在第2天用lv-iiinsb4-29、lv-iiinsb4-29-mirna、lv-il-10/insb4-29和lv-ido/insb4-29转导。作为对照，生成dc-ova。用指定的lv-dc刺激分离自糖尿病nod小鼠的efour标记的脾脏cd4⁺t细胞。共培养3天后，通过染料稀释测量增殖。指示扩增细胞的％。

图11.lv-dc的体内定位和生命周期。分离自balb/c小鼠的骨髓(bm)在gm-csf存在的情况下分化成dc，并在第2天用编码荧光素酶的lv转导。用lv-dc(5x10⁶)静脉内和腹腔内注射balb/c受体小鼠。在指定时间点通过生物发光成像(bli)监测生物分布和lv-dc存活。

图12.自体同源lv-dc细胞疗法保护nod小鼠免于t1d发作。分离自nod小鼠的骨髓(bm)在gm-csf存在的情况下分化成dc，并在第2天用lv-iiova、lv-iiinsb4-29、lv-iiinsb4-29-mirna、lv-il-10/insb4-29和lv-ido/insb4-29转导，以生成dc-ova、dc-insb、dc-insb.mirna、dc-il-10/insb、dc-ido/insb。10周龄nod雌性小鼠每周3次接受静脉内注射dc-ova(n＝3)、dc-insb(n＝10)、dc-insb.mirna(n＝6)、dc-il-10/insb(n＝9)、dc-ido/insb(n＝11)，并且每周三次监测血糖水平，以评估t1d发展。**p<0.005，对数秩(mantel-cox)检验。

图13.用双向lv开发有效转导人dc的方案。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝8)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天、第2天和第5天用lv-δngfr/gfp(lv-dcvpx)转导。作为对照，用lv-δnfgr/gfp转导的dc(lv-dc)分化自同一供体。a.lv介导的单核细胞衍生的dc的转导的方案。b.基于分化的dc上的δngfr表达对转导效率进行定量。

图14.使用vpx的预处理和lv介导的转导不激活人lv-dc。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝6)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天、第2天和第5天用lv-δngfr/gfp(lv-dcvpx)转导。作为对照，用lv-δnfgr/gfp转导的dc(lv-dc)分化自同一供体。通过cd86的表达监测lv-dc的激活。在vpx不存在的情况下(白色标志)或在vpx存在的情况下(黑色标志)转导lv-dc。

图15.dc^il-10与dc-10具有表型相似性。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝11)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。作为对照，使用gm-scf/il-4和il-10存在的情况下分化自同一供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)。a.基于分化的dc上的δngfr表达对转导效率进行定量。b.通过facs评估指定的表面标志物的表达。*p<0.05，**<0.01，威尔科克森符号秩(wilcoxonsignedran)检验。

图16.在il-12不存在的情况下，dc^il-10分泌高水平的il-10。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝5)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。作为对照，使用gm-scf/il-4和il-10存在的情况下分化自同一供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)。所得细胞保持未激活或用lps/ifng激活48小时。通过elisa测量培养上清液中il-10(a)和il-12(b)的水平(n＝5)。*p<0.05，**<0.01，威尔科克森符号秩检验。

图17.dc^il-10诱导同种异体cd3⁺t细胞中低增殖反应。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝11)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。作为对照，使用gm-scf/il-4和il-10存在的情况下分化自同一供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)。同种异体cd3⁺t细胞经eflour标记，并用指定的dc刺激5天。基于增殖染料稀释计算增殖的细胞的百分比。显示了总cd3⁺(a)、cd3⁺cd4⁺(b)和cd3⁺cd8⁺t(c)细胞的增殖。*p<0.05，**<0.01，威尔科克森符号秩检验。

图18.dc^il-10促进同种异体特异性无变应性cd4⁺t细胞，用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝7)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。作为对照，gm-scf/il-4和il-10存在的情况下分化自同一供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)为对照。用指定的dc刺激同种异体cd4⁺t细胞10天。10天后，t细胞经eflour标记并用成熟的dc(mdc)再刺激，所述mdc与用于初免的dc同源。基于增殖染料稀释计算增殖的细胞的百分比(n＝7)。**<0.005，*<0.05，曼-惠特尼检验。

图19.dc^il-10促进同种异体特异性的、生成il-10的tr1细胞。用vpx-vlp预处理分离自健康对象(n＝7)外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。作为对照，使用gm-csf/il-4和il-存在的情况下分化自同一供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)。用指定的dc刺激同种异体cd3⁺t细胞10天。a.10天后，通过facs染色评估tr1细胞(cd49b⁺lag-3⁺)的百分比(n＝7)。b.10天后，用成熟的dc(mdc)再刺激细胞，所述mdc与用于初免的dc同源，并在48小时后通过elisa评估il-10的水平(n＝7)。**<0.005，*<0.05，曼-惠特尼检验。

图20.过继转移dc^il-10延缓移植物抗宿主病。balb/c骨髓(bm)细胞用gm-csf分化成dc，并在第2天用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。balb/c小鼠经致死辐射，并静脉内注射c57bl/6bm细胞(10⁷)和脾细胞(5x10⁶)。在第2天，向小鼠过继转移dc^gfp或dc^il-10(2x10⁶)，监测小鼠的体重减轻(a)和存活(b)。

图21.用编码给定抗原的双向lv高效转导人dc的方案。在无血清培养基中培养分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞并用vpx-vlp(2ul/孔)预处理6-8小时，然后在人dc分化期间的第0天用lv转导，以获得人(h)lv-dc。在第1天替换一半培养基(lv稀释)。在il-4(100ng/ml)和gm-csf(100ng/ml)存在的情况下分化dc。

图22.dc-sign表达可以用于监测体外lv-dc分化。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后用lv-δngfr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)或lv-ido/ag(dc-ido/ag)转导。作为对照，用编码人clip的lv转导的dc(dc-clip)平行地进行分化。通过dc-sign和cd14的表达监测dc分化。

图23.dc-il-10/ag的转导效率。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)。a.基于δngfr表达对dc-ag转导效率进行定量。b.为了监测dc-il-10/ag的转导效率，将dc保持未刺激或用lps(200ng/ml)和ifn-g(50ng/ml)刺激24小时。6小时时，将布雷菲德菌素(brefeldin)添加到细胞，通过胞质内染色对il-10的表达进行定量。指示阳性细胞的百分比。

图24.dc-ido/ag的转导效率。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-dnfgr/ag、lv-ido/ag(dc-ido/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)。a.基于δngfr表达对dc-ag转导效率进行定量。b.基于包制备ido表达对dc-ido/ag转导效率进行定量。指示阳性细胞的百分比。

图25.dc-il-10/ag表达的dc-10相关标志物。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)的未转导的dc(dc^ut)。通过facs评估指定的表面标志物cd14、cd163+cd141+、ilt4和hla-g的表达。

图26.dc-il-10/ag在激活同时或之后分泌高水平的il-10。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)和未转导的dc(dc^ut)。所得细胞保持未激活或用lps/ifnγ(200ng/ml的lps和50ng/ml的ifn-g)激活48小时。通过elisa测量培养上清液中的il-10水平。***p<0.0001，****<0.0001，曼惠特尼检验。

图27.dc-il-10/ag在激活后分泌低水平的il-12。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δnfgr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)和未转导的dc(dc^ut)。所得细胞用lps/ifnγ(200ng/ml的lps和50ng/ml的ifn-γ)激活48小时。通过elisa测量培养上清液中的il-12水平。*p<0.05，曼惠特尼检验。

图28.dc-il-10/ag诱导自体同源cd3⁺t细胞中低增殖反应。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δnfgr/agnfgr/ag(dc-ag)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)。hla-dq8供体用lv-dc刺激，所述lv-dc编码胰岛素b肽(insb)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/insb转导的细胞(dc-insb)或用lv-il-10/insb转导的细胞(dc-il-10/insb)，hla-dq2.5供体用lv转导，所述lv编码醇溶蛋白肽(glia)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/glia转导的细胞(dc-glia)或用lv-il-10/glia转导的细胞(dc-il-10/glia)。自体同源cd3⁺t细胞经eflour标记，并用指定的dc以10:1的比例刺激6天。基于增殖染料稀释计算增殖的细胞的百分比。*p<0.05，威尔科克森符号秩检验。

图29.dc-il-10/ag促进ag特异性tr1细胞。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δnfgr/agnfgr/ag(dc-ag)(a)、lv-il-10/ag(dc-il-10/ag)(b)转导。hla-dq8供体用lv-dc刺激，所述lv-dc编码胰岛素b肽(insb)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/insb转导的细胞(dc-insb)或用lv-il-10/insb转导的细胞(dc-il-10/insb)，hla-dq2.5供体用lv转导，所述lv编码醇溶蛋白肽(glia)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/glia转导的细胞(dc-glia)或用lv-il-10/glia转导的细胞(dc-il-10/glia)。自体同源cd3⁺t细胞经eflour标记，并用指定的dc刺激。10天后，通过facs染色评估具有增殖的细胞的tr1细胞(cd49b⁺lag-3⁺)。阳性细胞％表示为4个测试的供体中的一个。

图30.dc-ido/ag诱导自体同源cd3⁺t细胞中的ag特异性增殖。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δnfgr/ag(dc-ag)、lv-ido/ag(dc-ido/ag)转导。作为对照，使用分化自同一供体的lv-clip转导的dc(dc^clip)。hla-dq8供体用lv-dc刺激，所述lv-dc编码胰岛素b肽(insb)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/insb转导的细胞(dc-insb)或用lv-il-10/insb转导的细胞(dc-il-10/insb)，hla-dq2.5供体用lv转导，所述lv编码醇溶蛋白肽(glia)，并且具体地，生成用lv-δnfgr/glia转导的细胞(dc-glia)或用lv-il-10/glia转导的细胞(dc-il-10/glia)。自体同源cd3⁺t细胞经eflour标记，并用指定的dc以10:1的比例刺激6天。显示了基于增殖染料稀释计算增殖的细胞的百分比。

图31.dc-ido/ag促进foxp3⁺t细胞。用vpx-vlp处理分离自hla-dq2.5或hla-dq8型健康对象外周血的cd14⁺细胞6-8小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δnfgr/ag(dc-ag)、lv-ido/ag(dc-ido/ag)转导。hla-dq8供体用lv-dc刺激，所述lv-dc编码胰岛素b肽(insb)，并且具体地，生成用lv-ido/insb转导的细胞(dc-ido/insb)，hla-dq2.5供体用lv转导，所述lv编码醇溶蛋白肽(glia)，并且具体地，生成用lv-ido/glia转导的细胞(dc-ido/glia)。自体同源cd3⁺t细胞经eflour标记，并用指定的dc刺激。10天后，通过facs染色评估treg细胞(foxp3+ctla-4+)。

图32.dc^il-10体外促进同种异体特异性tr1细胞。用vpx-vlp在第0天预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞，并在dc分化期间用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。平行地，生成未转导的dc(dc^ut)。在第7天，dc用于刺激同种异体cd4⁺t细胞，其分离自外周血并以10:1的比例培养。10天后，使用cd4miltenyi微珠纯化用dc^ut[t(dc^ut)]、dc^gfp[t(dc^gfp)]或dc^il-10[t(dc^il-10)]培养的t细胞，并且用增殖染料染色，然后用经lps成熟化的cd(分化自与初次刺激所用的dc相同的供体)再刺激。3天后，通过流式细胞术评估增殖。培养终点时增殖的细胞的百分比通过总体增殖染料稀释计算。各点代表单一供体，数据以平均值±std显示。*p≤0.05(威尔科克森匹配对检验，双尾)。

图33.dc^il-10体外促进同种异体特异性tr1细胞。用vpx-vlp在第0天预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞，并在dc分化期间用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。平行地，生成未转导的dc(dc^ut)。在第7天，dc用于刺激同种异体cd4⁺t细胞，其分离自外周血并以10:1的比例培养。10天后，使用cd4miltenyi微珠纯化用dc^ut[t(dc^ut)]、dc^gfp[t(dc^gfp)]或dc^il-10[t(dc^il-10)]培养的t细胞，并评估抑制活性。与初次刺激中使用的cd4⁺细胞自体同源的cd4⁺t细胞经增殖染料染色，然后用mdc(分化自初次刺激中所用同一供体)刺激，在以1:1比例的t(dc^il-10)细胞存在或不存在的情况下。培养终点时增殖的细胞的百分比(左)通过总体增殖染料稀释计算。各点代表单一供体，数据以平均值±std显示(a)。显示了一个代表性供体(b)。

图34.dc^il-10预防人源化小鼠(humice)中同种异体特异性t细胞再活化。nsg小鼠移植有2-4x10⁵cd34⁺。通过静脉内注射用经辐照的同种异体apc对重建的人源化小鼠进行免疫。在第7天，仅用自体同源未转导的dc(dc^ut)或用dc^il-10(dc^ut+dc^il10)或dc^gfp(dc^ut+dc^gfp)增强免疫的人源化小鼠；显示了pbcd4⁺细胞增殖的动力学。

图35.dc^il-10是表型稳定的细胞。用vpx-vlp在第0天预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞，并在dc分化期间用lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。在第7天，用lps、热杀伤的李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、鞭毛蛋白鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、polii:c、odn2006(cpg)或细胞因子的混合物(il-1b、tnf-a和il-6)激活dc^il-10。24小时后，通过facs评估指定的表面标志物cd1a(a)、cd141(b)和cd83(c)的表达。各点代表单一供体，数据以平均值±std显示。*p≤0.05(威尔科克森匹配对检验，双尾)。

图36.dc^il-10的激活调节ilt4表达。用vpx-vlp在第0天预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞，并在dc分化期间用lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。在第7天，用lps、热杀伤的李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、鞭毛蛋白鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、polii:c、odn2006(cpg)或细胞因子的混合物(il-1b、tnf-a和il-6)激活dc^il-10。24小时后，通过facs评估指定的表面标志物hla-g(a)和ilt4(b)的表达。各点代表单一供体，数据以平均值±std显示。*p≤0.05(威尔科克森匹配对检验，双尾)。

图37.dc^il-10是功能稳定的细胞。用vpx-vlp在第0天预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞，并在dc分化期间用lv-δngfr/gfp(dc^gfp)或lv-δngfr/il-10(dc^il-10)转导。在第5天，分别用lps和lps或polii:c刺激dc^il-10和dc^gfp。在第7天，dc用于刺激同种异体cd4⁺t细胞，其分离自外周血并以10:1的比例培养。10天后，使用cd4miltenyi微珠纯化用mdc^gfp[t(mdc^gfp)]、dc^il-10[t(dc^il-10)]或经刺激的dc^il-10[t(stimdc^il-10)]培养的t细胞。a.tr1细胞的频率。用cd3、cd4、cd45ra、cd49b和lag-3对初免t细胞(primedtcell)进行染色，以通过流式细胞评估tr1细胞的百分比。b.t细胞增殖。用增殖染料对初免t细胞进行染色，然后用经lps成熟化的dc(分化自与用于初次刺激的dc相同的供体)再刺激。3天后，通过流式细胞术评估增殖。通过峰分析计算出前体群中增殖的细胞百分比(右)，而培养结束时增殖的细胞百分比(左)通过总体增殖染料稀释来计算。c.细胞因子产生概况。通过elisa评估细胞培养上清液中的il-10产生。d.抑制活性。用经lps成熟化的dc(分化自与用于初次刺激的dc相同的供体)刺激与初次刺激中使用的cd4⁺细胞自体同源的cd4⁺t细胞，在以1:1比例的t(dc^il-10)或t(stimdc^il-10)细胞存在或不存在的情况下。培养终点时增殖的细胞的百分比(左)通过总体增殖染料稀释计算。各点代表单一供体，数据以平均值±std显示。白色圆形符号表示用lps激活的dc^il-10生成的细胞，红色圆形符号表示用经polii:c处理的dc^il-10刺激的细胞。

