在多个主要组织相容性复合体分子上受限的NY-ESO-1特异性T细胞受体的组合物

相关申请案的交叉引用本申请案依据美国法典第35篇第119条(e)款(35u.s.c.section119(e))要求共同待决和共同受让的美国临时专利申请案序列号62/727,485的权益，其于2018年9月5日提交且名称为“compositionofny-eso-1-specifictcellreceptorsrestrictedonmultiplemajorhistocompatibilitycomplexmolecules”，该申请案以引用的方式并入本文。关于联邦政府资助的研究与开发的声明本发明在国立卫生研究院(thenationalinstitutesofhealth)授予的政府资助号ca132681和ca197633的支持下完成。政府对本发明享有一定权利。序列表本申请含有以ascii格式以电子方式提交的序列表并且在此以引用的方式整体并入。在2019年8月28日创建的所述ascii副本的名称是30435_364-wo-u1_sl.txt并且大小是101,375个字节。本发明涉及适用于αβt细胞受体基因疗法中的方法和材料。发明背景αβt细胞受体(tcr)决定了每个幼稚t细胞的独特特异性。在t细胞表面上与cd3信号蛋白组装后，tcr监视由主要组织相容性复合体(mhc)分子在有核细胞表面上呈递的肽配体。对于肽-mhc复合体，tcr的特异性是由呈递的mhc分子和呈递的肽共同决定。mhc基因座(在人类中也称为人白细胞抗原(hla)基因座)是人基因组中最多的等位基因座，包含>18,000个mhci类和ii类等位基因，其频率在族亚群中差异很大(1,2)。mhci类分子呈递的配体主要来源于内源表达抗原的蛋白酶体裂解。受感染的癌细胞会呈递被cd8+t细胞识别为外来或异常的肽，从而导致t细胞介导的呈递细胞杀伤。t细胞可被工程化，以通过转移肿瘤反应性αβtcr基因来杀死肿瘤细胞(3)。此方法的关键在于，患者表达治疗性tcr受其限制的mhc等位基因，并且靶向肽衍生自肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。由肿瘤特异性突变产生的私人(患者特异性)新抗原是此类靶标的潜在来源(4)。然而，个性化tcr基因疗法的实施由于需要以下操作而变得复杂：通过测序鉴定突变，分离突变反应性患者特异性tcr以及按需对患者t细胞进行基因修饰。对于无法进行测序的肿瘤以及几乎没有或没有新抗原的低突变负荷肿瘤，这仍然更具挑战性(5)。特别是对于这些最后的肿瘤类型，用现有的tcr靶向公有的(非患者特异性的)肿瘤限制性抗原仍然是一个有吸引力的选择。临床上首个被tcr基因疗法靶向的公有抗原是黑素细胞抗原mart1/melan-a，在2/15转移性黑色素瘤患者中产生客观反应(6)。使用更高亲和力的mart1反应性tcr(f5)可将反应率提高至30％，但由于mart1在皮肤、眼睛和中耳中的健康黑素细胞上的表达，还会产生多种副作用，包括白癜风、葡萄膜炎和短暂性听力丧失(7)。由于靶上/肿瘤外的反应性，靶向其他公有抗原的t细胞疗法已类似地产生病态或其他严重不良事件。例如，靶向癌胚抗原由于与正常结直肠组织的反应性而在转移性结直肠癌患者中产生严重的结肠炎(8)。更严重的是，针对靶标erbb2或mage-a3的t细胞疗法均导致死亡，这是由于靶抗原(或类似变体)在重要器官上的表达不准确所致(9,10)。因此，这些研究强调了严格鉴定肿瘤特异性公有抗原的重要性(11)，特别是当使用治疗成功所必需的充分表达的高亲和力靶向受体时(7,12)。ctag1b基因的产物ny-eso-1是现有的tcr基因疗法有吸引力的靶标。作为原型癌-睾丸抗原，ny-eso-1在正常的非生殖系组织中不表达，但在许多肿瘤中异常表达(13)。实体肿瘤中异常表达的频率范围为10-50％，黑色素瘤中为25-50％，且在滑膜肉瘤中高达80％(13-18)，在较高级别的转移性肿瘤组织中观察到表达增加(14,15,19)。此外，ny-eso-1具有高度免疫原性，可针对多个由各种mhc等位基因呈递的表位，引发自发的和疫苗诱导的t细胞免疫应答(20-23)。因此，在基因疗法试验中，由hla-a*02:01呈递的表位ny-eso-1157-165(sllmwitqc，(seqidno.36))已被同源1g4tcr靶向，在转移性黑色素瘤和滑膜肉瘤患者分别产生55％和61％的客观反应率并且未产生与靶向相关的不良事件(24,25)。在多发性骨髓瘤患者中用慢病毒介导的tcr基因疗法靶向这个相同的a2限制性表位同样会产生70％完全或近完全的反应，而无明显的安全隐患(26)。然而，令人遗憾的是，据报道，大多数对疗法有反应的患者会在几个月内复发，并且mhci基因座处杂合性的丧失是肿瘤逃逸靶向hla-a*02:01/ny-eso-1157-165的过继性t细胞疗法的一种机制(27)。因此，ny-eso-1是肿瘤特异性的免疫原性公有抗原，其在多种肿瘤类型中表达，在临床中安全地靶向，但在通过单一hla亚型靶向时很容易逃逸。由于上述原因，本领域需要适用于ny-eso-1tcr基因疗法的另外的方法和材料。技术实现要素：如上所述，可以将t淋巴细胞工程化以表达肿瘤特异性t细胞受体(tcr)基因，从而杀死癌细胞。这种被称为tcr基因疗法的方法是有效的，但如果靶标也在健康的非癌性组织中表达，则可能导致严重的不良事件。ny-eso-1是肿瘤特异性抗原，其已通过用于黑色素瘤、滑膜肉瘤和骨髓瘤的tcr基因疗法而成功地且安全地被靶向。然而，迄今为止，试验仅集中在hla-a*02:01上呈递的单个ny-eso-1衍生表位上，从而限制了在表达该等位基因的患者中的应用。如下所公开，开发了新的tcr，它们共同识别由多个mhc等位基因呈递的多个ny-eso-1衍生表位。因此，提供了将靶向免疫疗法扩展为更多种mhc单倍型的通用方法。本发明的实施方案包括用于制造和使用修饰的cd8+t细胞的方法和材料，所述修饰的cd8+t细胞包含编码某些αβt细胞受体多肽的核酸。本发明的实施方案包括例如安置于载体中的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码vαt细胞受体多肽和/或vβt细胞受体多肽。在典型的实施方案中，当包含vαt细胞受体多肽和/或vβt细胞受体多肽的vα/vβt细胞受体在cd8+t细胞中表达时，在cd8+t细胞表面上表达的异源vα/vβt细胞受体识别与人白细胞抗原a2、人白细胞抗原b07、人白细胞抗原b18或人白细胞抗原c03相关的ny-eso-1肽。在本文所公开的本发明的说明性工作实施方案中，异源t细胞受体包含命名为“3a1”、“4a2”、“5g6”、“9d2”、“1e4”、“2b8”或“3c7”的vα/vβt细胞受体。本发明的实施方案还包括本文所公开的许多不同的tcr核酸和多肽(例如，αβtcr核酸和用于tcr的编码的多肽，被命名为“3a1”、“4a2”、“5g6”、9d2”、“1e4”、“2b8”和“3c7”)。例如，本发明的实施方案包括一种物质组合物，其包含编码tcrvα和/或tcrvβ多核苷酸的一种或多种多核苷酸(通常安置于一种或多种载体中的多核苷酸)，包括：至少编码3a1tcrvα多肽(seqidno:3)的多核苷酸；至少编码3a1tcrvβ多肽(seqidno:4)的多核苷酸；至少编码4a2tcrvα多肽(seqidno:7)的多核苷酸；至少编码4a2tcrvβ多肽(seqidno:37)的多核苷酸；至少编码5g6tcrvα多肽(seqidno:10)的多核苷酸；至少编码5g6tcrvβ多肽(seqidno:11)的多核苷酸；至少编码9d2tcrvα多肽(seqidno:14)的多核苷酸；至少编码9d2tcrvβ多肽(seqidno:15)的多核苷酸；至少编码1e4tcrvα多肽(seqidno:18)的多核苷酸；至少编码1e4tcrvβ多肽(seqidno:19)的多核苷酸；至少编码2b8tcrvα多肽(seqidno:22)的多核苷酸；至少编码2b8tcrvβ多肽(seqidno:23)的多核苷酸；至少编码3c7tcrvα多肽(seqidno:26)的多核苷酸；或至少编码3c7tcrvβ多肽(seqidno:27)的多核苷酸。在本发明的典型实施方案中，这些多核苷酸还编码另外的氨基酸，诸如α和/或β多肽的恒定区、tm结构域、短的胞质尾等。在本发明的说明性实施方案中，组合物包含编码tcrvα多肽的多核苷酸组合有编码tcrvβ多肽的多核苷酸，其中此类多核苷酸被安置于一种或多种载体内，以使得vα/vβtcr可在用所述载体转导的哺乳动物细胞(例如cd8+t细胞)表面上表达，其中所表达的异源vα/vβtcr识别与人白细胞抗原相关的ny-eso-1肽。另一方面，本发明包括用于生成修饰的cd8+t细胞的方法，所述方法包括将编码本文所公开的tcr多肽的核酸引入t细胞(例如，由被诊断患有表达ny-eso-1抗原的癌症的个体获得的cd8+t细胞)中。另一方面，本发明包括一种组合物，其包含根据本文所述的方法生成的修饰的cd8+t细胞。另一方面，本发明包括治疗以ny-eso-1表达为特征的疾病或病状的方法。所述治疗方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的修饰的cd8+t细胞。在本发明的典型实施方案中，受试者患有癌症。在本发明的某些实施方案中，癌细胞形成实体肿瘤。