治疗性树状聚体的制作方法

1.本发明一般涉及通过药物
‑
树状聚体缀合物递送喜树碱活性物质。树状聚体包括核和构建单元，最外层的构建单元包括经由可裂解连接基连接的喜树碱活性物。本发明还涉及包含药物
‑
树状聚体缀合物的药物组合物和治疗方法，以及制备药物
‑
树状聚体缀合物的工艺和合成中间体。


背景技术：

2.配制用于递送至其预期作用位点的药物活性剂可引起许多重大挑战，与诸如水溶性差、生物利用度低、在生物条件下不稳定、体内快速降解、缺乏功效、缺乏靶向作用位点和毒性等问题相关。
3.已经开发了许多方法来尝试和解决这些问题，包括使用旨在改善活性剂在体内的生物利用度和/或控制释放的复合制剂，例如，涉及使用增溶赋形剂、聚合物基质或包封在脂质体或胶束中。然而，控制药物活性剂的释放仍然存在问题。在一些情况下，载体快速降解，在其到达靶器官之前释放药物活性剂。在其它情况下，药物活性剂从载体中的释放被减慢到在体内或靶器官中不能达到药物的治疗剂量的程度。此外，此类组合物可呈现稳定性和制造挑战。
4.肿瘤学药物是一类重要的药物，近几十年来在癌症治疗方面取得了显著进展。然而，许多肿瘤试剂由于它们的细胞毒性质而与严重的副作用相关，提供了窄的治疗窗，并且限制了可以使用的剂量方案，并且潜在地也限制了治疗的功效。
5.一类肿瘤学药物是喜树碱类化合物。喜树碱和结构相关的化合物(诸如sn
‑
38)是拓扑异构酶1抑制剂。然而，sn
‑
38的已知问题是，尽管化合物具有高拓扑异构酶1抑制活性，但制剂受水溶解性差的阻碍，并且高毒性和快速清除将限制临床使用。伊立替康是在c
‑
10位含有二哌啶基氨基甲酸酯基团的前药，并且当在体内使用时，伊立替康在肝脏和血浆中代谢以释放活性化合物sn
‑
38。伊立替康(irinotecan)已被批准临床用作治疗几种癌症的疗法。伊立替康在白血病、淋巴瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌中显示出活性。然而，依立替康仍然具有快速清除和显著的副作用，最显著的是胃肠道毒性、引起腹泻、呕吐、腹痛、厌食症和血液学毒性，诸如中性粒细胞减少、白细胞减少和血小板减少。市售伊立替康携带有腹泻和骨髓抑制的黑盒警告。此外，伊立替康在肝脏中通过羧酸酯酶代谢为活性代谢物sn
‑
38，然后葡糖醛酸化成无活性的sn
‑
38g，然而，转化率和酶活性在患者中高度可变。喜树碱的另一个问题是在ph>6下内酯环水解成无活性的羧酸盐形式，这降低了其效力。
6.为了进一步解决活性剂的一些缺点，还进行了研究以鉴定伊立替康的改进制剂。例如，是可注射的脂质体伊立替康产品，其含有分散在制剂缓冲液中的直径约为110nm的脂质体，这对于控制脂质降解是关键的。该脂质体制剂还携载有中性粒细胞减少和严重腹泻的黑盒警告。
7.已经应用了许多增溶策略来试图克服这些问题。例如，通过nektar(nktr
‑
102)(其
在转移性乳腺癌中的第3期研究失败)、enzon(ezn2208)和prolynx(pl038)(peg)与聚(乙二醇)缀合提供了相对水溶性的缀合物。另一种方法是使用与亲脂性载体结合和不结合的小胶束或脂质体，诸如nk
‑
012(nippon kayaku)、sn2310乳剂(ocogenex)和irinophore(champions oncology)。其它方法是sn
‑
38三嵌段共聚物(玛希隆大学(mahidol university)，泰国)、dspc/胆固醇纳米颗粒、hyaluran
‑
ironotecan(alchemia，在结肠直肠癌中的第3期研究失败)、crlx101、环糊精缀合的cpt
‑
11(cerulean)和在第2期研究中失败的聚
‑1‑
羟甲基亚乙基羟甲基
‑
甲醛xmt1001(mersana)。由于缺乏功效或3级和4级中性粒细胞减少，这些方法在临床上基本上不成功。
8.已经在体外研究了pamam
‑
sn
‑
38树状聚体用于口服递送(goldberg et al,j control release,2011,150(3),p318
‑
325)。england等(j control release,2017,247,p73
‑
85)产生经由树状聚体上的随机位点缀合至sn
‑
38的c10位的树状聚体，并且仅具有约8％的药物负载。fox等(mol.pharm.,2009,6(5),p1562
‑
1572)描述了伊立替康经由甘氨酸或丙氨酸上的羧酸酯缀合至天冬氨酸或谷氨酸表面树状聚体，具有4
‑
6％伊立替康负载。
9.仍然需要替代的和/或改进的肿瘤学疗法，其提供递送延长的有效水平的活性药剂的有效方式，具有低水平的副作用和良好的治疗窗。还需要提供治疗剂的一致和受控释放的疗法。这样的疗法可导致更好的患者结果和更好的患者顺应性。
10.还需要在实际生产条件下以受控和一致的方式提供药物，以提供活性成分的良好产率，具有充分理解和可再现的性质。


技术实现要素：

11.本发明的主题部分基于以下出人意料的发现：诸如sn
‑
38的喜树碱活性物质，在缀合至树状聚体时产生药物
‑
树状聚体缀合物，所述药物
‑
树状聚体缀合物提供药物的改善的效力和/或药代动力学性质。
12.相应地，在第一方面，提供了一种树状聚体，其包含：
13.i)核单元(c)；和
14.ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
15.其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
16.树状聚体是五代构建单元树状聚体；
17.其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
18.所述树状聚体进一步包含：
19.iii)多个第一端基(t1)，其包含与下式的二酰基连接基共价连接的喜树碱活性物质残基，
20.其中a为任选地被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷；并且
21.iv)多个第二端基(t2)，其包含peg或peox基团；
22.其中所述外部构建单元的至少一半具有与第一端基共价连接的一个氮原子并且具有与第二端基共价连接的一个氮原子；
23.或其药学上可接受的盐。
24.在一些实施方案中，核单元由包含两个氨基的核单元前体形成。
25.在一些实施方案中，核单元为：
[0026][0027]
在一些实施方案中，构建单元各自为：
[0028][0029]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点。
[0030]
在一些实施方案中，构建单元各自为：
[0031][0032]
在一些实施方案中，树状聚体具有五代完整的构建单元。
[0033]
在一些实施方案中，二酰基连接基选自由以下组成的组
[0034][0035]
在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0036][0037]
在一些实施方案中，所述喜树碱活性物质的残基是通过c
‑
10或c
‑
20位与所述二酰基连接基连接的sn
‑
38的残基。
[0038]
在一些实施方案中，sn
‑
38的残基是：
[0039][0040]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0041][0042]
并且经由存在于内酯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；并且其中所述二酰基连接基是
[0043]
其中a为被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷；
[0044]
在一些实施方案中，每个第一端基(t1)是：
[0045][0046]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0047][0048]
其中
[0049]
r1选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；
[0050]
r2选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；
[0051]
每个r3独立地选自氢和c1‑6烷基；
[0052]
其中所述喜树碱活性物质的残基经由存在于苯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；并且其中所述二酰基连接基是
[0053]
其中a为c2‑
c
10
亚烷基。
[0054]
在一些实施方案中，第二端基包含具有至少750道尔顿的平均分子量的peg基团。
[0055]
在一些实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为1500至2500道尔顿范围内的peg基团。
[0056]
在一些实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为1800至2200道尔顿范围内的peg基团。
[0057]
在一些实施方案中，peg基团是甲氧基封端的peg。
[0058]
在一些实施方案中，所述树状聚体具有28至32个表面单元，所述表面单元包含与
第一端基连接和与第二端基连接的外部构建单元。
[0059]
在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第一端基共价连接；且存在于外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第二端基共价连接。
[0060]
在一些实施方案中，所述五代构建单元是完全代，并且其中所述外部代的构建单元提供用于与第一端基或第二端基共价连接的64个氮原子，其中28至32个第一端基与所述氮原子中的一个共价连接，并且其中28至32个第二端基各自与所述氮原子中的一个共价连接。
[0061]
在一些实施方案中，存在于所述外代构建单元中的不超过五分之一的氮原子是未取代的。
[0062]
在一些实施方案中，树状聚体是任何实施例树状聚体。
[0063]
在一些实施方案中，孵育6小时后，在ph 7.4和37℃下在pbs中从所述树状聚体释放的喜树碱活性物质的％释放范围为10至50％。
[0064]
在一些实施方案中，树状聚体与另外的活性物质组合。
[0065]
在一些实施方案中，另外的活性物质是免疫治疗剂。
[0066]
在一些实施方案中，另外的活性物质是pd
‑
1或pd
‑
l1抑制剂。
[0067]
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、avelumab、德瓦鲁单抗(durvalumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。
[0068]
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是派姆单抗。
[0069]
在一些实施方案中，另外的活性物质是parp抑制剂。
[0070]
在一些实施方案中，parp抑制剂奥拉帕尼。
[0071]
在一些实施方案中，另外的活性物质是egfr抑制剂。
[0072]
在一些实施方案中，egfr抑制剂是egfr抗体。
[0073]
在一些实施方案中，egfr抗体是西妥昔单抗(cetuximab)。
[0074]
在另一方面，提供了包含多种树状聚体或其药学上可接受的盐的组合物，
[0075]
其中树状聚体如本文所定义，
[0076]
所述组合物中每个树状聚体的第一端基的平均数量在24至32的范围内，且
[0077]
所述组合物中每个树状聚体的第二端基的平均数量在24至32的范围内。
[0078]
在一些实施方案中，每个树状聚体的第一端基的平均数量在28至32的范围内，和/或每个树状聚体的第二端基的平均数量在28至32的范围内。
[0079]
在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物，并且其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
[0080]
在一些实施方案中，树状聚体或药物组合物用于治疗癌症。
[0081]
在另一方面，提供了治疗癌症的方法，其包含向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的树状聚体或如本文所述的药物组合物。
[0082]
在另一方面，还提供了如本文所述的树状聚体或如本文所述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0083]
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和子宫颈癌。
[0084]
在一些实施方案中，树状聚体的治疗有效量在2至50mg/m2体表面积的范围内。
[0085]
在一些实施方案中，树状聚体与另外的抗癌药物组合施用。
[0086]
在一些实施方案中，另外的抗癌药物是免疫治疗剂。
[0087]
在一些实施方案中，免疫治疗剂是pd
‑
1或pd
‑
l1抑制剂。
[0088]
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、avelumab、德瓦鲁单抗(durvalumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。
[0089]
在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是派姆单抗。
[0090]
在一些实施方案中，另外的抗癌药物是parp抑制剂。
[0091]
在一些实施方案中，另外的抗癌药物是奥拉帕尼。
[0092]
在一些实施方案中，另外的抗癌药物是egfr抑制剂。
[0093]
在一些实施方案中，egfr抑制剂是egfr抗体。
[0094]
在一些实施方案中，egfr抗体是西妥昔单抗(cetuximab)。
[0095]
在一些实施方案中，树状聚体是任何实施例树状聚体。
[0096]
在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用所述树状聚体提供至少2倍的喜树碱活性物质的治疗性药物暴露量(auc)。
[0097]
在一些实施方案中，与施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用所述树状聚体提供增强的临床效力。
[0098]
在一些实施方案中，与施用相同剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用树状聚体减少了副作用的发生。
[0099]
在另一方面，提供了用于生产如本文所述的树状聚体的工艺，其包含：
[0100]
a)
[0101]
a1)在酰胺偶联条件下，将喜树碱活性物质中间体与树状聚体中间体或其盐反应，所述喜树碱活性物质中间体为
[0102][0103]
其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；并且其
中pg是保护基；
[0104]
所述树状聚体中间体包含：
[0105]
i)核单元(c)；和
[0106]
ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
[0107]
其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
[0108]
树状聚体是五代构建单元树状聚体；
[0109]
其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
[0110]
所述树状聚体进一步包含：
[0111]
iv)多个第二端基(t2)，每个第二端基包含peg或peox基团；
[0112]
其中所述外部构建单元的至少一半具有与第二端基共价连接的一个氮原子，并且具有可用于与所述第一中间体反应的一个未取代的氮原子；和
[0113]
a2)使步骤a1)的产物经受脱保护条件以去除保护基pg；
[0114]
或者
[0115]
b)
[0116]
b1)在酰胺偶联条件下，将表面单元中间体与树状聚体中间体或其盐反应，所述表面单元中间体为：
[0117]
peg/peox基团
[0118]
其中peg基团是含peg的基团，peox是含peox的基团；
[0119]
x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；并且其中pg是保护基；
[0120]
所述树状聚体中间体包含：
[0121]
i)核单元(c)；和
[0122]
ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
[0123]
其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
[0124]
所述树状聚体中间体是四代构建单元树状聚体中间体；
[0125]
其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
[0126]
并且其中存在于所述树状聚体中间体的外部构建单元中的氮原子是未取代的；和
[0127]
b2)在所述表面单元中间体包含保护基pg的情况下，使步骤b1)的产物经受脱保护条件以去除pg。
[0128]
在进一步的方面，提供了用于生产树状聚体的中间体，所述树状聚体是
[0129][0130]
其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；且其中pg为保护基。
[0131]
在进一步的方面，提供了用于生产树状聚体的中间体，所述树状聚体是
[0132]
peg/peox基团
[0133]
其中peg基团是含peg的基团，peox是含peox的基团；
[0134]
x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；且其中pg为保护基。
[0135]
应当理解，本文描述了进一步的方面、实施方案和实施例，其可以包括如上所述的一个或多个实施方案或特征。
附图说明
[0136]
图1显示在结肠癌模型研究中媒介物、伊立替康和实施例树状聚体对携带sw620肿瘤的小鼠体重的影响。
[0137]
图2显示媒介物、伊立替康和实施例树状聚体对小鼠中sw620肿瘤异种移植物的效
力。
[0138]
图3显示图2所示数据的kaplan
‑
meier存活曲线。
[0139]
图4显示在结肠癌模型研究中媒介物、伊立替康和实施例树状聚体对携带ht
‑
29肿瘤的小鼠体重的影响。
[0140]
图5显示媒介物、伊立替康和实施例树状聚体对小鼠中ht
‑
29细胞系异种移植物的效力。
[0141]
图6显示图5所示数据的kaplan
‑
meier存活曲线。
[0142]
图7显示了在乳腺癌模型研究中伊立替康和实施例树状聚体对携带mda
‑
mb
‑
231肿瘤的小鼠体重的影响。
[0143]
图8显示伊立替康和实施例树状聚体对小鼠中mda
‑
mb
‑
231细胞系异种移植物的效力。
[0144]
图9显示图8所示数据的kaplan
‑
meier存活曲线。
[0145]
图10显示在胰腺癌模型研究中，静脉内和腹膜内施用媒介物和实例树状聚体对携带capan
‑
1肿瘤的小鼠体重的影响。
[0146]
图11显示静脉内和腹膜内施用的媒介物和实施例树状聚体对小鼠中capan
‑
1细胞系异种移植物的效力。
[0147]
图12显示sn
‑
38物质从血浆中的树状聚体释放。
[0148]
图13显示sn
‑
38物质从在pbs/dma中的树状聚体在数小时内的释放。
[0149]
图14显示sn
‑
38物质从在pbs/dma中的树状聚体在数天内的释放。
[0150]
图15和17显示单独和组合的媒介物、伊立替康、西妥昔单抗和实施例树状聚体2f针对小鼠中ht
‑
29细胞系异种移植物的效力。
[0151]
图16和18显示了图15和17中所示数据的kaplan
‑
meier存活曲线。
[0152]
图19显示单独和组合的媒介物、奥拉帕尼、伊立替康和实施例树状聚体2f针对小鼠中ht
‑
29细胞系异种移植物的效力。
具体实施方式
[0153]
一般定义
[0154]
除非另有明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义(例如，化学、生物化学、药物化学、聚合物化学等)。
[0155]
如本文所用，术语“和/或”，例如“x和/或y”应被理解为表示“x和y”或“x或y”，并且应被理解为对这两种含义或无论哪种含义提供明确的支持。
[0156]
如本文所用，除非有相反的说明，否则术语“约”是指指定值的+/
‑
20％，更优选地+/
‑
10％。
[0157]
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则术语“一(a/an)”和“该”既包括单数形式也包括复数形式。
[0158]
如本文所用，术语“受试者”是指易受疾病或病症影响的任何生物体。例如，受试者可以是动物，哺乳动物，灵长类动物，牲畜动物(例如，绵羊、牛、马、猪)，伴侣动物(例如，狗、猫)或实验动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是非人类动物。
[0159]
如本文所用，术语“治疗”包括减轻与特定病状或病症相关的症状。例如，如本文所用，术语“治疗癌症”包括减轻与癌症相关的症状。在一个实施方案中，术语“治疗癌症”是指癌性肿瘤尺寸的减小。在一个实施方案中，术语“治疗癌症”是指无进展存活的增加。如本文所用，术语“无进展存活”是指在治疗癌症期间和之后的时间长度，患者患有该疾病，即癌症，但该疾病没有复发或症状增加的时间长度。
[0160]
如本文所用，术语“预防”包括预防特定病况或病症。例如，如本文所用，术语“预防癌症”是指预防与癌症相关的症状的发作或持续时间。在一个实施方案中，术语“预防癌症”是指减缓或停止癌症的进展。在一个实施方案中，术语“预防癌症”是指减缓或预防转移。
[0161]
本文所用的术语“治疗有效量”是指以足以在一定程度上减轻或预防所治疗的病况或病症的一种或多种症状的量施用的树状聚体。结果可以是疾病或病症的体征、症状或病因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其它期望的改变。在一个实施方案中，术语“治疗有效量”是指以足以导致癌性肿瘤尺寸减小的量施用的树状聚体。在一个实施方案中，术语“治疗有效量”是指以足以导致无进展存活增加的量施用的树状聚体。本文所用的术语“有效量”是指有效实现期望的药理学效果或治疗性改善而没有不适当的不良副作用或实现期望的药理学效果或治疗性改善且副作用分布减少的树状聚体的量。治疗有效量可以例如通过常规实验确定，包括但不限于剂量递增临床试验。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。在一个实施方案中，预防有效量是足以防止转移的量。应理解，“有效量”或“治疗有效量”可因受试者不同而变化，这归因于化合物的代谢以及受试者的年龄、体重、一般病症、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度和开处方医师的判断中的任一者的变化。在任何个别情况下，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
[0162]
如本文所用，术语“烷基”是指单价直链(即直链)或支链饱和烃基。在一个实施例中，烷基含有1至10个碳原子(即，c1‑
10
烷基)。在一个实施例中，烷基含有1至6个碳原子(即，c1‑6烷基)。烷基的示例包括甲基，乙基、丙基(例如正丙基、异丙基)、丁基(例如正丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基和己基)。
[0163]
如本文所用，术语“亚烷基”是指二价直链(即直链)或支链饱和烃基。在一个实施例中，亚烷基含有2至10个碳原子(即，c2‑
10
亚烷基)。在一个实施例中，亚烷基含有2至6个碳原子(即，c2‑6亚烷基)。亚烷基的示例包括例如
‑
ch2ch2‑
、
‑
ch2ch2ch2‑
、
‑
ch2ch(ch3)
‑
、
‑
ch2ch2ch2ch2‑
、
‑
ch2ch(ch3)ch2‑
等。
[0164]
树状聚体的合适的盐包括与有机或无机酸或碱形成的那些。如本文所用，短语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的有机或无机盐。示例性的酸加成盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸酯、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1
′‑
亚甲基
‑
双(2
‑
羟基
‑3‑
萘甲酸盐))盐。示例性碱加成盐包括但不限于铵盐，碱金属盐，例如钾和钠的那些，碱土金属盐，例如钙和镁的那些，以及与有机碱的盐，例如二环己胺，n
‑
甲基
‑
d
‑
葡糖胺，吗啉，硫代吗啉，哌啶，吡咯烷，单
‑
、二
‑
或三
‑
低级烷基胺，例如乙基
‑
、叔丁基
‑
、二乙基
‑
、二异丙基
‑
、三乙基
‑
、三丁基
‑
或二甲基
‑
丙胺，或单
‑
、二
‑
或三羟基低级烷基胺，例如单
‑
、二
‑
或三乙醇胺。药学上可接受的盐可涉及包含另一种分子，诸如
乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。还将理解，非
‑
药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为这些可用作制备药学上可接受的盐的中间体或可在储存或运输期间使用。
[0165]
有机和/或药物化学领域的技术人员将理解，许多有机化合物可以与它们在其中反应或它们从其中沉淀或结晶的溶剂形成络合物。这些络合物称为“溶剂化物”。例如，与水的络合物称为“水合物”。如本文所用，短语“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物的缔合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
[0166]
如本文所用，术语“树状聚体”是指含有核和连接到核的树状基元的分子。每个树状基元由多代支化构建单元组成，从而导致具有随着每代构建单元而增加的支链数的支化结构。“树状聚体”，包括药物
‑
树状聚体缀合物，可以包括如上定义的药学上可接受的盐或溶剂合物。
[0167]
如本文所用，术语“构建单元”是指支链分子，其为具有三个官能团的赖氨酸残基或其类似物，一个官能团用于连接至核或前一代构建单元，并且至少两个官能团用于连接至下一代构建单元或形成树状聚体分子的表面。
[0168]
如本文所用，术语“附接”是指化学组分之间通过共价键合的连接。术语“共价键合”与术语“共价连接”可互换使用。
[0169]
树状聚体
[0170]
在第一方面，提供了一种树状聚体，其包含：
[0171]
i)核单元(c)；和
[0172]
ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
[0173]
其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
[0174]
树状聚体是五代构建单元树状聚体；
[0175]
其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
[0176]