图38.用双向lv高效转导人dc的vpx时程分析。用5μlvpx-vlp预处理分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞1-6小时，然后在dc分化期间的第0天用lv-δngfr/gfp转导。基于分化的dc上的δngfr表达对转导效率进行定量。

图39.通过无人cd47的lv颗粒增加转基因表达。在dc分化期间的第0天，用lv.pgk.gfp转导分离自健康对象外周血的cd14⁺细胞。使用过表达人cd47(高cd47lv)或敲除cd47(无cd47lv)的包装细胞系生成lv.pgk.gfp。作为对照，使用经典lv。相较于高hucd47(hucd47-高)lv颗粒或携带正常hucd47水平的wtlv颗粒，无人cd47lv颗粒能增加转导效率，表达为gfp+细胞％，通过％gfp293t标准化。

发明具体实施方式

除非另外指出，否则本发明的实施将采用本领域不同技术人员能力范围内细胞生物学、分子生物学、组织学、免疫学、肿瘤学的常规技术。这些技术在文献中已有描述。

免疫调节分子

免疫调节分子是调节免疫反应的物质(蛋白质或小分子)。

免疫反应是通过免疫系统的细胞所介导的针对抗原反应的过程。免疫反应可以包括对病原微生物及其产物的免疫，或对自体抗原的自身免疫，针对引起过敏症的抗原的过敏症，和针对同种异体抗原的移植物排斥。在该过程中，所涉及的主要细胞是t细胞和b细胞，以及抗原呈递细胞，包括巨噬细胞和树突细胞。免疫反应可以通过t细胞的增殖和细胞因子如il-2、il-4、il-10和ifng的分泌来测量。

免疫调节分子包括，受体，诸如pdl-1，pdl-2，ilt-3，ilt-4，ho-1，icos-lgal9，hvme，hla-g，hla-e；可溶性介质，诸如il-10，il-35，tgf-a，ctla-4ig，pge2，tnfrs；酶，诸如ido,arg1；药物，诸如雷帕霉素，地塞米松，维生素d3，皮质类固醇。优选的免疫调节分子是il-10和/或ido。

本文所用术语"增强"可以指改善、助推、增高或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的动作。例如，增强免疫反应可以指将导致改善、助推、增高或以其他方式增加免疫反应的任何动作。在其它实例中，增强核酸的表达可以包括但不限于：增加核酸的转录，增加mrna丰度(例如，增加mrna转录)，减少mrna降解，增加mrna翻译等。在其它实例中，增强蛋白质的表达可以包括但不限于：增加编码蛋白质的核酸的转录，增加编码蛋白质的mrna的稳定性，增加蛋白质的翻译，增加蛋白质的稳定性等。

微小rna(mirna)是小型非编码rna，其通过转录后沉默来调节细胞基因表达。当mirna与靶mrna序列部分互补时，它们通常降低靶mrna稳定性并抑制翻译。相反，当mirna与其mrna靶标几乎完全互补时，它们切割mrna，触发其大规模破坏。mirna可以在转录后水平上实现全身递送和泛素表达的转基因的组织特异性调控。mirna在不同的组织和细胞类型中具有不同的表达谱，其差异性地调节细胞基因的转录概况和细胞功能，包括apc和免疫激活。因此，本文提供的方法采用免疫相关mirna(例如，apc特异性mirna)来沉默免疫细胞(例如，apc)中的转基因表达。

mir或mirna靶序列或“种子序列(seedsequence)”对于mirna与mrna的结合是必需的。靶序列或种子序列是保守的七重质(heptametrical)序列，其主要位于mirna5'端的位置2-7处。即使mirna和其靶mrna的碱基配对不是完美匹配，“种子序列”必须是完全互补的。

mirna靶序列是调控mrna表达以及其后蛋白质表达的序列。

mir-15a，mir-16-1，mir-17，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-l，mir-21，mir-29a，mir-29b，mir-29c，mir-30b，mir-31，mir-34a，mir-92a-l，mir-106a，mir-125a，mir-125b，mir-126，mir-142-3p，mir-146a，mir-150，mir-155，mir-181a，mir-223和mir-424。更优选地，mir155，mir146a，各自重复2次。

"受体抗原"指接受者表达的抗原。本文所用"效应细胞"指介导针对抗原的免疫反应的细胞。效应细胞的示例包括但不限于t细胞和b细胞。

本文所用术语"免疫反应"包括t细胞介导的和/或b细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括t细胞反应，例如，细胞因子产生和细胞毒性，和b细胞反应，例如，抗体生产。此外，术语免疫反应包括受t细胞激活(例如，抗体产生(体液反应))和激活细胞因子反应细胞(例如，巨噬细胞)间接影响的免疫反应。免疫反应中涉及的免疫细胞包括：淋巴细胞，诸如b细胞和t细胞(cd4+、cd8+、th1和th2细胞)：抗原呈递细胞(例如，专职性抗原呈递细胞，诸如树突细胞、巨噬细胞、b淋巴细胞，朗格汉斯细胞，和非专职性抗原呈递细胞，诸如角质化细胞，内皮细胞，星形胶质细胞，成纤维细胞，少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，诸如巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和粒细胞。

抗原是导致免疫系统产生反应的物质，例如，通过生成识别源自蛋白质物质的肽的t细胞，和产生针对该物质的抗体的b细胞。抗原可具有一个或多个表位。

抗原衍生肽或抗原性肽或蛋白质是衍生自在i类mhc或ii类mhc分子与t细胞的竞争中加工和呈递的抗原的肽或蛋白质。其通常由9-12个氨基酸组成。它含有至少一种免疫显性肽或表位。抗原衍生肽片段或抗原性肽或抗原性蛋白片段是比抗原行肽或蛋白质短的片段，并且具有肽或蛋白质的抗原性。

本文所用术语免疫显性肽(或"表位")是可以引起免疫反应的抗原的部分，包括b和/或t细胞反应。抗原可具有一个或多个免疫显性肽。大多数抗原具有许多表位，即它们是多价的。在一些实施例中，表位的大小约为10个氨基酸。优选地，免疫显性肽或表位为约4-18个氨基酸，更优选约5-16个氨基酸，甚至更优选6-14氨基酸，更优选约7-12个氨基酸，最优选约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解的是，在一些情况下，分子的三维结构而非特定的线性序列是抗原性特异性的主要标准，并因此将一个免疫显性肽或表位与另一个区分。

在本发明中，为了能够正确处理和呈递免疫显性肽，构建体将包含编码免疫显性肽的核苷酸序列和可变侧接区，各侧接区由5-10个氨基酸组成。例如，对于糖尿病，免疫显性肽是胰岛素b9-23，而构建体包括编码胰岛素b4-29的核苷酸序列。

在本发明中，抗原性肽或其抗原性片段来自与异常生理反应相关联的多肽。这类异常生理反应包括但不限于：自身免疫疾病、过敏反应和本发明的其它疾病。

修饰的抗原衍生肽或抗原性肽

在本发明中，抗原衍生肽(或抗原性肽)或免疫显性肽或表位可以经修饰，例如，以增强t细胞识别。这类修饰包括但不限于：瓜氨酸化、脱酰胺化、甲基化、氨甲酰化、糖基化酰化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、羟基化。

例如，有利地是，将针对类风湿性关节炎的抗原衍生肽或免疫显性肽或表位修饰为瓜氨酸化肽或糖基化。有利地是，将针对乳糜泻(醇溶蛋白)的抗原衍生肽或免疫显性肽或表位修饰为脱酰胺化的肽。

本文所用的术语"抗原"或"ag"定义为引起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体产生，或者激活特定免疫活性感受态细胞，或两者。本领域技术人员将理解的是，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以是抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组dna。本领域技术人员将理解的是，本文使用任何dna，所述dna包括编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，并因此编码如本文所用术语"抗原"。此外，本领域技术人员将理解的是，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于，使用超过一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，本领域技术人员将理解的是，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，可以合成抗原，或者可以由生物样品中衍生抗原。这类生物样品可以包括但不限于：组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。"抗原呈递细胞"(apc)是能够激活t细胞的细胞，并且包括但不限于：单核细胞/巨噬细胞、b细胞和树突细胞(dc)。

不变链(invariantchain)

不变链(li；cd74)具有多种功能，但是最佳表征为主要ii类mhc(mhcii)伴侣。它是由短胞质尾、跨膜区和管腔结构域组成的ii型蛋白，所述管腔结构域可被进一步分成膜-近端无序区，主要mhcii相互作用序列(clip)和c-末端三聚化结构域(44、45)(小鼠表达两种li同种型p31和p41，后者由可选拼接产生(46)。在人中，对应的同种型称为p33和p41。另外，大约20％的iimrna翻译自产生p35和p43同种型的上游起始密码子。它们具有16-氨基酸细胞质延伸，其包括强二-精氨酸(rxr)er保留基序(retentionmotif)(47-49)。

联合mhcii来看，合成的ii可以视为：(i)控制触及mhcii槽的守卫(guardian)；(ii)协助α和βmhcii链折叠和配对的支架(scaffold)；和(iii)引导mhcii到内体路径的前导(leader)。已经充分形成的认识是，这些ii功能主要取决于其clip区占据mhcii肽槽的能力。许多报告显示，核内体中的ii蛋白分解允许hla-dm脱离clip槽并催化名义上的抗原性肽的结合(综述(50))。

mhcii分子的不变链(li，不变链，mhciiγ链)是文献中最常描述的能够介导靶向的序列。描述了人中不变链的各种变体，并且也称为iip33、iip41、iip35和iip43(51)，它们适合作为靶向模块。适合作为本发明目的的靶向模块的其它序列是mhcii分子的β链(52)。所述序列的片段也适合作为靶向模块。

不变链是人类中由cd74基因编码的蛋白质。其是涉及ii类mhc蛋白质形成和运输的多肽。er中的新生ii类mhc蛋白质结合不变链的片段(clip)，从而使肽结合槽成形并防止形成封闭构象。不变链促进ii类mhc从er的囊泡核内体中释放，所述胞质核内体包含内吞的抗原蛋白(来自外源性途径)。

此处，术语不变链包括所有天然存在的或人工产生的全长或片段化的同源基因以及与人不变链具有一定相似性的蛋白质。

vpx

骨髓细胞，诸如树突细胞和巨噬细胞，对于载体转导，特别是慢病毒载体转导是反应不佳(refractory)的，这归因于骨髓特异性限制因子samhd1。sivmac/hiv-2和相关病毒通过编码vpx来减轻samhd1介导的限制，所述vpx是在感染后诱导samhd1降解的病毒粒包装的辅助蛋白。hiv-1不编码vpx，从而不能包装蛋白质。

适当地，vpx包装基序可以包装在慢病毒载体病毒粒中，例如，可以置于gag/pol表达载体的p6区中，所述gag/pol表达载体用于生成慢病毒载体病毒粒，所述慢病毒载体病毒载体进而包装高拷贝数的vpx。或者，通过预处理含有vpx的病毒样颗粒(vlp)，可以将vpx提供给dc或其前体细胞。

标志物

在本发明中，标志物优选选择性标志物，诸如本文所述的δngfr，其编码序列包括在核酸构建体中，以便能够选择转导的细胞。替代方案可以是cd19的截短形式，其中cd19胞质结构域的缺失消除了信号转导途径[93]。

双顺反子构建体

双顺反子载体或构建体是这样的构建体，其中使用多个启动子或包括内部核糖体进入位点(ires)元件来表达两个因子。ires元件是允许在信使rna(mrna)序列中间开始翻译的核苷酸序列。

载体

除了上文针对载体所述的主要元素外，载体还包括常规控制元件，所述常规控制元件以允许其细胞中转录、翻译和/或表达的方式与核酸序列操作性地连接，所述细胞经质粒载体转染或经本公开产生的病毒感染。如本文所用，"操作性地连接的"序列包括与感兴趣的基因连续的表达控制序列以及以反式作用或位于感兴趣的基因一定距离的表达控制序列。

表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效rna处理信号，如剪接和聚腺苷酸化(多聚a)信号；稳定胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(例如，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码的产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子在本领域中是已知的，并且可以利用。本文所用的核酸序列(例如，编码序列)和调控序列，当以使核酸序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制之下的方式共价连接时，被称为"操作性地"连接。如果需要将核酸序列翻译成功能性蛋白质，则在以下情况中称2个dna操作性地连接：5'调控序列中启动子的诱导导致转录编码序列，并且2个dna序列之间连接的性质不(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力或(3)干扰对应rna转录本翻译成蛋白质的能力。因此，如果启动子区域能够实现转录所述dna序列，那么启动子区域将操作性地连接核酸序列，使得所得到的转录物可以被翻译成所需的蛋白质或多肽。类似地，当两个或更多个编码区以这样的方式连接时，它们是操作性地连接的，其它们从共同启动子的转录导致表达已经在框内翻译的两个或更多个蛋白质。在一些实施方式中，操作性地连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方式中，操作性地连接的编码序列产生功能性rna(例如，shrna、mirna、mirna抑制剂)。

对于编码蛋白质的核酸，聚腺苷酸化序列通常在核酸序列之后插入。

可以使用的另一载体元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于由单个基因转录本中产生超过一种多肽。ires序列将用于产生包含超过一种多肽链的蛋白质。选择这些和其它常见载体元件是常规的，并且存在多种这类序列。

宿主细胞中基因表达所需的调控序列的精确性质在物种、组织或细胞类型之间可能发生变化，但通常应包括分别涉及开始转录和翻译的5'非转录和5'非翻译序列(必要时)，如tata盒，加帽序列，caat序列，增强子元件等。特别地，这类5'非转录调节序列将包括启动子区域，所述启动子区域包括用于转录控制操作性地连接的基因的启动子序列。根据需要，调节序列还可以包括增强序列或上游活化剂序列。任选地，本公开的载体可以括5'前导或信号序列。适当载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和决定范围内。

组成型启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)，巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)[参见，例如boshart等,cell,41:521-530(1985)]，sv40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1启动子[英杰公司(invitrogen)]。

诱导型启动子允许调控基因表达并且可以通过外源供应的化合物、环境因素(如温度)或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅复制细胞)的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可以获自各种商业来源，包括但不限于：英杰公司、克隆泰克公司(clontech)和阿瑞雅德公司(ariad)。已经描述了许多其它系统，并且本领域技术人员可以容易地选择许多其它系统。外源供应的启动子调节的诱导型启动子的实例包括：锌诱导型羊金属硫蛋白(mt)启动子，地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子，t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(no等,proc.natl.acad.sci.usa,93:3346-3351(1996))，四环素可抑制系统(gossen鞥,proc.natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992))四环素诱导型系统(gossen等,science,268:1766-1769(1995)，还参见harvey等,curr.opin.chem.biol.,2:512-518(1998))，ru486诱导型系统(wang等,nat.biotech.,15:239-243(1997)和wang等,genether.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(magari等,j.clin.invest.,100:2865-2872(1997))。能够在此上下文中使用的其它类型的诱导型启动子是由特定生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅复制细胞)调节的那些诱导型启动子。

在另一实施方式中，将使用核酸序列的天然启动子。当希望核酸的表达应模仿天然表达时，可以使用天然启动子。当核酸的表达必须在时间上或发育上调节，或以组织特异性的方式调节，或响应特定转录刺激调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施方式中，其它天然表达控制元素，如增强子元素，聚腺苷酸化位点或kozak共有序列也可用于模拟天然表达。