在本发明的一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。通过下面的具体实施方式，本发明的其他目标、特征和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。然而，应当理解，尽管具体实施方式和特定实施例指示了本发明的一些实施方案，但它们是通过示例而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，并且本发明包括所有这样的修改。附图说明图1a-1e示出了与ny-eso-1特异性t细胞克隆的扩增和分离有关的公开内容。pbmc获自转移性黑色素瘤患者。示出了代表性hla-a2+,hla-cw3+供体的t细胞克隆策略。图1(a)提供了概述鉴定ny-eso-1反应性t细胞克隆的扩增和测试策略的示意图。将pbmc与28个ny-eso-118聚体肽(重叠12个氨基酸)一起培育，然后扩增10天，之后在bfa存在下用个别肽再刺激。在含有全表位序列的那些肽中，由患者mhc等位基因呈递的表位被染成红色、蓝色和绿色。图1(b)提供了在用个别ny-eso-1衍生的18聚体肽再刺激的扩增的pbmc中ifn-γ的胞内染色的代表性流式细胞术测量。图1(c)提供了概述使用经证实可引发t细胞反应的个别9聚体或10聚体肽的再扩增策略的示意图。图1(d)提供了显示在分选之前cd3+cd8+t细胞的ny-eso-1反应性亚群的代表性流式细胞术数据。分选的细胞在存在il-2和受辐照的自体pbmc的情况下扩增。图1(e)提供了显示在分选之后cd3+cd8+t细胞的ny-eso-1反应性亚群的代表性流式细胞术数据。图2a-2d提供与ny-eso-1特异性t细胞受体的克隆和功能筛选有关的公开内容。图2(a)提供了功能性tcr克隆策略的示意图。对于每个tcr，制备了两个合并有人或鼠类tcr恒定结构域的构建体。图2(b)提供了具有所描绘的与此项研究相关的表位的ny-eso-1的蛋白质序列(seqidno：28)。图2(c)提供了流式细胞术直方图，比较了用仅载体骨架、先前报道的1g4tcr和新型a2限制性ny-eso-1特异性tcr转染的hek293t细胞对hla-a2/ny157-165右旋体(dextramer)的结合。图2(d)提供了流式细胞术直方图，比较了用仅载体骨架或所示在除hla-a2以外的mhc等位基因上受限的新型ny-eso-1特异性tcr转染的hek293t细胞对所示肽-mhc右旋体的结合。转染实验进行两次，每次一式两份。显示了代表性直方图。图3a-3f提供了与a2限制性ny-eso-1特异性tcr的功能有关的公开内容。图3(a)提供了代表性流式细胞术绘图的叠加图，比较了表达具有人或鼠类恒定结构域的a2限制性tcr的jurkat和cd8+jurkat细胞对a2/ny-eso-1157-165右旋体的结合。图3(b)示出了来自如a中的两个独立实验的右旋体结合平均荧光强度测量结果。图3(c)示出了来自如b中的两个独立实验的右旋体结合平均荧光强度比率的测量结果。图3(d)示出了elisa，其测量与表达a2/mart26-35或a2/ny-eso-1157-165单链三聚体的k562靶细胞共培育48小时后从tcr转导的jurkat细胞分泌的il-2。重复实验3次，每次有两个技术复制品。示出了代表性实验的平均值±sd。图3(e)示出了elisa，其测量与黑色素瘤细胞系m257或a2+衍生物共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。重复实验至少三次，每次有两个技术复制品。示出了代表性实验的平均值±sd。图3(f)示出了绿色目标总面积随时间的incucyte测量值作为gfp+a2+m257细胞的tcr转导的t细胞介导的杀伤的量度。示出了四个技术复制品的平均值±sd。图4a-4j提供了与ny-eso-1tcr工程化的人t细胞的体内抗肿瘤功效有关的公开内容。图4(a和b)示出了以下实验设计的示意图：图4(a)生成ny-eso-1tcr工程化的人t细胞，及图4(b)研究这些工程化的t细胞在中nsg小鼠人前列腺肿瘤异种移植物模型中的抗肿瘤功效。pbmc：外周血单核细胞；nsg：免疫缺陷nod/scid/γc-/-小鼠。图4(c)示出了代表性流式细胞术绘图，表征了在过继性t细胞转移后第14天存在于实验小鼠的外周血中的工程化的人t细胞。图4(d)提供了显示工程化的人t细胞(门控为lngfr+hcd45+)在实验小鼠的外周血中的持久性的时程。图4(e和f)提供了以下的平均荧光强度测量值：图4(e)鼠类tcr及图4(f)过继性t细胞转移后第14天在实验小鼠的外周血中针对工程化的人t细胞的hla-a2/ny-eso-1右旋体。图4(g和h)提供了以下的横截面积测量值：图4(g)pc-3/hla-a2及图4(h)pc-3/hla-a2/ny-eso-1肿瘤。图4(i)提供了显示代表性肿瘤切片的免疫组织学图像。cd3+细胞以红色染色。上图比例尺：500μm；下图比例尺：50μm。图4(j)示出了cd3+细胞面积占整个肿瘤切片面积的百分比。两个实验的代表。数据表示为平均值±sem(n＝4-5)。ns：不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，通过单向anova。图5a-5e提供了与在除hla-a2以外的mhc等位基因上受限的ny-eso-1特异性tcr的功能有关的公开内容。图5(a)提供了代表性流式细胞术绘图的叠加图，比较了表达具有人或鼠类恒定结构域的新型tcr的jurkat和cd8+jurkat细胞对所指定的右旋体的结合。图5(b)提供了来自如(a)中的两个独立实验的所示右旋体结合平均荧光强度的测量结果。图5(c)示出了来自如(b)中的两个独立实验的相应右旋体结合平均荧光强度比率的测量结果。图5(d和e)提供了测量以下各物的elisa：图5(d)从tcr转导的jurkat细胞分泌的il-2或图5(e)与表达所示单链三聚体的k562靶细胞共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。重复实验三次，每次有两个技术复制品。示出了代表性实验的平均值±sd。图6a-6d提供了与以下有关的公开内容：靶向在多个mhc等位基因上受限的ny-eso-1表位拓宽了tcr基因疗法的应用并且使其面对mhc基因座处的杂合性丧失时具有稳健性。将用仅lngfr、a2限制性3a1tcr或b7限制性1e4tcr或3a1与1e4的1:1混合物转导的t细胞与hla-a2+egfp+靶细胞、hla-b7+egfp+靶细胞或1:1靶细胞混合物共培育48小时。图6(a和b)提供了elisa，其测量与图6(a)m257或图6(b)被工程化以表达egfp和hla-a*02:01或hla-b*07:02的pc-3肿瘤细胞系共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。pc-3系另外被工程化以表达ny-eso-1。m257系表达内源性ny-eso-1。重复实验三次，每次有4个或8个复制品。示出了代表性实验的平均值±sd。图6(c和d)示出了使用incucyte活细胞分析随时间测量的图6(c)m257和图6(d)pc-3肿瘤细胞系衍生物的t细胞介导的杀伤。相对于用lngfr转导的t细胞的治疗，将每种治疗在48小时内测量的每个时间点的绿色目标总面积(指示肿瘤细胞密度)归一化。重复实验三次，每次有4个或8个复制品。示出了代表性8复制品实验的结果。图7a-7e提供了与测定ny-eso-1特异性tcr的ec50有关的公开内容。图7(a和b)提供了elisa，其测量与被工程化以表达hla-a*02:01并用变化浓度的图7(a)mart126-35或(b)nyeso1157-165肽脉冲处理的k562共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。图7(c-e)提供了elisa，其测量与被工程化以表达图7(c)hla-b*07:02、图7(d)hla-b*18:01或图7(e)hla-c*03:04并用变化浓度的指示肽脉冲处理的k562共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。示出了两个技术复制品的平均值±sd。指示了ec50值和通过非线性曲线拟合确定的相关误差。图8a-8c提供了与异种移植物肿瘤系的建立和用于体内实验的输入t细胞的功能有关的公开内容。图8(a)提供了elisa，其测量与被工程化以表达(左)hla-a*02:01和ny-eso-1全蛋白质、(中)hla-a*02:01单独或(右)ny-eso-1全蛋白质单独的pc-3前列腺癌细胞系的衍生物共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。示出了两个技术复制品的平均值±sd。图8(b)提供了elisa，其比较与所示m257或pc-3靶细胞共培育48小时后从tcr转导的pbmc分泌的ifn-γ。转导后第4天，将tcr转导的pbmc针对cd3+/lngfr+分选，然后再扩增13天，之后进行共培养/elisa测定和体内实验。示出了具有两个技术复制品的代表性实验的平均值±sd。图8(c)提供了流式细胞术等高线图，其比较用于体内实验的tcr转导的pbmc的转导(lngfr+)水平。