所述树状聚体进一步包含：
[0177]
iii)多个第一端基(t1)，其包含与下式的二酰基连接基共价连接的喜树碱活性物质残基，
[0178]
其中a为任选地被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷；和
[0179]
iv)多个第二端基(t2)，其包含peg或peox基团；
[0180]
其中所述外部构建单元的至少一半具有与第一端基共价连接的一个氮原子并且具有与第二端基共价连接的一个氮原子；
[0181]
或其药学上可接受的盐。
[0182]
其中所述树状聚体的核单元(c)经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；因此，核单元可以例如由包含两个氨基的核单元前体形成。任何合适的含二氨基的分子可用作核单元前体。在一些实施方案中，核单元为：
[0183][0184]
并且可以例如由核单元前体形成：
[0185][0186]
其具有两个反应性(氨基)氮。
[0187]
构建单元(bu)是赖氨酸残基或其类似物，并且可以由合适的构建单元前体形成，例如，含有适当保护基团的赖氨酸或赖氨酸类似物。赖氨酸类似物具有两个用于与随后生成的构建单元结合的氨基氮原子和用于与先前生成的构建单元或核结合的酰基。
[0188]
合适的构建单元的实例包括
[0189][0190][0191]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点。
[0192]
在一些优选的实施方案中，构建单元各自为：
[0193][0194]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点。
[0195]
在一些优选的实施方案中，构建单元各自为：
[0196][0197]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点。
[0198]
最外代构建单元(bu
outer
)可以由赖氨酸或赖氨酸类似物构建单元形成，如用于如上所述的构建单元(bu)的其它代。最外代构建单元(bu
outer
)是构建单元的产生，所述构建单元是树状聚体的核的最外代，即，在最外代构建单元(bu
outer
)上没有连接另外的代的构建单元。
[0199]
应当理解，树状聚体的树状基元可以例如通过相应地连接构建单元(bu)而合成至所需数量的代。在一些实施方案中，每一代构建单元(bu)可以由相同的构建单元形成，例如所有代的构建单元可以是赖氨酸构建单元。在一些其它实施方案中，一代或多代构建单元可以由与其它代构建单元不同的构建单元形成。
[0200]
树状聚体是五代构建单元树状聚体。五代构建单元树状聚体是具有包括彼此共价连接的五个构建单元的结构的树状聚体，例如在构建单元是赖氨酸的情况下，它可以包含以下子结构：
[0201][0202]
在一些实施方案中，树状聚体具有五代完整的构建单元。对于具有两个反应性胺基的核，这种树状聚体将包含62个构建单元(即，核单元+2bu+4bu+8bu+16bu+32bu)。然而，应当理解，由于用于制备树状聚体的合成方法的性质，为制备树状聚体而进行的一个或多个反应可能没有完全完成。因此，在一些实施方案中，树状聚体可以包含不完全代的构建单元。例如，可以获得树状聚体群体，其中树状聚体具有每个树状聚体的构建单元数量的分布。在一些实施方案中，获得树状聚体群体，其每个树状聚体的平均建筑单元数量为至少55或至少56或至少57或至少58或至少59或至少60。在一些实施方案中，获得树状聚体群体，其中至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体具有55个或更多个构建单元。在一些实施方案中，获得树状聚体群体，其中至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体具有60个或更多个构建单元。
[0203]
所述核的每个反应性(氨基)基团表示包含构建单元的树状基元的缀合位点。
[0204]
在一些实施方案中，每个树状基元(x)中的每一代构建单元可以由式[bu]2(b
‑
1)表示，其中b是代数量。具有五代完整构建单元的树状基元(x)表示为[bu]1‑
[bu]2‑
[bu]4‑
[bu]8‑
[bu]
16
。
[0205]
喜树碱类
[0206]
树状聚体包含多个第一端基(t1)，第一端基包含与下式的二酰基连接基共价连接的喜树碱活性物质残基，
[0207]
其中a为任选地被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷。
[0208]
喜树碱是具有以下结构的拓扑异构酶1抑制剂：
[0209][0210]
还鉴定了也具有拓扑异构酶抑制活性的结构相关的化合物的家族。在一个实施方案中，喜树碱活性物质是具有以下子结构的化合物：
[0211][0212]
喜树碱活性物质(其残基可形成第一端基的部分)的示例包括sn
‑
38、伊立替康(cpt
‑
11)、托泊替康(topotecan)、silatecan、cositecan、依喜替康(exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)、贝洛替康(belotecan)和鲁比替康(rubitecan)。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基通过c
‑
10或c
‑
20位置与二酰基连接基连接。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0213][0214]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0215][0216]
其中r1选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；r2选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；每个r3独立地选自氢和c1‑6烷基。在一些实施方案中，第一端基包含喜树碱活性物质的残基，其为sn
‑
38的残基。sn
‑
38具有以下结构：
[0217][0218]
在一些实施方案中，所述喜树碱活性物质的残基是通过c
‑
10或c
‑
20位与所述二酰基连接基连接的sn
‑
38的残基。在一些优选的实施方案中，sn
‑
38的残基是
[0219][0220]
在其它实施方案中，sn
‑
38的残基是
[0221]
[0222]
在体内施用时，典型地，树状聚体释放喜树碱活性物质(例如，sn
‑
38)。
[0223]
喜树碱活性物质的残基与下式的二酰基连接基共价连接
[0224]
其中a为任选地被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0225]
其中a为被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷；在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0226]
其中a为由o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0227]
其中a为由o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c6烷基。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0228]
其中a为由o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c6直链烷基。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0229]
其中a为未由o、s、nh中断的c2‑
c6烷基。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0230]
其中a为未由o、s、nh中断的直链c2‑
c6烷基。在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0231]
其中a是选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷。在一些实施方案中，二酰基连接基选自由以下组成的组
[0232][0232][0233]
在一些实施方案中，二酰基连接基选自由以下组成的组
[0234][0235]
在一些实施方案中，二酰基连接基是：
[0236][0237]
喜树碱活性物质的残基通常经由在作为喜树碱活性物质侧链的部分存在的氧原子与作为二酰基连接基的部分存在的酰基的碳原子之间形成的酯键与二酰基连接基共价连接。二酰基连接基的其它酰基与存在于外部构建单元中的氮原子形成酰胺键。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0238][0239]
并且经由存在于内酯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；并且其中所述二酰基连接基是
[0240]
其中a为被o、s、nh或n(me)中断的c2‑
c
10
亚烷基，或其中a为选自由以下组成的组的杂环：四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷和n
‑
甲基吡咯烷；在一些实施方案
中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0241][0242]
并且经由存在于内酯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；且所述二酰基连接基是
[0243][0244]
在一些实施方案中，每个第一端基(t1)是：
[0245][0246]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0247][0248]
其中
[0249]
r1选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；
[0250]
r2选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；
[0251]
每个r3独立地选自氢和c1‑6烷基；
[0252]
且所述喜树碱活性物质的残基经由存在于苯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；并且其中所述二酰基连接基是
[0253]
其中a为c2‑
c6亚烷基。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基具有以下子结构：
[0254]
其中r1选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；r2选自由以下组成的组：氢、c1‑6烷基、
‑
or3和
‑
c1‑6烷基
‑
n(r3)2；每个r3独立地选自氢和c1‑6烷基；且所述喜树碱活性物质的残基经由存在于苯环上的氧原子与所述二酰基连接基共价连接；并且其中所述二酰基连接基是
[0255][0256]
在一些实施方案中，每个第一端基(t1)是：
[0257][0258]
本发明人已经发现，通过特定可裂解的连接基与喜树碱结构中存在的特定羟基的组合，可以实现喜树碱活性物质的受控且一致的释放，导致良好的生物活性和良好的药代动力学性质。例如，喜树碱活性物质的c
‑
20位比c
‑
10位更受空间位阻，并且c
‑
20构建体比相应的c
‑
10构建体在热力学上更不利。然而，已经鉴定了以期望速率从树状聚体释放药物的接头基团，其可以高产率与喜树碱活性物质缀合，并且其还可以用于实现将良好水平的喜树碱活性物质负载到树状聚体上。
[0259]
第二端基
[0260]
树状聚体包含多个第二端基(t2)，每个第二端基(t2)包含peg或peox基团。第二端基t2为药代动力学修饰剂。药代动力学修饰剂是可以修饰或调节树状聚体或树状聚体所递送的药物活性剂(即喜树碱活性物质)的药代动力学特性的药剂。药代动力学修饰剂可以调节药物活性剂的树状聚体的吸收、分布、代谢、排泄和/或毒性。药代动力学修饰剂(t2)可通过减慢或增加活性剂通过化学(例如，水解)或酶促降解途径从树状聚体释放的速率来影响药物活性剂的释放速率。药代动力学修饰剂(t2)可以改变树状聚体的溶解度曲线，增加或降低树状聚体在药学上可接受的载体中的溶解度。药代动力学修饰剂(t2)可以帮助树状聚体将药物活性剂递送至特定组织(例如，肿瘤)。药代动力学修饰剂(t2)可以通过降低树状聚体的清除率来延长药物活性剂半衰期。
[0261]
在一些实施方案中，第二端基包含peg基团。peg基团是聚乙二醇基团，即包含式
–
ch2ch2o
‑
的重复单元的基团。用于生产本发明的树状聚体的peg材料通常含有分子量具有一些变化(即，
±
10％)的peg的混合物，因此在指定分子量的情况，通常是peg组合物的平均分子量的近似值。例如，术语“peg
～2100”是指具有约2100道尔顿的平均分子量，即
±
约10％的聚乙二醇(peg
1890
至peg
2310
)。术语“peg
～2300”是指具有约2300道尔顿的平均分子量，即
±
约10％的聚乙二醇(peg
2070
至peg
2530
)。通常使用三种方法来计算mw平均值：数均分子量、重均分子量和z均分子量。如本文所用，短语“分子量”是指可以使用本领域众所周知的技术测量的重均分子量，所述技术包括但不限于nmr、质谱法、基质辅助的激光解吸电离飞行时间(maldi
‑
tof)、凝胶渗透色谱法或其它液相色谱技术、光散射技术、超速离心和粘度测定法。
[0262]
在一些实施方案中，第二端基包含具有约200至5000道尔顿的平均分子量的peg基团。在一些实施方案中，第二端基包含具有至少750道尔顿的平均分子量的peg基团。在一些
实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为1000至2500道尔顿范围内的peg基团。在一些实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为1500至2500道尔顿范围内的peg基团。在一些实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为1900至2300道尔顿范围内的peg基团。在一些实施方案中，所述第二端基包含平均分子量为2100至2500道尔顿范围内的peg基团。在一些实施方案中，第二端基包含具有约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400或约2500道尔顿的平均分子量的peg基团。
[0263]
在一些实施方案中，peg基团的多分散指数(pdi)为介于约1.00和约1.50之间、介于约1.00至约1.25之间或介于约1.00至约1.10之间。在一些实施方案中，peg基团具有约1.05的多分散指数(pdi)。术语“多分散性指数”是指给定聚合物样品中分子质量分布的量度。多分散性指数(pdi)等于重均分子量(m
w
)除以数均分子量(m
n
)并指示一批聚合物中单个分子质量的分布。多分散指数(pdi)具有等于或大于1的值，但当聚合物接近均匀变化的长度和平均分子量时，多分散指数(pdi)将更接近1。
[0264]
在第二端基包含peg基团的情况，peg基团可以是直链或支化的。如果需要，可以使用封端的peg基团。在一些实施方案中，peg基团是甲氧基封端的peg。
[0265]
在一个实施方案中，第二端基包含peox基团。peox基团是聚乙基恶唑啉基团，即包含下式的重复单元的基团
[0266][0267]
peox基团之所以如此命名是因为它们可以通过乙基恶唑啉的聚合来制备。用于生产本发明的树状聚体的peox材料通常含有分子量具有一些变化(即，
±
10％)的peox的混合物，因此在指定分子量的情况，通常是peox组合物的平均分子量的近似值。在一些实施方案中，第二端基包含具有至少750道尔顿、至少1000道尔顿、或至少1500道尔顿的平均分子量的peox基团。在一些实施方案中，第二端基包含平均分子量为750道尔顿至2500道尔顿或1000道尔顿至2000道尔顿的范围内的peox基团。如果需要，可以使用封端peox基团。在一些实施方案中，peox基团是甲氧基封端的peox。
[0268]
第二端基可以经由任何合适的方式与外部构建单元连接。在一些实施方案中，连接基用于将peg基团或peox基团连接到外部构建单元。
[0269]
第二端基通常经由使用第二端基前体连接，所述第二端基前体含有可与胺基反应的反应性基团，诸如反应性酰基(其可以形成酰胺键)或醛(其可以在还原胺化条件下形成胺基)。
[0270]
在一些实施方案中，第二端基各自包含经由存在于peg基团中的碳原子与存在于peg连接基的氧原子之间形成的醚键共价连接至peg连接基(l1)，并且每个第二端基经由存在于构建单元中的氮原子与存在于peg连接基中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键共价连接至构建单元。在一些实施方案中，第二端基各自为peg基团
[0271]
并且其中peg基团是甲氧基封端的peg，其具有在约1750至2500道尔顿范围内的平均分子量。
[0272]
在一些实施方案中，第二端基各自包含经由存在于peox基团中的氮原子与存在于
peox连接基的碳原子之间形成的醚键共价连接至peox连接基(l1
′
)，并且每个第二端基经由存在于构建单元中的氮原子与存在于peox连接基中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键共价连接至构建单元。在一些实施方案中，第二端基各自为peox基团。
[0273]
在本发明的树状聚体中，外部构建单元的至少一半具有共价连接至第一端基的一个氮原子并且具有共价连接至第二端基的一个氮原子。因此，树状聚体可被认为具有受控的化学计量和/或拓扑结构。例如，树状聚体通常使用允许高度控制存在于树状聚体上的第一和第二端基的数量和排列的合成工艺来制备。树状聚体可以使用正交保护基来合成，以允许端基与外部构建单元以预定的或受控的方式缀合。在一些实施方案中，外部构建单元的至少三分之二具有与第一端基共价连接的一个氮原子并且具有与第二端基共价连接的一个氮原子；在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的外部构建单元具有与第一端基共价连接的一个氮原子并且具有与第二端基共价连接的一个氮原子；在一些实施方案中，每个官能化外构建单元含有一个第一端基和一个第二端基。
[0274]
在一些实施方案中，所述树状聚体包含表面单元，所述表面单元包含连接至第一端基和第二端基的外部构建单元，所述表面单元具有以下结构：
[0275]
peg基团
[0276]
在那些实施方案中，在一些实施例中，peg基团是平均分子量为约1500至2500道尔顿的甲氧基封端的peg。
[0277]
构建单元是赖氨酸残基或其类似物。赖氨酸具有α
‑
氮原子(与碳原子相连接的氮，该碳原子是赖氨酸中羰基的一部分的α
‑
碳原子)和ε
‑
氮原子(与碳原子相连的氮，该碳原子是赖氨酸中羰基的部分的ε
‑
碳原子)。
[0278]
在许多情况下，已经在树状聚体表面官能化的树状聚体群体含有官能团的随机化学计量和拓扑结构。例如，含有例如64个反应性表面基团的树状分子群与一个或多个反应性官能团的反应可以产生不同的官能化树状聚体产物群，其中一些树状聚体产物含有比其它产物更多数量的官能团。在存在多个可用于与反应性官能团反应的不同表面基团的情况下，也可以获得具有不同表面拓扑结构的树状聚体产物的广泛分布。
[0279]
在本发明的情况下，在一些实施方案中，树状聚体相对于第一端基和第二端基具有受控的化学计量和/或受控的拓扑结构。例如，在一些实施方案中，外部构建单元的α
‑
氮原子与第一端基连接，并且外部构建单元的ε
‑
氮原子与第二端基连接。在其它实施方式中，外部构建单元的ε
‑
氮原子与第一端基连接，并且外部构建单元的α
‑
氮原子为第二端基。
[0280]
本发明的树状聚体支架、中间体和工艺允许将高负载的喜树碱活性物质掺入树状聚体中。此类树状聚体也被认为促进治疗有效水平的喜树碱活性物质在施用后的延长的时间段内释放，并因此可降低期望的施用频率和/或次数。
[0281]
载药量(％w/w)可以通过将喜树碱活性物质(例如，sn
‑
38)的分子量乘以负载到树状聚体上的喜树碱活性分子数除以构建体的总分子量来计算。在一些实施方案中，树状聚体的喜树碱活性物质负载量为至少10％、至少11％、至少12％、至少13％w/w、或介于10％和20％之间、或介于12％和15％之间。
[0282]
在一些实施方案中，树状聚体具有24至32、26至32、28至32、30至32、24至30、26至30、28至30、26至30、26至28或28至30个表面单元，表面单元包含与第一端基连接且与第二端基连接的外部构建单元。
[0283]
在一些实施方案中，26至32、或27至32、或28至32个第一端基与存在于外部构建单元上的氮原子共价连接。在一些实施方案中，26至32、或27至32、或28至32个第一端基与存在于外部构建单元上的α
‑
氮原子共价连接。
[0284]
在一些实施方案中，26至32、或27至32、或28至32个第二端基与存在于外部构建单元上的氮原子共价连接。在一些实施方案中，26至32、或27至32、或28至32个第二端基与存在于外部构建单元上的ε
‑
氮原子共价连接。
[0285]
在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第一端基共价连接。在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少45％各自与第一端基共价连接。在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的约50％各自与第一端基共价连接；
[0286]
在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第二端基共价连接。在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少45％各自与第二端基共价连接。在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的约50％各自与第二端基共价连接；
[0287]
在一些实施方案中，存在于所述外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第一端基共价连接；且存在于外部构建单元中的氮原子的至少40％各自与第二端基共价连接。在一些实施方案中，存在于外部构建单元中的氮原子的至少45％各自与第一端基共价连接；且存在于外部构建单元中的氮原子的至少45％各自与第二端基共价连接。在一些实施方案中，存在于所述外部构建单元中的氮原子的约50％各自与第一端基共价连接；且存在于所述外部构建单元中的氮原子的约50％各自与第二端基共价连接。
[0288]
在一些实施方案中，所述五代构建单元是完全代，并且其中所述外部代的构建单元提供用于与第一端基或第二端基共价连接的64个氮原子，其中26至32个第一端基与所述氮原子中的一个共价连接，并且其中26至32个第二端基各自与所述氮原子中的一个共价连接。
[0289]
在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过四分之一的氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于所述外代构建单元中的不超过五分之一的氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于所述外代构建单元中的不超过六分之一的氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于所述外代构建单元中的不超过八分之一的氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于所述外代构建单元中的不超过十分之一的氮原子是未取代
的。
[0290]
在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过20个氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过10个氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过5个氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过3个氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过2个氮原子是未取代的。在一些实施方案中，存在于外代构建单元中的不超过1个氮原子是未取代的。在一些实施方案中存在于外代构建单元中的基本上所有氮原子被取代。
[0291]
应当理解，除了喜树碱活性物质和peg或peox基团之外，另外的端基可以连接到树状聚体上。因此，在一些实施方案中，树状聚体包含一个或多个第三端基。在一些实施方案中，第三端基包含另外的治疗剂的残基，诸如不是喜树碱活性物质的治疗剂。例如，第三端基可以包含其它治疗剂的残基，另外的治疗剂是化学治疗剂、化学敏化剂或免疫调节剂。另外的治疗剂的残基可以经由例如连接基(例如，可裂解连接基)连接。所述外部构建单元的至少一半具有与第一端基共价连接的一个氮原子并且具有与第二端基共价连接的一个氮原子；在一些实施方案中，在树状聚体包含一个或多个第三端基的情况下，第三端基可以与外部构建单元的氮原子连接，外部构建单元与第一或第二端基未共价连接。
[0292]
在一些实施方案中，外部构建单元的α
‑
氮原子与第三端基连接。在一些实施方案中，外部构建单元的ε
‑
氮原子与第三端基连接。
[0293]
缀合物
[0294]
在一些实施方案中，树状聚体具有：核单元，其由包含两个氨基的核单元前体形成；构建单元，每个构建单元各自是
[0295][0296]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点；二酰基连接基选自由以下组成的组：
[0297][0298]
和喜树碱活性物质的残基，其是通过c
‑
10或c
‑
20位与所述二酰基连接基连接的sn
‑
38的残基。
[0299]
在一些实施方案中，树状聚体具有：下述核单元
[0300]
构建单元，构建单元各自是
[0301]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点；二酰基连接基选自由以下组成的组：
[0302][0302]
和喜树碱活性物质的残基，其是通过c
‑
10或c
‑
20位与所述二酰基连接基连接的sn
‑
38的残基。
[0303]
在一些实施方案中，树状聚体具有：核单元，其由包含两个氨基的核单元前体形成；构建单元，构建单元各自是其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点；二酰基连接基选自由以下组成的组：
[0304][0304]
和下述喜树碱活性物质的残基
[0305][0306]
在一些实施方案中，树状聚体具有：核单元，所述核单元是构建单元，构建单元各自是