在一些实施方式中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。这类组织特异性调节序列(例如，启动子，增强子等)是本领域公知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于下述组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子，胰岛素启动子，胰高血糖素启动子，生长激素抑制素启动子，胰腺多肽(ppy)启动子，突触蛋白-1(syn)启动子，肌酸激酶(mck)启动子，哺乳动物肌间线蛋白(des)启动子，a-肌球蛋白重链(a-mhc)启动子，或心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子。其它示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子，乙型肝炎病毒核心启动子，sandig等,genether.,3:1002-9(1996)；α-胎蛋白(afp)启动子，arbuthnot等,hum.genether.,7:1503-14(1996))，骨钙蛋白启动子(stein等,mol.biol.rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(chen等,j.boneminer.res.,11:654-64(1996))，cd2启动子(hansal等,j.immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；t细胞受体a-链启动子，神经元类，诸如神经元特异性烯醇酶(nse)启动子(andersen等,cell.mol.neurobiol.,13:503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(piccioli等,proc.natl.acad.sci.usa,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(piccioli等,neuron,15:373-84(1995))，还有其他一些对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方式中，启动子是肌肉特异性启动子desmin460或截短的肌肉肌酸激酶(tmck)启动子。

本领域技术人员将意识到的是，对于编码蛋白质或多肽的核酸，可以在核酸中进行导致保守氨基酸取代的突变，以提供功能上等同的蛋白质或肽的变体同源物。在一些方面中，公开包括导致核酸序列保守氨基酸取代的序列改变。

树突细胞

树突细胞是免疫系统的专职性(professional)抗原呈递细胞，其具有将抗原加工和呈递至t细胞的能力。

术语"树突细胞"或"dc"指在淋巴或非淋巴组织中发现的形态学上相似的细胞类似的不同群体的任何成员。这些细胞的特征在于其独特的形态学，高水平的表面ii类mhc表达。dc可以分离自多种组织来源。dc在敏化mhc限制的t细胞方面的能力很高，并且在原位呈递抗原至t细胞中非常有效。

抗原可以是t细胞发育和耐受期间表达的自身抗原，以及正常免疫过程中存在的外来抗原。

树突细胞的前体细胞

树突细胞的前体细胞是表达cd14的细胞(cd14⁺)。

自身抗原

自身抗原(自身ag)也称为免疫显性肽，通常是由自身免疫疾病患者的免疫系统识别的正常蛋白质或蛋白质复合物。在正常条件下，这些抗原不促进免疫反应，但在自身免疫疾病中，这些抗原促进导致组织损伤的t细胞反应。表2提供了已知免疫显性肽的列表。

自身ag包括t1d中的自身ag，包括非特异性胰岛细胞ag(ica)，胰岛素，谷氨酸脱羧酶65(gad65)，胰岛素瘤抗原-2(ia-2)，热休克蛋白(hsp)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(igrp)，imogen-38和β细胞特异性自身ag，例如，锌转运蛋白-8(znt8)，胰十二指肠同源框因子1(fdx1)，嗜铬粒蛋白a(chga)，和胰岛淀粉样多肽(iapp)；ms中的自身ag，包括髓鞘碱性蛋白(mbp)；蛋白脂质蛋白(plp)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)；髓鞘相关抗原(mag)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)和2′,3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶(cnp酶)；s100β蛋白，和转醛醇酶h；ra中的自身ag，包括免疫球蛋白的fc-部分；瓜氨酸化抗原，氨基甲酰化抗原，胶原，65-kda热休克蛋白，软骨糖蛋白-聚集蛋白聚糖1，聚集蛋白聚糖核心蛋白前体(acan)，α-纤维蛋白原(fga)，波形蛋白(vim)；ibd中的自身ag，包括酶原颗粒膜糖蛋白2(gp2)；原肌球蛋白(tm)，癌胚抗原(cea)；血管炎中的自身ag，为β-2-糖蛋白1(b2gpi)，髓过氧化物酶(mpo)；蛋白酶3/成髓细胞素(pr3)；重症肌无力中的自身ag，为烟碱乙酰胆碱受体(nachr，肌肉特异性激酶(musk)；自身免疫葡萄膜炎视网膜s-抗原中的自身ag(pdsag)，异质性核内核糖核蛋白(hnrph3)，内光感受器类视黄素结合蛋白(irbp)，细胞视网膜醛结合蛋白(cralbp)；寻常天疱疮中的自身ag，为桥粒芯蛋白-31(dsg1)，桥粒芯蛋白-3(dsg3)，pemphaxin(px)。

表2：已知免疫显性肽

这类已知的免疫显性肽的变体也包括在本发明中。该变体保持了免疫显性肽的抗原性。

无害抗原

无害抗原是存在于体内的物质，并且通常不促进活性免疫反应(食物抗原，包括醇溶蛋白、卵清蛋白、花生衍生的蛋白质，乳衍生的蛋白质，风疹块衍生的蛋白质等)。

过敏原

过敏原是通常无害的物质，其能够触发免疫反应并导致过敏反应。过敏原包括含有谷类的谷蛋白，花生衍生的蛋白质，梯牧草过敏原(phlp1、2、5a、5b、6)，毒液衍生的蛋白质，桦树花粉(betulaverrucosa)的betv1，屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)的derp1和derp2，梨(pyruscommunis)的pyrc5，和榛子(corylusavellana)的cora1。

cd4+和cd8+t细胞反应的调节

cd4+和cd8+t细胞反应的调节指对t细胞产生不同水平的促炎(即ifn-g、il-2、gm-csf)或抗炎性(即il-10、tgf-β)细胞因子、颗粒酶和表达受体(即cd69、cd25、ctla-4)的作用。

促炎和抗炎细胞因子的水平可以通过本领域已知的任何方法测定。

抗原特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞增殖的体外和/或体内调节

抗原特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞增殖的体外和/或体内调节指细胞抑制t细胞的活化和增殖的性质。

生成调节性dc

生成调节性dc指这样的方法，所述方法调节dc以调节dc，从而使其能够分泌高水平的抗炎性细胞因子(即il-10)和少量促炎细胞因子(即il-12、tnf-α等)并表达耐受性分子(即hla-g、il4、ido)。

有利于抗原特异性tr1和/或foxp3⁺treg细胞的扩增

有利于抗原特异性tr1和/或foxp3⁺treg细胞的扩增指这样的细胞性质，其诱导/转化具有致病活性的cd4t细胞至能够抑制体外和/或体内t细胞反应的调节性细胞。

致耐受性细胞

致耐受性细胞是促进调节性细胞体外和/或体内产生的细胞。

i类和ii类mhc情况下的抗原呈递

在i类和ii类mhc情况下呈递抗原是通过其tcr以抗原特异性方式激活cd4⁺和cd8⁺t细胞的细胞的性质。

免疫治疗剂

它们是能够通过诱导、增强或抑制免疫反应的一类分子，包括雷帕霉素、地塞米松、维生素d3等。

细胞命名法

lv-dc是已经用慢病毒载体(lv)转导的树突细胞。

toldc是具有致耐受性活性的树突细胞。

lv.iiova是编码与ova肽融合的不变链的lv。

lv.ova.mirna是单向lv，其编码与ova肽融合的不变链以及mirna155和mirna146a的靶序列。

lv-il-10/ova是双向lv，其共编码与ova肽融合的不变链以及il-10。

lv-ido/ova是双向lv，其共编码与ova肽融合的不变链以及ido。

dc-ova是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与ova肽融合的不变链(lv-iiova)。

dc-ovamirna是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与ova肽融合的不变链以及mirna155和mirna146a的靶序列。

dc-il-10/ova是已经用lv转导的树突细胞，所述lv共编码与ova肽融合的不变链以及il-10(lv-il-10/ova)。

dc-ido/ova是已经用lv转导的树突细胞，所述lv共编码与ova肽融合的不变链以及ido(lv-ido/ova)。

otiicd4⁺t细胞是分离自tcr转基因小鼠的cd4+t细胞，其识别ova323-339肽。

oticd8⁺t细胞是分离自tcr转基因小鼠的cd8+t细胞，其识别ova242-353肽。

用ova肽脉冲的dc是已经用ova肽脉冲的树突细胞。

dc-unt是未转导的细胞。

dc-gfp或dc^gfp是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码gfp(lv.gfp)。

dc-insb是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与insb融合的不变链(lv.insb)。

dc-insb.mirna是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与insb融合的不变链以及mirna155和mirna146a的靶序列(lv.insb.mirna)。

dc-il-10/insb是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与insb肽融合的不变链以及il-10(lv.il-10/insb)。

dc-ido/insb是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与insb融合的不变链以及ido(lv.ido/insb)。

lv-δngfr/gfp是双向lv，其共编码δngfr和gfp。

lv-gfp是单向lv，其编码gfp。

lv-il-10是双向lv，其共编码δngfr和il-10。

dc^il-10是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码δngfr和il-10。

dc-10是在il-10、il-4和gm-csf存在的情况下分化自cd14⁺细胞的树突细胞。

同种异体cd3⁺t细胞是对自身ag具有特异性的t细胞。

同种异体特异性无应变性cd4⁺t细胞是对自身ag具有特异性的cd4⁺t细胞，其不增殖。

成熟dc(mdc)是在il-4和gm-csf存在的情况下分化自cd14⁺细胞并用lps激活的树突细胞。

同种异体(allo-)成熟dc是在il-4和gm-csf存在的情况下分化自同种异体cd14⁺细胞并用lps激活的树突细胞。

产生同种异体特异性il-10的tr1细胞是对自身ag具有特异性的t细胞，所述自身ag生成il-10并表达cd49b和lag-3，其是无应变性的并且抑制t细胞反应。

lv-δngfr/ag是双向lv，其共编码与抗原衍生肽以及δngfr融合的不变链。

lv-il-10/ag是双向lv，其共编码与抗原衍生肽融合的不变链以及il-10。

lv-clip是双向lv，其共编码不变链clip肽和δngfr。

dc-ido/ag是已经用lv转导的树突细胞，所述lv编码与抗原衍生肽融合的不变链以及ido。

hlv-dc是分化自人cd14⁺细胞并用lv转导的树突细胞。

dc^ut是在il-4和gm-csf存在的情况下分化自同种异体cd14⁺细胞的树突细胞。

t(dc^ut)细胞，通过用同种异体dc^ut培养cd4⁺t细胞10天生成的t细胞。

t(dc^gfp)，通过用同种异体dc^gfp培养cd4⁺t细胞10天生成的t细胞。

t(dc^il-10)，通过用同种异体dc^il-10培养cd4⁺t细胞10天生成的t细胞。

t(stimdc^il-10)，通过用同种异体dc^il-10培养cd4⁺t细胞10天生成的t细胞，所述dc^il-10经lps或polii:cc刺激。

在一些方面中，本公开提供了转染的或转导的宿主细胞。术语"转染"或"转导"用于指通过细胞摄取外来dna，并且当外源dna被引入细胞膜内时，细胞被"转染"或"转导"。许多转染/转导技术在本领域是公知的。参见例如，graham等(1973)《病毒学》(virology),52:456，sambrook等(1989)《分子克隆实验手册》(molecularcloning,alaboratorymanual),冷泉更高实验室出版社,纽约，davis等(1986)《分子生物学基础方法》(basicmethodsinmolecularbiology),爱思唯尔出版社(elsevier)，和chu等(1981)gene13:197。这类技术可以用于将一种或多种外源核酸(如核苷酸整合载体和其它核酸分子)引入合适的宿主细胞中。

"宿主细胞"指具有或能够具有感兴趣的物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作dna构建体，质粒，附属功能载体或与与慢病毒载体产生相关联的其他转移dna的受体。该术语包括已转染/转导的原始细胞的后代。因此，本文所用"宿主细胞"可以指已经用外源dna序列转染/转导的细胞。应当理解的是，由于天然、偶然或特意突变，单个亲本细胞的后代与原始亲本在在形态上或在基因组上或在总dna互补上可能不一定完全相同。

本文所用术语"细胞系"指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是衍生自单个祖细胞的克隆群体。本领域进一步已知的是，在储存或转移这类克隆群体期间，自发的或诱导的变化可能在核型中发生。因此，衍生自提及的细胞系的细胞可以与祖先细胞或培养物不精确等同，并且提及的细胞系包括这类变体。

本文所用术语"重组细胞"或"遗传修饰的细胞"指其中已经引入了外源dna片段的细胞，诸如导致转录生物活性多肽或者产生生物活性核酸(如rna)的dna片段。

本文所用术语“载体”指当与适当的控制元件关联时能够复制并在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，人工染色体，病毒，病毒粒等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体，优选慢病毒载体。在一些实施方式中，有用的载体预期是这样的载体，所述载体中待转录的核酸片段处于启动子的转录控制下。"启动子"指这样的dna序列，所述dna序列被启动基因的特定转录所需的引入的合成结构或者细胞的合成结构所识别。短语"操作性地位于/处于"、"在……的控制下"或"在转录控制下"指启动子相对于核酸处于正确的位置和取向，以控制rna聚合酶启动和基因表达。术语"表达载体或构建体"指包含核酸的任何类型遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸转录，例如，由转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性rna(例如，shrna、mirna、mirna抑制剂)。

在本发明中，术语"吲哚胺双加氧酶"或"ido"指ido1(吲哚胺2,3-双加氧酶，ec1.13.11.52)或ido2(吲哚胺-吡咯2,3双加氧酶样1，ec1.13.11.-)，它们是可以分解代谢色氨酸并且可以通过apc表达的两种不同的蛋白质。

"免疫耐受性"意指缺少对抗原(自身或外来抗原)的响应，并且包括天然耐受性或诱导耐受性(即，对免疫系统的故意操纵)。

"自身抗原"意指生物体任何这样的分子或化学基团，其在诱导另一生物体中t效应细胞反应或抗体形成中作为抗原起作用，但是亲本生物体的健康免疫系统对其是耐受的。在某些情况下，例如，当对象患有自身免疫疾病或易受自身免疫疾病影响时，亲本生物体对自身抗原不耐受，并且具有针对自身抗原的特定适应性免疫反应。

"外源性治疗剂"意指源自对象外部用于治疗对象的任何治疗剂。

术语"共培养"意指在彼此存在的情况下培养两种(或更多种)细胞类型。

本领域技术人员将理解的是，本文所述的组合物和方法可以与用于治疗本文其它地方所述疾病和病症的当前的治疗方法联用。作为非限制性示例，本发明的细胞可以与免疫抑制药物疗法联用。将细胞与免疫抑制药物联用的优点是，通过使用本发明的方法改善对象中免疫反应的严重程度，对于这样的移植受体，可以减少使用的免疫抑制性药物治疗的量和/或免疫抑制性药物治疗的给药频率。减少免疫抑制药物治疗使用的益处是缓解与免疫抑制药物治疗相关的一般免疫抑制和不希望的副作用。还预期的是，本发明的细胞可以重复地或作为"一次性"疗法给予受体，用于预防或治疗疾病或病症，诸如自身免疫疾病或病症，炎性疾病或病症，或与移植物相关的疾病或病症，诸如宿主排斥供体组织或移植物对宿主病。将细胞一次性给予移植物的受体消除了对于慢性免疫抑制性药物治疗的需要。然而，如果需要，可以采用多次给予细胞。