具体实施方式在实施方案的描述中，可以参考形成其一部分的附图，且附图是通过例示可实施本发明的特定实施方案来示出的。应理解，可利用其他实施方案并且可在不脱离本发明范围的情况下进行结构变化。本文描述或引用的许多技术和程序是本领域技术人员充分理解并通常采用的。除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号及其他科学名词或术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中被定义,用以明晰和/或方便参阅，并且在本文中纳入这种定义不一定被解释为与此领域中一般理解的相当大的差异。ny-eso-1是癌-睾丸抗原的典型例子，其在生殖细胞和胎盘细胞中的表达受到限制，并在肿瘤细胞中重新表达。已在广泛多种肿瘤类型中报道了ny-eso-1的表达，包括神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌。它引发自发的体液和细胞免疫应答的能力，以及其受限制的表达模式，使其成为癌症免疫疗法的良好候选靶标。参见，例如thomas等人,frontimmunol.2018；9:947.doi:10.3389/fimmu.2018.00947。本文的公开内容展示了与适用于ny-eso-1tcr基因疗法中的方法和材料有关的两个重要目标的实现。首先，由于具有更高强度和亲和力的tcr更有效，因此寻求鉴定靶向a2/ny-eso-1157-165的新tcr，其敏感性与临床使用的1g4tcr相当或更好。由于亲和力提高的tcr可具有交叉反应性(28-30)，因此建立了用于从患者血液中直接分离抗原反应性tcr的方案。在肿瘤杀伤测定中，在体外和体内，这些新型tcr中的两个在敏感性上均与1g4相当或更高。其次，为了拓宽ny-eso-1作为tcr基因疗法靶标的临床效用，使用了分离方案来鉴定靶向由除hla-a*02:01以外的常见mhc等位基因呈递的ny-eso-1表位的tcr。靶向多个ny-eso-1表位将能够治疗更大的患者集合，并且可使治疗对于肿瘤逃逸更稳健。如本文所述，本发明提供了用于制备和使用修饰的t细胞的方法和材料，所述修饰的t细胞包含编码某些t细胞受体多肽的核酸。如本文所用，术语“t细胞受体”或“tcr”是指响应于抗原呈递而参与t细胞活化的膜蛋白复合体。tcr负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。tcr由阿尔法(α)和贝塔(β)链的异二聚体组成，不过在某些细胞中，tcr由γ和δ链组成。tcr可以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似，但具有不同的解剖位置和功能。每条链由两个胞外域组成，即可变域和恒定域。本发明的实施方案包括许多不同的tcrα/β核酸及其编码的多肽(例如，tcr核酸和tcr的编码多肽命名为“3a1”、“4a2”、“5g6”、“9d2”、“1e4”、“2b8”和“3c7”)。本发明的实施方案包括物质组合物，其包含一种或多种包含本文所公开的tcr多核苷酸的载体。“载体”是一种物质组合物，其包含分离的核酸并且可用于将所分离的核酸递送到细胞内部。众多载体是本领域中已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语也应解释为包括非质粒和非病毒化合物，它们促进核酸转移到细胞中，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。通常，载体为表达载体。如本文所用，术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在本上下文中，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接到有待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中已知的所有表达载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其合并有重组多核苷酸。本发明的实施方案包括例如安置于表达载体中的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码vαt细胞受体多肽和/或vβt细胞受体多肽。在这类实施方案中，当包含vαt细胞受体多肽和/或vβt细胞受体多肽的vα/vβt细胞受体在cd8+t细胞中表达时，vα/vβt细胞受体识别与人白细胞抗原a2、人白细胞抗原b07、人白细胞抗原b18或人白细胞抗原c03有关的ny-eso-1肽。在本文所公开的本发明的工作实施方案中，修饰的cd8+t细胞受体包含3a1t细胞受体、4a2t细胞受体、5g6t细胞受体、9d2t细胞受体、1e4t细胞受体、2b8t细胞受体或3c7t细胞受体。在本发明的典型实施方案中，所述载体包含以下中的至少一个：编码3a1tcrvα多肽(seqidno:3)的多核苷酸；编码3a1tcrvβ多肽(seqidno:4)的多核苷酸；编码4a2tcrvα多肽(seqidno:7)的多核苷酸；编码4a2tcrvβ多肽(seqidno:37)的多核苷酸；编码5g6tcrvα多肽(seqidno:10)的多核苷酸；编码5g6tcrvβ多肽(seqidno:11)的多核苷酸；编码9d2tcrvα多肽(seqidno:14)的多核苷酸；编码9d2tcrvβ多肽(seqidno:15)的多核苷酸；编码1e4tcrvα多肽(seqidno:18)的多核苷酸；编码1e4tcrvβ多肽(seqidno:19)的多核苷酸；编码2b8tcrvα多肽(seqidno:22)的多核苷酸；编码2b8tcrvβ多肽(seqidno:23)的多核苷酸；编码3c7tcrvα多肽(seqidno:26)的多核苷酸；或编码3c7tcrvβ多肽(seqidno:27)的多核苷酸。下表1公开了编码这些tcr多肽的说明性多核苷酸序列。通常，本发明的组合物包含一种或多种vα/vβ多核苷酸，例如编码tcrvα多肽的多核苷酸组合有编码tcrvβ多肽的多核苷酸，以使得vα/vβtcr可以在用一种或多种载体转导的哺乳动物细胞(例如cd8+t细胞)的表面上表达，其中vα/vβtcr识别与hla相关的ny-eso-1肽。如本文所用，术语“转导的”或“转染的”或“转化的”是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。在另一方面，本发明包括一种用于生成修饰的t细胞的方法，所述方法包括将编码本文所公开的tcr的一种或多种核酸(例如，安置于慢病毒载体内的核酸)引入t细胞(例如，由被诊断患有表达ny-eso-1抗原的癌症的个体获得的cd8+t细胞)中。本发明还包括具有下调或敲除的基因表达的修饰的t细胞(例如，具有敲除的内源性t细胞受体和识别与hla相关的ny-eso-1肽的外源性/引入的t细胞受体的修饰的t细胞)。如本文所用，术语“敲除”是指一个或多个基因的基因表达的减少。如本文所用，术语“敲除”是指一个或多个基因的基因表达的去除。本文所述的修饰的t细胞可包含在用于治疗方案的组合物中。组合物可以包含药物组合物，并且还包含药学上可接受的载剂。可以施用治疗有效量的包含修饰的t细胞的药物组合物。本发明的药物组合物可包含如本文所述的修饰的t细胞组合有一种或多种药学上或生理上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。这类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；及防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉内施用。用载有抗原特异性tcr的t细胞进行的过继性免疫疗法在治疗癌症方面具有治疗潜力。具有特定tcr的cd8+t细胞的基因工程具有将t细胞重定向到选定抗原(诸如ny-eso-1抗原)的优势。在本上下文中，一方面，本发明包括在受试者中刺激t细胞介导的对靶细胞或组织的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的修饰的cd8+t细胞。在此实施方案中，如本文别处所述来修饰cd8+t细胞。本发明的实施方案还包括施用靶向多个ny-eso-1表位的多个修饰的cd8+t细胞。例如，本发明的实施方案包括施用至少两种不同的修饰的cd8+t细胞，例如，靶向与第一人白细胞抗原相关的ny-eso-1肽的第一修饰的cd8+t细胞组合有靶向与第二人白细胞抗原相关的ny-eso-1肽的第二cd8+t细胞。本发明的实施方案包括治疗以ny-eso-1(即原型癌-睾丸抗原)的表达为特征的疾病或病状的方法。所述治疗方法包括向有此需要的受试者施用有效量的包含本文所述的修饰的t细胞的药物组合物。术语“受试者”意在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文所用，“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，诸如羊、牛、猪、犬、猫和鼠类哺乳动物。优选地，受试者是人。在本发明的典型实施方案中，所述人患有表达ny-eso-1抗原的癌症。在本发明的一些实施方案中，癌细胞形成实体肿瘤。