经修饰的丝状真菌宿主细胞的制作方法

序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。本发明涉及经修饰的丝状真菌细胞，以及用于产生此类细胞的方法，连同产生其中分泌的目的多肽的方法。
背景技术：
：丝状真菌宿主细胞被广泛用于多种目的多肽的工业生产。大量的研究工作旨在改善丝状真菌宿主细胞中目的多肽的产生，特别是改善生产率和/或产率。技术实现要素：本发明人发现，在产酶宿主细胞中修饰编码预测的推定的类固醇脱氢酶的基因可改善酶的生产率和/或产率。因此，在第一方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。可以通过本领域已知的任何合适的方法来修饰、截短、灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶，例如，通过用异源启动子(优选地，受调控的启动子)替代所述基因的天然启动子来减少编码基因的表达。降低推定的类固醇脱氢酶水平的另一种策略可以是向蛋白质中添加去稳定化结构域，例如泛素结构域，从而降低蛋白质的半衰期。灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式是共表达或添加一种或多种类固醇脱氢酶抑制剂。完全消除表达的便利方式的实例是基因缺失、基因替代或基因中断，例如通过在编码序列中引入无义突变。修饰编码序列的另一种方式可以是通过缺失一些编码序列或通过突变编码序列来干扰内含子加工而引入内部缺失。灭活推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式可以是使用rna干扰或sirna或者通过插入含有启动子并且可能缺乏终止子的构建体来沉默其表达，该构建体的转录方向朝向编码推定的类固醇脱氢酶的基因的末端，导致编码推定的类固醇脱氢酶的基因的转录受到空间位阻(由于rna聚合酶发生碰撞)或可能的mrna去稳定化(由于形成具有互补序列的mrna分子)。因此，在第二方面，本发明涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺序的以下步骤：a)用编码分泌的目的多肽的多核苷酸构建体转化丝状真菌宿主细胞；以及b)突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该天然推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。本发明的最后一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在有利于产生该分泌的多肽的条件下培养如任一项前述权利要求所述的突变的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地b)回收该分泌的目的多肽。附图说明图1示出了pnjoc577的质粒图。图2示出了pnjoc383的质粒图。图3示出了在seqidno:3、6、9和12中鉴别的四种推定的类固醇脱氢酶的多重比对。相同的残基以黑色框表示。在四种蛋白质的三种中保守的残基以灰色框表示。使用muscle算法版本3.8.31和默认参数来比对蛋白质(edgar,r.c.(2004).nucleicacidsresearch[核酸研究],32(5),1792-1797)。图4示出了pnjoc569的质粒图。图5示出了菌株njoc587(对照)和njoc618-81d(类固醇脱氢酶突变体)的相对溶菌酶生产率/产率(lsu(f)/ml)。将发酵结束时对照的lsu(f)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图6示出了ptmmd-tl_脂肪酶的质粒图。图7示出了菌株njoc600-2a(对照)和njoc609-1a(类固醇脱氢酶突变体)的相对脂肪酶生产率/产率(lu(lxp)/ml)。将发酵结束时对照的lu(lxp)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图8示出了psmai326的质粒图。图9示出了菌株njoc608-1b(对照)和njoc617-77c(类固醇脱氢酶突变体)的相对黄原胶酶生产率/产率。将发酵结束时对照的黄原胶酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图10示出了ptmmd-mf_溶菌酶的质粒图。图11示出了菌株njoc601-5a(对照)和njoc610-2b(类固醇脱氢酶突变体)的相对m.f.溶菌酶生产率/产率(lsu(a)/ml)。将发酵结束时对照的溶菌酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。图12示出了pihar473的质粒图。图13示出了pat3631的质粒图。图14示出了菌株at3091(对照)和at3944(类固醇脱氢酶突变体)的相对植酸酶生产率/产率。将发酵结束时对照的植酸酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。定义cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mrna。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(如n-末端加工、c-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，rice等人,2000,trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(needleman-wunschalgorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)具体实施方式宿主细胞本发明涉及重组宿主细胞，该宿主细胞包含与一种或多种控制序列可操作地连接的本发明的多核苷酸，该控制序列指导异源目的多肽的产生和分泌。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人在以下文献中所定义：ainsworthandbisby’sdictionaryofthefungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,cabinternational[国际应用生物科学中心],universitypress[大学出版社],cambridge，uk[英国剑桥])。本发明的真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：ep238023,yelton等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及christensen等人,1988,bio/technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由malardier等人,1989,gene[基因]78:147-156和wo96/00787描述。在一个方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。在本发明各方面的优选实施例中，该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。优选地，该分泌的目的多肽是天然的或异源的；优选地，该分泌的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。在本发明的优选实施例中，该天然推定的类固醇脱氢酶包含与seqidno:3、seqidno:6、seqidno:9、和/或seqidno:12所示的成熟氨基酸序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与seqidno:3、seqidno:6、seqidno:9、和/或seqidno:12所示的成熟氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。优选地，该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与seqidno:1、seqidno:4、seqidno:7、和/或seqidno:10所示的基因组dna序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与seqidno:1、seqidno:4、seqidno:7、和/或seqidno:10所示的基因组dna序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。