基于本文提供的公开内容，树突细胞或其前体可以获自任何来源，例如，获自组织供体，移植物受体或其他不相关的来源(完全不同的个体或物种)。细胞可以相对于t细胞(获自同一宿主)为自体同源的，或者可以相对于t细胞为同种异体的。在树突细胞或其前体为同种异体的情况下，细胞可以相对于t细胞响应的移植物为自体同源的，或者细胞可以获自这样的哺乳动物，所述哺乳动物相对于t细胞的来源或者t细胞响应的移植物的来源而言是同种异体的。此外，t细胞对于t细胞(获自不同物种的动物)，可以是异种异体的，例如小鼠细胞可以用于抑制人t细胞的活化和增殖。

本发明的另一方面包括将细胞给予对象的途径。细胞可以通过适合环境的途径给予。细胞可以全身给予，即胃肠外地给予，通过静脉内注射或腹膜内注射，或者可以靶向特定组织或器官，诸如骨髓，细胞可以通过皮下植入细胞或通过将细胞注射到结缔组织(例如肌肉)给予。

细胞可以悬浮在适当的稀释剂中，浓度为约1x10⁴至约20x10⁷细胞/ml，优选约5x10⁶细胞/ml。用于注射溶液的合适赋形剂是与细胞和受体生物学和生理相容的赋形剂，如缓冲盐水溶液或其它合适的赋形剂。可以根据符合适当无菌性和稳定性的标准方法配制、生产和保存用于给予的组合物。

细胞的剂量在宽范围内变化，并且可以在各自特定情况下调节至对象的要求。所用细胞的数量取决于受体的体重和状况，给药的次数和/或频率，和本领域技术人员已知的其它变量。

自身免疫疾病

自身免疫疾病是由针对自身抗原的异常免疫应答所引起的病症，包括：1型糖尿病、自身免疫性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、自身免疫性肌炎、牛皮癣、爱迪生氏病、格雷夫斯氏病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血、乳糜泻、自身免疫肝炎、斑秃、寻常型天疱疮、白癜风、再生障碍性贫血、自身免疫性葡萄膜炎。

自免疫疾病还包括：斑秃，肌萎缩性侧索硬化症(卢伽雷氏病)，强直性脊柱炎，抗gbm肾炎，抗磷脂综合征，骨关节炎，哮喘，特应性过敏症，特应性皮炎，自身免疫性活动性慢性肝炎，自身免疫性内耳疾病(aied)，巴洛病，白塞氏病，伯杰氏病，大疱性类天疱疮，心肌病，慢性疲劳免疫功能障碍综合征，查格-施特劳斯综合征，瘢痕性类天疱疮，冷凝集素病，结肠炎颅动脉炎，crest综合征，克罗恩病，代戈氏病，皮肌炎和jdm，德维克疾病，湿疹，基本混合性冷球蛋白血症，嗜酸性筋膜炎，纤维肌痛–纤维肌炎，纤维化性牙槽炎，巨细胞动脉炎，肾小球肾炎，古德帕斯病，格林-巴利综合征，桥本氏甲状腺炎，肝炎，休斯综合征，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，川崎病，扁平苔藓，狼疮状肝炎，狼疮/sle，莱姆病，美尼尔氏病，混合性结缔组织病，肌炎/jm，jdm和jpm，骨质疏松症，睫状体扁平部炎，寻常天疱疮，多腺自身免疫综合征，风湿性多肌痛，多发性肌炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，银屑病，雷诺氏综合征，瑞特氏综合征，风湿热，类风湿关节炎，巩膜炎，硬皮病，粘血综合征，斯蒂尔氏病，僵人综合征，西登哈姆氏舞蹈病，高安氏动脉炎，颞动脉炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎，韦格纳氏肉芽肿病和威尔逊氏综合征。

优选的自身免疫疾病包括：血管炎，诸如难性抗磷脂抗体综合征(也称为阿舍森氏综合征(asherson’ssyndrome))，巨细胞动脉炎和抗anca血管炎，重症肌无力，难治性乳糜泻，自身免疫性葡萄膜炎，如白塞氏病，寻常型天疱疮，巨细胞心肌炎，格雷夫斯病，爱迪生氏病，和肉芽肿性多血管炎。

材料与方法

对象。所有方案由机构评审委员会批准，并根据赫尔辛基宣言(declarationofhelsinki)在签署书面知情同意书的情况下收集样品。

细胞制备和细胞系。分离自balb/c、c57bl/6或nod小鼠的骨髓细胞在rmgm-csf(25ng/ml；r&d系统公司(r&dsystems))存在的情况下保持培养8天以分化成dc。

通过在梯度上离心制备外周血单核细胞(pbmc)。用cd4t细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司(miltenyibiotec))纯化cd4⁺t细胞，获得>95％的纯度。然后，使用抗cd45ro偶联的磁珠和ld负选择柱(美天旎生物技术公司)，将cd4⁺t细胞的cd45ro⁺细胞耗尽。选定群体中cd4⁺cd45ra⁺的比例始终大于90％。使用cd14⁺和cd3⁺微珠(美天旎生物技术公司)通过正选择纯化cd14⁺和cd3⁺t细胞，分别获得>95％的纯度。

根据生产商的说明，使用cd14微珠(美天旎生物技术公司)通过正选择由pbmc分离cd14⁺单核细胞。在10ng/mlrhil-4(r&d系统公司)和100ng/mlrhgm-csf(健赞公司(genzyme))和10ng/ml的rhil-10(bd生物科学公司(bd,bioscience))存在的情况下，细胞在rpmi1640(隆萨公司(lonza))(dc培养基)中以培养7天以分化dc-10，所述rpmi1640补充有10％胎牛血清(fbs)(隆萨公司)或者5％人血清(hs)(euroclone公司)，100u/ml青霉素/链霉素(隆萨公司，意大利)，2mml-谷氨酰胺(隆萨公司，意大利)。在第5天，用1μg/ml的lps(西格玛公司(sigma))对用rhil-4和rhgm-csf培养的细胞进行额外2天的成熟，以生成mdc。在第7天，收集dc，进行表型分析，并用于刺激t细胞。

在一些实验中，在存在10ng/mlrhil-4和100ng/mlrhgm-csf(美天旎生物技术公司)，伴有或没有10ng/ml的rhil-10(cellgenix公司)的情况下，hla-dq8⁺或hla-dq2.5⁺cd14⁺细胞以10^6个细胞/ml培养基的的密度用补充有青霉素/链霉素(euroclone公司)的无血清dc培养基(cellgenix公司)培养。在第3天，细胞补充有1ml无血清培养基+20ng/mlrhil-4和200ng/mlrhgm-csf(美天旎生物技术公司)。在第7天收集未成熟的dc，用于后续表型和功能分析。

dna提取和hla-dq筛选。为了选择hla-dq8⁺和/或hla-dq2.5⁺健康供体，根据生产商的说明，使用qiaampdna血液迷你试剂盒(凯杰公司(qiagen))由200μl全血提取基因组dna。根据生产商的说明，使用eu-gen试剂盒(eurospital公司)，通过pcr确定hla-dq8或-dq2.5等位基因的存在与否。

质粒构建。合成与编码insb4-29或ova315-353的序列融合的鼠不变链(cd74)的编码序列(geneart)，并克隆到多个lv主链中：hpgk.xxx.wpre(84)，以获得lv-iiova和lv-iiinsb；hpgk.xxx.wpremir155t.mir146at，以获得lv-iiovamirna和lv-iiinsbmirna，以及克隆到双向主链中：hpgk.xxx.wpre.mcmvil10.sv40pa(85)和hpgk.xxx.wpre.mcmvido.sv40pa，以分别获得lv-il-10/ova和lv-il-10/insb和lv-ido/ova和lv-ido/insb。

人il-10的编码序列提取自ph15c(atccn°68192)，并将549bp片段克隆到pbluksm(英杰公司(invitrogen)的多个克隆位点以获得pbluksm-hil-10。通过切除pbluksm-hil-10的hil-10获得555bp的片段，并连接1074.1071.hpgk.gfp.wpre.mhcmv.dngfr.sv40pa(85)(此处命名为lv-δngfr)，以获得lv-il-10/δngfr。双向启动子(人pgk启动子+反向的cmv启动子的最小核心元件)允许共表达两种转基因。通过焦磷酸测序(primm)验证lv-il-10/δngfr序列。

合成与编码胰岛素b肽4-29(insb4-29)或a2-醇溶蛋白51-80的序列融合的人不变链p33同种型的编码序列(geneart)，并克隆到下述双向主链中：hpgk.xxx.wpre.mcmv.yyyy.sv40pa，以获得lv-lip33ag/δngfr、lvlip33ag/il-10或lvlip33ag/ido。作为对照，用ii类相关不变链肽(clip)替换编码抗原的序列。通过焦磷酸测序(gatc)验证所得质粒的序列。

载体产生和滴定。通过ca3po4瞬时四质粒共转染到293t细胞中来产生vsv-g假型三代bdlv，并通过超速离心进行浓缩(40)。通过有限稀释来估计效价，通过hiv-1gagp24抗原免疫捕获(nen生命科学公司(nenlifescience)产品)测量载体颗粒，并将载体感染性计算为效价与颗粒之间的比率。效价范围为5x10⁸至6x10⁹转导单位/ml，感染性为5x10⁴至10⁵转导单位/ng的p24。

树突细胞的转导。在gm-csf(25ng/ml；r&d系统公司存在的情况下，将分离自balb/c、c57bl/6或nod小鼠的骨髓细胞分化成dc，并在第2天用lv转导，感染复数(moi)为3。

在包含病毒蛋白x(vpx)1-5μl的病毒样颗粒(vlp)存在的情况下，如上所述接种cd14⁺单核细胞。6小时后，添加lv，感染复数(moi)为5。14-18小时后，补充半培养基。基于δngfr的细胞表面表达，通过流式细胞术在转导的对照上评估了转导细胞的效率。

细胞因子确定。在第7天收集单核细胞衍生的dc，用pbs洗涤，并以500000个细胞/ml再次接种到仅新鲜培养基中或者补充有lps200ng/ml和ifnγ50ng/ml的新鲜培养基中。48小时后，收集上清液，并通过elisa确定细胞因子浓度。

增殖和抑制试验。为了评估cd4+和cd8+t细胞的ag特异性增殖，按照生产商的说明，用efluor-670增殖染料(英杰公司)标记otii和oti细胞。将efluor标记的t细胞单独接种于u形底96孔板中，最终体积为200μl，或者在lv-dc(t:dc比率为10:1)存在的情况下进行。5天后，通过流式细胞术评估t细胞的增殖。使用bdfacscantoii分析仪获取细胞，并使用flowjo软件进行分析。

为了评估ag特异性增殖，将cd4+t细胞(与单核细胞衍生的dc自体同源)解冻，在37℃下静置1-2小时，并按照生产商的说明用efluor-450增殖染料(英杰公司)标记。将150000个efluor标记的cd4+t细胞单独接种到96孔圆底板中，最终体积为200μl，或者在用lv-lip33ag/δngfr或lvlip33ag/il-10或对照lv-lip33-clip转导的dc存在的情况下进行(t:dc比率为10:1)。6天后，通过流式细胞术评估cd4+t细胞的增殖。使用bdfacscantoii分析仪获取细胞，并使用flowjo软件进行分析。

流式细胞术分析。在分化结束的第8天通过流式细胞术确定鼠bm-lvdc表型。为了检测细胞表面抗原，使用下述单克隆抗体(mab)：抗cd11c-v450(e-生物科学公司(e-bioscience))，抗cd86-pe-cy7(bd生物科学公司)，抗cd80-percpcy5.5(bd生物科学公司)，抗iab-pe(bd生物科学公司)。使用抗cd4-pe-cy7(bd生物科学公司)和抗cd45.2-太平洋蓝(bd生物科学公司)鉴定otii细胞。

在第7天通过流式细胞术确定单核细胞衍生的人lv-dc的表型。为了检测细胞表面抗原，使用下述单克隆抗体(mab)：抗dc-sign-pe(bd生物科学公司)，-cd14-fitc(bd生物科学公司)，-hladr-apc-cy7(bd生物科学公司)，cd86-percp-cy5.5(bd生物科学公司)，cd83-bv421(bd生物科学公司)，dngfr-apc(美天旎生物技术公司)，cd11c-pe-cy7(bd生物科学公司)。还确定了致耐受性分子的细胞表面表达：抗hlag-pe(exbio公司)，-ilt4-apc(r&d系统公司)，-cd163-pcy5.5(bd生物科学公司)，-cd141-bv421(bd生物科学公司)。根据生产商的说明，使用活/死细胞活力实验(赛默飞世尔公司(thermofisher))评估细胞活力。为了评估生成il-10的dc的频率，用lps200ng/ml和ifng50ng/ml+布雷菲德菌素a(10μg/ml)刺激lv-dc14-16小时。如前所述(levingsji2001)，使用抗il-10-pe(bd法敏进公司(bdpharmingen))确定il-10的胞内表达。为了评估表达ido的dc的频率，用2％甲醛溶液(赛默飞世尔公司)固定20分钟并用含有0,5％皂苷的pbs2％fbspbs(西格玛公司)透化10分钟，然后用抗人idope(e生物科学公司)进行胞内染色。

为了在表面染色后检测foxp3(克隆259d，美国白乐津公司)，将细胞固定、透化并用染色foxp3的缓冲液组合进行染色，根据生产商的说明(美国e生物科学公司)。为了在表面染色后表达颗粒酶b(克隆mhgb04，美国英杰公司)，将细胞固定、透化并用bdcytofix/cytoperm^tm试剂盒染色，根据生产商的说明(目录号554714，美国白乐津公司)。使用bdfacscantoii或bd-lsrfortessa分析仪采集样品，并使用flowjo软件进行分析。

小鼠。购买c57bl/6，雌性nod(nod/ltj)和balb/c小鼠(查尔斯河实验室(charlesriverlaboratories))，并将其饲养在无特定病原体的条件下。发明人在发明人的实验室中杂交并产生了foxp3报告小鼠。发明人使用8-12周龄的年龄和性别匹配的同窝仔。通过将cd45.1(95％)和cd45.2otii/firtiger(5％)bm细胞移植到经致死照射的cd45.1小鼠中来产生嵌合小鼠。otii/firtigercd4+t细胞是分别识别ova323-339和表达rfp和gfp作为foxp3和il10的报告基因的tcr转基因细胞。

当通过bayerbreeze血糖监测系统(拜耳公司(bayer))确定连续两天的血糖测量值≥250mg/dl时，认为nod小鼠患有糖尿病。所有过程均由米兰的圣拉斐尔研究所(sanraffaeleinstitute)的机构动物护理和使用委员会(iacuc)审查和批准(iucac416和604)。

gvhd模型：balb/c小鼠经致死辐射，并静脉内注射c57bl/6bm细胞(10⁷)和脾细胞(5x10⁶)。在第2天，向小鼠过继转移dc^gfp或dc^il-10(2x10⁶)，监测小鼠的体重减轻和存活。