[0307]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点；二酰基连接基，其为
[0308]
和下述喜树碱活性物质的残基
[0309][0310]
在一些实施方案中，树状聚体具有：核单元，其是
[0311]
构建单元，构建单元各自是
[0312]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点；二酰基连接基，其为
[0313][0314]
和下述喜树碱活性物质的残基
[0315][0316]
在一些实施方案中，树状聚体是：
[0317][0318]
，其中t1
′
表示以下的第一端基：
[0319][0320]
或t1
′
表示h，其中少于5个t1
′
是h；且t2
′
表示以下的第二端基peg基团，其中peg基团是甲氧基封端的peg，其分子量在约1500至2500道尔顿的范围内，或t2
′
表示h，并且其中少于5个t2
′
是h。
[0321]
在一些实施方案中，树状聚体的分子量为50至300kda。在一些实施方案中，树状聚体的分子量为60至200kda。在一个实施例中，树状聚体的分子量为70至150kda。在一个实施例中，树状聚体的分子量为100至120kda
[0322]
在一些实施方案中，孵育6小时后，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的％释放范围为10至50％。在一些实施方案中，孵育6小时后，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的％释放范围为15至40％。在一些实施方案中，孵育6小时后，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的％释放范围为20至30％。在一些实施方案中，孵育后，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的50％释放范围为1至72小时。在一些实施方案中，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的50％释放范围为5至60小时。在一些实施方案中，在ph 7.4和37℃下在pbs缓冲液/dma 9:1(v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的50％释放范围为10至24小时。
[0323]
在一些实施方案中，孵育后，在37℃下在大鼠血浆/pbs(5:1v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质的50％释放为1至72小时。在一些实施方案中，在37℃下在大鼠血浆/pbs(5:1v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质中的50％释放范围为1至24小时。在一些实施方案中，在37℃下在大鼠血浆/pbs(5:1v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质中的50％释放范围为2至20小时。在一些实施方案中，在37℃下在大鼠血浆/pbs(5:1v/v)中从树状聚体释放的喜树碱活性物质中的50％释放范围为3至10小时。
[0324]
在一些实施方案中，树状聚体是以下实施例中所述的任何树状聚体。
[0325]
组合物
[0326]
在一些实施方案中，树状聚体呈现为组合物，优选药物组合物。
[0327]
应当理解，由于生产树状聚体的合成工艺的性质，给定组合物中存在的树状聚体之间的分子组成可能会有一些变化。例如，如上所述，用于制备树状聚体的一个或多个合成步骤可能不完全进行至完成，这可能导致树状聚体的存在，所述树状聚体不全部包含相同数量的第一端基或第二端基，或含有不完全代的构建单元。
[0328]
因此，提供了包含多种树状聚体或其药学上可接受的盐的组合物，其中树状聚体如本文所定义，
[0329]
所述组合物中每个树状聚体的第一端基的平均数量在24至32的范围内，且
[0330]
所述组合物中每个树状聚体的第二端基的平均数量在24至32的范围内。在一些实施方案中，每个树状聚体的第一端基的平均数量在26至32的范围内，并且其中每个树状聚体的第二端基的平均数量在26至32的范围内。在一些实施方案中，每个树状聚体的第一端基的平均数量在28至32的范围内，并且其中每个树状聚体的第二端基的平均数量在28至32的范围内。在一些实施方案中，每个树状聚体的第一端基的平均数量在29至32的范围内，并且其中每个树状聚体的第二端基的平均数量在29至32的范围内。在一些实施方案中，每个树状聚体的第一端基的平均数量在30至32的范围内，并且其中每个树状聚体的第二端基的平均数量在30至32的范围内。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物，并且所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
[0331]
在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少
95％的树状聚体含有至少26个第一端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少28个第一端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少30个第一端基。
[0332]
在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少26个第二端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少28个第二端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少30个第二端基。
[0333]
在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少26个第一端基和至少26个第二端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少28个第一端基和至少28个第二端基。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的树状聚体含有至少30个第一端基和至少30个第二端基。
[0334]
本发明还提供用于兽医和人类医学用途两者的药物制剂或组合物，其包含本发明的树状聚体或其药学上可接受的盐，与一种或多种药学上可接受的载体，和任选的任何其它治疗成分、稳定剂等。载体必须在与制剂的其它成分相容的意义上是药学上可接受的，并且不会对其接受者过度有害。本发明的组合物还可包括聚合物赋形剂/添加剂或载体，例如聚乙烯吡咯烷酮，衍生化纤维素，诸如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素，ficolls(一种聚合糖)，羟乙基淀粉(hes)，右旋糖苷(例如环糊精，诸如2
‑
羟丙基
‑
β
‑
环糊精和磺基丁基醚
‑
β
‑
环糊精)，聚乙二醇，和果胶。组合物可以进一步包括稀释剂，缓冲剂，柠檬酸盐，海藻糖，粘合剂，崩解剂，增稠剂，润滑剂，防腐剂(包括抗氧化剂，无机盐(例如氯化钠)，抗微生物剂(例如氯化苄烷铵)，甜味剂，抗静电剂，脱水山梨糖醇酯，脂质(例如磷脂，诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸和脂肪酸酯、类固醇(例如胆固醇))，和螯合剂(例如edta、锌和其它此类合适的阳离子)。适用于根据本发明的组合物中的其它药物赋形剂和/或添加剂列在“remington:the science&practice of pharmacy",19.sup.th ed.,williams&williams,(1995)”，和“physician's desk reference",52.sup.nd ed.,medical economics,montvale,n.j.(1998),和"handbook of pharmaceutical excipients”,third ed.,ed.a.h.kibbe,pharmaceutical press,2000”中。
[0335]
本发明的树状聚体可以配制成组合物，包括适于鼻内递送、吸入肺部、通过气雾剂或肠胃外(包括腹膜内、静脉内、皮下或肌内注射)施用的组合物。组合物可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。所有方法包括使树状聚体与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，通过使树状聚体与液体载体缔合以形成溶液或悬浮液，或可选地，使树状聚体与适于形成固体、任选地颗粒产物的制剂组分缔合，且然后，如果有保证，则使产物成形为期望的递送形式来制备组合物。当为颗粒时，本发明的固体制剂通常将包含尺寸范围为约1纳米至约500微米的颗粒。通常，对于用于静脉内施用的固体制剂，颗粒的直径通常将在约1nm至约10微米的范围内。组合物可以含有本发明的树状聚体，所述树状聚体是具有低于1000nm的颗粒直径的纳米颗粒，例如介于5和1000nm之间、
特别是5和500nm之间、更特别是5和400nm之间，诸如5至50nm和特别是5和20nm之间。在一个实施例中，组合物含有平均尺寸为介于5和20nm之间的树状聚体。在一些实施方案中，树状聚体多分散在组合物中，pdi为介于1.01和1.8之间，特别是介于1.01和1.5之间、更特别是介于1.01和1.2之间。在一些实施方案中，树状聚体多分散在组合物中，具有约1.1的pdi。在一个示例中，树状聚体单分散在组合物中。
[0336]
在一些优选的实施方案中，组合物被配制用于肠胃外递送。例如，在一个实施方案中，所述制剂可以是适于在注射前在水性溶媒中重构的无菌冻干组合物。
[0337]
在一个实施方案中，适于肠胃外施用的制剂方便地包含树状聚体的无菌水性制剂，其可以例如被配制成与接受者的血液等渗。
[0338]
在一些实施方案中，组合物被配制用于腹膜内递送。可以使用任何合适的递送方式。例如，在一些实施方案中，递送可以通过灌洗或气雾剂进行。在一个实施方案中，所述组合物被配制用于腹膜内递送，并且用于治疗腹膜腔中的癌症，所述癌症包括恶性上皮肿瘤(例如卵巢癌)和腹膜癌病(例如，胃肠癌，特别是结肠直肠癌、胃癌、妇科癌症和原发性腹膜肿瘤)。
[0339]
还提供了适于作为气雾剂通过吸入施用的药物制剂。这些制剂包含期望的树状聚体或其盐的溶液或悬浮液。可将期望的制剂置于小室中并雾化。雾化可通过压缩空气或通过超声能量完成以形成多个包含树状分子或其盐的液滴或固体颗粒。
[0340]
如下所述，本发明的树状聚体可以例如与一种或多种另外的药学活性剂组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与另外的活性物质组合提供。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含如本文定义的树状聚体或其药学上可接受的盐，一种或多种药学上可接受的载体和一种或多种另外的药学活性剂，例如另外的抗癌/肿瘤学药剂，诸如小分子细胞毒性剂、检查点抑制剂、或抗体疗法。不仅本发明的树状聚体可以与其它化疗药物一起施用，而且也可以与其它药物一起施用，诸如皮质类固醇、抗组胺药、镇痛药和帮助恢复或防止血液毒性的药物，例如细胞因子。
[0341]
在一些实施方案中，所述组合物用于作为化疗方案的一部分的肠胃外输注而配制。在这些实施方案中，组合物可以例如基本不含或完全不含增溶赋形剂，特别是下述增溶赋形剂，诸如聚乙氧基化蓖麻油(例如诸如以商品名出售或以商品名出售的产品)，或聚乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯(诸如，以商品名polysorbate出售的产品)。增溶赋形剂是帮助树状聚体在一种或多种溶剂中溶解的添加剂。在一个实施方案中，组合物基本上不含或完全不含聚乙氧基化蓖麻油(例如诸如以商品名出售或以商品名出售的产品)和聚乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯(例如诸如，polysorbate)。在一个实施方案中，组合物基本上或完全不含增溶赋形剂。通过避免使用一些增溶赋形剂，树状聚体的组合物不太可能引起副作用，诸如急性或迟发性超敏反应，包括危及生命的过敏反应和/或严重的液体滞留，和/或消除对类固醇预处理的需要。
[0342]
使用方法
[0343]
本发明的树状聚体可用于治疗或预防未修饰的药物活性剂可用于治疗或预防的任何疾病、病况或症状。因此，还提供了用于治疗的如本文所述的树状聚体或药物组合物。
[0344]
在一些实施方案中，树状聚体用于治疗或预防癌症的方法中，例如用于抑制肿瘤
的生长。在一些实施方案中，树状聚体用于治疗癌症。还提供了治疗癌症的方法，包含向有需要的受试者施用治疗有效量的树状聚体。还提供了如本文定义的树状聚体或如本文定义的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0345]
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。所述癌症可以是原发性或转移性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是原发性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性肿瘤。
[0346]
在一些实施方案中，癌症是与brca1和/或brca2突变相关的癌症。
[0347]
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、癌症、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和子宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是转移性结肠癌或直肠癌。在一些实施方案中，癌症是转移性胰腺腺癌。在一些实施方案中，癌症是转移性卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞或小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是iv
‑
b期、复发性或持续性子宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是转移性胃癌。在一些实施方案中，癌症是转移性食道癌。
[0348]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)的树状聚体具有核，该核是：
[0349][0350]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)中的树状聚体具有构建单元，所述构建单元各自为：
[0351]
更优选地
[0352]
其中每个构建单元的酰基提供用于连接至核或前一代构建单元的共价连接点；并且其中每个氮原子提供用于共价连接至后续代构建单元、第一端基或第二端基的共价连接点。
[0353]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)的树状聚体具有第一端基(t1)，第一端基各自为：
[0354][0355]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)的树状聚体具有第二端基，第二端基各自为
[0356]
peg基团
[0357]
并且其中peg基团是甲氧基封端的peg，其具有在约1500至2500道尔顿范围内的平均分子量。
[0358]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)的树状聚体具有在26至32的范围内的第一端基和26至32的范围内的第二端基。
[0359]
在一些实施方案中，用于治疗(例如，癌症治疗)的树状聚体是
[0360][0361]
其中t1
′
表示以下的第一端基：
[0362][0363]
或t1
′
表示h，其中少于5个t1
′
是h；且
[0364]
t2
′
表示以下的第一端基：
[0365]
peg基团
[0366]
其中peg基团是甲氧基封端的peg，其平均分子量在约1500至2500道尔顿的范围内，或t2
′
表示h，并且其中少于5个t2
′
是h。
[0367]
在一些实施方案中，治疗(例如，肿瘤治疗)中使用的树状聚体是以下实施例中描述的树状聚体中的任一种。
[0368]
组合
[0369]
在联合治疗中，特别是在化疗期间，药物通常与其它药物共同给药。因此，在一些实施方案中，树状聚体与一种或多种其它药物活性剂，例如一种或多种其它抗癌剂/药联合施用。树状聚体和一种或多种其它药物活性剂可以同时、随后或分别给药。例如，它们可以作为相同组合物的一部分施用，或通过单独的组合物施用。一种或多种其它药物活性剂可以是例如用于治疗结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或乳腺癌的抗癌剂。
[0370]
一组另外的抗癌药物的一个具体示例是免疫治疗剂。如本领域技术人员将理解的，短语
‘
免疫治疗剂’是指指导免疫应答以攻击肿瘤细胞从而提高免疫系统对抗疾病的天然能力的试剂。在一些实施方案中，其它药物活性剂是免疫治疗剂。因此，在一些实施方案中，树状聚体与一种或多种免疫治疗剂联合施用。癌细胞表达肿瘤抗原，其通过免疫系统中的抗体蛋白检测。当正常抗体与外部病原体结合时，修饰的免疫治疗剂与肿瘤抗原结合并标记它们以使免疫系统抑制和/或杀死。在一些实施方案中，免疫治疗剂是抗体。
[0371]
免疫疗法的一种形式是检查点抑制剂疗法。这些疗法靶向免疫检查点，这些免疫检查点是免疫系统的关键调节物，当受到刺激时可以减弱对免疫刺激的免疫应答。一些癌症可以通过刺激免疫检查点靶标来保护自身免受攻击。检查点抑制剂疗法可以阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能。在一些实施例中，免疫疗法靶向免疫检查点蛋白。在免疫检查点蛋白中，程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)受体在活化的t细胞表面表达，并且其配体pd
‑
l1和pd
‑
l2通常在树突细胞或巨噬细胞表面表达。阻断或抑制肿瘤细胞上的pd
‑
l1和/或pd
‑
l2与t细胞上的pd
‑
1结合的免疫治疗剂防止肿瘤逃避免疫应答。在一些实施方案中，免疫治疗剂是结合pd
‑
1、pd
‑
l1、ctl4、cd52和/或cd20的试剂。在一些实施方案中，免疫治疗是pd
‑
1抑制剂和/或pd
‑
l1抑制剂。在一个示例中，免疫治疗剂是pd
‑
1抑制剂。在一个示例中，免疫治疗剂是pd
‑
l1抑制剂。在一个示例中，免疫治疗剂是ctl4抑制剂。在一个示例中，免疫治疗剂是cd52抑制剂。在一个示例中，免疫治疗剂是cd20抑制剂。
[0372]
几种pd
‑
1和pd
‑
l1抑制剂已被批准用于治疗各种癌症，包括：
[0373]
·
派姆单抗被批准用于黑素瘤，包括携带braf突变的患者中的晚期黑素瘤、转移性非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌；
[0374]
·
纳武单抗(nivolumab)被批准用于治疗不能手术的或转移性黑素瘤、鳞状细胞肺癌、肾细胞癌和霍奇金(hodgkin)淋巴瘤；
[0375]
·
阿特朱单抗(atezolizumab)被批准用于治疗肺癌、膀胱癌、小细胞肺癌、三阴性乳腺癌；
[0376]
·
avelumab被批准用于治疗非小细胞肺癌、胃癌、梅克尔(merkel)细胞癌，目前正在临床试验用于治疗膀胱癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤、卵巢癌和肾癌；
[0377]
·
durvalumab被批准用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌，目前正在临床试验用于治疗非小细胞肺癌、晚期转移性尿路上皮癌和复发性头颈癌；和
[0378]
·
西米利昔单抗(cemiplimab)被批准用于治疗鳞状细胞皮肤癌、骨髓瘤、肺癌和转移性皮肤鳞状细胞癌。
[0379]
几种pd
‑
1和pd
‑
l1抑制剂正在试验用于治疗各种癌症，包括司帕珠单抗(spartalizumab)、卡瑞珠单抗(camrelizumab)、sintilizumab、tislelizumab和toripalimab。此外，几种pd
‑
1和pd
‑
l1抑制剂处于实验开发阶段，包括kn035、ck
‑
301、aunp12、ca
‑
170和bms
‑
986189。
[0380]
因此，在一些实施方案中，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、avelumab、德瓦鲁单抗(durvalumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。在一个示例中，免疫治疗剂是是派姆单抗。在一个示例中，免疫治疗剂是纳武单抗。在一个示例中，免疫治疗剂是阿特朱单抗。在一个示例中，免疫治疗剂是avelumab。在一个示例中，免疫治疗剂是durvalumab。在一个示例中，免疫治疗剂是西米利昔单抗。免疫治疗剂也可以是任何两种或多种上述免疫治疗剂的组合。例如，免疫治疗剂可以是派姆单抗和纳武单抗的组合。
[0381]
免疫治疗剂可以根据任何合适的常规方法施用。通常，免疫治疗剂根据免疫治疗剂的产品信息施用。当与本申请的树状聚体联合使用时，免疫治疗剂的剂量可以与免疫治疗剂单一疗法的剂量相同，或者可以不同(例如，降低剂量)。在一些实施方案中，当与树状聚体联合使用时，免疫治疗剂的剂量与免疫治疗剂单一疗法的剂量相同。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，免疫治疗剂的剂量不同于免疫治疗剂单一疗法的剂量(例如，更低剂量)。本领域技术人员将理解免疫治疗剂的剂量以及相关的剂量方案/时间表可以相应地调整。
[0382]
例如，当作为免疫治疗剂单一疗法施用时，每三周以200mg静脉内输注30分钟施用派姆单抗。当与树状聚体联合施用时，派姆单抗的剂量可以与派姆单抗单一疗法的剂量相同，或者派姆单抗的剂量可以与派姆单抗单一疗法的剂量不同。
[0383]
因此，在一些实施方案中，树状聚体与派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、avelumab、德瓦鲁单抗(durvalumab)和西米普利单抗(cemiplimab)中的任何一种或多种组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与纳武单抗组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与阿特朱单抗组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与avelumab组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与德瓦鲁单抗组合施用。在一些实施方案中，树状聚体与西米普利单抗组合施用。
[0384]
在癌症的治疗中，免疫治疗剂可以与放射疗法组合施用。因此，在一些实施方案中，树状聚体或包含树状聚体的组合物与免疫治疗剂(诸如派姆单抗)组合施用和与放射疗法组合施用。可以在施用根据本发明的树状聚体之前、同时或之后向患者施用放射治疗。
[0385]
一组另外的抗癌药物的另一个示例是聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。parp酶是参与许多细胞过程的蛋白质家族，细胞过程包括但不限于dna修复、基因组稳定性和程序性细胞死亡。结果，parp酶的抑制呈现为吸引人的抗癌靶标。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是parp抑制剂。
[0386]
目前已知几种parp抑制剂，它们的选择已被批准用于销售。例如，奥拉帕尼(olaparib)、rucapabrib、尼拉帕尼(niraparib)和塔拉唑帕尼(talazoparib)都已被usfda批准。因此，在一些实施方案中，另外的抗癌药物是奥拉帕尼。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是rucapabrib。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是尼拉帕尼。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是塔拉唑帕尼。
[0387]
当作为化学治疗剂单独施用时，奥拉帕尼作为包含100mg或150mg奥拉帕尼的片剂或胶囊口服施用。奥拉帕尼的推荐日剂量是300mg，每天服用两次，导致600mg的等效总日剂量。当与本申请的树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量可以与奥拉帕尼单一疗法的日剂量相同，或者可以不同(例如，降低的日剂量)。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量与奥拉帕尼单一疗法的日剂量相同。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量不同于用于奥拉帕尼单一疗法的日剂量(例如，更低剂量)。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量为600mg。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量为约600mg。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量少于600mg。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量小于约600、500、400、300、200、100或50mg。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量为介于约50和600mg、100和600mg、200和600mg或300和600mg之间。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量为介于约300和600mg之间。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量为300至500mg、300至400mg、200至500mg、200至400mg、200至300mg、100至500mg、100至400mg、100至300mg或100至200mg的范围。
[0388]