在本发明的说明性实施方案中，所述癌细胞是神经母细胞瘤细胞、骨髓瘤细胞、转移性黑色素瘤细胞、滑膜肉瘤细胞、膀胱癌细胞、食道癌细胞、肝细胞癌细胞、头颈癌细胞、非小细胞肺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞或乳腺癌细胞。本发明的一个相关实施方案包括一种预防和/或治疗被诊断为、疑似患有癌症或有发展为癌症或有癌症复发风险的个体的方法，其中所述癌症包括表达ny-eso-1抗原的癌细胞。此方法包括向个体施用包含编码tcr的重组多核苷酸的修饰的人t细胞，其中所述t细胞能够直接识别表达ny-eso-1抗原的癌细胞，且其中癌细胞的直接识别包括tcr的hlaii类限制性结合至由癌细胞表达的ny-eso-1抗原。关于本发明的工程化cd8+t细胞的用途，所述方法通常包括向有此需要的个体施用有效量(例如，通过静脉内或腹膜内注射)的包含cd8+t细胞的组合物。合适的药物组合物可适于通过任何合适的途径施用，诸如肠胃外(包括皮下、肌内或静脉内)、肠内(包括经口或直肠)、吸入或鼻内途径。这类组合物可以通过药学领域已知的任何方法来制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与一种或多种载体或赋形剂混合。另一方面，本发明包括本文所述的多核苷酸或修饰的cd8+t细胞在制造用于治疗有此需要的受试者中以表达ny-eso-1为特征的疾病或病状的药剂中的用途。在本发明的说明性实施方案中，疾病是表达ny-eso-1抗原的癌症，例如黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。此领域中的技术是相当发达的，并且本领域中已知的许多方法和材料可以适于与本文所公开的发明一起使用。这类方法和材料公开于例如美国专利公布号20190247432、20190119350、20190002523、20190002522、20180371050、20180057560、20170029483、20160024174和20150141347中，其内容以引用的方式并入。本发明的其他方面和实施方案在以下实施例中提供。实施例实施例1：ny-eso-1特异性t细胞克隆的扩增和分离。我们先前曾报道转移性黑色素瘤患者的血液中存在与各种ny-eso-1衍生表位反应的t细胞(22)。为了富集这些反应性t细胞，用28个重叠的18聚体刺激患者外周血单核细胞(pbmc)的扩增，这些聚体共同构成了完整的ny-eso-1蛋白序列(图1a)。然后，用个别肽再刺激扩增的细胞，针对ifn-γ进行胞内染色，以确定哪些肽驱动了扩增，并使用预测算法分析刺激性肽，以鉴定与每个患者的mhc单倍型相关的最小表位(31)(图1b)。在与免疫刺激性表位相对应的个别9-10聚体肽的存在下，反应性t细胞再扩增(图1c)，并使用同源肽-mhc四聚体，经由荧光激活细胞分选(facs)进行分选(图1d)。从这些单细胞分选物中生长的细胞系是无性系的，并且与其同源表位具有反应性(图1e)。总共选择了与hla-a*02:01/ny-eso-1157-165有反应性的4个细胞系和与由hla-b和hla-c等位基因呈递的表位有反应性的4个细胞系进行进一步研究。实施例2：ny-eso-1特异性tcr的克隆和筛选使用商品化rt-pcr试剂盒，用靶向所有的人trav和trbv基因区段的定制多重引物，从分选的单细胞中克隆了配对的tcrα和tcrβ基因。将得到的vα和vβcdna亚克隆到具有人或鼠类tcr恒定区的逆转录病毒载体骨架中(图2a)。为了验证克隆的tcr的特异性，用每个完整的人tcr转染cd3+hek293t细胞，并用每种所靶向的ny-eso-1表位的肽-mhc右旋体试剂对转染的细胞进行染色(图2b)。所有4个hla-a2限制性tcr均表现出预期的反应性(图2c)。尽管分析事件的门控转染水平相似，但新型tcr表现出高度可变的右旋体结合。与背景几乎无法区分9d2tcr的右旋体结合，而3a1tcr与临床上使用的1g4tcr相比，显示出更强的右旋体结合。4a2和5g6tcr的右旋体结合介于9d2与1g4之间。此外，在除hla-a2之外的mhc等位基因上受限的4个tcr中有3个被证实与它们的靶标特异性结合(图2d)。表达b7/ny-eso-160-72-特异性1e4tcr、b18/ny-eso-188-96特异性2b8tcr或cw3/ny-eso-196-104特异性3c7tcr的转染的293t细胞各自结合它们相应的右旋体，而未转染的细胞则不。用从与cw3/ny-eso-192-100反应的t细胞中克隆的9g2tcr转染的细胞相对于未转染的细胞没有可检测地结合同源右旋体。可能的原因是hek293t细胞不表达cd8共受体。cd8通过直接与mhci结合而增加了tcr-pmhc相互作用的亲和力，从而使较低亲和力的tcr参与(32)。因此，将此tcr包括在内，以进一步分析jurkatt细胞中的cd8依赖性。实施例3：a2限制性ny-eso-1特异性tcr的功能表征tcr转导的t细胞的敏感性是tcr与其同源肽-mhc的单体亲和力(kd～0.1-400μm)(33)以及细胞表面上的tcr密度的函数(12)。转导的tcr由于在其折叠、二聚化以及与内源性tcr竞争以组装有限cd3链的效率方面的变化而在t细胞表面上以广泛不同的水平表达(称为tcr“强度”的特性)(34,35)。因此，tcr转导的t细胞的最佳细胞毒性功能与tcr亲和力和表面表达相关(3,12)，强调了选择高亲和力、有效输出的tcr用于基因疗法的重要性(7)。由于较高亲和力的tcr-pmhc相互作用较少依赖于cd8参与，因此推断可以通过比较带有或不带有cd8共表达的tcr转导的jurkatt细胞的右旋体结合来鉴定高亲和力的tcr。此外，由于可以通过用鼠类恒定结构域取代来增强人tcr的表面表达强度(36)，因此将每个tcr表达为全人或鼠化衍生物，以评估每个tcr的强度。仅用媒介物或用错配的tcr(mart1特异性f5tcr)转导的细胞不表现出与a2/ny-eso-1157-165右旋体的任何结合(图3a，3b)。相比之下，无论是1g4被全人或鼠化以及是否存在cd8，用充分确立的1g4tcr(kd＝9.3μm)转导的细胞(37)都结合同源右旋体。1g4的鼠化使mutcr的右旋体结合强度比亲本hutcr高1.4倍，表明强度适度提高(图3b，3c)。cd8的存在使1g4mutcr的右旋体结合增加了3.8倍。新型tcr4a2和5g6的右旋体结合在强度和比较指数上均类似于1g4(图3a-3c)。在cd8存在下，3a1tcr的右旋体结合仅增加1.9倍，表明此tcr以比1g4更高的亲和力与a2/ny-eso-1157-165结合。相对于用1g4、4a2和5g6mutcr转导的cd8+细胞，右旋体结合在3a1mutcr转导的cd8+细胞中对cd8水平的依赖性降低对此有进一步的支持(比较图3a中绿色群体的斜率)。最终，在不存在cd8的情况下，9d2在jurkat细胞上未显示出与右旋体的可检测结合，而在cd8共表达时仅显示了弱结合。9d2的鼠化并未增加其与右旋体的结合。为了比较表达新型a2/ny-eso-1特异性tcr的t细胞的功能敏感性，将tcr转导的jurkatt细胞与表达a*02:01/ny-eso-1157-165或a*02:01/mart127-35单链三聚体的k562细胞共培育(38)并测量分泌的白介素2(il-2)。所有tcr均表现出其预期的肽特异性：对照mart1特异性f5tcr仅响应于mart1呈递介导il-2释放，并且所有ny-eso-1特异性tcr仅响应于ny-eso-1呈递介导il-2释放(图3d)。鼠化改善了除1g4以外的所有tcr的功能敏感性。与右旋体染色结果一致，1g4和3a1mutcr优于4a2和5g6mutcr。相比之下，尽管9d2与右旋体的结合较弱，但对同源配体的功能敏感性却很高，可与3a1相当。为了量化此观察结果，用不同浓度的ny-eso-1157-165或mart127-35肽对a2+k562细胞进行脉冲处理，然后测量从与肽脉冲的靶细胞共培育的tcr转导的原代t细胞分泌的ifn-γ(图7a，7b)。如使用单链三聚体靶标观察到的，3a1、9d2和1g4对ny-eso-1157-165肽表现出最高敏感性。尽管4a2结合右旋体的mfi比9d2高18倍，但9d2的功能敏感性比4a2高10倍(图3a，3b)。为了评估对内源性加工和呈递抗原的反应，将tcr转导的原代t细胞与人黑色素瘤细胞系a2+m257共培育(图3e)。再次，用3a1、9d2和1g4转导的t细胞彼此相当地作出反应，并且比用5g6和4a2转导的t细胞具有更高的敏感性。tcr转导的t细胞对缺少hla-a*02:01的m257系无反应。最终，体外细胞毒性与细胞因子释放密切相关：表达9d2或3a1的t细胞最有效地杀死a2+m257肿瘤细胞，其次是被1g4、5g6和效率最低的4a2转导的t细胞(图3f)。为了能够评估肿瘤异种移植物模型中的tcr功能，对pc-3人前列腺癌细胞系进行工程化以表达ny-eso-1和hla-a*02:01，然后验证：此系以抗原依赖性和mhc限制性方式引发tcr转导的t细胞的功能反应(图8a)。新型ny-eso-1反应性tcr的图中对a2+ny+pc-3的相对反应与a2+m257引起的反应一致(图3e和图8b)。基于这些结果，选择了1g4、3a1和9d2mutcr，用于体内的进一步功能表征。