体外生成人treg细胞的方法。为了诱导ag特异性cd4+treg细胞，将与单核细胞衍生的dc自体同源的t细胞解冻，在37℃下静置1-2小时，并按照制造商的说明用efluor-450增殖染料(英杰公司)标记。将10⁶个efluor标记的cd4+t细胞接种到24孔圆底板中，最终体积为2ml，在用lv-lip33ag/dngfr、lvlip33ag/il-10、lvlip33ag/ido或对照lv-lip33-clip转导的dc存在的情况下进行(t:dc比率为10:1)。10天后，通过流式细胞术评估cd4+t细胞的增殖，并且在lvlip33ag/il-10的情况中，tr1细胞的存在通过增殖细胞上cd49b和lag-3的共表达评估，并且在lvlip33ag/ido的情况中，foxp3+treg的存在通过增殖细胞上的foxp3和ctla-4的共表达评估。使用bdfacscantoii分析仪获取细胞，并使用flowjo软件进行分析。

vpx-vlp产生。通过ca3po4瞬时双质粒(表达vsv-g的质粒和猴免疫缺陷病毒衍生的包装质粒siv3+)进入293t细胞并通过如(86)所述超速离心进行浓缩来产生浓缩的纳入vpx的病毒样颗粒(vlp)。通过有限稀释估计效价。效价范围为5x10⁸至6x10⁹转感单位/ml。

t细胞分化和抑制试验。10⁶个cd4⁺t细胞与用10⁵个同种异体dc在x-vivo15培养基中(隆萨公司，瑞士)培养(10:1，t:dc)，所述x-vivo15培养基补充有5％人血清(西格玛奥里奇公司(sigmaaldrich)，美国加利福尼亚州)，和100u/ml青霉素/链霉素(隆萨公司，瑞士)。10天后，收集初免t细胞，并使用cd4微珠(美天旎生物技术公司，德国)纯化。经dc^ut刺激的t细胞称为t(dc^ut)细胞，而经dc^gfp刺激那些t细胞称为t(dc^gfp)细胞。用未刺激的dc^il-10培养的t细胞称为t(dc^il-10)细胞，而用lps-或polii:c刺激的dc^il-10培养的那些t细胞称为t(stimdc^il-10)细胞。

用细胞增殖染料670(e生物科学公司，美国加利福尼亚州)对初免t细胞染色，然后与来自用于初免同一供体的dc^ut一起铺板(10:1，t:dc)。刺激3天后，收集t细胞，洗涤，并通过流式细胞术评估增殖。

为了评估t(dc^il-10)和t(stimdc^il-10)细胞的抑制活性，我们用细胞增殖染料450(e生物科学公司，美国加利福尼亚州)对与引发中使用的t细胞自体同源的全部cd4⁺t细胞(应答细胞)进行染色，并用来自用于初免同一供体的成熟dc^ut将其激活。将用细胞增殖染料670(e生物科学公司，美国加利福尼亚州)染色的t(dc^il-10)或t(dc^il-10*)细胞以1:1的比例与应答细胞一起添加(总t:dc比例为10:1)。4天后，通过利用流式细胞仪的增殖染料稀释来计算分裂的应答t细胞的百分率。

dc刺激。在一些实验中，在第7天收集dc，并将其单独再铺板或者于下述刺激存在时再铺板：1μg/ml的lps(西格玛奥里奇公司，美国加利福尼亚州)，10⁸个细胞/ml的热杀单核细胞增多性李斯特氏菌(代码tlrl-hklm，英韦沃基公司(invivogen)，美国加利福尼亚州)，1ug/ml的鞭毛蛋白鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)(代码tlrl-stfla，英韦沃基公司，美国加利福尼亚州)，10ug/ml的poli(i:c)(代码tlrl-pic英韦沃基公司，美国加利福尼亚州，5um的odn2006(cpg)(代码tlrl-2006，英韦沃基公司，美国加利福尼亚州，或10ng/ml的il-1b、tnf-a和il-6各细胞因子的混合物(r&d系统公司，美国明尼苏达州)。24小时后，收集上清液，以通过elisa评估细胞因子分泌概况，并且通过流式细胞术分析细胞。

人源化小鼠中免疫反应的调节。2-5日龄nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wji/szj,jax小鼠系)小鼠经亚致死性辐照(1.5cgy)，并在5-7小时后，肝内注射10⁵个cd34+(纯度≥95％，隆萨公司)，如之前所述(santonidesio等jaci2018)。

从移植后8周开始，通过流式细胞术监测外周血中人总细胞和t细胞的百分比。一旦人移植物稳定并且可以清楚地检测到t细胞再群体化(repopulation)(通常在移植后11-13周左右)，即通过静脉注射5x10⁶同种异体cd3-细胞(由人外周血磁性分离(dynabeadscd3-赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))对人源化小鼠(humice)进行免疫。一周后，通过流式细胞术评估人t细胞百分比，将人源化小鼠随机分配至实验组，并注射3x10⁵未转导的树突细胞(dc^ut)，或3x10⁵未转导的树突细胞加3x10⁵gfp或il-10转导的树突细胞(分别为dc^gfp和dc^il-10)，其分化自cd14+单核细胞，所述cd14+单核细胞分离自用于cd3-纯化的同一供体。通过ki67染色评估外周血中的t细胞增殖。

产生包装细胞系cd47高(cd47hi)和cd47无(cd47free)。将之前所述(87)表达cas9和sgrna的质粒用于破坏293t中的cd47表达。用于生成sgrna的crispr的序列为：cd47a(ctactgaagtatacgtaaagtgg)(seqidno:115)，b(cttgtttagagctccatcaaagg)(seqidno:116)，c(atcgagctaaaatatcgtgttgg)(seqidno:117)。

基因破坏和错配选择性核酸内切酶实验，通过磷酸钙介导瞬时转染指定量的所需表达sgrna的质粒和表达cas9的质粒来进行基因破坏。错配选择性核酸内切酶试验用于测量cas9靶位点处非同源末端连接(nhej)引起的突变程度，如(88)所述。使用侧接cd47基因中sgrna结合位点的引物进行pcr(正向：5’-ttcctttccaggatcagctcagc-3’(seqidno:118)；反向：5’-ttgattcaaaggagtacctatccc-3’)(seqidno:119))。

sin-rv基因组转移，将编码基因合成的cd47cdna的人密码子优化形式的pgk.cd47(genewiz)与gfp交换，成为prt43.3.pgk.gfp(bamhi-noti)(89)，用于生成293tcd47高细胞。如所述(89)，用prt43.3.pgk.cd47、包装质粒pcmv-gag/pol(莫罗尼白血病病毒)和pmd2.g转染293t细胞。将293t细胞cd47高和cd47无用于生成lv，如上所述。

统计学分析。平均值报告为平均值±sem。发明者使用了mann-whitney检验和anova检验来确定数据的统计显著性。发明人将显著性定义为*p≤0.05、**p≤0.005、***p≤0.0005和***p<0.0001。发明人使用prism程序5.0(graphpad软件公司)进行统计学计算。

序列

在下述蛋白质中，免疫显性肽或表位以粗体突出显示，而脱酰胺残基以灰色突出显示。

鼠dc的lv构建体

不变链(m-ii,cd74)(dna)(seqidno:120)

atggatgaccaacgcgacctcatctctaaccatgaacagttgcccatactgggcaaccgccctagagagccagaaaggtgcagccgtggagctctgtacaccggtgtctctgtcctggtggctctgctcttggctgggcaggccaccactgcttacttcctgtaccagcaacagggccgcctagacaagctgaccatcacctcccagaacctgcaactggagagccttcgcatgaagcttccgaaatctgccaaacctgtgagccagatgcggatggctactcccttgctgatgcgtccaatgtccatggataacatgctccttgggcctgtgaagaacgttaccaagtacggcaacatgacccaggaccatgtgatgcatctgctcacgaggtctggacccctggagtacccgcagctgaaggggaccttcccagagaatctgaagcatcttaagaactccatggatggcgtgaactggaagatcttcgagagctggatgaagcagtggctcttgtttgagatgagcaagaactccctggaggagaagaagcccaccgaggctccacctaaagagccactggacatggaagacctatcttctggcctgggagtgaccaggcaggaactgggtcaagtcaccctg

不变链(m-ii,cd74)(蛋白质)(seqidno:121)

mddqrdlisnheqlpilgnrprepercsrgalytgvsvlvalllagqattayflyqqqgrldkltitsqnlqleslrmklpksakpvsqmrmatpllmrpmsmdnmllgpvknvtkygnmtqdhvmhlltrsgpleypqlkgtfpenlkhlknsmdgvnwkifeswmkqwllfemsknsleekkpteappkepldmedlssglgvtrqelgqvtl

不变链框内融合至：

>ova315-353,stop(dna)(seqidno:122)

tgtggcatctcctcagcagagagcctgaagatatctcaagctgtccatgcagcacatgcagaaatcaatgaagcaggcagagaggtggtagggtcagcagaggctggagtggatgctgcaagctga

ova315-353,stop(蛋白质)(表位ova323-339)(seqidno:123)

>ova242-353.stop(dna)(seqidno:124)

tgcatgttggtgctgttgcctgatgaagtctcaggccttgagcagcttgagagtataatcaactttgaaaaactgactgaatggaccagttctaacgttatggaagagaggaagatcaaagtgtacttacctcgcatgaagatggaggaaaaatacaacctcacatctgtcttaatggctatgggcattactgacgtgtttagctcttcagccaatctgtctggcatctcctcagcagagagcctgaagatatctcaagctgtccatgcagcacatgcagaaatcaatgaagcaggcagagaggtggtagggtcagcagaggctggagtggatgctgccagctga

ova242-353.stop(蛋白质)(表位:ova257-264；ova323-339)(seqidno:125)

>insb4-29.stop(seqidno:126)

cagcacctttgtggttcccacctggtggaggctctctacctggtgtgtggggagcgtggcttcttctacacacccatgtaa

insb4-29.stop(蛋白质)(表位insb9-23)(seqidno:127)

>insb4-29r22e.stop(dna)(seqidno:128)

cagcacctttgtggttcccacctggtggaggctctctacctggtgtgtggggagcgtggcttcttctacacacccatgtaa

insb4-29r22e.stop(蛋白质)(表位insb9-23r22e)(seqidno:129)

>gad65500-585(dna)(seqidno:130)

cacacaaatgtctgcttctggtttgtacctcctagtttgcgcactctggaagacaatgaagagagaatgagccgcctctcaaaggtggcgccagtgattaaagccagaatgatggagtatgggaccacaatggtcagctaccaacccttaggggacaaggtcaacttcttccgcatggtcatctcaaaccctgcagcaactcaccaagacattgacttccttattgaagaaatcgaacgcctcggacaagatttgt

gad65500-585(蛋白质)(表位:gad509-528；gad524-543，gad561-575)(seqidno:131)

>gad65202-225(dna)(seqidno:132)

actaacatgttcacctatgagatcgcccctgtatttgtgctgctagaatatgttacactaaagaaaatgagataa

gad65202-225(蛋白质)(表位:gad206-220)(seqidno:133)

>igrp191-218(dna)(seqidno:134)

gaggcctttgaacacactccaggagtccacatggccagcttgagtgtgtacctgaagaccaacgtcttcctcttcctgtttgcctaa

igrp195-214(蛋白质)(表位:igrp195-214)(seqidno:135)

w1e14(dna)(seqidno:136)

gaggtggaggaccctcaggtggcccagctggagctgggcggcggccctggcgccggcgacctgcagaccctggccctgtggagcagaatggaccagctggccaaggagctgaccgccgagtga

we14(融合蛋白)(组合n-tercpep–chra)(seqidno:137)

人dc的lv构建体

人不变链(hu-ii,p33,clip)(dna)(seqidno:138)

atggatgaccagcgcgaccttatctccaacaatgagcaactgcccatgctgggccggcgccctggggccccggagagcaagtgcagccgcggagccctgtacacaggcttttccatcctggtgactctgctcctcgctggccaggccaccaccgcctacttcctgtaccagcagcagggccggctggacaaactgacagtcacctcccagaacctgcagctggagaacctgcgcatgaagcttcccaagcctcccaagcctgtgagcaagatgcgcatggccaccccgctgctgatgcaggcgctgcccatgggagccctgccccaggggcccatgcagaatgccaccaagtatggcaacatgacagaggaccatgtgatgcacctgctccagagtcactggaactggaggacccgtcttctgggctgggtgtga

人不变链(hu-ii,p33,clip)(蛋白质)(seqidno:139)

用编码感兴趣ag的序列替换clip序列

hu.insb4-29(dna)(seqidno:140)

caacacctgtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaag

hu.insb4-29(蛋白质)(表位insb9-23)(seqidno:141)

hu.insb4-29(-14e-21e-22e)(dna)(seqidno:142)

caacacctgtgcggctcacacctggtggaagaactctacctagtgtgcggggaagaaggcttcttctacacacccaag

hu.insb4-29(-14e-21e-22e)(蛋白质)(表位insb9-2314e-21e-22e)(seqidno:143)

hu.ppi前胰岛素/胰岛素原71-96(dna)(表位ppi71-96)(seqidno:144)

ggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgt

hu.ppi(蛋白质)(表位c19a3)(seqidno:145)

hu.ppi前胰岛素/胰岛素原13-28(dna)(ppi13-28)(seqidno:146)

ctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaa

hu.ppi(蛋白质)(表位ppi17-24)(seqidno:147)

i-a2801-821(dna)(seqidno:148)

gagagcggctgcaccgtcatcgtcatgctgaccccgctggtggaggatggtgtcaagcagtgt

i-a2(蛋白质)(表位:i-a2805-820；i-a2806-814)(seqidno:149)

a2-醇溶蛋白51-80>(seqidno:150)

tctcagcagccctacctgcaactgcagccctttccacagcctgagctgccctatcctcagcctcagcctagctttccacctcagcag

a2-醇溶蛋白51-80>(蛋白质)(表位a2-gli55-76)(seqidno:151)

t调节细胞表位(tregitope)289(dna)(seqidno:152)

gaggagcagtacaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactgg

t调节细胞表位289(蛋白质)(seqidno:153)

eeqynstyrvvsvltvlhqdw

克隆到下述中：

-单向lv主链(seqidno:154)

lv.pgk.ii

caggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagcttggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagaagcttgatatcgaattcccacggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcggggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagggggatccaccatggatgaccaacgcgacctcatctctaaccatgaacagttgcccatactgggcaaccgccctagagagccagaaaggtgcagccgtggagctctgtacaccggtgtctctgtcctggtggctctgctcttggctgggcaggccaccactgcttacttcctgtaccagcaacagggccgcctagacaagctgaccatcacctcccagaacctgcaactggagagccttcgcatgaagcttccgaaatctgccaaacctgtgagccagatgcggatggctactcccttgctgatgcgtccaatgtccatggataacatgctccttgggcctgtgaagaacgttaccaagtacggcaacatgacccaggaccatgtgatgcatctgctcacgaggtctggacccctggagtacccgcagctgaaggggaccttcccagagaatctgaagcatcttaagaactccatggatggcgtgaactggaagatcttcgagagctggatgaagcagtggctcttgtttgagatgagcaagaactccctggaggagaagaagcccaccgaggctccacctaaagagccactggacatggaagacctatcttctggcctgggagtgaccaggcaggaactgggtcaagtcaccctgtgtggcatctcctcagcagagagcctgaagatatctcaagctgtccatgcagcacatgcagaaatcaatgaagcaggcagagaggtggtagggtcagcagaggctggagtggatgctgcaagctgataagtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcgtcgagacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcc

pgk.iiag.mir155t.mir146at(seqidno:155)