在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量为约8mg/kg。在一些实施方案中，当与树状聚体组合使用时，奥拉帕尼的日剂量小于8mg/kg。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量小于约8、7、6、5、4、3或2mg/kg。在一些实施方案中，奥拉帕尼的日剂量为介于约2和8mg/kg、3和8mg/kg、4和8mg/kg、5和8mg/kg、6和8mg/kg、2和7mg/kg、3和7mg/kg、4和7mg/kg、5和7mg/kg、2和6mg/kg、3和6mg/kg、4和6mg/kg、2和5mg/kg、3和5mg/kg、或2和4mg/kg之间。本领域技术人员将理解，可以相应地调节奥拉帕尼的日剂量。
[0389]
组合治疗的药剂可以涉及单独的剂量方案。例如，树状聚体可能需要以与其中需要施用其它抗癌剂的时间间隔不同的时间间隔施用，其它抗癌剂即，parp抑制剂(例如，奥拉帕尼)。在一些实施方案中，以预定频率向有需要的受试者施用治疗有效量的树状聚体。在一些实施方案中，根据其中树状聚体每一至四周施用一次的给药方案向需要其的受试者施用树状聚体。在一些实施方案中，根据其中树状聚体每三至四周施用一次的给药方案向需要其的受试者施用树状聚体。在一些实施方案中，根据每天一次、两次、三次、四次或五次施用parp抑制剂的剂量方案，将parp抑制剂施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，parp抑制剂每天施用一次。在一些实施方案中，parp抑制剂每天施用两次。在一些实施方案中，parp抑制剂每天施用三次。在一些实施方案中，parp抑制剂以由5天施用和2天不施用组成的每周方案施用。在一些实施方案中，所述2天是连续的。在一些实施方案中，根据每天一次、两次、或三次施用奥拉帕尼的剂量方案，将奥拉帕尼施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，奥拉帕尼每天施用一次。在一些实施方案中，奥拉帕尼每天施用两次。在一些实施方案中，奥拉帕尼每天施用三次。在一些实施方案中，奥拉帕尼以由5天施用和2天不施用组成的每周方案施用。在一些实施方案中，所述2天是连续的。
[0390]
parp抑制剂可以根据任何常规方式施用。此外，parp抑制剂不一定需要经由与树状聚体相同的途径施用。在一些实施方案中，parp抑制剂口服施用。在一些实施方案中，树状聚体静脉施用。在一些实施方案中，树状聚体静脉施用，parp抑制剂口服施用。在一些实施方案中，奥拉帕尼口服施用。在一些实施方案中，树状聚体静脉施用，奥拉帕尼口服施用。
[0391]
除了奥拉帕尼、卢卡帕尼(rucapabrib)、尼拉帕尼(niraparib)和他拉唑帕尼
(talazoparib)之外的其它parp抑制剂是已知的，并且这样的其它parp抑制剂与树状聚体组合的用途也形成本发明的一部分。例如，维利帕尼(veliparib)、cep9722、e7016、iniparib和3
‑
氨基苯甲酰胺是已知的parp抑制剂。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是维利帕尼。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是cep9722。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是e7016。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是iniparib。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是3
‑
氨基苯甲酰胺。
[0392]
奥拉帕尼，也称为azd
‑
2281、mk
‑
7339和是fda批准的针对癌症的靶向疗法。其特别可用于治疗患有遗传性brca1或brca2突变的患者的癌症，癌症包括但不限于一些卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。在一些实施方案中，树状聚体和parp抑制剂(例如，奥拉帕尼)的组合用于治疗与brca1突变相关的癌症。在一些实施方案中，组合用于治疗与brca2突变相关的癌症。在一些实施方案中，组合用于治疗与同源重组修复突变(hrrm)或同源重组缺陷(hrdlower)相关的癌症。hrr基因包括brca1/2、brip1、atm、rad54l和cdk12。在一些实施方案中，组合用于治疗实体瘤。在一些实施方案中，组合用于治疗同源重组修复突变(hrrm)或同源重组缺陷(hrd)阳性(例如hrd得分≥42，myriad mychoice hrd)实体癌。在一些实施方案中，组合用于治疗与卵巢癌相关的癌症。在一些实施方案中，组合用于治疗与乳腺癌相关的癌症。在一些实施方案中，组合用于治疗前列腺癌。在一些实施方案中，组合用于治疗胰腺癌。在一些实施方案中，组合用于治疗结肠直肠癌。在一些实施方案中，组合用于治疗胃癌。在一些实施方案中，组合用于治疗小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是奥拉帕尼，并且组合用于治疗卵巢癌。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是奥拉帕尼，并且组合用于治疗乳腺癌。在一些实施方案中，另外的抗癌药物是奥拉帕尼，并且组合用于治疗前列腺癌。
[0393]
在癌症的治疗中，parp抑制剂可以与放射疗法组合施用。因此，在一些实施方案中，树枝状聚体或包含树枝状聚体的组合物与parp抑制剂(诸如奥拉帕尼)组合施用并且与放射疗法组合施用。可以在施用根据本公开的树状聚体之前、同时或之后向患者施用放射治疗。
[0394]
其它药学活性剂的示例包括但不限于化学治疗剂和细胞毒性剂、酪氨酸激酶抑制剂、检查点抑制剂、egfr抑制剂和单克隆抗体疗法。在一些实施方案中，egfr抑制剂是egfr抗体。efgr抗体的示例是西妥昔单抗(cetuximab)。西妥昔单抗是抗表皮生长因子受体(egfr，也称为erbb
‑
1或her
‑
1)抗体。其适用于治疗具有egfr表达、ras野生型转移性结肠直肠癌连同伊立替康(irinotecan)的患者以及适用于头颈部鳞状细胞癌。其它egfr抗体包括奈西木单抗(necitumumab)(鳞状nsclc与吉西他滨(gemcitabine)和顺铂组合)和帕尼单抗。西妥昔单抗以400mg/m2初始剂量施用，随后在伊立替康、用氟尿嘧啶或folfiri的基于铂的疗法之前1小时每周施用250mg/m2。cochrane综述(2016年)报告，与单独化疗相比，施用西妥昔单抗联合化疗的患者不会进一步延迟肺癌扩散，并且不会延长生命。在一线方案中，iii期crystal试验(西妥昔单抗联合伊立替康一线治疗转移性结肠直肠癌)证明西妥昔单抗改善了标准化疗方案，特别是降低了进展风险(8.9与8个月，hr 0.85；p＝0.048，肿瘤反应增强(46.9％与38.7％，or 1.40；p＝0.004)和根治性切除(r0)转移有治愈意图(p＝0.002)。然而，os分析未显示处理组之间的统计学显著性差异(19.9与18.6；hr 0.93，p＝0.31)。然而，本发明人已经证明，当与本发明的含喜树碱的树状聚体组合施用时，西妥昔单
抗和树状聚体的组合在小鼠的ht
‑
29细胞小鼠异种移植结肠直肠癌模型中提供改善的性质。其它egfr抑制剂的示例包括酪氨酸激酶抑制剂，诸如来那替尼(neranitinib)(her2+乳腺癌)、奥西替尼(osimertinib)(t790m+nsclc)、埃罗替尼(erlotinib)(mpc或nsclc)、吉非替尼(gefitinib)(nsclc或转移性癌症)和拉帕替尼(lapatinib)(her2+乳腺癌)、凡德他尼(vandetanib)(甲状腺癌)和达克替尼(dacomitinib)(nsclc)。在一些实施方案中，树状聚体与egfr抑制剂(例如，egfr抗体，诸如西妥昔单抗)组合施用，并且该组合用于治疗例如结直肠癌。
[0395]
对于治疗结肠直肠癌，树状聚体可以与例如5
‑
氟尿嘧啶和/或亚叶酸、西妥昔单抗、贝伐单抗、卡培他滨或铂酸盐(包括顺铂)一起施用。适用于各种适应症的其它药学活性剂的示例包括：
[0396]
·
替莫唑胺(temozolomide)、安洛替尼(anlotinib)、环磷酰胺、尼拉帕尼(niraparib)，用于尤因肉瘤；
[0397]
·
安洛替尼、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿帕替尼(雷莫芦单抗)、顺铂、卢卡帕尼(rucapabrib)，用于食道癌；
[0398]
·
维利帕尼、ds
‑
8201a、曲妥单抗(trastuzumab)，用于乳腺癌；
[0399]
·
阿利替尼(alisertib)、环磷酰胺、顺铂、贝伐单抗(bevacizumab)、替莫唑胺(替莫唑胺)，用于成神经细胞瘤；
[0400]
·
恩杂鲁胺(enzalutamide)，用于前列腺癌；
[0401]
·
厄洛替尼(erlotinib)，用于胰腺癌。
[0402]
剂量
[0403]
应当理解，治疗有效量是指以足以在一定程度上减轻或预防所治疗的病况或病症的一种或多种症状的量施用的树状聚体。树状聚体的治疗有效量可以基于例如施用的树状聚体的量。或者，可以基于树状聚体理论上能够递送的喜树碱活性物质(例如sn
‑
38)的量来确定，例如，基于喜树碱活性物质在树状聚体上的负载来确定。
[0404]
树状聚体可以通过任何合适的途径施用，包括例如树状聚体可以静脉内施用。伊立替康(irinotecan)通常以iv输注给药30
‑
90分钟。在一些实施方案中，树状聚体作为iv推注递送。在一些实施方案中，在0.5分钟至90分钟、或0.5分钟至60分钟、或0.5分钟至15分钟、或0.5分钟至5分钟的时间段内iv施用树状聚体。在另一个示例中，树状聚体可以腹膜内给药。施用途径可以例如针对受试者具有的疾病或病症。例如，在一些实施方案中，疾病或病症可以是腹腔内恶性肿瘤，诸如妇科或胃肠癌，并且树状聚体可以腹膜内施用。在一些实施方案中，树状聚体可以用于治疗腹膜腔的癌症，诸如恶性上皮肿瘤(例如卵巢癌)或转移性腹膜癌(例如胃肠癌，特别是结肠直肠癌、胃癌、妇科癌症和原发性腹膜肿瘤)，并且将树状聚体腹膜内施用。
[0405]
在一些实施方案中，施用的树状聚体的量足以递送介于2和100mg活性剂/m2之间、介于2和50mg活性剂/m2之间、介于2和40mg活性剂/m2之间、介于2和30mg活性剂/m2之间、介于2和25mg活性剂/m2之间、介于2和20mg活性剂/m2之间、介于5和50mg活性剂/m2之间、介于10和40mg活性剂/m2之间、介于15和35mg活性剂/m2之间、介于10和20mg/m2之间、介于20和30mg/m2之间、或介于25和35mg活性剂/m2之间。小鼠中10mg/kg的活性剂的剂量应该大约等于30mg/m2的人类剂量(fda指导2005)。(为了将人类mg/kg剂量转换为mg/m2，可将该数字乘
以37，fda指南2005)。
[0406]
在一些实施方案中，以预定频率向有需要的受试者施用治疗有效量的树状聚体。在一些实施方案中，根据其中树状聚体每一至四周施用一次的给药方案向需要其的受试者施用树状聚体。在一些实施方案中，根据其中树状聚体每三至四周施用一次的给药方案向需要其的受试者施用树状聚体。
[0407]
已经令人惊奇地发现，本发明的树状聚体包含喜树碱活性物质的残基，即与直接施用伊立替康(临床批准的sn
‑
38前药)相比，sn
‑
38具有增加的效力。伊立替康疗法的示例包括和如本文所用，术语“未缀合的”和“释放的”是指药物，即喜树碱活性物质，其已从树状聚体解离或裂解。这种解离或裂解可在施用药物
‑
树状聚体缀合物后在体内发生。
[0408]
如上所述，树状聚体可以与其它活性剂组合施用，例如egfr抑制剂，诸如西妥昔单抗，parp抑制剂，诸如奥拉帕尼，或免疫治疗剂，诸如派姆单抗。通常，对于这样的组合，所施用的每种药剂的剂量低于实现治疗或预防效果所需的单一疗法的剂量。在一些实施方案中，当与西妥昔单抗组合施用时，树状聚体的剂量足以递送介于约2和约100mg活性剂/m2之间、介于约2和约50mg活性剂/m2之间、介于约2和约40mg活性剂/m2之间、介于约2和约30mg活性剂/m2之间、介于约2和约25mg活性剂/m2之间、介于约2和约20mg活性剂/m2之间、介于约5和约50mg活性剂/m2之间、介于约10和约40mg活性剂/m2之间、介于约15和约35mg活性剂/m2之间、介于约10和约20mg/m2之间、介于约20和约30mg/m2之间、或介于约25和约35mg活性剂/m2之间，并且西妥昔单抗的剂量在约50mg/m2至约400mg/m2的范围内，例如在约50mg/m2至约250mg/m2的范围内，或在约50mg/m2至约150mg/m2的范围内。在一些实施方案中，当奥拉帕尼与树状聚体组合施用时，树状聚体的剂量足以递送介于约2和约100mg活性剂/m2之间、介于约2和约50mg活性剂/m2之间、介于约2和约40mg活性剂/m2之间、介于约2和约30mg活性剂/m2之间、介于约2和约25mg活性剂/m2之间、介于约2和约20mg活性剂/m2之间、介于约5和约50mg活性剂/m2之间、介于约10和约40mg活性剂/m2之间、介于约15和约35mg活性剂/m2之间、介于约10和约20mg/m2之间、介于约20和约30mg/m2之间、或介于约25和约35mg活性剂/m2之间，和/或奥拉帕尼的剂量介于约200mg/天和约600mg/天之间、介于约400mg/天和约600mg/天之间，或介于约200mg/天和约400mg/天之间。在一些实施方案中，当派姆单抗与树状聚体组合施用时，树状聚体的剂量足以递送介于约2和约100mg活性剂/m2之间、介于约2和约50mg活性剂/m2之间、介于约2和约40mg活性剂/m2之间、介于约2和约30mg活性剂/m2之间、介于约2和约25mg活性剂/m2之间、介于约2和约20mg活性剂/m2之间、介于约5和约50mg活性剂/m2之间、介于约10和约40mg活性剂/m2之间、介于约15和约35mg活性剂/m2之间、介于约10和约20mg/m2之间、介于约20和约30mg/m2之间、或介于约25和约35mg活性剂/m2之间，和/或派姆单抗的剂量介于约100mg/天至约400mg/天之间，或约100mg/天至约200mg/天。
[0409]
当树状聚体与诸如西妥昔单抗的egfr抑制剂，诸如奥拉帕尼的parp抑制剂、或诸如派姆单抗的免疫治疗剂组合施用时，其可以例如顺序施用。在一些实施方案中，在施用树状聚体之前施用其它治疗剂(例如，egfr抑制剂，诸如西妥昔单抗；parp抑制剂，诸如奥拉帕尼；或免疫治疗剂，诸如派姆单抗)。例如，可以预先施用至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟。例如，可以预先施用不超过24小时、不超过12小时、不超过6小时、不超过3小时、不超过2小时或不超过90分钟。在一些实施方案中，在施用树状聚体之前约1小时施用其它治疗剂
(例如，egfr抑制剂，诸如西妥昔单抗；parp抑制剂，诸如奥拉帕尼；或免疫治疗剂，诸如派姆单抗)。
[0410]
药代动力学，效力和副作用
[0411]
在一些实施方案中，与施用等量的未缀合(例如，“游离”)药物相比，本发明的树状聚体提供以下中的一种或多种：增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。举例来说，托泊替康(topotecan)是具有以下结构的喜树碱活性物质：
[0412][0413]
其已被批准用于治疗卵巢癌和肺癌，商品名为可以例如在施用包含托泊替康作为喜树碱活性物质的树状聚体之后，和在施用等量的未缀合药物(例如，)之后进行比较。在本文中，术语“等量”是指施用一定剂量的树状聚体，如果作为树状聚体的一部分存在的所有喜树碱活性物质被释放，将提供与施用的一定剂量的未缀合药物中相同摩尔数的喜树碱活性物质。
[0414]
在一些实施方案中，与施用等量的未缀合药物的小分子前药形式相比，本发明的树状聚体提供以下中的一种或多种：增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。例如，如上所述，伊立替康是喜树碱活性物质sn
‑
38的前药。可以例如在施用包含sn
‑
38作为喜树碱活性物质的树状聚体之后，和在施用等量的伊立替康(例如，)之后进行比较。在本文中，术语“等量”是指施用一定剂量的树状聚体，如果作为树状聚体的一部分存在的所有sn
‑
38都被释放，将提供与一定剂量伊立替康所提供的相同摩尔数的游离sn
‑
38，假定所有伊立替康前药被裂解成sn
‑
38。
[0415]
在一些实施方案中，与施用等剂量的伊立替康相比，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。
[0416]
在一些实施方案中，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与等剂量的sn
‑
38(例如，游离sn
‑
38)相比，提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且以与通过施用最大耐受剂量伊立替康提供的sn
‑
38的量相比含有等量或更大量sn
‑
38的树状聚体的量施用，并且与施用最大耐受剂量伊立替康相比，提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。
[0417]
在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且以与通过施用最大耐受剂量伊立替康提供的sn
‑
38的量相比含有等量或更少量sn
‑
38的树状聚体的量施用，并且与施用最大耐受剂量伊立替康相比，提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露
(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的t
max
、降低的c
max
、和/或降低的毒性。
[0418]
在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且以与最大耐受剂量sn
‑
38的相比含有等量或更大量sn
‑
38的树状聚体的量施用，并且与施用最大耐受剂量sn
‑
38相比，提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的tmax、降低的cmax、和/或降低的毒性。
[0419]
在一些实施例中，树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且以与最大耐受剂量sn
‑
38相比含有等量或更少量的sn
‑
38的树状聚体的量施用，并且与施用最大耐受剂量sn
‑
38相比，提供以下中的一种或多种：游离sn
‑
38的增加的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)、增加的tmax、降低的cmax、和/或降低的毒性。
[0420]
在一些实施方案中，与直接施用等剂量的喜树碱活性物质(例如，游离喜树碱活性物质)相比，施用树状聚体提供至少两倍的游离喜树碱活性性物质的治疗性药物暴露(auc)。
[0421]
在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与直接施用等剂量的伊立替康相比，树状聚体的施用提供至少两倍的游离sn
‑
38的治疗性药物暴露(auc)。
[0422]
在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38，并且与以其最大耐受剂量施用的等量伊立替康的施用相比，提供至少两倍的游离sn
‑
38的治疗性药物暴露(auc)。
[0423]
在一些实施方案中，树状聚体包含sn
‑
38，并且与以其最大耐受剂量施用的等量sn
‑
38的施用相比，提供至少两倍的游离sn
‑
38的治疗性药物暴露(auc)。
[0424]
随着时间逐渐释放游离sn
‑
38的树状聚体的有益特性允许治疗有效浓度的活性物质在长时间内持续，但不具有高c
max
。这意味着与施用相同量的sn
‑
38或伊立替康本身相比，树状分子通常具有改善的副作用/毒性特征，并且与通过施用最大耐受剂量的sn
‑
38或伊立替康所提供的相比，可以允许以含有更大量结合到树状分子上的喜树碱活性物质(例如sn
‑
38)的量施用树状分子。
[0425]
肿瘤学药物通常具有显著的副作用，其归因于系统毒性，诸如血液毒性、神经毒性、心脏毒性、肝毒性、肾毒性、耳毒性和胃肠道反应。例如，喜树碱诸如伊立替康可引起副作用，诸如：腹泻，骨髓抑制，中性粒细胞减少症，中性粒细胞减少性发热，中性粒细胞减少性感染，白细胞减少症，血小板减少症，淋巴细胞减少症，超敏反应，肾损害，肾衰竭，肺毒性(呼吸困难、咳嗽、肺炎、间质性肺病)，致畸性，恶心，呕吐，脱水，腹痛，败血性休克，便秘，厌食症，粘膜炎，贫血，乏力，疼痛，发热，感染，眩晕，嗜睡，精神错乱，血管舒张，低血压，血栓栓塞事件，异常胆红素，皮疹，脱发或体重下降。
[0426]
在一些实施方案中，与施用相同剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用树状聚体减少了副作用和/或毒性的发生。在一些实施方案中，副作用是腹泻，和/或呕吐/恶心，和/或骨髓抑制。
[0427]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质是sn
‑
38的残基，并且与施用等剂量的伊立替康相比，施用树状聚体减少了副作用和/或毒性的发生率。在一些实施方案中，副作用是腹泻和/或骨髓抑制。
[0428]
药物的毒性是指对生物体造成损害的程度，并通过其对靶标的作用来测量。在肿瘤学中，动物模型中毒性的一种这样的测量是体重减轻，其决定了最大耐受剂量(mtd)。在人类中，通常通过特定的不良事件(ae事件)来确定毒性，其通常标识剂量限制性毒性。应当
理解，通常在肿瘤学中，存在狭窄的治疗窗口并且脱靶毒性被认为是杀死肿瘤细胞的正常副作用。
[0429]
在一些实施方案中，当在治疗癌症的方法中使用时，诸如结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或子宫颈癌中使用时，与施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用树状聚体提供降低的毒性。在一些实施方案中，喜树碱活性物质是sn
‑
38，当在治疗癌症的方法中使用时，诸如结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或子宫颈癌中使用时，与施用等剂量的伊立替康相比，施用树状聚体提供降低的毒性。
[0430]
在一些实施方案中，如通过具有特定ae(例如，腹泻，骨髓抑制，中性粒细胞减少症，中性粒细胞减少性发热，中性粒细胞减少性感染，白细胞减少症，血小板减少症，淋巴细胞减少症，超敏反应，肾损害，肾衰竭，肺毒性(呼吸困难、咳嗽、肺炎、间质性肺病)，致畸性，恶心，呕吐，脱水，腹痛，败血性休克，便秘，厌食症，粘膜炎，贫血，乏力，疼痛，发热，感染，眩晕，嗜睡，精神错乱，血管舒张，低血压，血栓栓塞事件，异常胆红素，皮疹，脱发或体重下降)的患者的数量所测量的，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，树状聚体提供毒性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％，或与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，通过ae的等级(不良事件的通用术语标准，“ctcae”)的降低所测量的ae严重程度，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的患者群体。
[0431]
在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用树状聚体提供小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的毒性，或与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，毒性严重性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0432]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基为sn
‑
38的残基，并且如通过具有特定ae(例如，腹泻，骨髓抑制，中性粒细胞减少症，中性粒细胞减少性发热，中性粒细胞减少性感染，白细胞减少症，血小板减少症，淋巴细胞减少症，超敏反应，肾损害，肾衰竭，肺毒性(呼吸困难、咳嗽、肺炎、间质性肺病)，致畸性，恶心，呕吐，脱水，腹痛，败血性休克，便秘，厌食症，粘膜炎，贫血，乏力，疼痛，发热，感染，眩晕，嗜睡，精神错乱，血管舒张，低血压，血栓栓塞事件，异常胆红素，皮疹，脱发或体重下降)的患者的数量所测量的，与直接施用等剂量的伊立替康相比，树状聚体提供毒性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％，或与直接施用等剂量的伊立替康相比，通过ae的等级的降低所测量的ae严重程度，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的患者群体。
[0433]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基为sn
‑
38的残基，并且与直接施用等剂量伊立替康相比，施用树状聚体提供小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的毒性发生率(例如，腹泻，骨髓抑制，中性粒细胞减少症，中性粒细胞减少性发热，中性粒细胞减少性感染，白细胞减少症，血小板减少症，淋巴细胞减少症，超敏反应，肾损害，肾衰竭，肺毒性(呼吸困难、咳嗽、肺炎、间质
性肺病)，致畸性，恶心，呕吐，脱水，腹痛，败血性休克，便秘，厌食症，粘膜炎，贫血，乏力，疼痛，发热，感染，眩晕，嗜睡，精神错乱，血管舒张，低血压，血栓栓塞事件，异常胆红素，皮疹，脱发或体重下降)。
[0434]
与临床使用伊立替康相关的一个显著问题是其倾向于引起胃肠道毒性。频繁且经常严重的胃肠毒性、特别是腹泻限制了其更广泛的应用。胃肠道毒性的早期症状包括腹泻、呕吐、发汗和腹部痉挛。实际上，已经报道这种症状在施用伊立替康的患者中多达80％。伊立替康的复杂药理学和代谢被认为是导致相关胃肠道毒性的原因。认为，依立替康，一种前药，通过羧基
‑
酯酶转化为其活性形式sn
‑
38，其在人中主要在肝脏中发现。随后sn
‑
38被肝尿苷二磷酸葡糖醛酸糖基转移酶
‑
1a1(udp
‑
gt 1a1)葡萄糖醛酸化为sn
‑
38
‑
葡糖醛酸苷(sn
‑
38g)。sn
‑
38和sn
‑
38g均经由尿和胆汁排泄。sn
‑
38g一旦在肠腔中，就被细菌β
‑
葡糖醛酸糖苷酶解偶联回到sn
‑
38。游离肠腔sn
‑
38，不论是胆汁还是sn
‑
38g解偶联，都被认为是伊立替康引起的腹泻的原因。
[0435]
与直接施用伊立替康相比，使用例如如本文所述含有喜树碱活性物质的树状聚体(sn
‑
38)可避免胃肠毒性，或降低胃肠毒性的发生率。这可能是酯裂解以释放游离药物(即，sn
‑
38)的结果，其可能更主要地发生在肝脏外，因此避免或降低胆汁排泄的倾向。
[0436]