用编码每个鼠化tcr的载体和转导标记(低亲和力神经生长因子受体(lngfr)转导了活化的人pbmc(图4a)。对转导的(cd3+lngfr+)t细胞进行分选(图8c)，并将这些t细胞眼眶后i.v.注射到在两侧预先接种了pc-3/hla-a2(对照)和pc-3/hla-a2/nyeso(靶标)肿瘤的辐照的nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠)中(图4b)。随后，监测t细胞植入和肿瘤大小，直到t细胞注射后两周实验结束。用1g4或9d2tcr转导的t细胞在外周血中持续存在或最小程度地扩增，而3a1转导的t细胞则显著扩增(图4c和4d)。相反，仅用lngfr转导的t细胞在实验过程中收缩，提示tcr转导的t细胞的扩增是抗原驱动的。鼠类tcrβ(mtcrβ)的表达水平在整个实验过程中是稳定的，并且在用不同鼠化tcr转导的t细胞之间具有可比性(图4c和4e)。每个带有a*02:01/ny157-165右旋体+的tcr转导的t细胞队列的相应染色水平也随时间稳定，但是正如体外结果所预期的，tcr之间存在显著差异。用1g4或3a1转导的人t细胞中有大约90％是具有高mfi的右旋体+。相比之下，仅约1％的9d2转导的t细胞是右旋体+，并且染色的mfi与lngfr转导的对照没有显著差异(图4c和4f)。尽管如此，用1g4、3a1或9d2转导的t细胞以抗原特异性方式同等地减小了肿瘤的大小，而经lngfr转导的t细胞却无法控制肿瘤的生长(图4g和4h)。在实验结束时，处死了小鼠并通过免疫组织化学分析肿瘤的t细胞浸润。免疫组织化学染色显示，在所有接受tcr转导的t细胞的队列中，抗原特异性t细胞仅浸润到靶肿瘤中(图4i和4j)。相对于接受1g4或9d2转导的t细胞的小鼠，接受3a1转导的t细胞的小鼠的浸润明显更高。实施例4：在hla-b和hla-c等位基因上受限的ny-eso-1特异性tcr的功能表征大多数靶向ny-eso-1的免疫疗法都集中在a2限制性ny-eso-1157-165表位上。为使ny-eso-1靶向的免疫疗法得到更广泛的应用，从四个非a2限制性t细胞克隆中克隆了tcr，并在转染的cd3+293t中验证了其中三个中的ny-eso-1反应性(图2d)。从cw3/ny-eso-192-100反应性t细胞中克隆的第四个tcr-9g2，即使在共表达cd8的情况下，也没有赋予转导的jurkatt细胞上的cw3/ny-eso-192-100以特异性(图5a，5b)，并且没有进一步研究。通过在jurkat或cd8+jurkat中表达为人或鼠类tcr的三种经过验证的tcr对右旋体的结合的比较显示出强度和亲和力方面的差异(图5a，5b，5c)。b7/ny-eso-160-72特异性1e4tcr表现出高强度但低亲和力，在jurkat细胞表面上同等地表达为hutcr或mutcr，但仅在cd8+存在时才结合右旋体。右旋体与这些cd8+,1e4转导的细胞的结合强烈依赖于所表达的cd8的水平。相比之下，在不存在cd8+的情况下，b18/ny-eso-188-96特异性2b8tcr结合右旋体，但对于鼠化tcr的结合则大体上更高。最终，cw3/ny-eso-196-104特异性3c7tcr表现出中等的表面表达强度和与2b8相当的亲和力指数。功能测定中反映了tcr强度和亲和力的这些差异。对于所有三个tcr，tcr恒定区的鼠化增加了与同源靶细胞共培育的tcr转导的jurkat细胞的il-2产量。然而，与1e4和3c7的相应的全人tcr相比，这种增加仅为1.6倍和3.0倍，而2b8的这种增加为18.6倍，与后者的较低强度相符(图5d)。在肽滴定测定中，1e4tcr对转导的cd8+t细胞上的同源肽的敏感性低于3c7或2b8(图7c，7d，7e)，这与1e4严格基于cd8依赖性右旋体结合而推测的亲和力较低一致。用每个tcr转导的原代pbmc以肽特异性和mhc限制性方式对呈递ny-eso-1衍生的表位有反应(图5e)。因此，预期采用在多个mhc上受限的ny-eso-1特异性tcr的tcr基因疗法可以更广泛地应用于患者单倍型，并且经由mhci基因座处的杂合性丧失而对肿瘤逃逸更加稳健。为了测试这一点，用hla-a2或hla-b7转导表达ny-eso-1的人类癌细胞。然后，将这些肿瘤靶标中的一个或两个与用a2限制性3a1tcr转导的人t细胞、用b7限制性1e4tcr转导的t细胞或3a1与1e4转导的t细胞的混合物共培育(图6)。如所预期，使用3a1与1e4转导的t细胞的混合物进行联合靶向能够识别表达两个mhc等位基因或单独表达任一mhc等位基因的肿瘤细胞群(图6a，6b)。相比之下，靶向单个ny-eso-1表位的t细胞对缺乏同源mhc等位基因的表达ny-eso-1的肿瘤细胞无反应。此外，当肿瘤靶标包含表达不同mhc等位基因的细胞混合物(模拟由单倍型不足引起的肿瘤异质性)时，靶向两个ny-eso-1表位的t细胞对肿瘤细胞的杀灭作用要比靶向任一单一表位的t细胞更完全(图6c，6d)。讨论t细胞介导的免疫疗法正在使以前的难治性癌症进入临床。两种最成功的免疫疗法模式是检查点阻断和癌症特异性t细胞的过继转移。随着肿瘤突变负担的增加，检查点阻断引发更好的临床反应(39-41)，提示免疫系统无法检测到非同义突变，除非偶然地，它们生成由患者的mhc分子补体呈递的新表位。最近的研究结果支持这种解释：因为检查点阻断导致在hla-a、hla-b和hla-c基因座处杂合的黑色素瘤患者的总体生存率更高，因此与在这些mhci基因座中的一个或多个处纯合的那些患者相比呈递更加多样化的表位(42)。过继性t细胞疗法的结果同样支持了多种靶向抗肿瘤免疫应答的重要性，该研究表明杂合性丧失是一种机制，通过该机制，肿瘤可以逃避单特异性免疫识别，同时继续表达另一种免疫原性抗原(43)。因此，从这些研究中出现的一个突出的叙述是，成功的免疫疗法需要多样化靶向由多个mhc等位基因呈递的多个表位。第二要点是针对具有低突变负担的癌症，靶向源自肿瘤特异性公有抗原的多个表位可能是靶向新表位的有前景的替代方法。已证明难以鉴定介导肿瘤消退的公有肿瘤相关抗原，而又不表现出由靶上肿瘤外t细胞反应性导致的严重病态或死亡。基于以下标准来选择ny-eso-1作为公有抗原靶标：1)仅在癌细胞和免疫特权生殖细胞中表达；2)在各种肿瘤类型的许多患者中表达；3)载有多个常见mhc等位基因的高亲和力配体；4)经过全面审查，已在若干肿瘤类型的患者中产生客观反应，而没有与特异性相关的不良事件；以及5)由于大多数研究都集中于仅针对a2限制性ny-eso-1157-165表位来动员t细胞反应，因此尚未被充分利用。采用抗原特异性扩增方案从转移性黑色素瘤患者的外周血中分离出ny-eso-1反应性t细胞。使用这种方法克隆了几种hla-a2限制性tcr，并且比较它们的表面表达强度、亲和力(即靶标结合cd8的依赖性)和功能(抗原诱导的细胞因子释放和肿瘤靶标杀伤)。从四个候选物中，鉴定能够识别并杀死表达ny-eso-1的癌细胞的两个，其效果等同或优于临床上采用的1g4tcr。这种基于扩增的tcr候选物鉴定方法非常适合靶向公有表位，因为分离的速度不是关键参数；一旦鉴定，这些tcr可用作任何表达必需mhc等位基因的患者的现有靶向受体。还证明了来自外周血的新抗原反应性t细胞的抗原特异性扩增(44,45)。然而，按需分离靶向新表位的私有tcr所需的方法要比此处使用的方法更快(例如，从血液中直接捕获抗原特异性t细胞或为快速性而优化的扩增方案)。由于ifn-γ的释放与细胞毒性密切相关(46)，因此可以通过使用ifn-γ释放作为更多涉及的肿瘤异种移植物测定的替代方法来加快候选评价。分离出的一种hla-a2/ny-eso-1反应性tcr(9d2)对同源多聚体的染色不良，但对同源抗原呈递靶细胞的功能亲合力很高。这与多聚体染色低估了功能性t细胞子集的观察结果一致(47)，并且可以用多聚体结合的亲和力阈值相对于t细胞活化的亲和力阈值更高来解释(48)。然而，另一种分离的a2限制性tcr–4a2–表现出稳健的多聚体染色，但在基于细胞的测定中功能较差，似乎与这种亲和力阈值解释不一致。尽管对后面的结果没有任何解释，但是两个结果都提醒我们不要在选择免疫疗法候选药物时过分依赖多聚体染色。hla-a*02:01等位基因是高加索人(45％)和西班牙人(41％)的美国群体中最普遍的mhci等位基因，但在亚洲人(15％)和非洲人(16％)的美国群体中较少见(2)。通过将tcr基因疗法的靶向范围从hla-a2扩大到更广泛的可靶向mhc等位基因组，这后一群体将得到特别好的服务。除hla-a2限制性tcr外，还分离并在功能上表征了在各种hla-b和hla-c等位基因上受限的ny-eso-1特异性tcr。通过这样做，原则上证明了tcr基因疗法可以扩展到更大的患者/单倍型子集，并且当以组合形式使用时，识别来自同一抗原的多个表位的tcr可以更有力地杀死具有异质mhc表达的肿瘤(例如由体细胞杂合性丧失所造成)。族群中超过80％的人表达来自三种mhci超型(a2、a3和b7，其中两个在此示出)的至少一个等位基因，并且>99％的人表达来自九种mhci超型的至少一个等位基因(49)。因此，获得一组能够实现tcr基因疗法的全面应用的公有抗原特异性tcr试剂是一个有限且可克服的挑战。材料和方法材料肽购自anaspec(fremont,ca)、thermofisherscientific(waltham,ma)和mimotopes(victoria,australia)。