双向lv主链(seqidno:156)

bd.δngfr.pgk.gfp

bd.il10.pgk.gfp(seqidno:157)

bd.huido.pgk.iiag(seqidno:158)

huil-10(dna)(seqidno:159)

atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaactga

huil-10(蛋白质)(seqidno:160)

mhssallcclvlltgvraspgqgtqsenscthfpgnlpnmlrdlrdafsrvktffqmkdqldnlllkeslledfkgylgcqalsemiqfyleevmpqaenqdpdikahvnslgenlktlrlrlrrchrflpcenkskaveqvknafnklqekgiykamsefdifinyieaymtmkirn*

huido(dna)(seqidno:161)

atggcccatgccatggaaaacagctggaccatcagcaaagagtaccacatcgacgaggaagtgggcttcgccctgcctaatcctcaagagaacctgcctgacttctacaacgactggatgtttatcgccaaacatctgcccgacctgatcgagagcggccagctgagagaaagagtggaaaagctgaacatgctgagcatcgaccacctgaccgaccacaagtctcagagactggccagactggtgctgggctgtatcaccatggcctacgtgtggggaaaaggccatggcgacgtgcggaaagtgctgcccagaaatatcgccgtgccttactgccagctgtccaagaagctggaactgcctcctatcctggtgtacgccgattgcgtgctggccaactggaagaagaaggaccccaacaagcccctgacctacgagaacatggacgtgctgtttagcttccgcgacggcgattgcagcaagggattcttcctggtgtccctgctggtggaaatcgccgctgcctctgccatcaaagtgatccccaccgtgttcaaggccatgcagatgcaagagcgggacaccctgctgaaggccctgctggaaattgcctcctgcctggaaaaagccctccaggtgttccaccagatccacgaccacgtgaaccccaaggccttcttcagcgtgctgcggatctatctgtctggctggaagggcaatccccagctgtctgacggcctggtgtatgaaggcttctgggaagatcccaaagagttcgctggcggctctgccggacagtctagtgtgttccagtgcttcgatgtgctgctgggcatccagcaaacagccggcggaggacatgctgctcagtttctgcaagacatgcggcggtacatgcctccagctcaccggaactttctgtgcagcctggaaagcaaccccagcgtgcgggaattcgtgctgtctaaaggcgacgccggactgagagaagcctacgatgcctgtgtgaaggctctggtgtctctgcggagctaccacctccagatcgtgaccaagtacattctgatccccgccagccagcagcctaaagagaacaagaccagcgaggacccctccaagctggaagcaaaaggcacaggcggaaccgatctgatgaacttcctgaaaaccgtgcggtccaccaccgagaagtctctgctgaaagagggctga

huido(蛋白质)(seqidno:162)

mahamenswtiskeyhideevgfalpnpqenlpdfyndwmfiakhlpdliesgqlrerveklnmlsidhltdhksqrlarlvlgcitmayvwgkghgdvrkvlprniavpycqlskklelppilvyadcvlanwkkkdpnkpltyenmdvlfsfrdgdcskgfflvsllveiaaasaikviptvfkamqmqerdtllkalleiasclekalqvfhqihdhvnpkaffsvlriylsgwkgnpqlsdglvyegfwedpkefaggsagqssvfqcfdvllgiqqtaggghaaqflqdmrrymppahrnflcslesnpsvrefvlskgdaglreaydacvkalvslrsyhlqivtkyilipasqqpkenktsedpskleakgtggtdlmnflktvrstteksllkeg*

gagpol多聚蛋白质猿猴免疫缺陷病毒(vpx)(dna)(seqidno:163)

atgggcgcgagaaactccgtcttgtcagggaagaaagcagatgaattagaaaaaattaggctacgacccggcggaaagaaaaagtacatgttgaagcatgtagtatgggcagcaaatgaattagatagatttggattagcagaaagcctgttggagaacaaagaaggatgtcaaaaaatactttcggtcttagctccattagtgccaacaggctcagaaaatttaaaaagcctttataatactgtctgcgtcatctggtgcattcacgcagaagagaaagtgaaacacactgaggaagcaaaacagatagtgcagagacacctagtggtggaaacaggaacagcagaaactatgccaaaaacaagtagaccaacagcaccatctagcggcagaggaggaaattacccagtacaacaaataggtggtaactatgtccacctgccattaagcccgagaacattaaatgcctgggtaaaattgatagaggaaaagaaatttggagcagaagtagtgccaggatttcaggcactgtcagaaggctgcaccccctatgacattaatcagatgttaaattgtgtgggagaccatcaagcggctatgcagattatcagagatattataaatgaggaggctgcagattgggacttgcagcacccacaaccagctccacaacaaggacagcttagggagccgtcaggatcagatattgcaggaacaactagttcagtagatgaacaaatccagtggatgtacagacaacagaaccccataccagtaggcaacatttacaggagatggatccaactggggttgcaaaaatgtgtcagaatgtataacccaacaaacattctagatgtaaaacaagggccaaaagagccatttcagagctatgtagacaggttctacaaaagcttaagagcagaacaaacagatgcagcagtaaagaattggatgactcaaacactgctgattcaaaatgctaacccagattgcaagctagtgctgaaggggctgggtgtgaatcccaccctagaagaaatgctgacggcttgtcaaggagtagggggaccaggacagaaggctagattaatggcagaagccctgaaagaggccctcgcaccagtgccaatcccttttgcagcagcccagaagaggggaccaagaaagccaattaagtgttggaattgtgggaaggagggacactctgcaaggcaatgcagagccccaagaagacagggatgctggaaatgtggaaaaatggaccatgttatggccaaatgcccagacagacaggcgggttttttaggccttggtccatggggaaagaagccccgcaatttccccatggctcaagtgcatcaggggctgacgccaactgctcccccagaggacccagctgtggatctgctaaagaactacatgcagttgggcaagcagcagagagaaagcagagagaagccttacaaggaggtgacagaggatttgctgcacctcaattctctctttggaggagaccagtagtcactgctcatattgaaggacagcctgtagaagtattattggatacaggggctgatgattctattgtaacaggaatagagttaggtccacattataccccaaaaatagtaggaggaataggaggttttattaatactaaagaatacaaaaatgtaaaaatagaagttttaggcaaaaggattaaagggacaatcatgacaggggacactccgattaacatttttggtaggaatttgctaacagctctggggatgtctctaaatcttcccatagctaaggtagagcctgtaaaagtcaccttaaagccaggaaaggttggaccaaaattgaagcagtggccattatcaaaagaaaagatagttgcattaagagaaatctgtgaaaagatggaaaaggatggtcagttggaggaagctcccccgaccaatccatacaacacccccacatttgccataaagaaaaaagataagaacaaatggagaatgctgatagattttagggaactaaatagggtcactcaggactttacagaagtccaattaggaataccacaccctgcaggactagcaaaaaggaaaaggattacagtactggatataggtgatgcatatttctccatacctctagatgaagaatttaggcagtacactgcctttactttaccatcagtaaataatgcagagccaggaaaacgatacatttataaggttctgcctcagggatggaaggggtcaccagccatcttccaatacactatgagacatgtgctagaacccttcaggaaggcaaatccagatgtgaccttagtccagtatatggatgacatcttaatagctagtgacaggacagacctggaacatgacagggtagttttacagctaaaggaactcttaaatagcatagggttctctaccccagaagagaaattccaaaaagatcccccatttcaatggatggggtacgaattgtggccgacaaaatggaagttgcaaaagatagagttgccacaaagagagacctggacagtgaatgatatacagaagttagtaggagtattaaattgggcagctcaaatttatccaggtataaaaaccaaacatctctgtaggttaattagaggaaaaatgactctaacagaggaagttcagtggactgagatggcagaagcagaatatgaggaaaataagataattctcagtcaggaacaagaaggatgttattaccaagaaggcaagccattagaagccacggtaataaagagtcaggacaatcagtggtcttataaaattcaccaagaagacaaaatactgaaagtaggaaaatttgcaaagataaagaatacacataccaatggagttagactattagcacatgtaatacagaaaataggaaaggaagcaatagtgatctggggacaggtcccaaaattccacttaccagttgagagggatgtatgggaacagtggtggacagactattggcaggtaacctggataccggagtgggattttatctcaacgccaccactagtaagattagtcttcaatctagtgaaggaccctatagagggagaagaaacctattatacagatggatcatgtaataaacagtcaaaagaagggaaagcaggatatatcacagataggggcaaagacaaagtaaaagtgttagaacagactactaatcaacaagcagaattagaagcatttctcatggcattgacagactcagggccaaagacaaatattatagtagattcacaatatgttatgggaataataacaggatgccctacagaatcagagagcaggctagttaaccaaataatagaagaaatgattaaaaagtcagaaatttatgtagcatgggtaccagcacacaaaggtataggaggaaaccaagaaatagaccacctagttagtcaggggattagacaagttctcttcttggaaaagatagagccagcacaagaagaacatgataaataccatagtaatgtaaaagaattggtattcaaatttggattacccagaatagtggccagacagatagtagacacctgtgataaatgtcatcagaaaggagaagctatacatgggcaggtaaattcagatctagggacttggcaaatggactgtacccatctagaaggaaaaatagtcatagttgcagtacatgtagctagtggattcatagaagcagaagtaattccacaagagacaggaagacagacagcactatttctgttaaaattggcaggcagatggcctattacacatctacacacagataatggtgctaactttgcctcgcaagaagtaaagatggttgcatggtgggcagggatagagcacacctttggggtaccatacaatccacagagtcagggagtagtggaagcaatgaatcaccacctgaaaaatcaaatagatagaatcagggaacaagcaaattcagtagaaaccatagtattaatggcagttcattgcatgaattttaaaagaaggggaggaataggggatatgactccagcagaaagattaattaacatgatcactacagaacaagaaatacaatttcaacaatcaaaaaactcaaaatttaaaaattttcgggtctattacagagaaggcagagatcaactgtggaagggacccggtgagctattgtggaaaggggaaggagcagtcatcttaaaggtagggacagacattaaggtagtacccagaagaaaggctaaaattatcaaagattatggaggaggaaaagaggtggatagcagttcccacatggaggataccggagaggctagagaggtggcatag

gagpol多聚蛋白质猿猴免疫缺陷病毒(vpx)(蛋白质)(seqidno:164)

mgarnsvlsgkkadelekirlrpggkkkymlkhvvwaaneldrfglaesllenkegcqkilsvlaplvptgsenlkslyntvcviwcihaeekvkhteeakqivqrhlvvetgtaetmpktsrptapssgrggnypvqqiggnyvhlplsprtlnawvklieekkfgaevvpgfqalsegctpydinqmlncvgdhqaamqiirdiineeaadwdlqhpqpapqqgqlrepsgsdiagttssvdeqiqwmyrqqnpipvgniyrrwiqlglqkcvrmynptnildvkqgpkepfqsyvdrfykslraeqtdaavknwmtqtlliqnanpdcklvlkglgvnptleemltacqgvggpgqkarlmaealkealapvpipfaaaqkrgprkpikcwncgkeghsarqcraprrqgcwkcgkmdhvmakcpdrqagflglgpwgkkprnfpmaqvhqgltptappedpavdllknymqlgkqqresrekpykevtedllhlnslfggdq

实施例

基于lv介导基因转移，用于转移特异性ag衍生肽加mir155和mir146a(dc成熟的已知调节剂(dc-ag.mirna))的靶序列，伴il-10(dc-il-10/ag)或ido(dc-ido/ag)，开发出了生成致耐受性dc(tollvdc)的替代性策略或(图1)。为了确定tollv-dc作用的方式，发明人使用卵清蛋白(ova)作为模型ag。生成编码与ova315-353融合的ii的lv，其包含能被tcr转基因otiicd4⁺t细胞识别的ova323-339，并将该lv用于在dc分化期间转导骨髓(bm)细胞。将lv.liova315-353.mir155t.mir146at、lv.il-10.iiova315-353、lv.ido.iiova315-353，以及对照lv.iiova315-353用于获得下述：dc-ova、dc-ova.mirna、dc-il-10/ova、dc-ido/ova。lv-dc为cd11c⁺并以与未转导的dc相同的水平表达cd80、cd86和ii类mhc，(图2)。.dc-ova促进otiicd4⁺t细胞的增殖，而dc-il-10/ova诱导低otiicd4⁺t细胞增殖反应。相反，dc-ido/ova诱导的增殖与dc-ova诱导的增殖相当(图3)。值得注意的是，用dc-il-10/ova产生的t细胞对二次ova刺激无应变性(图4)，这表明用lv.il-10.iiova转导dc促进了在功能上可与dc-10高度相当(super-imposable)的dc群，所述dc-10是在有效促进无应变性ag特异性t细胞的il-10存在的情况下体外生成的细胞群((22)；wo2007/131575；us2016/0046910a1)。dc-ova.mirna促进otiicd4⁺t细胞增殖，但在lps激活后，mir155和mir146a介导的转录后调节消除了它们促进otiicd4⁺t细胞增殖的能力(图5)，这表明dc-ovamirna只在未成熟样阶段为应答状态的cd4⁺t呈递ova。

为了研究lv-dc的作用机制，发明人通过将cd45.1(95％)和cd45.2otii/firtiger(5％)骨髓(bm)细胞移植到经致死照射的cd45.1小鼠中来产生嵌合小鼠。otii/firtigercd4+t细胞是分别识别ova323-339和表达rfp和gfp作为foxp3和il10的报告基因的tcr转基因细胞。在完全重建时，用lv-de的不同亚组重复注射循环中具有约5％的otii/firtigercd4⁺t细胞的嵌合小鼠(图6，左图)。最后一次dc注射后5周，ova特异性cd45.2otiicd4⁺t细胞的频率在用dc-ova处理的小鼠的脾脏中显著高于用dc-gfp注射的小鼠(图6，右图)。此外，ova特异性cd4⁺t细胞的扩增在接受编码ova的不同致耐受性lv-dc的小鼠中是明显的，但对于gfp并非如此。此外，在用dc-ova或表达ova和致耐受性分子的致耐受性lv-dc处理的小鼠中，发明人观察到cd4⁺记忆t细胞的扩增(未显示)，这表明发生ova特异性t细胞的体内初免。然后，发明人使用报告基因和tr1特异性标志物cd49b和lag-3(90)的表达以及foxp3treg的cd25的表达研究了处理的嵌合小鼠中ova特异性treg的诱导。结果表明，相较于用dc-gfp或dc-ova处理的小鼠中观察到的结果，注射dc-ova.mirna或dc-il-10/ova促进显著更高的生成il-10的cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞的扩增(图7)。相反，lv-dc处理都不显著诱导foxp3⁺treg的扩增(未显示)。在用dc-ova体外再刺激后，分离自致耐受性lv-dc处理的小鼠的t细胞呈低响应性(hypo-responsive)，相较于通过分离自注射dc-ova的小鼠的t细胞观察到的结果，其通过otiicd4⁺t细胞的低增殖能力证明(图8)。

鉴于调节cd4+和cd8+t细胞应答的目的，发明人生成了编码ova242-353的lv，其包含tcr转基因otiicd4⁺t细胞识别的ova323-339和tcr转基因oticd8⁺t细胞的ova257-264(siinfekl)。bm细胞经lv.iiova315-353或lv.iiova242-353转导，并将工程改造的dc-ova315-353和dc-ova242-353用于刺激otii和oti细胞。dc-ova均促进oticd4+t细胞的增殖，而dc-ova242-353(而不是dc-ova315-353)促进oti细胞的增殖(图9)。这些数据表明lv-dc可以经工程改造，以调节cd4⁺和cd8+t细胞反应。

这些结果表明，与不变链融合的ag的lv介导的基因转移给予dc在体外和体内呈递和促进ag特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞增殖的能力。此外，在lv主链中添加致耐受元件(mirna靶序列、il-10或ido)，确保在高水平il-10和ido存在的情况下由dc或未成熟样dc的编码ag的呈递，有利于产生促进ag特异性t细胞低反应性的调节性dc，并且，在dc-ova.mirna或dc-il-10/ova情况中，有利于ag特异性tr1细胞的扩增。