因此，在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，并且与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如，伊立替康)相比，施用树状聚体减少了胃肠毒性和/或相关副作用。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，并且与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如，伊立替康)相比，施用树状聚体减少了通过具有胃肠毒性和/或相关副作用的患者的数量所测量的胃肠毒性和/或相关副作用。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，并且与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如伊立替康)相比，施用树状聚体在至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的患者中减少了胃肠毒性和/或相关副作用。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，并且树状聚体的施用减少了选自由以下组成的组的胃肠毒性症状和/或相关副作用：急性腹泻、延迟腹泻、呕吐、发汗和腹部痉挛。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，并且施用树状聚体在至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的患者中使选自由以下组成的组的胃肠毒性症状和/或相关副作用的减少：急性腹泻、延迟腹泻、呕吐、发汗和腹部痉挛。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如伊立替康)相比，施用树状聚体减少了急性腹泻。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如伊立替康)相比，施用树状聚体减少了延迟腹泻。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如，伊立替康)相比，施用树状聚体减少了呕吐。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质(例如伊立替康)相比，施用树状聚体减少了发汗。在一个示例中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物(例如伊立替康)相比，施用树状聚体减少了腹部痉挛。
[0437]
本发明的树状聚体令人惊奇地实现了未缀合或释放的药物的持续药代动力学曲
线，导致auc与游离药物的当量或归一化量相比显著增加。该持续的药代动力学曲线和相关的增加的释放/未缀合的喜树碱活性物质auc表明药物将以治疗有效水平在体内存在更长的时间。应当理解，暴露于药物较长时间是合乎需要的，因为它可以延长药物的治疗效果并允许降低给药频率。在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，树状聚体提供增加的喜树碱活性物质的治疗药物暴露/曲线下面积(auc)。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的伊立替康相比，树状聚体提供增加的治疗药物暴露/sn
‑
38曲线下面积(auc)。auc是血浆中药物浓度对时间的曲线下面积。auc表示随时间的总药物暴露。应当理解，auc通常与递送至身体的药物的总量成比例。在一些实施方案中，与施用等剂量游离伊立替康所实现的sn
‑
38浓度水平的药代动力学曲线相比，对于所释放的sn
‑
38的浓度水平，树状聚体实现更持续的体内药物动力学曲线。
[0438]
在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，树状聚体提供增加的喜树碱活性物质的治疗药物暴露/曲线下面积(auc)。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的伊立替康相比，树状聚体提供增加的治疗药物暴露/sn
‑
38曲线下面积(auc)。在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用树状聚体提供至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少15倍的喜树碱活性物质的治疗性药物暴露(auc)。在一些实施方案中，喜树碱的残基是sn
‑
38的残基，并且树状聚体的施用提供至少100、至少200ng/h/ml、至少300ng/h/ml、至少400ng/h/ml、至少500ng/h/ml、至少600ng/h/ml、至少700ng/h/ml、至少800ng/h/ml、至少900ng/h/ml、至少1000ng/h/ml、至少2000ng/h/ml、至少3000ng/h/ml、至少5000ng/h/ml或至少10000ng/h/ml的游离sn
‑
38。在一些实施方案中，喜树碱的残基是sn
‑
38的残基，并且施用树状聚体提供介于约100ng/h/ml和约10000ng/h/ml之间、或介于约1000ng/h/ml和约10000ng/h/ml之间、或介于约2000ng/h/ml和约5000ng/h/ml之间的游离sn
‑
38。
[0439]
本发明的实施例树状聚体可以释放喜树碱活性物质，以便在持续的时间段内实现活性物质的治疗有效浓度，而不实现高c
max
水平，从而降低ae的可能性。
[0440]
药物的最大浓度(c
max
)是在已经施用药物之后并且在施用第二剂量之前，药物在身体的指定隔室或测试区域中达到的最大(或峰)血清浓度。应理解，尽管能够以足以实现治疗浓度水平的水平给药药剂是重要的，但如果达到的最大浓度水平高，则遭遇脱靶效应，副作用和毒性增加的风险增加。这对于短半衰期的化合物尤其是一个问题，因为在这些情况下，为了在延长的时间段内提供活性物质的治疗有效水平，可能需要增加剂量并因此增加c
max
，使得副作用的可能性增加。因此，非常需要能够以提供持续时间段的治疗有效水平的形式递送药物活性剂，同时避免以在体内实现非常高的最大浓度(c
max
)的水平给药。
[0441]
在一些实施方案中，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与施用相等剂量的sn
‑
38相比提供游离sn
‑
38的降低的c
max
。在一些实施方案中，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与施用相等剂量的伊立替康相比提供游离sn
‑
38的降低的c
max
。在一些实施方案中，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与施用相等剂量的sn
‑
38相比，提供游离小于0.8倍、小于0.75倍、小于0.5倍的sn
‑
38的c
max
。在一些实施方案中，喜树碱的残基是sn
‑
38的残基，并且施用树状聚体提供小于约50ng/ml、小于约40ng/ml或小于约30ng/ml的游离sn
‑
38。
[0442]
如上所述，根据本发明的树状聚体在体内施用时显示具有持续暴露。在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，观察到的从树状聚体释放的喜树碱活性物质的药代动力学曲线具有增加的终末期半衰期(t
1/2
)。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基为sn
‑
38，并且与直接施用等剂量伊立替康相比，从树状聚体释放的sn
‑
38具有增加的终末期半衰期(t
1/2
)。在一些实施方案中，本发明的树状聚体包含sn
‑
38的残基，并且与施用等效剂量的sn
‑
38相比，提供至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少15倍的游离sn
‑
38的t
1/2
。药物的半衰期是药物的血浆浓度减半所花费的时间。应当理解，增加(即，更长)半衰期可能是合乎需要的，因为其导致暴露于治疗有效浓度的药物更长的时间段。这也导致需要较不频繁的给药。在一些实施方案中，喜树碱的残基是sn
‑
38的残基，并且施用树状聚体导致游离sn
‑
38(即已从树状聚体释放sn
‑
38)的药代动力学曲线具有至少约5小时、至少约10小时、至少约20小时、至少约25小时或至少约30小时的t
1/2
。在一些实施方案中，喜树碱残基是sn
‑
38的残基，并且施用树状聚体使游离sn
‑
38的药代动力学曲线具有至少约0.5小时、至少约1小时、至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时的t
max
。
[0443]
在一些实施方案中，当在治疗癌症的方法中使用时，诸如结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或子宫颈癌中使用时，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，从树状聚体释放的喜树碱活性物质具有增加的终末期半衰期(t
1/2
)。
[0444]
在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38，并且当在治疗癌症的方法中使用时，诸如结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或子宫颈癌中使用时，与直接施用等剂量的伊立替康相比，从树状聚体释放的sn
‑
38具有增加的终末期半衰期(t
1/2
)。
[0445]
应当理解，与直接施用游离药物相比，任何一种或多种改善的治疗药物暴露(auc)、增加的半衰期(t
1/2
)和降低的药物毒性可提供更好的临床效力。在一些实施方案中，与施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，施用所述树状聚体提供增强的临床效力。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与施用等剂量的伊立替康相比，施用树状聚体提供增强的临床效力。在一些实施方案中，与直接施用等剂量的游离喜树碱活性物质相比，树状聚体提供了选自由以下组成的组的效力性质的改善：无进展存活、进展时间、客观应答率(pr+cr)、总应答率、总存活和应答持续时间。在一些实施方案中，喜树碱活性物质的残基是sn
‑
38的残基，与直接施用等剂量的伊立替康相比，树状聚体提供了选自由以下组成的组的效力性质的改善：无进展存活、进展时间、客观应答率(pr+cr)、总应答率、总存活和应答持续时间。
[0446]
树状聚体合成
[0447]
本发明的树状聚体可以通过任何合适的方法制备，例如通过将喜树碱活性中间体与已经含有peg或peox基团的树状聚体中间体反应以引入药物活性剂，或通过将包含赖氨酸基团、喜树碱活性残基和peg或peox基团的残基的中间体与树状聚体中间体反应。因此，在第五方面，提供了用于生产如本文所定义的树状聚体的工艺，其包含：
[0448]
a)
[0449]
a1)在酰胺偶联条件下，将喜树碱活性物质中间体与树状聚体中间体或其盐反应，
所述喜树碱活性物质中间体为
[0450][0451]
其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；并且其中pg是保护基；
[0452]
所述树状聚体中间体包含：
[0453]
i)核单元(c)；和
[0454]
ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
[0455]
其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
[0456]
树状聚体是五代构建单元树状聚体；
[0457]
其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
[0458]
所述树状聚体进一步包含：
[0459]
iv)多个第二端基(t2)，每个第二端基包含peg或peox基团；
[0460]
其中所述外部构建单元的至少一半具有与第二端基共价连接的一个氮原子，并且具有可用于与所述第一中间体反应的一个未取代的氮原子；和
[0461]
a2)使步骤a1)的产物经受脱保护条件以去除保护基pg，
[0462]
或者
[0463]
b)
[0464]
b1)在酰胺偶联条件下，将表面单元中间体与树状聚体中间体或其盐反应，所述表面单元中间体为：
[0465]
peg/peox基团
[0466]
其中peg基团是含peg的基团，并且peox基团是含peox的基团；
[0467]
x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；并且其中pg是保护基；
[0468]
所述树状聚体中间体包含：
[0469]
i)核单元(c)；和
[0470]
ii)构建单元(bu)，每个构建单元是赖氨酸残基或其类似物；
[0471]
其中所述核单元经由酰胺键共价连接至两个构建单元，每个酰胺键在存在于所述核单元中的氮原子与存在于构建单元中的酰基的碳原子之间形成；
[0472]
所述树状聚体中间体是四代构建单元树状聚体中间体；
[0473]
其中不同代的构建单元经由存在于一个构建单元中的氮原子与存在于另一构建单元中的酰基的碳原子之间形成的酰胺键彼此共价连接；
[0474]
并且其中存在于所述树状聚体中间体的外部构建单元中的氮原子是未取代的；和
[0475]
b2)在所述表面单元中间体包含保护基pg的情况下，使步骤b1)的产物经受脱保护条件以去除pg。
[0476]
工艺变型a)和b)涉及通过
–
c(o)x基团与树状中间体中存在的胺基的反应形成酰胺键。可以使用任何合适的酰胺形成条件。典型条件的示例包括使用合适的溶剂(例如二甲基甲酰胺)，任选地合适的碱，并且在合适的温度(例如环境温度，例如在15℃至30℃的范围内)下。其中x是离去基团，可以使用任何合适的离去基团，例如活化的酯。其中x是
‑
oh基团或其中x与它所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐，该基团通常在与树状中间体反应之前转化成合适的离去基团，例如通过使用诸如pybop的合适的酰胺偶联剂来实现。
[0477]
在使用保护基pg的情况下，可以使用任何合适的基团，其对于步骤a1)或b1)之后的反应条件是惰性的或基本上惰性的，但是其随后可以在温和的反应条件下除去，所述温和的反应条件不会导致发生显著水平的对树状结构的副反应，即，使得可以获得最终树状聚体的良好产率。保护基团是本领域已知的，并且对于羟基，示例包括：甲硅烷基醚，诸如tbdms或tbdps；酸不稳定的醚保护基团，诸如thp或mom基团；或可还原的醚保护基团，诸如苄基。
[0478]
可以使用任何合适的分离和/或纯化技术，例如树状聚体可以通过溶解在合适的溶剂(例如thf)中并通过加入反溶剂(例如mtbe)中沉淀而获得。
[0479]
用于变型a)中的喜树碱活性物质中间体本身可例如通过喜树碱活性物质(例如呈保护形式的)与二甘醇酸酐的反应获得。
[0480]
变型b)中使用的表面单元中间体本身可以例如通过以下步骤获得：
[0481]
i)使peg或peox中间体，所述peg或peox中间体为：
[0482]
peg/peox基团
[0483]
其中peg基团是含peg的基团并且peox是含peox的基团，并且
[0484]
x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；
[0485]
与以下反应，
[0486][0487]
其中pg1为胺保护基(诸如boc或cbz基团)，且pg2为酸保护基(诸如甲基酯或苄基酯)；
[0488]
ii)使pg1脱保护；
[0489]
iii)使步骤ii)的产物与喜树碱活性中间体反应，所述喜树碱活性中间体为：
[0490][0491]
其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；和iv)使pg2脱保护。
[0492]
变型a)中使用的树状聚体中间体本身可以通过例如包括以下步骤的连续工艺获得：
[0493]
i)使含有氨基的核单元(c)与构建单元反应，所述构建单元是被保护的赖氨酸或其类似物，其含有
–
c(o)x基团，其中x是
‑
oh或离去基团或
–
co(x)形成羧酸盐，并且其中存在于赖氨酸或其类似物中的氨基被保护，以在核单元和构建单元之间形成酰胺键；
[0494]
ii)使存在于构建单元上的保护基脱保护；
[0495]
iii)使存在于构建单元上的游离氨基与其它构建单元反应，所述其它构建单元是被保护的赖氨酸或其类似物，其含有
–
c(o)x基团，其中x是
‑
oh或离去基团或
–
c(o)x形成羧酸盐，并且其中存在于赖氨酸或其类似物中的氨基被保护，以在不同代的构建单元之间形成酰胺键；
[0496]
iv)使存在于构建单元上的保护基脱保护；
[0497]
v)重复步骤iii)和iv)直至产生四代建筑单元；
[0498]
vi)使存在于构建单元上的游离氨基与以下反应
[0499]
peg/peox基团
[0500]
其中pg为保护基，且其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐，以在其间形成酰胺键；和
[0501]
vii)使保护基pg脱保护。
[0502]
或者，变型a)中使用的树状聚体中间体可以例如通过进行如上所述的步骤i)至v)获得，和：
[0503]
vi)使存在于构建单元上的游离氨基与其它构建单元反应，所述其它构建单元是被保护的赖氨酸或其类似物，其含有
–
c(o)x基团，其中x是
‑
oh或离去基团或
–
c(o)x形成羧酸盐，并且其中存在于赖氨酸或其类似物中的氨基被正交保护，以在不同代的构建单元之间形成酰胺键；
[0504]
vii)使第一组氨基保护基脱保护；
[0505]
viii)使存在于所述构建单元上的游离氨基与以下反应
[0506]
peg/peox基团
[0507]
其中peg基团是含peg的基团，并且x是
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；
[0508]
vii)使第二组氨基保护基脱保护。
[0509]
在变型c)中使用的树状聚体中间体本身可以例如通过进行如以上关于变型a)所述的步骤i)至v)而获得。
[0510]
本发明还提供用于制备树状聚体的合成中间体。因此，本发明还提供了用于制备树状聚体的中间体，其是
[0511][0512]
其中x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；且其中pg为保护基。
[0513]
还提供了用于生产树状聚体的中间体，其是
[0514]
peg/peox基团
[0515]
其中peg基团是含peg的基团，peox基团是含peox的基团；x为
‑
oh或离去基团，或其中x与其所连接的c(o)基团一起形成羧酸盐；且其中pg为保护基。这种中间体可以例如如上所述制备。
[0516]
现在将参考说明本发明的一些特定方面的以下实施例描述本发明。然而，应当理解，本发明的以下描述的特殊性并不取代本发明的前述描述的一般性。
[0517]
实施例
[0518]
实施例1：的合成和表征
[0519]
以下实施例中表示的树状聚体包括涉及树状聚体的最外代中的核和构建单元。没有描述地下世代。树状聚体bhalys[lys]
32
代表具有式bhalys[lys]2[lys]4[lys]8[lys]
16
[lys]
32
的5代树状聚体。
[0520]
涉及可用peg
～2100
取代的树状聚体上的ε表面氨基的理论数。通过1h nmr实验测定连接至bhalys[lys]
32
的peg
～2300
基团的实际平均数(参见本实施例的以下部分，标题为
的表征)。
[0521]
bhalys[boc]2[0522]
将固体α,ε
‑
(boc)2‑
(l)
‑
赖氨酸对硝基苯酚酯(2.787kg，5.96mol)添加到氨基二苯甲烷(苯甲胺)(0.99kg，5.4mol)的无水乙腈(4.0l)、dmf(1.0l)和三乙胺(1.09kg)溶液中，历时15分钟。将反应混合物在20℃下搅拌过夜。然后将反应混合物升温至35℃，并缓慢加入氢氧化钠水溶液(0.5n，10l)，历时30min。将混合物再搅拌30min，然后过滤。将固体滤饼用水洗涤并干燥至恒重(2.76kg，5.4mol)，100％产率。1h nmr(cd3od)δ7.3(m,10h,ph计算10h)；6.2(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.08(m,α
‑
ch,1h),3.18(br,ε
‑
ch2)和2.99(m,ε
‑
ch
2 2h)；对于β,γ,δ
‑
ch2，总计1.7
‑
1.2(br,β,γ,δ
‑
ch2)和1.43(s,tbu)，且tbu 25h计算24h。ms(esi+ve)实测534.2[m+na]
+
计算为c
29
h
41
n3o5na[m+na]
+
534.7。
[0523]
bhalys[hcl]2[0524]
将浓hcl(1.5l)于甲醇(1.5l)中的溶液分三批以使过度起泡最小化的速率缓慢添加到bhalys[boc]2(780.5g，1.52mol)于甲醇(1.5l)中的搅拌悬浮液中。将反应混合物再搅拌30min，然后在真空下在35℃下浓缩。将残余物溶于水(3.4l)并在真空下在35℃浓缩两次，然后在真空下储存过夜。然后加入乙腈(3.4l)，并将残余物再次在真空下在35℃浓缩，以得到bhalys[hcl]2，为白色固体(586g，1.52mol)，100％产率。1h nmr(d2o)δ7.23(br m,10h,ph计算10h)；5.99(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；3.92(t,j＝6.5hz,α
‑
ch,1h,计算1h)；2.71(t,j＝7.8hz,ε
‑
ch2,2h,计算2h)；1.78(m,β,γ,δ
‑
ch2,2h),1.47(m,β,γ,δ
‑
ch2,2h),和1.17(m,β,γ,δ
‑
ch2,2h,总计6h计算6h)。ms(esi+ve)实测312[m+h]+计算为c
19
h
26
n3o[m+h]+312。
[0525]
bhalys[lys]2[boc]4[0526]
向bhalys[hcl]2(586g，1.52mmol)于无水dmf(3.8l)中的悬浮液中缓慢添加三乙胺(1.08kg)以维持反应温度低于30℃。分三份加入固体α,ε
‑
(boc)2‑
(l)
‑
赖氨酸对硝基苯酚酯(1.49kg)，在加入之间缓慢搅拌2小时。将反应搅拌过夜。向充分搅拌的混合物中缓慢加入氢氧化钠水溶液(0.5m，17l)，并保持搅拌直至固体沉淀物自由移动。过滤收集沉淀，固体滤饼用水(2
×
4l)洗涤，然后用丙酮/水(1:4，2
×
4l)洗涤。将固体再次用水浆化，然后过滤并在真空下干燥过夜，以得到bhalys[lys]2[boc]4(1.51kg)，100％产率。1h nmr(cd3od)δ7.3(m,10h,ph计算10h)；6.2(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.21(m,α
‑
ch),4.02(m,α
‑
ch)和3.93(m,α
‑
ch,总计3h,计算3h)；3.15(m,ε
‑
ch2)和3.00(m,ε
‑
ch2总计6h,计算6h)；对于β,γ,δ
‑
ch2，总计1.7
‑
1.3(br,β,γ,δ
‑
ch2)和1.43(s,tbu)，且tbu 57h计算54h。ms(esi+ve)实测868.6[m
‑
boc]
+
；990.7[m+na]
+
计算为c
51
h
81
n7o
11
na[m+na]+991.1。
[0527]
bhalys[lys]2[hcl]4[0528]
在35℃下在搅拌下将bhalys[lys]2[boc]4(1.41kg，1.46mol)悬浮于甲醇(1.7l)中。将盐酸(1.7l)与甲醇(1.7l)混合，并将所得溶液分四份加入到树状聚体悬浮液中，并搅拌30分钟。在减压下去除溶剂并且用两个连续的水(3.5l)条带处理，接着用两个连续的乙腈(4l)条带处理，以得到bhalys[lys]2[hcl]4(1.05kg，1.46mmol)，定量产率。1h nmr(d2o)δ7.4(br m,10h,ph计算10h)；6.14(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.47(t,j＝7.5hz,α
‑
ch,1h),4.04(t,j＝6.5hz,α
‑
ch,1h),3.91(t,j＝6.8hz,α
‑
ch,1h,总计3h,计算3h)；3.21(t,j＝7.4hz,ε
‑
ch2,2h),3.01(t,j＝7.8hz,ε
‑
ch2,2h)和2.74(t,j＝7.8hz,ε
‑
ch2,2h,总计6h,计算6h)；
1.88(m,β,γ,δ
‑
ch2),1.71(m,β,γ,δ
‑
ch2),1.57(m,β,γ,δ
‑
ch2)和1.35(m,β,γ,δ
‑
ch2总计19h,计算18h)。
[0529]
bhalys[lys]4[boc]8[0530]
将bhalys[lys]2[hcl]4(1.05kg，1.47mol)溶解于dmf(5.6l)和三乙胺(2.19l)中。分三份加入α,ε
‑
(boc)2‑
(l)
‑
赖氨酸对硝基苯酚酯(2.35kg，5.03mol)，并将反应在25℃搅拌过夜。加入naoh(0.5m，22l)溶液，过滤得到的混合物，用水(42l)洗涤，然后空气干燥。将固体在真空下在45℃干燥，以得到bhalys[lys]4[boc]8(2.09kg，1.11mol)，76％产率。1h nmr(cd3od)δ7.3(m,10h,ph计算10h)；6.2(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.43(m,α
‑
ch),4.34(m,α
‑
ch),4.25(m,α
‑
ch)和3.98(br,α
‑
ch,总计7h,计算7h)；3.15(br,ε
‑
ch2)和3.02(br,ε
‑
ch2总计14h,计算14h)；对于β,γ,δ
‑
ch2，总计1.9
‑
1.2(br,β,γ,δ
‑
ch2)和1.44(br,s,tbu)，且tbu 122h计算144h。
[0531]
bhalys[lys]4[tfa]8[0532]
在0℃下向bhalys[lys]4[boc]8(4g，2.13mmol)于dcm(18ml)中的搅拌悬浮液中加入tfa(13ml)。将固体溶解，并将溶液在氩气气氛下搅拌过夜。真空除去溶剂，通过用乙醚(100ml)研磨除去残余tfa。将产物再溶于水中，然后冷冻干燥，得到bhalys[lys]4[tfa]8，为灰白色固体(4.27g，2.14mmol)，定量产率。1h nmr(d2o)δ7.21(br m,10h,ph计算10h)；5.91(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.17(t,j＝7.4hz,α
‑
ch,1h),4.09(t,j＝7.1hz,α
‑
ch,1h),4.02(t,j＝7.2hz,α
‑
ch,1h,3.84(t,j＝6.5hz,α
‑
ch,2h),3.73(t,j＝6.7hz,α
‑
ch,1h),3.67(t,j＝6.7hz,α
‑
ch,1h,总计7h,计算7h)；3.0(m,ε
‑
ch2),2.93(m,ε