用于流式细胞术的荧光抗体和7-aad购自bdbiosciences(sanjose,ca)、biolegend(sandiego,ca)或ebioscience(sandiego,ca)。荧光肽-mhc多聚体购自tcmetrix(epalinges,switzerland)或如所述(50)由生物素化单体(获自nihtetramercore,atlanta,ga或在大肠杆菌中异源表达，重新折叠并如所述(51)在内部进行生物素化)在内部制备。引物购自integrateddnatechnologies(coralville,ia)。kod聚合酶预混液和聚凝胺购自emdmillipore(darmstadt,germany)。通过retrogeninc(sandiego,ca)进行测序。抗cd3(okt3)和抗cd28(cd28.2)激活抗体购自ebioscience。细胞因子购自peprotech,inc.(rockyhill,nj)。biot转染试剂购自biolandscientific(paramount,ca)。细胞培养基、抗生素和胎牛血清购自corning(corning,ny)。人ab血清购自omegascientific(tarzana,ca)。聚-l-赖氨酸和pha-l(植物血凝素-l)购自sigma(st.louis,mo)。细胞细胞系(293t/17、jurkate6-1和k562)购自美国菌种保藏中心(manassas,va)。293t细胞在补充了抗生素(青霉素/链霉素)和10％(v/v)胎牛血清(fbs)的dulbecco改良版eagle培养基(dmem)中生长。jurkat和k562细胞在补充了抗生素、10％(v/v)fbs、10mmhepes、50μmβ-巯基乙醇、1xmemneaa和1mm丙酮酸钠的rpmi1640培养基中生长。细胞每2-3天分裂一次，以使粘附细胞亚汇合或非粘附细胞的密度保持在<106个细胞/ml。用非复制型病毒载体转导jurkat和k562细胞，通过流式细胞术分析，并直接用于细胞测定中或通过facs进行分选，以建立所示的衍生细胞系。功能测定中使用的原代人pbmc购自uclaaidsinstitute的cfarvirologycorelab，如前所述进行刺激，转导和培养(52)。t细胞是由pbmc在新鲜添加了细胞因子的t细胞培养基(aim-v培养基，补充了5％热灭活的人ab血清、55μmβ-巯基乙醇和4mml-谷氨酰胺)中生长而成的。所有细胞均生长并在37℃和5％大气co2下进行分析。ny-eso-1特异性cd8+t淋巴细胞克隆的生成和培养对来自具有各种hla限制(157-165/hla-a*02:01(53)、60-72/hla-b*07:02(21)、88-96/hla-b*18:01(23)、92-100/hla-c*03:04(54)、96-104/hla-c*03:04(22)、124-133/hla-c*03:04(22))的ny-eso-1的表位具有特异性的cd8+t淋巴细胞克隆是从hla型黑色素瘤患者中产生的。所有选出的患者均患有iii/iv级转移性黑色素瘤，并且先前记录了ny-eso-1对离体相关t淋巴细胞表位的反应(55)。在1μm汇集肽(mimotopes)存在下刺激患者pbmc，所述肽包含28x18聚体，重叠12个氨基酸，共同跨越ny-eso-1蛋白序列，然后将这些细胞在25iu/mlil-2(peprotech)存在下培养10天。第10天，在存在布雷菲德菌素a的情况下，用1μm每种个别肽对细胞进行再刺激，并通过胞内细胞因子染色(ics)确定响应于每种肽的cd8+t细胞的活化。简言之，按照制造商说明书，用活的/死的可固定的紫色染色剂(invitrogen)标记细胞，然后在4℃下与抗cd3和cd8的抗体一起培育15分钟。洗涤样品，并用固定/透化试剂(bdbiosciences)在4℃下固定20分钟。将细胞在透化/洗涤溶液(bdbiosciences)中于4℃下用抗ifnγ(ebiosciences)染色25分钟。门控策略为：ssc/ld-；cd3+/cd8+；cd8+/ifnγ+。在facscanto上采集了至少100,000个染色细胞的数据，并使用flowjo软件进行分析。数据收集和分析是根据miata指南进行的(56)。ny-eso-1反应性t细胞在其鉴定的同源9-10聚体表位存在下扩增，然后用包含相关肽和hla分子的荧光四聚体标记(tcmetrix,epalinges,switzerland)，并使用moflo细胞分选仪进行单细胞分选。用汇集的同种异体健康供体pbmc作为饲养细胞、1μg/mlpha-l和600iu/mlil-2(cetus)对克隆进行再扩增。大约20天后，如上所述，在存在同种异体pbmc作为饲养细胞、pha-l和il-2的情况下，对1–10x103个克隆进行再刺激。通过四聚体染色证实克隆特异性。在补充了2mmglutamax、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mmhepes、1％非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、55μmβ-巯基乙醇和10％人血清(tcrpmi)的rpmi1640培养基中培养t淋巴细胞克隆/系。添加il-2(100iu/ml)，并且每3天更换一次。克隆tcr构建体将单一ny-eso-1反应性t细胞在facsariaii上针对抗原特异性进行分选，并在rnase抑制剂存在下通过冻融来溶解。使用qiagenonesteprt-pcr试剂盒(redwoodcity,ca)，采用一组定制的人tcr可变区特异性引物，从单一分选的t细胞中克隆新型tcr可变基因，然后进行巢式pcr扩增步骤。经由组装pcr和限制酶介导的克隆将扩增的可变基因整合到具有人或小鼠tcr恒定结构域以及连接α和β基因的2a核糖体跳跃肽的tcr表达盒中。编码低亲和力神经生长因子受体(lngfr)的截短形式的p2a连锁基因也作为非依赖性转染/转导标记包含在盒中。如先前所述，在用tcr和cd3基因共转染的293t细胞中评估了克隆的tcr的抗原特异性和mhc限制(52)。评估jurkatt细胞上的tcr输出和右旋体结合用基于msgv的逆转录病毒转导jurkatt细胞，该逆转录病毒以lngfrδ-p2a-tcrα-f2a-tcrβ形式编码每种新型tcr。病毒如所述在293t细胞中产生(52)。为了进行转导，将jurkatt细胞与补充了5μg/ml聚凝胺的未浓缩的病毒上清液一起离心(1350xg，在30℃下90分钟)。将tcr转导的jurkat细胞在室温下用同源pmhc右旋体染色15分钟，然后在4℃下用抗lngfr和cd8α的抗体共染色15分钟。使用facscanto分析器，通过流式细胞术分析染色的细胞。示出的数据在lngfr+(转导)细胞上门控。转导效率>95％。pbmc活化和转导原代人pbmc购自uclaaidsinstitute的cfarvirologycorelab。在所有报道的实验中都使用相同的pbmc供体。用编码新型tcr的逆转录病毒如所述转导原代人pbmc(52)。简言之，在病毒转导前两天，在板包被了抗cd3(克隆okt3)的24孔板中用含有1μg/ml可溶性抗cd28(克隆cd28.2)和300u/mlil-2的t细胞培养基每孔激活总计1-2x106个解冻的pbmc。激活48小时后，将大部分培养基替换为补充了10μg/ml聚凝胺的未浓缩的逆转录病毒上清液，并在30℃下以1350xg离心细胞90分钟。离心转染后，将大部分逆转录病毒上清液替换为含有300u/mlil-2和1μg/ml抗cd28的新鲜培养基。24小时后重复转导，之后用1xpbs洗涤细胞，接着返回到含有最终300u/mlil-2的新鲜培养基中，并再培养3至4天，随后用于抗原刺激测定中。在共培养的前一天或当天，通过facs分析pbmc，以评估lngfr、tcr和/或pmhc多聚体结合的表达水平。功能性共培养测定–细胞因子elisa当使用jurkatt细胞作为效应子时，在补充了10％fbs、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素和4mml-谷氨酰胺的rpmi中进行共培养。将效应细胞(50,000个tcr转导的juratt细胞)与靶细胞(50,000个用同源或对照单链三聚体转导的k562细胞)在96孔平底板中共培育。在共培养后44-48h收集来自重复孔的上清液，并通过如下所述的酶联免疫吸附测定(elisa)进行分析。当使用原代pbmc作为效应子时，在含有300u/mlil-2的t细胞培养基中进行共培养。将效应细胞(50,000个tcr转导的pbmc)与靶细胞(50,000个m257、pc-3或k562细胞)在96孔平底板中共培育。在一些实验中，用肽对靶细胞进行脉冲处理。在共培养后44-48小时收集来自每种条件的2-8倍复制孔的上清液，并通过如下所述的酶联免疫吸附测定(elisa)进行分析。对于用脉冲肽滴定靶细胞的实验，将冻干的肽在dmso中溶解至10mm，然后在水中进一步稀释至2mm工作储备液。使用之时，将2mm储备液在细胞培养基中稀释至250μm，然后从250μm连续5倍稀释至3.2nm。通过在96孔u型底板上每孔添加25μl每种系列稀释液对靶细胞进行脉冲处理，然后在100μl培养基中添加50,000个靶细胞，最终肽浓度范围为50μm至0.64nm。