为了研究lv-dc体内和体外调节糖尿病t细胞反应的功效，生成这样的lv，所述lv编码与insb4-29融合的li，其仅包含糖尿病肽insb9-23或者与mirna155和146a靶序列、il-10或ido组合，并将所述lv用于转导分离自nod小鼠的bm细胞(dc分化期间)。将lv.liinsb4-29.mir155t.mir146at、lv.il-10.iiinsb4-29、lv.ido.iiinsb4-29和作为对照的lv.liinsb9-23和lv.iiova315-35用于获得dc-insb.mirna、dc-il-10/insb、dc-ido/insb、dc-insb和dc-ova。lv-dc为cd11c⁺并以与未转导的dc相似的水平表达ii类mhci-a^g7和cd86(未显示)。当用dc-insb刺激时，从糖尿病nod小鼠分离的cd4⁺t细胞增殖，但用dc-ova刺激时不增殖(图10)。与用ova获得的结果相似，相较于对照dc-insb，dc-il-10/insb促进低cd4⁺t细胞增殖。相反，用dc-insbmirna和dc-ido/insb刺激的t细胞增殖与用dc-insb刺激的细胞增殖一样多(图10)。

发明人接下来研究了lv-dc的体内生物分布和存活。因此，在dc分化期间的第2天，用编码荧光素酶的lv转导分离自balb/c小鼠的bm细胞。将lv-dc^luc静脉内(i.v.)或腹腔内(i.p.)注射到balb/c受体小鼠中，并通过生物发光成像(bli)监测生物分布和lv-dc^luc存活，如所预期，静脉内或腹腔内注射后，lv-dc^luc分别定位于肺和腹膜。从第6天开始，静脉内注射的lv-dc^luc定位于脾脏，而从第2天开始，腹腔内注射的lv-dc^luc定位于脾脏。注射的细胞在第8-10天逐渐消失(图11)。通过腹腔内注射细胞研究lv-dc预防t1d发展的功效。为此，10周龄nod雌性小鼠被重复注射dc-insb、dc-insbmirna、dc-il-10/insb、dc-ido/insb和dc-ova。结果显示，相较于用dc-ova(p＝0.0028)或dc-insb(p＝0.0407)处理的对照小鼠，通过dc-ido/insb的ido组成型表达显著减少nod小鼠中的t1d发展(图11)。给予dc-il-10/insb导致较温和但不显著的疾病控制，而dc-insbmirna处理的nod小鼠表现出延迟t1d发作，相较于dc-ova处理的对照。

最后一次dc注射后15周处死经处理的小鼠，并分析脾脏和胰腺淋巴结中treg的频率。总之，未观察到cd49b⁺lag-3⁺tr1细胞或cd25⁺foxp3⁺treg的特异性诱导(图12)，以及分离自lv-dc处理的小鼠的cd4⁺t细胞对insb9-23的增殖反应的高可变性，这与注射的lv-dc亚型无关(未显示)。

总之，发明人通过基于编码特定自身ag和致耐受性分子的lv的前沿技术开发了一种高效而强大的方法，以生成稳定且有效的致耐受性dc。

为了将基于lv的方法转化到人细胞，发明人首先开发了一种促进bdlv介导的人dc转导的有效方案。为此，在dc分化的第0天、第2天或第5天，cd14⁺细胞用或不用包含猴免疫缺陷病毒(siv)衍生的辅助蛋白vpxvpl的病毒样颗粒预处理，抵消samhd1介导的限制(图13左图)。在分析的所有时间点，用vpx-vpl预处理改善了转导效率，当在第0天用vpx-vpl预处理细胞时达到较高的效率(图13右图)。重要的是，第0天进行的vpx-vpl预处理不影响培养结束时产生的细胞的激活(图14)。时程分析表明，暴露于vpx-vpl一小时足以达到95％的转导效率(图38)。

利用已建立的方案来生成工程改造的人lv-dc，发明人首先研究了lv共编码il-10和δngfr以生成dc^il-10的能力，所述δngfr是之前用于生成tr1样(cd4^il-10)细胞((40、85)wo2016146542)的选择的标志物。cd14⁺细胞用vpx-vpl处理6-8小时，然后在dc分化的第0天用lv-il-10/δngfr(dc^il-10)或lv-gfp/δngfr(dc^gfp)转导。作为对照，发明人采用了通过用gm-csf和il-4或分别gm-csf、il-4和il-10培养cd14⁺细胞得到的分化自相同供体的dc-10和未转导的dc(dc^ut)。两种载体高效转导人dc，实现高达98％的转导，如δngfr表达所示(图15左图)。分析dc-10相关标志物的表达表明，dc^il-10表达cd14、cd16、cd141、cd163、ilt4和hla-g，而dc^gfp细胞的对照dc^ut不表达(图15右图)。相较于dc-10，dc^il-10在稳态和激活时分泌显著较高水平的il-10。重要的是，类似于dc-10，dc^il-10在活化后并不产生il-12(图16)。类似于dc-10，dc^il-10在同种异体t细胞(cd4⁺和cd8⁺t细胞)中促进低反应性(图17)。发明人接下来比较了dc^il-10相较于dc-10促进无应变性同种异体特异性tr1细胞的能力。为此，用dc^il-10刺激同种异体cd4⁺t细胞10天，或者用dc^gfp、dc^ut和dc-10作为对照进行。在测试的所有供体中，相较于用dc^ut初免的t细胞(t-dc^ut)或用dc^gfp初免的t细胞(t-dc^gfp)，用dc^il-10初免的cd4⁺t细胞(t-dc^il-10)，与用dc-10激活的细胞(t-dc-10)类似，与用于其初免的相同的自身ag再次刺激，呈无变应性(图18)。此外，相较于t-dc^ut和t-dc^gfp细胞，t-dc^il-10和t-dc-10细胞包含显著更高比例的tr1细胞(图19，左图)。相较于t-dc-10，t-dc^ut和t-dc^gfp细胞，在经与用于其初免的相同的自身ag再次刺激时，t-dc^il-10细胞分泌显著更高水平的il-10(图19，右图)。

总之，这些发现表明lv介导的il-10基因转移转化人dc于dc-10样细胞，赋予了调节同种异体t细胞和促进无变应性同种异体特异性tr1细胞分化的能力。

为了研究dc^il-10预防移植物抗宿主病(gvhd)的能力，发明人通过在dc分化期间用lv-il-10/δngfr转导分离自balb/c小鼠的bm细胞生成了鼠dc^il-10。作为对照，生成了用lv-gfp/δngfr转导的bm细胞(dc^gfp)。然后，将鼠dc^il-10和dc^gfp过继转移到balb/c小鼠，所述经致死辐照并注射有同种异体(c57bl/6)bm细胞和脾细胞。未处理的小鼠或用dc^gfp处理的小鼠发展出致命的gvhd，然而单一注射dc^il-10显著延迟了gvhd(图20)。

为了生成ag特异性人lv-dc，发明人设计了这样的lv构建体，其编码与自身ag衍生肽融合的iip33的人clip序列(ii类mhc分子的不变链p33结合结构域)。发明人生成了这样的lv，其编码与胰岛素b4-29序列融合的iip33(lv.insb4-29)或与α2-醇溶蛋白51-80融合iip33(lv.glia51-80)。使用优化方案用lv转导分化dc的单核细胞，这预示了在无血清培养基中用vpx-vpl预处理cd14⁺前体(图21)。分化后，通过dc-sign的表达监测dc分化。如图22所示，人lv转导的细胞是dc-sign⁺，并且在lv-il-10/ag转导的细胞(dc-il-10/ag)的情况中，所得dc还表达cd14。在对照lv-δngfr/ag转导细胞的情况中，用δngfr表达评估转导效率。在lv-il-10/ag转导的细胞的情况中，通过针对il-10的胞浆内染色来监测转导效率。具体地，dc-il-10/ag和用lv-clip(dc^clip)或用lv-δngfr/ag(dc-ag)转导的dc(作为对照)保持未刺激或用lps/ifn-g激活24小时，并针对il-10进行染色。结果表明：dc-il-10/ag在稳态和激活后表达il-10，然而在刺激后，仅有4-10％的dc^clip和dc-ag表达il-10(图23)。在lv-ido/ag转导的细胞的情况中，通过ido表达监测转导效率。如图24所示，dc-ido/ag表达ido，而dc^clip和dc-ag几乎不表达ido。

类似于dc^il-10，dc-il-10/ag表达高水平的dc-10相关标志物，包括cd14、cd141、cd163和ilt4，然而不获得hla-g的表达(图25)。相反，dc-ido/ag与dc^ut、dc^clip和dc-ag存在表型相似性(未显示)。dc-il-10/ag的细胞因子产生概况表明，类似于dc^il-10和dc-10，这些细胞在稳态或在lps/ifn-g刺激后分泌显著较高水平的il-10以及低水平的il-12(图26和图27)。dc-ido/ag显示了与dc^ut、dc^clip和dc-ag高度相当(super-imposable)的细胞因子概况(未显示)。

dc-il-10/ag的功能特征表明，与持续诱导hla限制性t细胞中ag特异性增殖反应的dc-ag，il-10的伴随性(concomitant)过表达下调ag特异性t细胞的增殖(图28)。重要的是，用dc-il-10/ag刺激自体同源t细胞10天促进含有高频率cd49b+lag-3+tr1细胞的ag特异性无变应性t细胞的诱导(图29)。dc-ido/ag促进自体同源t细胞的增殖，类似于对照dc-ag诱导的增殖(图30)，并且用dc-ido/ag刺激自体同源t细胞10天促进含有高比例的foxp3+ctla4+细胞的细胞群的诱导(图31)。

总之，这些数据表明，用编码与特异性ag融合的不变链(ii)的lv工程改造的dc产生能够调节ag特异性t细胞反应并促进ag特异性tr1细胞或foxp3+t细胞体外和体内细胞分化的致耐受性dc群，所述特异性ag与mir155和mir146a的多个靶序列(dc成熟的已知调节剂(dc-ag.mirna))或与il-10(dc-il-10/ag)或ido(dc-ido/ag)联合(couple)。

根据上述证据，可以使用示例性方法获得对t效应细胞的强抑制和/或对t调节性细胞的强激活。

作为与dc-10相似的dc^il-10，我们通过刺激同种异体cd4⁺t细胞10天来研究它们在体外促进同种异体特异性tr1细胞的能力。在所有测试的供体中，相较于用dc^ut和dc^gfp初免t细胞(分别为[t(dc^ut)和t(dc^gfp)细胞])，用dc^il-10初免cd4⁺t细胞([t(dc^il-10)细胞])包含较高比例的tr1细胞(图19)。用与用于初免的dc自体同源的成熟dc(mdc)再刺激的t(dc^il-10)细胞，相较于(t-dc^ut)和(t-dc^gfp)细胞以较低水平进行增殖(图32)，相较于(t-dc^ut)和(t-dc^gfp)细胞产生显著较高水平的il-10，但是相似水平的ifn-γ。最终，使用来自与用于初免的dc的同一供体的mdc，t(dc^il-10)细胞抑制自体同源cd4⁺t细胞增殖，其平均抑制为67％(图33)。总之，这些发现表明人dc中lv介导的il-10基因转移促进人dc^il-10的生成，赋予调节同种异体t细胞应答和促进同种异体特异性tr1细胞体外分化的能力。

为了评估dc^il-10的体内调节活性，发明人利用了最近开发的用人脐血cd34⁺细胞使nsg小鼠再群体化的方案。在亚致死性辐照的新生nsg小鼠中肝内注射人cd34⁺细胞允许人cd45⁺t细胞有效地植入骨髓(bm)并在外周中分化淋巴(b、t效应细胞和t调节性细胞)和骨髓成熟细胞(91)。通过静脉内注射经辐照的同种异体人apc对重建的hunsc小鼠进行免疫，之后仅用自体同源dc^ut或用dc^il-10(dc^ut+dc^il10)或dc^gfp(dc^ut+dc^gfp)增强免疫7天(图34)。用dc^il-10进行的处理预防同种异体dc^ut诱导的cd4⁺t细胞的体内增殖，通过ki67染色评估(图34)。这些数据表明，人dc^il-1调节体内同种异体t细胞反应。

基于dc的细胞产物的关键方面之一是其稳定性(即激活后维持tr1细胞的诱导和刺激活性、特异性标志物的表达、细胞因子的分泌)，因此，发明人评估了用不同tlr激动剂(即lps、李斯特菌属(listeria)、鞭毛蛋白、polii:c和cpg)或混合的促炎细胞因子(il-1b、tnf-a和il-6)的体外刺激后的dc^il-10的表型。类似于之前dc-10中获得的数据(92)，激活后，dc^il-10稳定地表达cd163和cd141(图35)。相反，cd16表达受到用lps或李斯特菌属的激活的影响(图35)。相较于未刺激dc^il-10的，激活的dc^il-10中未观测到cd14和cd1a表达显著变化(图35)。用lps、李斯特菌属和cpg刺激dc^il-10后，cd86的表达显著上调，同时观测到对cd83和hla-dr表达没有影响(图35)。虽然dc^il-10中hla-g表达在激活后保持稳定(未显示)，但是ilt4的表达在经历lps和李斯特菌属或polii:c和cpg刺激后分别显著增加或降低(图36)。由于ilt4在dc-10介导的tr1细胞诱导中起重要作用(22)，发明人选择lps和polii:c来刺激dc^il-10并研究其体外致耐受性活性。与刺激无关，激活的dc^il-10在稳态和lps/ifng刺激后分泌大量的il-10，而不存在il-12。tlr刺激后，dc^il-10培养物中诱导的tr1细胞的百分比较低，但是仍高于dc^gfp培养物(图36)。在用与用于初免的dc自体同源的mdc再刺激时，t(stim-dc^il-10)呈无变应性，即使相较于t(unstim-dc^il-10)，其无反应性不明显。类似地，相较于t(unstim-dc^il-10)，t(stim-dc^il-10)中il-10产生的水平较低，但相较于t(dc^gfp)，其水平较高(图37)。忽略观察到的tr1标志物表达、无变应性和细胞因子产生的差异，t(stim-dc^il-10)的抑制能力与t(unstim-dc^il-10)相当(图37)。总之，我们得出这样的结论，通过激活的dc^il-10诱导的tr1细胞与通过未刺激的dc^il-10诱导的那些细胞一样强大，因此tlr刺激不会改变dc^il-10的致耐受能力。

lv颗粒上的cd47与其配体sirp-α在靶细胞上的相互作用通过减少经吞噬作用的lv颗粒摄取来损害转导效率。因此，发明人验证了lv颗粒上cd47的表达是否改变了人dc的转导效率。为此，他们用表面具有不同水平的人cd47(hucd47)的lv颗粒(高hucd47lv>lv>无hucd47lv)进行了dc前体的转导。有趣的是，lv介导的表达sirp-a的dc前体的转导在使用无hucd47lv颗粒时显著增加(图39)。

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序列表

<110>圣拉斐尔医院有限公司（ospedalesanraffaelesrl）

泰莱托恩基金会（fondazionetelethon）

圣拉斐尔基金会中心（fondazionecentrosanraffaele）

<120>工程改造的细胞的产生及其用途

<130>pct140607

<150>ep18178595

<151>2018-06-19

<160>164

<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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serhisleuvalglualaleutyrleuvalcysglygluglugly

151015

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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serhisleuvalglugluleutyrvalleuvalcysglygluglugly

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<212>prt

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<212>prt

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<220>

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ileval

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<220>

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<220>

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<212>prt

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argvalleuasnileaspleuleutrpservalproile

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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<212>prt

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<220>

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1510

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<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>19