‑
ch2)和2.79(b,ε
‑
ch2,总计15h,计算14h)；1.7(br,β,γ,δ
‑
ch2),1.5(br,β,γ,δ
‑
ch2),1.57(m,β,γ,δ
‑
ch2)and 1.25(br,β,γ,δ
‑
ch2总计45h,计算42h)。ms(esi+ve)实测541.4[m+2h]
2+
；计算为c
55
h
99
n
15
o7[m+2h]
2+
541.2。
[0533]
bhalys[lys]8[boc]
16
[0534]
将α,ε
‑
(boc)2‑
(l)
‑
赖氨酸对硝基苯酚酯(1.89g，4.05mmol)于dmf(25ml)中的溶液添加到bhalys[lys]4[nh2tfa]8(644mg，0.32mmol)和三乙胺(0.72ml，5.2mmol)于dmf(25ml)中的溶液，并将该反应在氩气气氛下搅拌过夜。将反应混合物倾倒在冰/水(500ml)上，然后过滤并将收集的固体在真空下干燥过夜。将干燥的固体用乙腈充分洗涤，以得到bhalys[lys]8[boc]
16
，为灰白色固体(0.82g，0.22mmol)，68％产率。1h nmr(cd3od)δ7.3(m,10h,ph计算10h)；6.2(br s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.48(br,α
‑
ch),4.30(br,α
‑
ch)和4.05(br,α
‑
ch,total 16h计算15h)；3.18(br,ε
‑
ch2)和3.02(m,ε
‑
ch2总计31h,计算30h)；对于β,γ,δ
‑
ch2，总计1.9
‑
1.4(br,β,γ,δ
‑
ch2)和1.47(br,s,tbu)，且tbu 240h计算234h。ms(esi+ve)实测3509[m+h
‑
(boc)2]
+
计算为c
173
h
306
n
31
o
43
[m+h
‑
(boc)2]
+
3508.5；3408[m+h
‑
(boc)3]
+
计算为c
168
h
298
n
31
o
41
[m+h
‑
(boc)3]
+
3408.4。
[0535]
bhalys[lys]8[tfa]
16
[0536]
将tfa/dcm(1:1，19ml)的溶液缓慢添加至bhalys[lys]8[boc]
16
(800mg，0.22mmol)在dcm(25ml)中的搅拌悬浮液中。将固体溶解，并将溶液在氩气气氛下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并且通过重复冷冻干燥残余物来除去残余tfa，以得到bhalys[lys]8[tfa]
16
，为灰白色冻干物(848mg，0.22mmol)，定量产率。1h nmr(d2o)δ7.3(br m,10h,ph计算10h)；6.08(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.3(m,α
‑
ch),4.18(m,α
‑
ch),4.0(m,α
‑
ch)和3.89(m,α
‑
ch,总计
16h,计算15h)；3.18(br,ε
‑
ch2)和2.94(m,ε
‑
ch2总计32h,计算30h)；1.9(m,β,γ,δ
‑
ch2),1.68(m,β,γ,δ
‑
ch2)和1.4(m,β,γ,δ
‑
ch2总计99h,计算90h)。ms(esi+ve)实测2106[m+h]
+
计算为c
103
h
194
n
31
o
15
[m+h]
+
2106.9。
[0537]
bhalys[lys]
16
[boc]
32
[0538]
将α,ε
‑
(boc)2‑
(l)
‑
赖氨酸对硝基苯酚酯(1.89g，4.05mmol)的dmf(25ml)溶液添加到bhalys[lys]8[tfa]
16
(644mg，0.32mmol)和三乙胺(0.72ml，5.2mmol)在dmf(25ml)中的溶液，并将该反应在氩气气氛下搅拌过夜。将反应倾倒在冰/水(500ml)上，然后过滤并将收集的固体在真空下干燥过夜。将干燥的固体用乙腈充分洗涤，以得到bhalys[lys]
16
[boc]
32
，为灰白色固体(0.82g，0.2 2mmol)，68％产率。1h nmr(cd3od)δ7.28(m,9h,ph计算10h)；6.2(br s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.53(br,α
‑
ch),4.32(br,α
‑
ch)and 4.05(br,α
‑
ch,total 35h,计算31h)；3.18(br,ε
‑
ch2)和3.04(m,ε
‑
ch2总计67h,计算62h)；对于β,γ,δ
‑
ch2，总计1.9
‑
1.5(br,β,γ,δ
‑
ch2)和1.47(br,s,tbu)，且tbu 474h计算474h。ms(esi+ve)实测6963[m+h
‑
(boc)4]
+
计算为c
339
h
610
n
63
o
87
[m+h
‑
(boc)4]
+
6960.9；6862[m+h
‑
(boc)5]
+
计算为c
334
h
604
n
63
o
85
[m+h
‑
(boc)5]
+
6860.8。
[0539]
bhalys[lys]
16
[tfa]
32
[0540]
将tfa/dcm(1:1，19ml)的溶液缓慢添加至bhalys[lys]
16
[boc]
32
(800mg，0.11mmol)在dcm(25ml)中的搅拌悬浮液中。将固体溶解，并将溶液在氩气气氛下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并且通过重复冷冻干燥残余物来除去残余tfa，以得到bhalys[lys]
16
[tfa]
32
，为灰白色冻干物(847mg，0.11mmol)，定量产率。1h nmr(d2o)δ7.3(br m,11h,ph计算10h)；6.06(s,1h,ch
‑
ph2计算1h)；4.3(m,α
‑
ch),4.19(m,α
‑
ch),4.0(m,α
‑
ch)和3.88(m,α
‑
ch,总计35h,计算31h)；3.15(br,ε
‑
ch2)和2.98(m,ε
‑
ch2总计69h,计算62h)；1.88(m,β,γ,δ
‑
ch2),1.7(m,β,γ,δ
‑
ch2)和1.42(m,β,γ,δ
‑
ch2总计215h,计算186h)。ms(esi+ve)实测4158[m+h]
+
计算为c
199
h
386
n
63
o
31
[m+h]+4157.6
[0541]
ho
‑
lys(α
‑
boc)(ε
‑
peg
～2300
)
[0542]
将dipea(0.37ml，2.10mmol)加入到nhs
‑
peg
～2300
(2.29g，1.05mmol)(其中peg
～2100
表示平均分子量约为2300da的甲氧基封端的peg基团，并且其中nhs表示nhs
‑
c(o)ch2)和n
‑
α
‑
boc
‑
l
‑
赖氨酸(0.26g，1.05mmol)于dmf(20ml)的冰冷却混合物中。使搅拌的混合物升温至室温过夜，然后过滤任何剩余的固体(0.45μmpall acrodisc)，然后真空除去溶剂。将残余物吸收在acn/h2o(1:3，54ml)中并且通过prep hplc(waters xbridge c18，5μm，19
×
150mm，25至32％acn(5
‑
15min)，32至60％acn(15至20min)，无缓冲液，8ml/min，rt＝17min)，得到1.41g(56％)ho
‑
lys(boc)(peg
2100
)。1h nmr(cd3od)δ3.96
‑
4.09(m,1h),3.34
‑
3.87(m,188h)；3.32(s,3h),3.15(q,j＝6.0hz,2h),2.40(t,j＝6.2hz,2h),1.28
‑
1.88(m,6h),1.41(s,9h)。
[0543][0544]
向bhalys[lys]
16
[tfa]
32
(0.19g，24μmol)于dmf(20ml)中的搅拌混合物中加入dipea(0.86ml，4.86mmol)。然后在室温下将该混合物滴加到pybop(0.62g，1.20mmol)和ho
‑
lys(boc
‑
lys)(peg
～2300
)(2.94g，1.20mmol)于dmf(20ml)中的搅拌混合物中。将反应混合物搅拌过夜，然后用水(200ml)稀释。将水性混合物进行离心过滤(5k膜，20l水)。将保留物冷冻干燥，提供1.27g(73％)的所需树状聚体。hplc(c8 xbridge，3
×
100mm，梯度：5％acn(0
‑
1min)，5
‑
80％acn/h2o)(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm.0.1％tfa)rf(min)＝8.52。1h nmr(300mhz,d2o)δ(ppm):1.10
‑
2.10(m,lys ch2(β,χ,δ)和boc,666h),3.02
‑
3.36(m,lys ch2(ε),110h),3.40(s,peg
‑
ome,98h),3.40
‑
4.20(m,peg
‑
och2,5750h+lys ch表面,32h),4.20
‑
4.50(m,lys,ch内部32h),7.20
‑
7.54(m,bha,8h)。1h nmr显示约29个peg。
[0545][0546]
将1.27g(17.4μmol)bhalys[lys]
32
[α
‑
boc]
32
[ε
‑
peg
～2300
]
32
在tfa/dcm(1:1，20ml)中在室温下搅拌过夜。真空除去挥发物，然后将残余物溶于水(30ml)。然后浓缩混合物。将该过程再重复两次，然后冷冻干燥，得到1.35g(106％)所需产物，为粘性无色油状物。hplc(c8 xbridge，3
×
100mm，梯度：5％acn(0
‑
1min)，5
‑
80％acn/h2o)(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm.0.1％tfa)rf(min)＝8.51。1h nmr(300mhz,d2o)δ(ppm):1.22
‑
2.08(lys ch2((β,χ,δ),378h),3.00
‑
3.26(lys ch2(ε),129h),3.40(peg
‑
ome,96h),3.45
‑
4.18(peg
‑
och2,5610h+lys ch表面,32h),4.20
‑
4.46(lys,ch内部,33h),7.24
‑
7.48(8h,bha)。1h nmr显示约29个peg。
[0547]
的表征
[0548]
表1示出了所合成的不同批次的树状分子上peg链的实际数目也通过1h nmr计算。
[0549]
表1.不同批次的
[0550][0551]
从质子nmr谱计算peg的数量。对于批次1：peg数＝nmr光谱的peg区域中的质子数(积分)(3.4
‑
4.2ppm)/单个peg链的质子数(nmr光谱)
[0552]
＝5594h/202h
[0553]
＝27.69(约28个peg单元)
[0554]
peg表示
–
c(o)ch2‑
peg
～2300
，其中peg
～2300
表示平均分子量约为2300道尔顿的甲氧基封端的peg基团。
[0555]
涉及可用连接基
‑
sn
‑
38取代的树状聚体上的α表面氨基的理论数。通过使用比较peg区与sn
‑
38的积分，通过1h nmr光谱实验测定连接至bhalys[lys]
32
的连接基
‑
sn
‑
38基团的实际平均数。
[0556]
实施例2：实施例树状聚体的合成
[0557]
制备以下树状聚体构建体，其中sn
‑
38通过c
‑
10或c
‑
20位置与二酸连接基共价连接，所述二酸接头与树状聚体最外层赖氨酸层上的α
‑
氨基位置连接。
[0558]
表2.
[0559][0560]
以下示出的是使用的glu(戊二酸)、tda(硫代二乙酸)、dga(二甘醇酸)和2,5
‑
thf(四氢呋喃
‑
2,5
‑
二羧酸)连接基，连同sn
‑
38，带有经由dga二酰基连接基连接的peg和sn
‑
38残基的树状聚体的代表，以及化合物2e/2f的表面构建单元。
[0561]
[0562][0563]
peg表示
–
c(o)ch2‑
peg
～2300
，其中peg
～2300
表示平均分子量约为2300道尔顿的甲氧基封端的peg基团。在上述实施例中，dga连接基与外赖氨酸层上的α
‑
氨基连接(实施例2e)。
[0564]
●
表示sn
‑
38的残基。
[0565]
[0566]
实施例2a：的合成
[0567]
(i)glu
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0568][0569]
在室温下向sn
‑
38(600mg，1.53mmol)和戊二酸酐(349mg，3.06mmol)于dcm(19ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加三乙胺(426μl，3.06mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，之后悬浮液已溶解。过滤一部分(7.5ml)反应混合物(0.45μl)，用dcm(10ml)稀释，用磷酸盐缓冲液(5％nacl和1％nah2po4于水中的溶液，用5％hcl将ph调节至3)洗涤，直到洗涤液保持在ph 3(4
×
9ml)。合并的水溶液的ph用1m hcl调节相至3，水层用etoac萃取(3
×
20ml)。合并的有机相(ca.70ml)用盐水(30ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。然后真空除去挥发性物质，残余物经制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，20
‑
60％acn/h2o(5
‑
50min)，0.1％tfa，rt＝33分钟)，得到106mg(35％)产物，为黄色固体。
[0570]
lcms(c8，梯度：15％acn/h2o(0
‑
1min)，15
‑
25％acn(1
‑
2min)，25％acn(2
‑
8min)，25
‑
80％acn(8
‑
10min)，80％acn(10
‑
11min)，80
‑
15％acn(11
‑
13min)，15％acn(13
‑
15min)，10mm甲酸铵(ph 6.8)，0.4ml/min，rf(min)＝6.04。esi+(ve)观察[m]
+
＝507。计算为c
27
h
26
n2o8＝507da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.88(dd,j＝7.4,7.2hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.4hz,3h),1.81
‑
1.97(m,4h),2.40(dd,j＝7.4,7.2hz,2h),2.73(t,j＝7.4hz,2h),3.15
‑
3.23(m,2h),5.34(s,2h),5.44(s,2h),6.51(br s,1h),7.33(s,1h),7.68(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),8.02(d,j＝2.5hz,1h),8.21(d,j＝9.1hz,1h),12.18(br s,1h)。
[0571]
(ii)
[0572]
[0573]
在室温下向磁力搅拌的glu
‑
c10
‑
sn
‑
38(215mg，424μmol)和pybop(221mg，424μmol)于dmf(9ml)中的混合物中添加同样于dmf(11ml)中的(757mg，10.2μmol)和nmm(179μl，1.63mmol)。在室温下16小时后，将反应混合物加入到1％acoh于3:7acn/水(200ml)中的冷冻(o℃)溶液中，过滤并通过超滤(0.005m2，10kda，再生纤维素滤膜)浓缩至30ml。将浓缩物用13
×
30ml渗滤进行进一步超滤(1％acoh于3:7acn/mq水中)。将保留物冻干，得到931mg产物。将该物质溶解在thf(4.5ml)中并在0℃加入到冷却的mtbe(20ml)中。在0℃下搅拌混合物(1h)并经由过滤分离所得沉淀物。将产物真空干燥(16h)，得到783mg(89％)的期望物质，为黄色固体。
[0574]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)梯度：5％sacn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，0.1％tfa，0.4ml/min，rf(min)＝8.69。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.65
‑
3.04(m,706h),3.04
‑
3.27(m,79h),3.36(s,93h),3.37
‑
4.14(m,5,615h),4.14
‑
4.63(m,76h),5.12
‑
5.89(m,50h),6.97
‑
7.80(m,114h)。通过比较sn
‑
38(4h)的芳族化合物的积分面积与peg的积分面积来测定sn
‑
38负载。在以上示例中，芳香族区域是来自树状聚体的bha部分的104h(114h
‑
10h)。104h/4h＝26sn
‑
38分子/树状聚体。具有28条peg2300链和26条dga
‑
sn
‑
38的缀合物的理论分子量为83,374da。然后可通过将sn
‑
38(392)的分子量乘以树状分子上sn
‑
38分子的数量除以构建体的总分子量来计算药物负载(％w/w)。即(392
×
26)/83,374＝12.2％。
[0575]
实施例2b：的合成
[0576]
(i)otbu
‑
glu
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)
[0577][0578]
在室温下，向boc
‑
c10
‑
sn
‑
38(zhao,h.et al,bioconjugate chem.,2008,19,849
‑
859)(48mg，0.097mmol)于dcm(1.8ml)中的磁力搅拌的悬浮液中加入于dcm中的(0.2ml)戊二酸单叔丁酯(25mg，0.14mmol)，edc(1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺，27μl，0.16mmol)和dmap(4
‑
二甲基氨基吡啶，4mg，0.031mmol)。将混合物在室温下搅拌3h，直到通过hplc判断反应完成>80％。将反应混合物用8ml dcm稀释并依次用nahco3水溶液(1％，2
×
2.5ml)，水(2.5ml)和hcl(0.1m，2
×
2.5ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。然后真空除去挥发物，并将残余物真空干燥(2h)，得到63mg(98％)产物，为黄色固体。
[0579]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝8.38。esi+(ve)观察[m]
+
＝663。计算为c
36
h
42
n2o
10
＝663da。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ(ppm):0.97(dd,j
＝7.4,7.3hz,3h),1.37
‑
1.48(m,3h),1.41(s,9h),1.61(s,9h),1.83
‑
1.97(m,2h),2.06
‑
2.37(m,4h),2.46
‑
2.67(m,2h),3.12
‑
3.20(m,2h),5.25(s,2h),5.41(d,j＝17.3hz,1h),5.68(d,j＝17.3hz,1h),7.17(s,1h),7.67(dd,j＝9.2,2.3hz,1h),7.90(d,j＝2.3hz,1h),8.22(d,j＝9.2hz,1h)。
[0580]
(ii)glu
‑
c20
‑
sn
‑
38
[0581][0582]
将otbu
‑
glu
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)(59mg，0.089mmol)于tfa(4ml)中的溶液在室温下磁力搅拌过夜。然后真空除去挥发物，并将残余物与dcm共沸，与水混合并冻干，得到59mg(>95％)产物，为白色
‑
黄色固体。
[0583]
lcms(c18，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
60％acn(1
‑
10min)，60％acn(10
‑
11min)，60
‑
5％acn(11
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝9.41。esi+(ve)观察[m]
+
＝507。计算为c
27
h
26
n2o8＝507da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.91(dd,j＝7.4,7.3hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.4hz,3h),1.71
‑
1.81(m,2h),2.10
‑
2.17(m,2h),2.30(t,j＝7.4hz,2h),2.56(t,j＝7.4hz,2h),3.08(dd,j＝14.9,7.4,2h),5.28(s,2h),5.48(s,2h),6.93(s,1h),7.39
‑
7.43(m,2h),8.01
‑
8.04(m,1h),10.33(br s,1h)。
[0584]
(iii)
[0585]
[0586]
在室温下向磁力搅拌的glu
‑
c20
‑
sn
‑
38(13mg，26μmol)和pybop(14mg，26μmol)于dmf(0.5ml)中的混合物中添加dmf(0.5ml)中的混合物中添加(50mg，0.60μmol)和dipea(16μl，97μmol)同样于dmf(1ml)中的混合物。在室温下16小时后，除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，acn)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓缩。然后将残余物溶于水，过滤(0.45μm)并冻干，得到45mg(79％)期望的物质，为黄色固体。
[0587]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)梯度：5％sacn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝8.13。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.62
‑
3.26(m,1,010h),3.36(s,103h),3.37
‑
4.10(m,6,100h),4.11
‑
4.50(m,72h),4.57(s,38h),5.17
‑
5.88(m,50h),6.92
‑
8.11(m,144h)。根据实施例2a，sn
‑
38分子的数目计算为32，药物负载为13.6％w/w。
[0588]
实施例2c：的合成
[0589]
(i)otbu
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0590][0591]
在室温下向sn
‑
38(100mg，0.26mmol)于dcm(2ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加硫代二乙醇酸单
‑
叔丁酯(53mg，0.33mmol/l)，edc(67μl，0.43mmol)和dmap(31mg，0.26mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。真空除去挥发物，残余物经过制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，35
‑
70％acn/水(5
‑
40min)，0.1％tfa)，得到10mg(7％)otbu
‑
tda
‑
c20
‑
sn
‑
38(rt＝35.8分钟)和10mg(7％)otbu
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(rt＝37.5分钟)，为黄色固体。
[0592]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝5.97。esi+(ve)观察[m]
+
＝581。计算为c
30
h
32
n2o8s＝581da。
[0593]
(ii)tda
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0594][0595]
方法a：
[0596]
将otbu
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(10mg，17.2μmol)于tfa(2ml)中的溶液在室温下磁力搅拌过夜。然后真空除去挥发物，并将残余物与dcm共沸，与水混合并冻干，得到9mg(>95％)产物，为黄色固体。
[0597]
方法b：
[0598]
在室温下向sn
‑
38(100mg，0.25mmol)和硫代二甘醇酸酐(85％，79mg，0.51mmol)于dcm(3ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加三乙胺(71μl，0.51mmol)。悬浮液迅速溶解并将混合物在室温下搅拌过夜。16小时后，通过hplc判断反应>80％完成。将反应混合物用3ml dcm稀释并用磷酸盐缓冲液(5％nacl和1％nah2po4于水中，用5％hcl将ph调节至3)洗涤直至洗涤液保持在ph 3(3
×
6ml)。合并的水溶液的ph用1m hcl调节相至3，水层用更多dcm萃取(2
×
20ml)。将合并的有机相用mgso4干燥、过滤并真空除去挥发物。将残余物在真空下干燥，得到81mg(60％)产物，为黄色固体。
[0599]
lcms(c8，梯度：15％acn/h2o(0
‑
1min)，15
‑
25％acn(1
‑
2min)，25％acn(2
‑
8min)，25
‑
80％acn(8
‑
10min)，80％acn(10
‑
11min)，80
‑
15％acn(11
‑
13min)，15％acn(13
‑
15min)，10mm甲酸铵(ph 6.8)，0.4ml/min，rf(min)＝5.44。esi+(ve)观察[m]
+
＝526。计算为c
26
h
24
n2o8s＝525da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.88(dd,j＝7.4,7.2hz,3h),1.30(dd,j＝7.7,7.4hz,3h),1.81
‑
1.94(m,2h),3.16
‑
3.23(m,2h),3.53(s,2h),3.83(s,2h),5.34(s,2h),5.44(s,2h),6.52(s,1h),7.34(s,1h),7.70(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),8.04(d,j＝2.5hz,1h),8.25(d,j＝9.1hz,1h),12.73(br s,1h).