可替代地，该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与seqidno:2、seqidno:5、seqidno:8、和/或seqidno:11所示的cdna序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与seqidno:2、seqidno:5、seqidno:8、和/或seqidno:11所示的cdna序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。在优选实施例中，该天然推定的类固醇脱氢酶通过编码基因的无义或移码突变，通过编码基因的部分或完全缺失，或通过编码基因的沉默被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除。在第二方面，本发明涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺序的以下步骤：a)用编码分泌的目的多肽的多核苷酸构建体转化丝状真菌宿主细胞；以及b)突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该天然推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。核酸构建体本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶(amds)、米曲霉中性α-淀粉酶(例如，amyb)、米曲霉酸稳定性α-淀粉酶(asaa)、米曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶(alpa)、米曲霉磷酸丙糖异构酶(tpia)、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(wo00/56900)、镶片镰孢quinn(wo00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及na2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自米曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区，其增加基因的表达。控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mrna的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。控制序列还可以是编码与多肽的n-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉中性淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。控制序列还可以是编码位于多肽的n-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的n-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的n-末端。还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用米曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶i启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶ii启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adea(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeb(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adea、adeb、amds、hph以及pyrg基因。选择性标记可以是如wo2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。确保位点特异性基因组整合的另一种有效方式是使用frt位点，例如frt-f和frt-f3，将这些frt位点插入每个基因组基因座处，以使用酿酒酵母翻转酶(flp)和frt翻转酶识别序列对表达盒进行位点特异性靶向整合，如描述于wo2012/160093和us2018/0037897中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人,1991,gene[基因]98:61-67；cullen等人,1987,nucleicacidsres.[核酸研究]15:9163-9175；wo00/24883)。可根据wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人,1989,同上)。去除或减少活性本发明还涉及包含如下步骤的方法：突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸或其同源物的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替代、或缺失。在优选方面，多核苷酸的表达被改变、减少或消除。例如，待改变、减少或消除的多核苷酸可以在活性必需的编码区或其一部分中或者在编码区的表达所需的调节元件中被突变或修饰。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活因子。该多核苷酸的修饰或灭活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过对dna序列进行pcr产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(uv)照射、羟胺、n-甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍(mnng)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(ems)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时，诱变一般是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。该多核苷酸或其同源物的修饰或灭活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或可读框的变化或内含子加工。此类修饰或灭活可以根据本领域已知的方法通过定点诱变或pcr产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选的是如下所示例地在体外进行修饰。以下描述了用于缺失或破坏靶向基因的方法，例如：miller等人(1985.mol.cell.biol.[分子细胞生物学]5:1714-1721)；wo90/00192；may,g.(1992.appliedmoleculargeneticsoffilamentousfungi.[丝状真菌的应用分子遗传学]j.r.kinghorn和g.turner,编著,blackieacademicandprofessional[布莱基学术和专业],第1-25页)；以及turner,g.(1994.vectorsforgeneticmanipulation.[用于基因操作的载体]s.d.martinelli和j.r.kinghorn,编著,elsevier[爱思唯尔],第641-665页)。消除或减少多核苷酸的表达的便利方式的实例是基于基因替代、基因缺失、基因编辑或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将与内源多核苷酸对应的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列替代内源多核苷酸。可能希望的是，缺陷多核苷酸还编码可用于选择其中的多核苷酸已被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用选择性标记如本文所述的那些来破坏多核苷酸。本发明还涉及抑制具有活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链rna(dsrna)分子或者在细胞中表达双链rna(dsrna)分子，其中dsrna包含多核苷酸或其同源物的子序列。在优选方面，dsrna长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。该dsrna优选地是小干扰rna(sirna)或微小rna(mirna)。在优选方面，该dsrna是用于抑制转录的小干扰rna。在另一个优选方面，该dsrna是用于抑制翻译的微小rna。