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15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>20

metglupheleugluargthrtyrleuvalasnasplysalaalalys

151015

methisalaphe

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>21

tyrleuvalasnasplysalaalalysmethisalaphethrleuglu

151015

servalgluleu

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>22

serleutrpleuserserlysproproserlysargleuthrphegly

151015

trphisargala

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>23

proproserlysargleuthrpheglytrphisargalagluileleu

151015

glyalaleuleu

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>24

pheilepheserileleuvalleualaserthrilethrileleulys

151015

asppheserile

20

<210>25

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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leulysasppheserileleuleumetgluglyvalprolysserleu

151015

asntyrsergly

20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>26

serleuasntyrserglyvallysgluleuileleualavalaspgly

151015

valleuserval

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>27

pheglytrphisargalagluileleuglyalaleuleuserileleu

151015

cysiletrpval

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>28

thrmetasnglnvalileleuseralahisvalalathralaalaser

151015

argaspsergln

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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lyspheglyalaaspalaargalaleumetleuglnglyvalaspleu

151015

leualaaspala

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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asnprovalgluileargargglyvalmetleualavalaspalaval

151015

ilealagluleu

20

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<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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glnserilevalproalaleugluilealaasnalahisarglyspro

151015

leuvalileileala

20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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151015

alaproglyphe

20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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ilevalleuglyglyglycysalaleuleuargcysileproalaleu

151015

aspserleuthr

20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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151015

thralaleuleu

20

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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serproserleutrpgluilegluphealalysglnleualaserval

151015

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(6)..(6)

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1510

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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151015

tyrglnasplys

20

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<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>x是瓜氨酸

<400>39

valvalleuleuvalalathrgluglyxaavalargvalasnserala

151015

tyrglnasplys

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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seralavalargalaargserservalproglyvalarg

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<212>prt

<213>人工序列

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seralavalargalacysilethrserservalproglyvalarg

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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1510

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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glntyrmetcysilethralaaspglnalaalaglyglyleuarg

151015

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<212>prt

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alaglyphelysglygluglnglyprolysglyglupro

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alaglyphelysglyglyglygluglnglyprolysglyglupro

151015

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<220>

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hiscysleuglylystrpleuglyhisproasplysphe

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2025

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<220>

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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leutrptrpvalasnasnglnserleuprovalserpro

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<213>人工序列

<220>

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151015

pro

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<213>人工序列

<220>

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propheproglnproglnleuprotyrproglnproglnleupro

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

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151015

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<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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<212>prt

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<220>

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<220>

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<212>prt

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<220>

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1510

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<220>

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1510

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<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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151015

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<213>人工序列

<220>

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gluargvallysilegln

20

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ilealagly

<210>75

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>75

glnalathrglnlysilethrtyrargileserglyvalglyileasp

151015

gln

<210>76

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>76

propheglyilephevalvalasplysasnthrglyaspileasnile

151015

thr

<210>77

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>77

hisleuasnserlysilealaphelysilevalserglngluproala

151015

gly

<210>78

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>78

glythrprometpheleuleuserargasnthrglygluvalargthr

151015

leu

<210>79

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>79

glncysglucysasnilelysvallysaspvalasnaspasnphepro

151015

met

<210>80

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>80

servallysleuserilealavallysasnlysalagluphehisgln

151015

ser

<210>81

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>81

asnvalarggluglyilealapheargproalaserlysthrphethr

151015

val

<210>82

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>82

iletyrvalasnvalgluprothrpheglnargthrleuhislysthr

151015

lys

<210>83

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>83

glygluileargthrmetasnasnpheleuasparggluiletyrval

151015

asnvalglupro

20

<210>84

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>84

metasnasnpheleuasparggluiletyrasnvalgluprothrphe

151015

glnargthr

<210>85

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>85

asparggluiletyrvalasnvalgluprothrpheglnargthrleu

151015

hislysthrlys

20

<210>86

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>86

thrleuthrleuleuproleuleualaasnasnarggluargarggly

151015

ilealaleuasp

20

<210>87

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>87

asnarggluargargglyilealaleuaspglylysilelyshisglu

151015

aspthrleu

<210>88

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>88

leuleualaasnasnarggluargargglyilealaleuaspglylys

151015

ilelyshisglu

20

<210>89

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>89

alaserserthrileilelysgluglyileaspargthrvalleugly

151015

ileleuvalser

20

<210>90

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>90

tyrglnilelysvallysleuthrvalserglypheglygluleuthr

151015

serserglu

<210>91

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>91

metalaalaserglylysthrserlyssergluproasnhisvalile

151015

phelyslys

<210>92

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>92

glnvalglnprovalaspglyvalvalleuvalaspproaspleuval

151015

lysglylyslys

20

<210>93

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>93

valtyrvalthrleuthrcysalapheargtyrglyglngluaspval

151015

aspvalilegly

20

<210>94

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>94

leuthrpheargargaspleutyrpheserargvalglnvaltyrpro

151015

provalglyala

20

<210>95

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>95

propheleuleuthrpheproasptyrleuprocysservalmetleu

151015

glnproalapro

20

<210>96

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>96

glnaspserglylyssercysglyvalaspphegluvallysalaphe

151015

alathraspser

20

<210>97

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>97

thraspalaglugluasplysileprolyslysserservalargtyr

151015

leuileargser

20

<210>98

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>98

phemetserasplysproleuhisleualavalserleuasnargglu

151015

iletyrphehis

20

<210>99

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>99

glygluproileprovalthrvalthrvalthrasnasnthrglulys

151015

thrvallyslys

20

<210>100

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>100

ilelysalacysvalgluglnvalalaasnvalvalleutyrserser

151015

asptyrtyrval

20

<210>101

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>101

glylysilelyshisgluaspthrasnleualaserserthrileile

151015

lysgluglyile

20

<210>102

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>102

glygluleuthrsersergluvalalathrgluvalpro

1510

<210>103

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>103

leuthrsersergluvalalathrgluvalpro

1510

<210>104

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>104

phelysasptyrserservalvalargprovalgluasphisarggln

151015

valvalgluvalthrvalglyleuglnleuileglnleuileasnval

202530

aspgluvalasnglnile

35

<210>105

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>105

leuglythrtrpthrtyraspglyservalvalalaileasnproglu

151015

ser

<210>106

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>106

vallyslysilehisileproserglulysiletrpargproaspleu

151015

valleutyrasnasnalaaspglyaspphealailevallysphethr

202530

lysvalleuleuglntyrthrglyhis

3540

<210>107

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>107

ilehisileproserglulysiletrpargproaspleuvalleutyr

151015

<210>108

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>108

leuglythrtrpthrtyraspglyvalvalalaileasnprogluser

151015

<210>109

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>109

aspprothrtyrleuaspilethrtyrhisphevalmetglnargleu

151015

proleu

<210>110

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>110

aspthrprotyrleuaspilethrtyrhisphevalmetglnargleu

151015

proleu

<210>111

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>111

valilevalgluleuileproserthrserseralaval

1510

<210>112

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>112

lyssertyrcysgluileilevalthrhisphepropheaspglugln

151015

asncyssermetlysleugly

20

<210>113

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>113

proargtrpasnglyglulysleutyrglnglualaarglysileval

151015

glyalametval

20

<210>114

<211>32

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>114

aspleuglytrpglyvalvalglythrhisalaalaproalahisgly

151015

glnalaleuglyalavalglyhistrpleuvalleuleutrpglnleu

202530

<210>115

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>115

ctactgaagtatacgtaaagtgg23

<210>116

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>116

cttgtttagagctccatcaaagg23

<210>117

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>117

atcgagctaaaatatcgtgttgg23

<210>118

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>118

ttcctttccaggatcagctcagc23

<210>119

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>119

ttgattcaaaggagtacctatccc24

<210>120

<211>645

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>120

atggatgaccaacgcgacctcatctctaaccatgaacagttgcccatactgggcaaccgc60

cctagagagccagaaaggtgcagccgtggagctctgtacaccggtgtctctgtcctggtg120

gctctgctcttggctgggcaggccaccactgcttacttcctgtaccagcaacagggccgc180

ctagacaagctgaccatcacctcccagaacctgcaactggagagccttcgcatgaagctt240

ccgaaatctgccaaacctgtgagccagatgcggatggctactcccttgctgatgcgtcca300

atgtccatggataacatgctccttgggcctgtgaagaacgttaccaagtacggcaacatg360

acccaggaccatgtgatgcatctgctcacgaggtctggacccctggagtacccgcagctg420

aaggggaccttcccagagaatctgaagcatcttaagaactccatggatggcgtgaactgg480

aagatcttcgagagctggatgaagcagtggctcttgtttgagatgagcaagaactccctg540

gaggagaagaagcccaccgaggctccacctaaagagccactggacatggaagacctatct600

tctggcctgggagtgaccaggcaggaactgggtcaagtcaccctg645

<210>121

<211>215

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>121

metaspaspglnargaspleuileserasnhisgluglnleuproile

151015

leuglyasnargproarggluprogluargcysserargglyalaleu

202530

tyrthrglyvalservalleuvalalaleuleuleualaglyglnala

354045

thrthralatyrpheleutyrglnglnglnglyargleuasplysleu

505560

thrilethrserglnasnleuglnleugluserleuargmetlysleu

65707580

prolysseralalysprovalserglnmetargmetalathrproleu

859095

leumetargprometsermetaspasnmetleuleuglyprovallys

100105110

asnvalthrlystyrglyasnmetthrglnasphisvalmethisleu

115120125

leuthrargserglyproleuglutyrproglnleulysglythrphe

130135140

progluasnleulyshisleulysasnsermetaspglyvalasntrp

145150155160

lysilepheglusertrpmetlysglntrpleuleupheglumetser

165170175

lysasnserleugluglulyslysprothrglualaproprolysglu

180185190

proleuaspmetgluaspleuserserglyleuglyvalthrarggln

195200205

gluleuglyglnvalthrleu

210215

<210>122

<211>126

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>122

tgtggcatctcctcagcagagagcctgaagatatctcaagctgtccatgcagcacatgca60

gaaatcaatgaagcaggcagagaggtggtagggtcagcagaggctggagtggatgctgca120

agctga126

<210>123

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>123

cysglyileserseralagluserleulysileserglnalavalhis

151015

alaalahisalagluileasnglualaglyarggluvalvalglyser

202530

alaglualaglyvalaspalaalaser

3540

<210>124

<211>345

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>124

tgcatgttggtgctgttgcctgatgaagtctcaggccttgagcagcttgagagtataatc60

aactttgaaaaactgactgaatggaccagttctaacgttatggaagagaggaagatcaaa120

gtgtacttacctcgcatgaagatggaggaaaaatacaacctcacatctgtcttaatggct180

atgggcattactgacgtgtttagctcttcagccaatctgtctggcatctcctcagcagag240

agcctgaagatatctcaagctgtccatgcagcacatgcagaaatcaatgaagcaggcaga300

gaggtggtagggtcagcagaggctggagtggatgctgccagctga345

<210>125

<211>114

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>125

cysmetleuvalleuleuproaspgluvalserglyleugluglnleu

151015

gluserileileasnpheglulysleuthrglutrpthrserserasn

202530

valmetglugluarglysilelysvaltyrleuproargmetlysmet

354045

gluglulystyrasnleuthrservalleumetalametglyilethr

505560

aspvalpheserserseralaasnleuserglyileserseralaglu

65707580

serleulysileserglnalavalhisalaalahisalagluileasn

859095

glualaglyarggluvalvalglyseralaglualaglyvalaspala

100105110

alaser

<210>126

<211>81

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>126

cagcacctttgtggttcccacctggtggaggctctctacctggtgtgtggggagcgtggc60

ttcttctacacacccatgtaa81

<210>127

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>127

glnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyrleuvalcys

151015

glygluargglyphephetyrthrpromet

2025

<210>128

<211>81

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>128

cagcacctttgtggttcccacctggtggaggctctctacctggtgtgtggggagcgtggc60

ttcttctacacacccatgtaa81

<210>129

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>129

glnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyrleuvalcys

151015

glyglugluglyphephetyrthrpromet

2025

<210>130

<211>256

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>130

cacacaaatgtctgcttctggtttgtacctcctagtttgcgcactctggaagacaatgaa60

gagagaatgagccgcctctcaaaggtggcgccagtgattaaagccagaatgatggagtat120

gggaccacaatggtcagctaccaacccttaggggacaaggtcaacttcttccgcatggtc180

atctcaaaccctgcagcaactcaccaagacattgacttccttattgaagaaatcgaacgc240

ctcggacaagatttgt256

<210>131

<211>85

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>131

histhrasnvalcysphetrpphevalproproserleuargthrleu

151015

gluaspasnglugluargmetserargleuserlysvalalaproval

202530

ilelysalaargmetmetglutyrglythrthrmetvalsertyrgln

354045

proleuglyasplysvalasnphepheargmetvalileserasnpro

505560

alaalathrhisglnaspileasppheleuileglugluilegluarg

65707580

leuglyglnaspleu

85

<210>132

<211>75

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>132

actaacatgttcacctatgagatcgcccctgtatttgtgctgctagaatatgttacacta60

aagaaaatgagataa75

<210>133

<211>24

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>133

thrasnmetphethrtyrgluilealaprovalphevalleuleuglu

151015

tyrvalthrleulyslysmetarg

20

<210>134

<211>87

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>134

gaggcctttgaacacactccaggagtccacatggccagcttgagtgtgtacctgaagacc60

aacgtcttcctcttcctgtttgcctaa87

<210>135

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>135

glualaphegluhisthrproglyvalhismetalaserleuserval

151015

tyrleulysthrasnvalpheleupheleupheala

2025

<210>136

<211>123

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>136

gaggtggaggaccctcaggtggcccagctggagctgggcggcggccctggcgccggcgac60

ctgcagaccctggccctgtggagcagaatggaccagctggccaaggagctgaccgccgag120

tga123

<210>137

<211>40

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>137

gluvalgluaspproglnvalalaglnleugluleuglyglyglypro

151015

glyalaglyaspleuglnthrleualaleutrpserargmetaspgln

202530

leualalysgluleuthralaglu

3540

<210>138

<211>435

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>138

atggatgaccagcgcgaccttatctccaacaatgagcaactgcccatgctgggccggcgc60

cctggggccccggagagcaagtgcagccgcggagccctgtacacaggcttttccatcctg120

gtgactctgctcctcgctggccaggccaccaccgcctacttcctgtaccagcagcagggc180

cggctggacaaactgacagtcacctcccagaacctgcagctggagaacctgcgcatgaag240

cttcccaagcctcccaagcctgtgagcaagatgcgcatggccaccccgctgctgatgcag300

gcgctgcccatgggagccctgccccaggggcccatgcagaatgccaccaagtatggcaac360

atgacagaggaccatgtgatgcacctgctccagagtcactggaactggaggacccgtctt420

ctgggctgggtgtga435

<210>139

<211>144

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>139

metaspaspglnargaspleuileserasnasngluglnleupromet

151015

leuglyargargproglyalaprogluserlyscysserargglyala

202530

leutyrthrglypheserileleuvalthrleuleuleualaglygln

354045

alathrthralatyrpheleutyrglnglnglnglyargleuasplys

505560

leuthrvalthrserglnasnleuglnleugluasnleuargmetlys

65707580

leuprolysproprolysprovalserlysmetargmetalathrpro

859095

leuleumetglnalaleuprometglyalaleuproglnglypromet

100105110

glnasnalathrlystyrglyasnmetthrgluasphisvalmethis

115120125

leuleuglnserhistrpasntrpargthrargleuleuglytrpval

130135140

<210>140

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