[0600]
(iii)
[0601][0602]
在室温下向磁力搅拌的tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(8mg，15μmol)和pybop(8mg，15μmol)于dmf(0.3ml)中的混合物中添加(0.3ml)中的混合物中添加(28mg，0.37μmol)和nmm(6.5μl，59μmol)同样于dmf(0.7ml)中的混合物。在室温下16小时后，除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓缩，溶于水中，过滤(0.45μm)并冻干，得到29mg(89％)期望的物质，呈黄橙色固体。
[0603]
hplc(c8 aeris widepore，100
×
2.1mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝7.94。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.16
‑
3.27(m,696h),3.36
(s,108h),3.37
‑
4.14(m,6,135h),4.14
‑
4.67(m,78h),4.97
‑
5.88(m,56h),6.82
‑
8.56(m,138h)。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为32，药物负载为13.8％。
[0604]
实施例2d：的合成
[0605]
(i)otbu
‑
tda
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)
[0606][0607]
在0℃下向boc
‑
c10
‑
sn
‑
38(306mg，0.62mmol)和硫代二甘醇单叔丁酯(192mg，0.93mmol)于dcm(8ml)中的磁力搅拌的悬浮液中加入edc(187μl，1.05mmol)和dmap(23mg，0.19mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌3h，直到通过hplc判断反应>70％完成。将反应混合物过滤(0.45μm)并用7mldcm稀释。加入15ml磷酸盐缓冲液(5％氯化钠和1％nah2po4于水中，用5％hcl将ph调节至3)，然后加入15ml etoac。在相分离之后，将有机层用mgso4干燥，过滤(0.7μm)并浓缩。残余物通过制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，30
‑
90％acn/h2o(5
‑
40min)，0.1％tfa，rt＝44min)，得到230mg(54％)产物，为黄色固体。
[0608]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝8.28。esi+(ve)观察[m]
+
＝681。计算为c
35
h
40
n2o
10
s＝681da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.94(dd,j＝7.4,7.3hz,3h),1.28(dd,j＝7.6,7.5hz,3h),1.38(s,9h),1.54(s,9h),2.10
‑
2.23(m,2h),3.16
‑
3.24(m,2h),3.36
‑
3.51(m,2h,部分隐藏在dmso
‑
d6峰下),3.70(dd,j＝19.6,15.2hz,2h),5.35(s,2h),5.52(s,2h),7.16(s,1h),7.74(dd,j＝9.2,2.5hz,1h),8.10(d,j＝2.5hz,1h),8.18(d,j＝9.2hz,1h)。
[0609]
(ii)tda
‑
c20
‑
sn
‑
38
[0610][0611]
将otbu
‑
tda
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)(333mg，0.49mmol)于tfa(20ml)中的溶液在室温
磁力搅拌4h。真空除去挥发物，残余物与dcm共沸，冷却至0℃，与水混合并冻干，得到337mg(>95％)产物，为黄橙色固体。
[0612]
lcms(c8，梯度：15％acn/h2o(0
‑
1min)，15
‑
25％acn(1
‑
2min)，25％acn(2
‑
8min)，25
‑
80％acn(8
‑
10min)，80％acn(10
‑
11min)，80
‑
15％acn(11
‑
13min)，15％acn(13
‑
15min)，10mm甲酸铵(ph 6.8)，0.4ml/min，rf(min)＝5.93。esi+(ve)观察[m]
+
＝525。计算为c
26
h
24
n2o8s＝525da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.94(dd,j＝7.3,7.4hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.4hz,3h),2.08
‑
2.21(m,2h),3.09(dd,j＝14.9,7.3hz,2h),3.42(dd,j＝17.6,15.6hz,2h),3.68(dd,j＝21.5,15.0hz,2h),5.29(s,2h),5.50(s,2h),7.07(s,1h),7.38
‑
7.42(m,2h),8.00
‑
8.03(m,1h),10.31(br s,1h)。
[0613]
(iii)
[0614][0615]
在室温下向磁力搅拌的tda
‑
c20
‑
sn
‑
38(250mg，476μmol)和pybop(248mg，476μmol)于dmf(10ml)中的混合物中添加mol)于dmf(10ml)中的混合物中添加(851mg,11.5μmol)和nmm(201μl,1.83mmol)在dmf(12ml)中的混合物。在室温下16小时后，将反应混合物加入到1％acoh于3:7acn/水(220ml)中的冷冻(o℃)溶液中，过滤并经由超滤(0.005m2，10kda，再生纤维素滤膜)浓缩至35ml。将浓缩物用17
×
35ml渗滤进行进一步超滤(在3:7acn/水中的1％acoh)。将保留物冻干，得到983mg产物。将该物质溶解在thf(4.5ml)中并加入到冷却的(o℃)mtbe(20ml)中。在0℃下搅拌混合物(1h)并通过过滤分离所得沉淀物。将产物真空干燥(72h)，提供816mg(82％)的期望物质，为黄色固体。
[0616]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝8.70。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.65
‑
2.48(m,532h),2.52
‑
3.26(m,122h),3.36(s,102h),3.37
‑
4.13(m,5,803h),4.13
‑
4.66(m,99h),5.15
‑
5.99(m,60h),6.84
‑
7.99(m,183h)。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为31，药物负载为14.1％。
[0617]
实施例2e：的合成
[0618]
(i)dga
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0619][0620]
在室温下向sn
‑
38(100mg，0.26mmol)和二乙醇酸酐(89mg，0.77mmol)于dcm(3ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加三乙胺(106μl，0.77mmol)。将混合物在室温下搅拌。20分钟后，将反应用dmf/乙腈(1:5v/v，含有0.1％tfa)稀释并通过制备型hplc(beh 300watersxbridge c18，5μm，30
×
150mm，10
‑
50％acn/h2o(5
‑
40min)，0.1％tfa，rt＝36.3min)，得到33mg(25％)产物，为黄色固体。
[0621]
lcms(c8，梯度：15％acn/h2o(0
‑
1min)，15
‑
25％acn(1
‑
2min)，25％acn(2
‑
8min)，25
‑
80％acn(8
‑
10min)，80％acn(10
‑
11min)，80
‑
15％acn(11
‑
13min)，15％acn(13
‑
15min)，10mm甲酸铵(ph 6.8)，0.4ml/min，rf(min)＝5.11。esi+(ve)观察[m]
+
＝509。计算为c
26
h
24
n2o9＝508da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.88(dd,j＝7.4,7.2hz,3h),1.30(dd,j＝7.7,7.5hz,3h),1.81
‑
1.94(m,2h),3.15
‑
3.22(m,2h),4.27(s,2h),4.60(s,2h),5.34(s,2h),5.44(s,2h),6.51(br s,1h),7.33(s,1h),7.72(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),8.08(d,j＝2.5hz,1h),8.23(d,j＝9.1hz,1h),12.79(br s,1h)。
[0622]
(ii)
[0623][0624]
在室温下向磁力搅拌的dga
‑
c10
‑
sn
‑
38(63mg，124μmol)和pybop(64mg，124μmol)
于dmf(2ml)中的混合物中添加于dmf(2ml)中的混合物中添加(213mg,2.87μmol)和nmm(50μl,0.46mmol)同样于dmf(3ml)中的混合物。在室温下16小时后，除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，acn)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓缩。然后将残余物溶于水，过滤(0.45μm)并冻干，得到211mg(85％)期望的物质，为黄色固体。
[0625]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)梯度：5％sacn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，0.1％tfa，0.4ml/min，rf(min)＝8.35。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.68
‑
2.37(m,506h),2.53
‑
3.27(m,148h),3.36(s,102h),3.37
‑
4.03(m,5,940h),4.03
‑
4.74(m,169h),4.93
‑
5.77(m,60h),6.87
‑
8.58(m,136h)。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为31，药物负载为14.1％。
[0626]
实施例2f：的合成
[0627]
(i)otbu
‑
dga
‑
c20
‑
sn
‑
38
[0628][0629]
在室温下向sn
‑
38(100mg，0.26mmol)和二甘醇单叔丁酯(63mg，0.33mmol)于dcm(1.5ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加edc(76μl，0.43mmol)和dmap(31mg，0.26mmol)于dcm(1ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌48h。然后过滤反应混合物(0.22μm)，真空除去挥发物。残余物通过制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，30
‑
65％acn/h2o(5
‑
40min)，0.1％tfa，rt＝37min)，得到29mg(20％)产物，为黄色固体。
[0630]
lcms(c18，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
60％acn(1
‑
10min)，60％acn(10
‑
11min)，60
‑
5％acn(11
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝11.83。esi+(ve)观察[m]
+
＝565。计算为c
30
h
32
n2o9＝565da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.92(dd,j＝7.4,7.3hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.5hz,3h),1.40(s,9h),2.08
‑
2.21(m,2h),3.09(dd,j＝15.0,7.4hz,2h),4.08(s,2h),4.39(d,j＝17.0hz,1h),4.56(d,j＝17hz,1h),5.29(dd,j＝20.5,18.9hz,2h),5.51(s,2h),7.00(s,1h),7.40(s,1h),7.41(d,j＝7.4,2.6hz,1h),8.01
‑
8.04(m,1h),10.31(br s,1h)。
[0631]
(ii)dga
‑
c20
‑
sn
‑
38
[0632][0633]
将otbu
‑
dga
‑
c20
‑
sn
‑
38(29mg，0.051mmol)于tfa(5ml)中的溶液在室温下磁力搅拌过夜。然后真空除去挥发物，并将残余物与dcm共沸，与水混合并冻干，得到23mg(88％)产物，为黄色固体。
[0634]
lcms(c18，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
60％acn(1
‑
10min)，60％acn(10
‑
11min)，60
‑
5％acn(11
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝9.12。esi+(ve)观察[m+h]
+
＝509。计算为c
26
h
24
n2o9＝508da。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.92(dd,j＝7.4,7.3hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.4hz,3h),2.08
‑
2.21(m,2h),3.09(dd,j＝15.0,7.4hz,2h),4.12(s,2h),4.40(d,j＝17.0hz,1h),4.57(d,j＝17hz,1h),5.29(s,2h),5.51(s,2h),7.00(s,1h),7.40(s,1h),7.41(dd,j＝7.0,2.5hz,1h),8.02
‑
8.05(m,1h),10.31(s,1h),12.75(br s,1h)。
[0635]
(iii)
[0636][0637]
在室温下向磁力搅拌的dga
‑
c20
‑
sn
‑
38(20mg，39μmol)和pybop(20mg，39μmol)于dmf(0.6ml)中的混合物中添加于dmf(1ml)中的(70mg，0.91μmol)和nmm(16μl,146μmol)的混合物。在室温下16小时后，除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓
缩，然后溶于水中，过滤(0.45μm)并冻干，得到72mg(89％)期望的物质，呈黄橙色固体。
[0638]
hplc(c8 aeris widepore，100
×
2.1mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝7.96。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.53
‑
3.24(m,813h),3.36(s,106h),3.37
‑
4.04(m,6,070h),4.04
‑
4.65(m,155h),5.18
‑
5.91(m,53h),6.75
‑
8.37(m,137h)。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为32，药物负载为13.9％。
[0639][0640]
(i)otbu
‑
修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0641][0642]
在室温下向sn
‑
38(100mg，0.26mmol)和修饰的戊二酸单叔丁酯(72mg)于dcm(2ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加edc(76μl，0.43mmol)和dmap(31mg，0.26mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，之后通过hplc判断反应完成70％。将混合物过滤(0.2μm)，在真空中浓缩至约3ml并且用含有0.1％tfa的3ml乙腈稀释。再次真空除去溶剂，残余物通过制备型hplc(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，35％acn/水(0
‑
5min)，35
‑
70％acn(5
‑
40min)，70％acn(40
‑
43min)，70
‑
80％acn(43
‑
44min)，80％acn(44
‑
49min)，80
‑
35％acn(49
‑
50min)，35％acn(50
‑
60min)，0.1％tfa)，得到101mg(67％)otbu
‑
修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38(rt＝48.9min)，冻干后为黄色固体。
[0643]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝7.46。esi+(ve)观察[m]
+
＝591。化合物的计算值＝591da。
[0644]
(ii)修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0645][0646]
将otbu
‑
修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38(95mg)于tfa(10ml)中的溶液在室温下磁力搅拌过夜。真空除去挥发物，残余物与dcm共沸，与水混合并冻干，得到90mg(>95％)修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38，为黄橙色固体。
[0647]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝3.72。esi+(ve)观察[m]
+
＝535。化合物的计算值＝535da。
[0648]
(iii)
[0649][0650]
在室温下向磁力搅拌的修饰的
‑
glu
‑
c10
‑
sn
‑
38(33mg)和pybop(32mg，61μmol)于dmf(1ml)中的混合物中添加dmf(1ml)中的混合物中添加(110mg，1.42μmol)和nmm(25μl,227μmol)于dmf(2ml)中的混合物。在室温下16小时后，真空除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓缩。将残余物溶于水，过滤(0.45μm)并冻干，得到120mg(94％)期望的物质，为黄色固体。
[0651]
hplc(aeris widepore，100
×
2.1mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，214nm，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝8.04。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为31，药物负载为13.4％。
[0652]
实施例2h：的合成
[0653]
(i)otbu
‑
修饰的
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0654][0655]
在室温下向sn
‑
38(35mg，0.089mmol)和修饰硫代二乙醇酸单叔丁酯(24mg)于dcm(1ml)中的磁力搅拌悬浮液中添加edc(24μl，0.13mmol)和dmap(10mg，0.079mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。真空除去挥发物，残余物通过制备型hplc(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，35％acn/水(0
‑
5min)，35
‑
70％acn(5
‑
40min)，70％acn(40
‑
43min)，70
‑
80％acn(43
‑
44min)，80％acn(44
‑
49min)，80
‑
35％acn
(49
‑
50min)，35％acn(50
‑
60min)，0.1％tfa)，得到13mg.(24％)otbu
‑
修饰的
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(rt＝44.3min)，为黄色固体。
[0656]
(ii)修饰的tda
‑
c10
‑
sn
‑
38
[0657][0658]
将otbu
‑
修饰的
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(13mg，0.021mmol)于tfa(2ml)中的溶液在室温下磁力搅拌过夜。然后真空除去挥发物，残余物与dcm共沸，与水混合并冻干，得到14mg(>95％)修饰的
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38，为黄橙色固体。
[0659]
lcms(c8，梯度：15％acn/h2o(0
‑
1min)，15
‑
25％acn(1
‑
2min)，25％acn(2
‑
8min)，25
‑
80％acn(8
‑
10min)，80％acn(10
‑
11min)，80
‑
15％acn(11
‑
13min)，15％acn(13
‑
15min)，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝6.47和6.57(两个异构体峰)。esi+(ve)观察[m]
+
＝553。化合物的计算值＝553da。
[0660]
(iii)
[0661][0662]
在室温下向磁力搅拌的修饰的
‑
tda
‑
c10
‑
sn
‑
38(64mg，116μmol)和pybop(60mg，116μmol)于dmf(2.5ml)中的混合物中添加于dmf(2.5ml)中的(199mg，2.68μmol)和nmm(47μl，428μmol)的混合物。在室温下16小时后，真空除去挥发物，并通过尺寸排阻色谱法(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化残余物。通过hplc判断，合并适当的级分并浓缩。将残余物溶解在水中，过滤(0.45μm)并冻干，得到225mg(96％)期望的物质，为黄色固体。
[0663]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)梯度：5％sacn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，
80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，0.1％tfa，0.4ml/min，rf(min)＝8.54。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为32，药物负载为14.3％。
[0664]
实施例2i：的合成
[0665]
(i)2,5
‑
thf
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)
[0666][0667]
在0℃下，向磁力搅拌的boc
‑
c10
‑
sn
‑
38(zhao,h.et al,bioconjugate chem.,2008,19,849
‑
859)(188mg，0.38mmol)和3,8
‑
二恶双环[3.2.1]辛烷
‑
2,4
‑
二酮(217mg，1.53mmol)于dcm(7.5ml)的悬浮液中加入三乙胺(265μl，1.91mmol)和dmap(12mg，95μmol)。将混合物在0℃下搅拌1h，直到通过hplc判断反应>80％完成。真空除去挥发物，残余物经制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，35
‑
75％acn/h2o(5
‑
50min)，0.1％tfa)，得到151mg(62％)的2,5
‑
thf
‑
c20
‑
sn
‑
38(rt＝34.5min)，冻干后为黄色固体。
[0668]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝6.25。esi+(ve)观察[m]
+
＝635。计算为c
33
h
34
n2o
11
＝635da。
[0669]
(ii)2,5/thf
‑
c20
‑
sn
‑
38
[0670][0671]
在0℃向2,5
‑
thf
‑
c20
‑
sn
‑
38
‑
o(boc)(151mg，0.24mmol)于二氯甲烷(1.4ml)中的磁力搅拌溶液中加入tfa(0.7ml)。将混合物在0℃搅拌5min，然后在室温下搅拌。2.5h后，用二氯甲烷(20ml)稀释反应。真空除去挥发物，残余物与dcm共沸，冷却至0℃，与水混合并冻干，得到151mg(>95％)2,5
‑
thf
‑
c20
‑
sn
‑
38，为黄橙色固体。
[0672]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，10mm甲酸铵，0.4ml/min，rf(min)＝6.54。1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6)δ(ppm):0.92(dd,j＝7.4,7.3hz,3h),1.29(dd,j＝7.6,7.5hz,3h),2.04
‑
2.43(m,6h),3.09(dd,j＝15.0,7.3hz,2h),4.51
‑
4.58(m,
1h),4.61
‑
4.68(m,1h),5.29(s,2h),5.49(s,2h),6.96(s,1h),7.38
‑
7.43(m,2h),8.03
‑
8.08(m,1h),10.31(br s,1h)。
[0673]
(iii)
[0674][0675]
在室温下，向2,5
‑
thf
‑
c20
‑
sn
‑
38(125mg，233μmol)和pybop(121mg，234μmol)于dmf(8ml)中的磁力搅拌混合物中加入dmf(8ml)中的磁力搅拌混合物中加入(417mg,5.6μmol)和nmm(99μl，899μmol)于dmf(7ml)的混合物中。在室温下2小时后，将反应混合物加入到1％acoh在3:7acn/水(150ml)中的冷冻(o℃)溶液中，过滤(p3烧结)并经由超滤(0.005m2，10kda，再生纤维素滤膜)浓缩至约15ml。将浓缩物用40
×
15ml渗滤进行超滤(1％acoh于3:7acn/mq水中)。将保留物冻干，得到486mg产物。将该物质溶解在thf(3.8ml)中并加入到冷却的(o℃)mtbe(16ml)中。在0℃下搅拌混合物(1h)并通过过滤分离所得沉淀物。将产物真空干燥(16h)，得到388mg(79％)的期望物质，为黄色固体。
[0676]
hplc(c8 xbridge，3
×
100mm)梯度：5％sacn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，0.1％tfa，0.4ml/min，rf(min)＝8.29。1h nmr(300mhz,cd3od)δ(ppm):0.27
‑
3.27(m,837h),3.36(s,100h),3.37
‑
3.90(m,5,784h),3.37
‑
4.65(m,167h),4.88
‑
6.02(m,94h),6.83
‑
8.18(m,140h)。根据实施例2a，计算sn
‑
38分子的数量为32，药物负载为14.4％。
[0677]
实施例2j：的合成
[0678]
(i)dga
‑
c20
‑
伊立替康
[0679][0680]
在室温下，向盐酸伊立替康(110mg，0.18mmol)于dcm(5ml)中的磁力搅拌的悬浮液中加入二甲基氨基吡啶(82mg，0.67mmol)。10分钟后，固体溶解并加入二甘醇酸酐(51mg，0.44mmol)。在室温下6小时后，加入另外份的二甲氨基吡啶(82mg，0.67mmol)和二甘醇酸酐(51mg，0.44mmol)。在室温下搅拌过夜后，除去溶剂，将残余物溶于乙腈中，并通过制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，5
‑
80％acn/h2o(5
‑
40min)，0.1％甲酸铵，rt＝37min)，得到48mg(39％)产物，为黄色固体。
[0681]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝7.77。esi+(ve)观察[m]
+
＝703。计算为c
37
h
42
n4o
10
＝703da。
[0682]
(ii)
[0683][0684]
向dga
‑
伊立替康(30mg，43μmol)和pybop(22mg，43μmol)于dmf(1ml)中的磁力搅拌溶液中加入(92mg,1.1μmol)于dmf(2ml)的溶液中，接着是nmm(19μl，173μmol)。室温下16小时后，将反应混合物真空浓缩，然后溶于meoh(1.5ml)中，并通过sec(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化。将含有产物的级分合并并且在真空中浓缩，并且将所得残余物溶解在mq水中，过滤(0.2μm acrodisc)并且冻干，得到期望产物，
为浅黄色固体(85mg，产率76％)。
[0685]
hplc(c8 xbridge,3
×
100mm),梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min),5
‑
80％acn(1
‑
7min),80％acn(7
‑
12min),80
‑
5％acn(12
‑
13min),5％acn(13
‑
15min),243nm,0.1％tfa,0.4ml/min,rf(min)＝8.37min.1h nmr(300mhz,cd3od
‑
d4)(ppm):0.83
‑
2.43(m,1073),2.84
‑
3.24(m,324h),3.36(s,113h),3.44
‑
3.99(m,5900h),4.03
‑
4.67(m,224h),5.04
‑
6.13(m,100h),7.23
‑
7.94(m,139h)。根据实施例2a，伊立替康分子的数量计算为32，且药物负载为19.1％w/w。
[0686]
实施例2k：的合成
[0687]
(i)tda
‑
c20
‑
伊立替康
[0688][0689]
在室温下，向盐酸伊立替康(112mg，0.18mmol)于dcm(5ml)中的磁力搅拌的悬浮液中加入二甲基氨基吡啶(89mg，0.73mmol)。10分钟后，固体溶解并加入硫代二甘醇酸酐(60mg，0.45mmol)。在室温下16小时后，加入另外份的二甲氨基吡啶(83mg，0.68mmol)和硫代二甘醇酸酐(63mg，0.48mmol)。在室温下再搅拌3小时后，除去溶剂，将残余物吸收在乙腈中，并通过制备型hplc纯化(beh 300waters xbridge c18，5μm，30
×
150mm，5
‑
80％acn/h2o(5
‑
40min)，0.1％甲酸铵，rt＝33min)，得到94mg(73％)产物，为黄色固体。
[0690]
lcms(c8，梯度：40％acn/h2o(0
‑
1min)，40
‑
90％acn(1
‑
7min)，90％acn(7
‑
9min)，90
‑
40％acn(9
‑
11min)，40％acn(11
‑
15min)，0.1％甲酸，0.4ml/min，rf(min)＝6.94。esi+(ve)观察[m]
+
＝719。计算为c
37
h
42
n4o9s＝719da。
[0691]
(ii)
[0692][0693]
向tda
‑
伊立替康(38mg，52μmol)和pybop(27mg，52μmol)于dmf(1ml)中的磁力搅拌溶液中加入(105mg,1.4μmol)于dmf(2ml)的溶液中，接着是nmm(23μl，210μmol)。室温下16小时后，将反应混合物真空浓缩，然后溶于meoh(1.5ml)中，并通过sec(sephadex，lh
‑
20，meoh)纯化。将含有产物的级分合并并且在真空中浓缩，并且将所得残余物溶解在mq水中，过滤(0.2μm acrodisc)并且冻干，得到期望产物，为黄色固体(110mg，产率85％)。
[0694]
hplc(c8 xbridge,3
×
100mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min),5
‑
80％acn(1
‑
7min),80％acn(7
‑
12min),80
‑
5％acn(12
‑
13min),5％acn(13
‑
15min),214nm,0.1％tfa,0.4ml/min。rt＝8.54min.1h nmr(300mhz,cd3od
‑
d4)(ppm):0.65
‑
2.72(m,816h),2.98
‑
3.32(m,231h),3.36(s,137h),3.38
‑
4.10(m,6112h),4.12
‑
4.71(m,144h),5.04
‑
5.99(m,63h),6.80
‑
8.46(m,104h)。根据实施例2a，伊立替康分子的数量计算为24，且药物负载为15.4％w/w。
[0695]
实施例3：比较连接基在37℃和ph 7.4的pbs和血浆中的释放速率
[0696]
进行研究以确定在37℃和ph 7.4下在9:1pbs(磷酸盐缓冲盐水):dma中sn
‑
38从某些树状聚体化合物释放的速率。结果显示在6和18小时释放的％sn
‑
38显示在下表中。
[0697]
表3.