在37℃下用肽对细胞进行脉冲处理2小时，在培育结束时每孔用100ul培养基稀释，离心，并除去上清液。用200ul培养基洗涤细胞，然后重新悬浮于100μl培养基中。随后将在100μl培养基中制备的五万个pbmc加入每个孔中进行共培养。通常，通过相对于标准曲线的内插将elisa结果转换为浓度(ng/ml)，并将复制elisa测定的浓度取平均值。将上清液稀释50-100倍以进行elisa分析。有时，需要更高的稀释度才能将信号置于标准曲线范围内。用于elisa分析的所有试剂均来自bdbiosciences：opteiareagentsetb(550534)用于稀释液和洗涤液，并且opteia人ifn-γelisa试剂盒(555142)和opteia人il-2elisa试剂盒(555190)分别用于测量ifn-γ和il-2的释放。功能性共培养测定-incucyte细胞杀伤测定在共培养以用于incucyte杀伤测定之前，将96孔平底板在37℃下在pbs中用100μl的0.001％聚-l-赖氨酸包被1小时，每次用200μlpbs洗涤2次，并短暂风干。添加靶细胞并使其在室温下静置3小时，之后添加效应细胞。共培养通常在96孔板的每个孔中采用25,000个pbmc和25,000个靶细胞。在将多个效应子群体(载有不同tcr)或多重靶标(载有不同mhc)混合在一起的测定中，每种细胞类型使用25,000个细胞，每孔总共产生75,000或100,000个细胞(分别对于单一/混合或混合/混合)。将所有孔的总体积调整为200μl。量化绿色目标总面积(μm2/孔)，并将其消失解释为对gfp+靶细胞的杀死。每2小时将细胞在每个孔的两个位置处成像，并将这两个图像加在一起作为一个数据点。将从每种效应子/靶标组合的4-8个复制共培养物中获得的数据点用于绘制曲线图并计算标准偏差。动物nod.cg-prkdcscidil-2rgtm1wjl/szj(nod/scid/il-2rg-/-，nsg)小鼠购自杰克逊实验室(jacksonlaboratory)，并保存在universityofcalifornia,losangeles(ucla)的动物设施中。将成年(16周龄)的雄性小鼠用于体内肿瘤激发实验。所有动物实验均已获得ucla机构动物护理和使用委员会的批准。人前列腺肿瘤异种移植物小鼠模型对于异种移植肿瘤植入，将10×106个pc-3/hla-a2细胞(过度表达hla-a2的pc-3细胞系)在每只小鼠的一侧皮下注射，而在另一侧皮下注射10×106个pc-3/hla-a2/ny-eso-1细胞(过度表达hla-a2和nyeso的pc-3细胞系)。允许小鼠在1周的过程中发展为实体肿瘤。肿瘤注射后第8天，对小鼠进行辐照(100拉德)，然后眼眶后静脉内注射8×106个纯化的t细胞，这些t细胞被工程化以仅表达lngfr或连同ny-eso-1特异性tcr(1g4、3a1或9d2)一起表达。在第3、7、10和14天对小鼠放血以进行流式细胞术分析。在第14天，对小鼠实施安乐死并收集肿瘤用于免疫组织学分析。免疫组织学将从实验小鼠身上切下的实体肿瘤固定在10％中性缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中以进行切片(4mm厚)，然后通过使用标准程序(uclatranslationalpathologycorelaboratory)进行苏木精和曙红(h/e)染色或抗体染色(针对人cd3ε)。使用配备有optronicsmacrofireccd摄像机(auoptronics)的olympusbx51立式显微镜以4倍和40倍放大率对切片进行成像。通过使用optronicspictureframe软件(auoptronics)和imagej软件(1.51j8版)来分析图像。使用imagej，通过设置颜色阈值测量cd3+面积来对人cd3抗体染色的载玻片进行定量。所使用的参数如下：阈值方法：默认值；阈值颜色：红色；颜色空间：hsb；亮度：168-215。统计分析对肿瘤异种移植物实验的统计分析是采用单向anova，然后进行图基多重比较检验(tukey’smultiplecomparisontest)。数据表示为平均值±sem。认为p<0.05是显著的。ns：不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****p<0.0001。所有统计分析均使用graphpadprism软件(6.0版)进行。表1：tcrα/β多核苷酸和多肽序列以下公开内容提供了本发明的各种实施方案的多核苷酸序列及其编码的可变区tcr蛋白序列(例如，seqidno:1的多核苷酸序列编码seqidno:3的可变区tcr蛋白序列)。3a1tcrvαdna序列3a1tcrvβdna序列3a1tcrvα蛋白序列3a1tcrvβ蛋白序列4a2tcrvαdna序列4a2tcrvβdna序列4a2tcrvα蛋白序列4a2tcrvβ蛋白序列5g6tcrvαdna序列5g6tcrvβdna序列5g6tcrvα蛋白序列5g6tcrvβ蛋白序列9d2tcrvαdna序列9d2tcrvβdna序列9d2tcrvα蛋白序列9d2tcrvβ蛋白序列1e4tcrvαdna序列1e4tcrvβdna序列1e4tcrvα蛋白序列1e4tcrvβ蛋白序列2b8tcrvαdna序列2b8tcrvβdna序列2b8tcrvα蛋白序列2b8tcrvβ蛋白序列3c7tcrvαdna序列3c7tcrvβdna序列3c7tcrvα蛋白序列3c7tcrvβ蛋白序列ny-eso-1蛋白(智人)：genbank:caa05908.1在本公开中使用的术语诸如“a2/ny-eso-1157-165”是指与包含上述蛋白质序列的氨基酸157-165(即sllmwitqc(seqidno:36))的ny-eso-1肽有关的hlaa2。以下序列包含安置于载体中的本发明的多核苷酸实施方案。pmtb1328(msgv-lngfr-p2a-gb4a2tcr小鼠恒定)pmtb1329(msgv-lngfr-p2a-gb5g6tcr小鼠恒定)pmtb1330(msgv-lngr-p2a+hhd2tcr小鼠恒定pmtb1331(msgv-lngfr-p2a-b07nytcr小鼠恒定)pmtb1332(msgv-lngfr-p2a-b18nytcr小鼠恒定)pmtb1333(msgv-lngfr-p2a-c03ny96tcr小鼠恒定)pmtb1289(msgv-lngfr-p2a-gba1tcr小鼠恒定)出版物本文提及的所有出版物(例如，本文中以数值形式列举的那些)以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。本文引用的出版物因其在本申请的提交日期之前的公开内容而被引用。本文中的任何内容均不得解释为承认发明人无权凭借较早的发明优先权日期或在先的发明日期早于出版物。此外，实际的发布日期可能与所示的日期有所不同，并且需要独立验证。以下参考文献包括对本
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：中的方法和材料的描述。参考文献1.robinsonj，etal.(2015)theipdandimgt/hladatabase：allelevariantdatabases.nucleicacidsres43(databaseissue)：d423-431.2.gonzalez-galarzaff.etal.(2015)allelefrequencynet2015update：newfeaturesforhlaepitopes，kiranddiseaseandhlaadversedrugreactionassociations.nucleicacidsres43(databaseissue)：d784-788.3.johnsonla，etal.(2006)genetransferoftumor-reactivetcrconfersbothhighavidityandtumorreactivitytononreactiveperipheralbloodmononuclearcellsandtumor-infiltratinglymphocytes.jimmunol177(9)：6548-6559.4.schumachertn&schreiberrd(2015)neoantigensincancerimmunotherapy.science348(6230)：69-74.5.bethunemt&joglekarav(2017)personalizedtcell-mediatedcancerimmunotherapy：progressandchallenges.currentopinioninbiotechnology48：142-152.6.morganra，etal.(2006)cancerregressioninpatientsaftertransferofgeneticallyengineeredlymphocytes.science314(5796)：126-129.7.johnsonla，etal.(2009)genetherapywithhumanandmouset-cellreceptorsmediatescancerregressionandtargetsnormaltissuesexpressingcognateantigen.blood114(3)：535-546.8.parkhurstmr，etal.