[0698]
[0699]
pbs释放研究通过在37℃下孵育之前立即制备树状聚体在9:1v/v(pbs/dma)中的1mg/ml溶液来进行。在6h和18h以及其它时间点通过hplc分析样品，比较sn
‑
38的％峰面积与树状聚体构建体的％峰面积。hplc(c8 xbridge,3
×
100mm)，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，10mm甲酸铵缓冲液，0.4ml/min。
[0700]
在其它时间点的释放示于图13和14中。
[0701]
表4.
[0702][0703]
通过将0.8ml大鼠血浆(离心法和过滤)加入0.16ml树状聚体溶液(约2mg/ml sn
‑
38当量/盐水)进行血浆释放研究。将混合物涡旋(30s)，然后在37℃孵育。在不同时间点取出等分试样(0.1ml)并加入到acn(0.2ml，5％甲酸)中。将得到的混合物涡旋(30s)，离心(10min，4℃)，过滤并通过hplc分析(c8 xbridge，3
×
100mm，0.4ml/min，梯度：5％acn/h2o(0
‑
1min)，5
‑
80％acn(1
‑
7min)，80％acn(7
‑
12min)，80
‑
5％acn(12
‑
13min)，5％acn(13
‑
15min)，243nm，0.1％tfa，rt(sn
‑
38)＝7.0min，rt(缀合物)＝8.5min。
[0704]
释放数据如图12所示。
[0705]
示例4：体外抗癌药物筛选测定
[0706]
使用细胞计数(srb)测定法进行研究以确定实施例树状聚体抑制ht
‑
29细胞(人结肠癌细胞系)生长的能力。gi
50
是抑制50％的净细胞生长所需的浓度。
[0707]
表6.
[0708]
树状聚体编号/化合物gi
50
μm2a0.13,0.132e<0.01,<0.012f0.05,0.042d0.142c0.032h0.022g0.82j122k46伊立替康7sn
‑
38<0.01
[0709]
实施例5：实施例树状聚体在balb/c裸鼠中的耐受性
[0710]
在balb/c裸鼠中研究了四种实施例树状聚体(2a、2f、2i和2h)的耐受性。
[0711]
样品制备
[0712]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，伊立替康在盐水中稀释。
[0713]
实验方法
[0714]
雌性balb/c裸鼠(6
‑
8周龄)每周一次静脉内注射树状聚体(0.1ml/10g体重)，持续3周(第1、8和15天)。每天给小鼠称重并观察任何毒性迹象(体重减轻，一般健康状况不佳)。在最后药物给药后监测动物3
‑
4周。任何超过伦理终点(≥20％体重减轻，一般健康状况不佳)的小鼠立即安乐死。每天给动物喂一小盘饲料补充剂(确保与食物粉混合)。在三周内每周给药后每1
‑
2天评估动物体重变化。最大耐受药物剂量(mtd)定义为引起不超过10％体重减轻且由此动物在7
‑
10天内恢复体重至基线水平的剂量。
[0715]
结果和讨论
[0716]
在1
‑
2只balb/c小鼠中测试了四种sn
‑
38树状聚体和伊立替康的耐受性。与每种药物和测试剂量相关的最大体重减轻总结在表7中。基于在sn
‑
38组中观察到的体重减轻，效力研究所选择的最终剂量是2f和2i，15mg/kg，2h，25mg/kg，和2a，30mg/kg。当以100mg/kg伊立替康处理的小鼠表现出四肢苍白和嗜睡时，选择90mg/kg的剂量。
[0717]
表7：在balb/c裸鼠中测试药物剂量的耐受性
[0718]
化合物测试的剂量(mg/kg)最大体重减轻(％)伊立替康75,90,1004,3,102a10,300,102h0.5,5,15,300,1,0,142f15,20,304,10,222i15,20,308,15,15
[0719]
体重减轻测定为基线体重的百分比。
[0720]
结论：
[0721]
向balb/c裸鼠静脉注射树状聚体2f(15mg/kg)、2i(15mg/kg)、2h(25mg/kg)和2a(30mg/kg)，每周一次，持续三周，耐受良好。
[0722]
实施例6：实施例树状聚体在小鼠的sw620异种移植模型中的效力
[0723]
在sw620(人结肠癌细胞系)异种移植模型中研究了四种实施例树状聚体(2f、2i、2h&2a)的体内抗肿瘤活性。
[0724]
样品制备
[0725]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，伊立替康在盐水中稀释。
[0726]
实验方法
[0727]
对雌性balb/c裸鼠(7
‑
8周龄)在侧腹皮下接种于pbs:matrigel(1:1)中的4
×
106sw620细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十二天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积135mm3)的小鼠随机分成6组，每组6只动物(第1天)。处理组为生理盐水，伊立替康(90mg/kg)，2f(15mg/kg)，2i(15mg/kg)，2h(25mg/kg)和2a(25mg/kg)。所有化合物在第1、8和15天通过尾静脉注射以0.1ml/10g体重施用。每天给小鼠喂一小盘饲料补充剂(确保与食物粉混合)。实验在第119天，或如果符合伦理终点，则更早结束。
[0728]
结果和讨论
[0729]
药物毒性：所有化合物被良好耐受，并且在任何处理组中平均体重减轻不超过10％。由于第99天体重减轻，在研究期间对来自2a组的一只动物实施安乐死。每组的平均动物体重变化总结在下面的图1中。数据表示
[0730]
每组自基线(第1天)的平均重量变化百分比；条形sem。显示每组的图表直至在组中剩余不少于4只动物。
[0731]
抗肿瘤效力：图2和3分别总结了药物处理对sw620肿瘤生长和存活的影响。当实验结束时，在第119天，在任何组中没有观察到再生长，每种测试药物诱导完全肿瘤消退。相反，依立替康处理引起肿瘤生长延迟，除了一个肿瘤，其在第25天后完全消退。显示图表直至组中剩余不少于4只动物。图3显示了图2中数据的kaplan
‑
meier存活曲线。分析的终点是肿瘤体积为1200mm3。对由于疾病而安乐死的小鼠进行检查。
[0732]
结论：
[0733]
向balb/c裸鼠静脉注射树状聚体2f(15mg/kg)、2i(15mg/kg)、2h(25mg/kg)和2a(25mg/kg)，每周一次，持续三周，耐受良好，并且诱导balb/c裸鼠中的sw620肿瘤的消退。
[0734]
实施例7：实施例树状聚体在小鼠的ht
‑
29异种移植模型中的效力
[0735]
在ht
‑
29(人结肠癌细胞系)异种移植模型中研究了三种实施例树状聚体(2f、2i和2h)的体内抗肿瘤活性。
[0736]
样品制备
[0737]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，伊立替康在盐水中稀释。
[0738]
实验方法
[0739]
对雌性balb/c裸鼠(7
‑
8周龄)在侧腹皮下接种于pbs:matrigel(1:1)中的5
×
106ht
‑
29细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十五天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积100mm3)的小鼠随机分成5组，每组10只动物(第1天)。处理组施用生理盐水，依立替康(90mg/kg)，2f(15mg/kg)，2i(15mg/kg)，和2h(25mg/kg)。所有化合物在第1、8和15天通过尾静脉注射以0.1ml/10g体重施用。每天向小鼠投喂一小碟含有食物补充剂(与食物粉尘混合)。实验在第130天，或如果符合伦理终点，则更早结束。
[0740]
在graphpad prism中分析肿瘤生长数据的anova，然后进行dunnett氏事后检验。使用mantel cox秩检验分析存活曲线。
[0741]
肠道毒性分析
[0742]
对携带肿瘤的小鼠(n＝1)施用单次iv剂量的盐水，90mg/kg伊立替康或15mg/kg2f。24小时后，将小鼠安乐死，取出肠道并冲洗，卷在盒子中，然后在福尔马林中固定和石蜡包埋。收获每只小鼠的肿瘤，切成两片，在福尔马林中半固定，在oct冷冻培养基中半冷冻。切割μm切片并h&e染色。载玻片在bx
‑
61显微镜上成像并拍摄图像。
[0743]
用于免疫组织化学和荧光分析的组织样品
[0744]
将携带肿瘤的小鼠(n＝2)用2f(15mg/kg)、2i(15mg/kg)、2h(25mg/kg)和伊立替康(90mg/kg)每周处理一次，持续三周。在最后剂量后3天，杀死小鼠，收获肿瘤(一半福尔马林固定，一半在oct中固定)，如上制备肠道，一部分肌肉固定在oct中。如上所述收获1只未处
理的动物。
[0745]
结果和讨论
[0746]
药物毒性
[0747]
所有化合物被良好耐受，并且在任何处理组中平均体重减轻不超过7％。没有动物因毒性而安乐死。每组的平均动物体重变化总结在图4中。数据代表每组自基线(第1天)的平均重量变化百分比；条形sem。显示每组的图表直至在组中剩余不少于6只动物。
[0748]
抗肿瘤效力
[0749]
图5和6分别总结了每种药物对ht
‑
29肿瘤生长和存活的影响。图6中分析的终点是1200mm3的肿瘤体积。到第40天，三种测试药物中的每一种瞬时诱导肿瘤消退，所有组中再生长明显。第36天，在伊立替康、2f、2i和2h组中肿瘤生长分别被抑制23％(p＝n.s相对于媒介物)、108％(p<0.001相对于媒介物)、103％(p<0.0001)和108％(p<0.0001)。与伊立替康相比，所有三种测试药物均显著延长存活(所有p都<0.0001)。
[0750]
结论：
[0751]
实施例2f(15mg/kg)、2i(15mg/kg)和2h(25mg/kg)的实施例树状聚体在balb/c裸鼠中诱导ht
‑
29肿瘤的瞬时消退。
[0752]
实施例8：实施例树状聚体在小鼠mda
‑
mb
‑
231异种移植模型中的效力
[0753]
在mda
‑
mb
‑
231(人乳腺癌细胞系)异种移植物模型中研究了两种实施例树状聚体(2f和2h)的体内抗肿瘤活性。
[0754]
样品制备
[0755]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，伊立替康在盐水中稀释。
[0756]
实验方法
[0757]
对雌性balb/c裸鼠(7周龄)在侧腹下皮下接种3.5
×
106mda
‑
mb
‑
231细胞于pbs:matrigel(1:1)中。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十四天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积110mm3)的小鼠随机分成3组，每组4只动物(第1天)。处理组为生理盐水，依立替康(90mg/kg)，2f(15mg/kg)，和2h(25mg/kg)。所有化合物在第1、8和15天通过尾静脉注射以0.1ml/10g体重施用。每天向小鼠投喂一小盘食物补充剂(与食物粉尘混合)。实验在第70天，或如果符合伦理终点，则更早结束。
[0758]
结果和讨论
[0759]
药物毒性
[0760]
所有化合物被良好耐受，并且在任何处理组中平均体重减轻不超过6％。每组的平均动物体重变化总结在图7中。数据代表每组自基线(第1天)的平均重量变化百分比；条形sem。显示每组的图表直至在组中剩余不少于2只动物。
[0761]
抗肿瘤效力
[0762]
图8和9分别总结了每种药物对mda
‑
mb
‑
231肿瘤生长和存活的影响。肿瘤体积表示为平均肿瘤体积(
±
sem)。显示图表直至组中剩余不少于2只动物。图8中分析的终点是1200mm3的肿瘤体积。
[0763]
两种sn
‑
38树状聚体对肿瘤发挥相同作用，最初诱导肿瘤消退至第24天，然后肿瘤
再生长。在药物处理期间，伊立替康组中的肿瘤继续生长。
[0764]
结论：
[0765]
当每周一次iv施用三周时，实施例2f(15mg/kg)和2h(25mg/kg)的实施例树状聚体在balb/c裸鼠中诱导mda
‑
mb
‑
231肿瘤消退。
[0766]
实施例9：实施例树状聚体在小鼠capan
‑
1异种移植模型中的效力
[0767]
研究了在capan
‑
1(胰腺癌细胞系)异种移植物模型中静脉内和腹膜内施用的实施例树状聚体(2f)的体内抗肿瘤活性。
[0768]
样品制备
[0769]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。
[0770]
实验方法
[0771]
在小鼠臀部皮下接种capan
‑
1细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在植入后第十四天，将具有相似大小的肿瘤的小鼠随机分成3组，每组3只动物(第1天)。处理组为生理盐水，2f静脉施用，且2f腹腔施用。每天向小鼠投喂一小盘食物补充剂(与食物粉尘混合)。
[0772]
结果和讨论
[0773]
药物毒性
[0774]
每组的平均动物体重变化总结在图10中。数据代表每组自基线(第1天)的平均重量变化百分比；条形sem。
[0775]
抗肿瘤效力
[0776]
图11总结了iv(静脉)和ip(腹腔)施用2f对capan
‑
1肿瘤生长和存活的影响。
[0777]
结论：
[0778]
当每周施用一次持续三周时，静脉内施用或腹膜内施用的实施例2f的实施例树状聚体在小鼠中诱导capan
‑
1肿瘤消退。
[0779]
实施例10：在小鼠的ht
‑
29异种移植模型中单独或与西妥昔单抗组合施用的树状聚体的实施例的效力
[0780]
在ht
‑
29(人结肠癌细胞系)异种移植模型中探索了在较低剂量下以及与egfr试剂西妥昔单抗组合的树状聚体(2f)的体内抗肿瘤活性。
[0781]
样品制备
[0782]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，伊立替康在盐水中稀释。
[0783]
实验方法
[0784]
对雌性balb/c裸鼠(7
‑
8周龄)在下侧腹皮下接种pbs:matrigel(1:1)中的5
×
106ht
‑
29细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十五天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积100mm3)的小鼠随机分成7组，每组8只动物(第1天)。处理组为盐水，伊立替康(35mg/kg)，西妥昔单抗(25mg/kg)，单独的树状聚体2f(10mg/kg和5mg/kg)，树状聚体2f(10mg/kg和5mg/kg)与西妥昔单抗(25mg/kg)组合。所有化合物在第1、8、15和22天通过尾静脉注射以0.1ml/10g体重施用。每天向小鼠投喂一小盘食物补充剂(与食物粉尘混合)。如果符合伦理终点，则对小鼠进
行剔除。分析的终点是1200mm3的肿瘤体积或更早出现的第55天。
[0785]
在graphpad prism中分析肿瘤生长数据的anova，然后进行dunnett氏事后检验。使用mantel cox秩检验分析存活曲线。
[0786]
结果和讨论
[0787]
药物毒性
[0788]
所有化合物被良好耐受，并且在任何处理组中平均体重减轻不超过9％。没有动物因毒性而安乐死。
[0789]
抗肿瘤效力
[0790]
图15和16总结了每种药物单独给药时对ht
‑
29肿瘤生长和存活的影响。伊立替康对该细胞系几乎没有影响(伊立替康抗性细胞系)，而西妥昔单抗仅具有中等影响。相比而言，树状聚体2f显示清晰的剂量反应，具有统计学显著的肿瘤消退。实施例2f与伊立替康相比显著延长存活(p<0.0001)，如先前实施例7中所示。实施例2f相对西妥昔单抗也延长存活。
[0791]
10mg/kg的较高剂量显示与以上图1至10所示的几乎相同的效果，表明在效力和安全性之间的宽治疗窗。
[0792]
图17和18总结了伊立替康或树状聚体与西妥昔单抗组合分别对ht
‑
29肿瘤生长和存活的影响。与单独施用每种药物相比，伊立替康和西妥昔单抗的组合仅显示非常温和的作用，而西妥昔单抗和低剂量(5mg/kg)2f的组合对效力和存活提供出乎意料的益处，清楚地表明树状聚体对西妥昔单抗的活性的增强作用。
[0793]
实施例11：在小鼠的ht
‑
29异种移植模型中单独或与奥拉帕尼组合施用的树状聚体的实施例的效力
[0794]
在ht
‑
29(人结肠癌细胞系)异种移植模型中探索了在较低剂量下以及与parp抑制剂奥拉帕尼组合的树状聚体(2f)的体内抗肿瘤活性。
[0795]
样品制备
[0796]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。每天给药中，将伊立替康临床制剂(dbl
tm
‑
伊立替康，hospira australia pty公司)在盐水中稀释。将得自medchemexpress的奥拉帕尼固体粉末溶解在dmso中，并在10％dmso:15％(2
‑
羟丙基)
‑
β
‑
环糊精于无菌水中制备最终浓度为5mg/ml的口服制剂。
[0797]
实验方法
[0798]
对雌性balb/c裸鼠(7
‑
8周龄)在下侧腹皮下接种pbs:matrigel(1:1)中的5
×
106ht
‑
29细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十三天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积100mm3)的小鼠随机分成8组，每组10只动物(第1天)。处理组为生理盐水，伊立替康(80mg/kg)或与奥拉帕尼(50mg/kg)组合，单独树状聚体2f(5mg/kg和8mg/kg)，树状聚体2f(5mg/kg和8mg/kg)与奥拉帕尼(50mg/kg)组合。在第1天、第8天和第15天以0.1ml/10g体重通过尾静脉注射施用所有化合物，除了(i)奥拉帕尼口服5天/2天停药，持续3周，(ii)接受树状聚体8mg/kg的组在第16天施用第三剂量，和(iii)树状聚体8mg/kg+奥拉帕尼组中，
‑
3/10小鼠在第2周和/或第3周错过1
‑
2个奥拉帕尼剂量。每天向小鼠投喂一小盘食物补充剂(与食物粉尘混合)。
如果符合伦理终点，则对小鼠进行剔除。分析的终点是肿瘤体积为1200mm3。
[0799]
当第一只研究动物达到肿瘤负荷的终点标准时，在第28天进行肿瘤生长的统计分析。
[0800]
表：肿瘤生长抑制百分比分析。
[0801]
处理百分比tgip(vs媒介物)奥拉帕尼00.9999伊立替康330.0446伊立替康+奥拉帕尼370.01715mg/kg 2f62<0.00015mg/kg 2f+奥拉帕尼100<0.00018mg/kg 2f97<0.00018mg/kg 2f+奥拉帕尼107<0.0001
[0802]
结果和讨论
[0803]
药物毒性
[0804]
所有化合物被良好耐受，并且在任何处理组中平均体重减轻不超过8％。没有动物由于毒性被安乐死，所有动物都保留在研究中直到第28天。
[0805]
抗肿瘤效力
[0806]
图19总结了当单独给药时每种药物对ht
‑
29肿瘤生长的作用。在该模型中单独的奥拉帕尼对肿瘤生长没有影响。伊立替康对肿瘤生长具有中度影响(在第28天，tgi为33％)。与之相比，树状聚体2f显示明显的剂量依赖性反应，具有统计上显著的肿瘤生长抑制(对于5mg/kg和8mg/kg，在第28天，分别为62％和94％tgi)。如上文实施例7和10所示，与伊立替康相比，实施例2f显著抑制肿瘤生长和延长肿瘤消退(p<0.0001)。实施例2f也延长肿瘤消退与奥拉帕尼的对比。
[0807]
图19也总结了伊立替康或树状聚体与奥拉帕尼组合对ht
‑
29肿瘤生长的影响。伊立替康与奥拉帕尼组合用药优于单用药物，而奥拉帕尼和低剂量(5mg/kg)2f的组合以完全肿瘤生长抑制提供了对效力出乎意料的益处，(第28天100％tgi清楚地表明奥拉帕尼增强了2f的抗肿瘤活性。同样地，奥拉帕尼和8mg/kg 2f的组合也增强了第28天明显肿瘤消退的活性(％tgi>100％)。
[0808]
实施例12：在小鼠的ct26异种移植模型中单独或与pd
‑
1抑制剂组合施用的树状聚体的实施例的效力
[0809]
将在ct26.wt(atcc)(结肠癌细胞系)同基因模型中探索与pd
‑
1抑制剂组合的树状聚体(2f)的体内抗肿瘤活性。
[0810]
样品制备
[0811]
树状聚体构建体储存在
‑
20℃直至使用。给药前立即将构建体溶于盐水中。所有树状聚体以mg/kg sn
‑
38当量施用。在每天的给药中，将pd
‑
1抗体(invivomab抗小鼠pd
‑
1(cd279)(clone：rmp1
‑
14))和同种型对照(invivomab大鼠igg2a同种型对照，抗
‑
三硝基苯酚)在盐水中稀释。
[0812]
实验方法
[0813]
对雌性balb/c小鼠(7
‑
8周龄)在下侧腹皮下接种pbs:matrigel(1:1)中的5
×
106ct26细胞。将小鼠称重并使用电子卡尺每周测量肿瘤2
‑
3次。肿瘤体积(mm3)计算为长度(mm)/2
×
宽度(mm)2。在移植后第十三天，将具有相似大小的肿瘤(平均肿瘤体积100mm3)的小鼠随机分组，每组6只动物(第1天)。处理组是单独或与抗体组合的盐水和化合物2f(15mg/kg)(在第1天，200μg i.p.，第4、8、12天，100μg)。在第1、8和15天以0.1ml/10g体重通过尾静脉注射施用所有的树状聚体处理。如果符合伦理终点，则对小鼠进行剔除。分析的终点是肿瘤体积为1200mm3。
[0814]
当第一研究动物达到肿瘤负荷的终点标准时，进行肿瘤生长分析。
[0815]
表：预期的肿瘤生长抑制百分比(tgi)分析。
[0816]
处理百分比tgi 媒介物+同种型对照0 抗pd
‑
1约20％ 15mg/kg 2f+同种型对照约60％(如上所述) 15mg/kg 2f+抗pd
‑
1约100％ [0817]
实施例13：药代动力学研究
[0818]
对大鼠进行2f单剂量毒性研究，以与伊立替康进行比较。5组sprague
‑
dawley大鼠均接受单次缓慢推注媒介物，低(约1.3mg/kg sn
‑
38当量)、中等(约7.5mg/kg sn
‑
38当量)或高剂量(约16.5mg/kg sn
‑
38当量)2f或伊立替康70mg/kg(约40mg/kg sn
‑
38当量)。(除媒介物n＝6外，每组n＝18)
[0819]
在给药后5m、30m、2h、4h、8h、24h、72h和120h，从6只动物的交替亚组中收集血样，并通过lc
‑
ms/ms分析总的和游离的sn
‑
38)，并确定药代动力学特性。结果总结在下表中。
[0820]
表：游离sn
‑
38的药代动力学参数。
[0821][0822]
表：总sn
‑
38的药代动力学参数。
[0823]