(2011)tcellstargetingcarcinoembryonicantigencanmediateregressionofmetastaticcolorectalcancerbutinduceseveretransientcolitis.moleculartherappy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy19(3)：620-626.9.morganra，etal.(2010)casereportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationoftcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingerbb2moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy18(4)：843-851.10.morganra，etal.(2013)cancerregressionandneurologicaltoxicityfollowinganti-mage-a3tcrgenetherapy.journalofimmunotherapy(hagerstown.md.：1997)36(2)：133-151.11.anonymous(2013)donoharm.natbiotechnol31(5)：365.12.jorritsmaa，etal.(2007)selectinghighlyaffineandwell-expressedtcrsforgenetherapyofmelanoma.blood110(10)：3564-3572.13.chenyt，etal.(1997)atesticularantigenaberrantlyexpressedinhumancancersdetectedbyautologousantibodyscreening.procnatlacadsciusa94(5)：1914-1918.14.goydosjs，patelm，&shihw(2001)ny-eso-1andctp11expressionmaycorrelatewithstageofprogressioninmelanoma.thejournalofsurgicalresearch98(2)：76-80.15.sharmap，etal.(2003)frequencyofny-eso-1andlage-1expressioninbladdercancerandevidenceofanewny-eso-1t-cellepitopeinapatientwithbladdercancer.cancerimmunity3：19.16.lim，etal.(2005)expressionprofileofcancer-testisgenesin121humancolorectalcancertissueandadjacentnormaltissue.clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch11(5)：1809-1814.17.gureao，etal.(2005)cancer-testisgenesarecoordinatelyexpressedandaremarkersofpooroutcomeinnon-smallcelllungcancer.clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch11(22)：8055-8062.18.jungbluthaa，etal.(2001)monophasicandbiphasicsynovialsarcomasabundantlyexpresscancer/testisantigenny-eso-1butnotmage-aiorct7.internationaljournalofcancer94(2)：252-256.19.aungpp，etal.(2014)expressionofnewyorkesophagealsquamouscellcarcinoma-1inprimaryandmetastaticmelanoma.humanpathology45(2)：259-267.20.ademuyiwafo，etal.(2012)ny-eso-1cancertestisantigendemonstrateshighimmunogenicityintriplenegativebreastcancer.plosone7(6)：e38783.21.ebertlm，etal.(2009)along，naturallypresentedimmunodominantepitopefromny-eso-1tumorantigen：implicationsforcancervaccinedesign.cancerresearch69(3)：1046-1054.22.jacksonh，etal.(2006)strikingimmunodominancehierarchyofnaturallyoccurringcd8+andcd4+tcellresponsestotumorantigenny-eso-1.，jimmunol176(10)：5908-5917.23.zhaory，etal.(2012)anovelhla-b18restrictedcd8+tcellepitopeisefficientlycross-presentedbydendriticcellsfromsolubletumorantigenplosone7(9)：e44707.24.robbinspf，etal.(2011)tumorregressioninpatientswithmetastaticsynovialcellsarcomaandmelanomausinggeneticallyengineeredlymphocytesreactivewithny-eso-1.jclinoncol29(7)：917-924.25.robbinspf，etal.(2015)apilottrialusinglymphocytesgeneticallyengineeredwithanny-eso-l-reactivet-cellreceptor：long-termfollow-upandcorrelateswithresponse.clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch21(5)：1019-1027.26.rapoportap.etal.(2015)ny-eso-l-specifictcr-engineeredtcellsmediatesustainedantigen-specificanfitumoreffectsinmyelona.natmed21(8)：914-921.27.klippelzk，etal.(2014)immuneescapefromny-eso-1-specifict-celltherapyvialossofheterozygosityinthemhc.genetherapy21(3)：337-342.28.zhaoy，etal.(2007)high-affinitytcrsgeneratedbyphagedisplayprovidecd4+tcellswiththeabilitytorecognizeandkilltumorcelllines.jimmunol179(9)：5845-5854.29.cameronbj，etal.(2013)identificationofatitin-derivedhla-al-presentedpeptideasacross-reactivetargetforengineeredmagea3-directedtcells.sciencetranslationalmedicine5(197)：197ra103.30.linettegp，etal.(2013)cardiovasculartoxicityandtitincross-reactivityofaffinity-enhancedtcellsinmyelomaandmelanoma.blood122(6)：863-871.31.andreattam&nielsenm(2016)gappedsequencealignmentusingartificialneuralnetworks：applicationtothemhcclassisystem.bioinformatics32(4)：511-517.32.wooldridgel，etal.(2005)interactionbetweenthecd8coreceptorandmajorhistocompatibilitycomplexclassistabilizestcellreceptor-antigencomplexesatthecellsurface.jbiolchem280(30)：27491-27501.33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