本发明还涉及此类双链rna(dsrna)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的seqidno:1和/或seqidno:4和/或seqidno:7和/或seqidno:10的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsrna可以进入细胞并且导致相似的或一致的序列的单链rna(ssrna)(包括内源mrna)的降解。当细胞暴露于dsrna时，来自同源基因的mrna选择性地被称为rna干扰(rnai)的过程所降解；参见例如美国专利号5,190,931。本发明的dsrna可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsrnai来选择性地降解rna的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsrna分子来在细胞、器官或动物中产生功能丧失性突变。用于制备并使用dsrna分子来选择性地降解rna的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824和6,515,109。这些蛋白酶缺陷型突变体细胞作为用于异源分泌的多肽的表达的宿主细胞尤其有用。用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。产生方法宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或提取(参见例如，proteinpurification[蛋白质纯化],janson和ryden编辑,vchpublishers[vch出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。在替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。本发明的一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在有利于产生该分泌的多肽的条件下培养如任一项前述权利要求所述的突变的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地b)回收该分泌的目的多肽。在优选实施例中，该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地，棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。实例丝状真菌菌株里氏木霉btr213描述于wo2013/086633中。里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1是一种ku70被破坏且副胞菌素合成酶(pars)缺失的里氏木霉btr213菌株。该菌株中缺失了纤维二糖水解酶i(cbh1)、纤维二糖水解酶ii(cbh2)、内切葡聚糖酶i(eg1)和木聚糖酶ii(xyn2)基因，并且具有frt位点(frt-f和frt-f3)，将这些frt位点插入这四个基因座的每个处，以使用酿酒酵母翻转酶(flp)和frt翻转酶识别序列frt-f和frt-f3对表达盒进行位点特异性靶向整合，如描述于wo2012/160093和us2018/0037897中。该菌株中还缺失了内切葡聚糖酶ii(eg2)和内切葡聚糖酶iii基因(eg3)。在四个基因座的每个处的frt-f和frt-f3位点之间插入黑曲霉胞嘧啶脱氨酶(fcya)基因，以用作5-氟胞嘧啶(5-fc)的反选择。培养基和溶液cove板由以下构成：342.30g蔗糖、25gdifcotm纯净琼脂、20mlcove盐溶液、10mm乙酰胺、15mm氯化铯、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。cove2板由以下构成：30g蔗糖、20mlcove盐溶液、10ml1m乙酰胺、25gdifcotm纯净琼脂、以及补足至1升的去离子。通过高压灭菌来为溶液灭菌。含有5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司(sigmachemicalco.))的cove2葡萄糖板由以下构成：20mlcove盐溶液、10ml1m乙酰胺、25gdifcotm纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。高压灭菌后，添加40ml50％(w/v)葡萄糖(无菌)。将溶液冷却至50℃，并且添加5-fc至终浓度为75μg/ml。cove盐溶液由以下构成：26gkcl、26gmgso4·7h2o、76gkh2po4、50mlcove痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。cove痕量金属溶液由以下构成：0.04gna2b4o7·10h2o、0.4gcuso4·5h2o、1.2gfeso4·7h2o、0.7gmnso4·h2o、0.8gna2moo2·2h2o、10gznso4·7h2o、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。发酵分批培养基(fermentationbatchmedium)由以下构成：24g右旋糖、40g大豆粉、8g(nh4)2so4、3gk2hpo4、8gk2so4、3gcaco3、8gmgso4·7h2o、1g柠檬酸、8.8ml85％磷酸、1ml消泡剂、14.7ml痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水。pda板由39gdifcotm马铃薯右旋糖琼脂和补足至1升的去离子水构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。pda+1m蔗糖板由以下构成：39gdifcotm马铃薯右旋糖琼脂、342.30g蔗糖、和补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。peg缓冲液由去离子水中的50％聚乙二醇(peg)4000、10mmtris-hcl(ph7.5)和10mmcacl2构成。将溶液过滤灭菌。样品缓冲液(ph7.5)由0.1mtris-hcl、0.1mnacl和0.01％tritonx-100构成。将溶液过滤灭菌。摇瓶培养基由以下构成：20g甘油、10g大豆粉、1.5g(nh4)2so4、2gkh2po4、0.2gcacl2、0.4gmgso4·7h2o、0.2ml痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水。1.2m山梨醇由218.4g山梨醇和补足至1升的去离子水构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。stc由去离子水中的1m山梨醇、10mmtris-hcl(ph7.5)和50mmcacl2构成。将溶液过滤灭菌。tbe缓冲液由以下构成：10.8gtris碱、5g硼酸、4ml0.5medta(ph8)、以及补足至1升的去离子水。te缓冲液由1mtris-hcl(ph8.0)和0.5medta(ph8.0)构成。痕量金属溶液由以下构成：26.1gfeso4·7h2o、5.5gznso4·7h2o、6.6gmnso4·h2o、2.6gcuso4·5h2o、2g柠檬酸、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。含有1.5μm5-氟-2’-脱氧尿苷(fdu)的木霉属基本培养基(trmm)板由以下构成：20mlcove盐溶液、0.6gcacl2.2h2o、6g(nh4)2so4、25gdifcotm纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。高压灭菌后，添加40ml50％(w/v)无菌葡萄糖。将培养基冷却至50℃，并且添加fdu(无菌)至终浓度为1.5μm。2xyt+amp板由以下构成：16gbactotm胰蛋白胨、10gbactotm酵母提取物、5gnacl、15gbactotm琼脂、1ml100mg/ml的氨苄青霉素(过滤灭菌，在高压灭菌后添加)、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为溶液灭菌。yp培养基由去离子水中的1％bactotm酵母提取物和2％bactotm蛋白胨构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。ypd培养基由1％bactotm酵母提取物、2％bactotm蛋白胨和2％葡萄糖构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。发酵补料培养基由1190g葡萄糖、14.2ml85％h3po4和486gh2o构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。实例1：从里氏木霉提取的基因组dna使里氏木霉在250ml带挡板的摇瓶中的50mlypd培养基中在28℃下伴随200rpm搅拌生长2天。使用衬有(emd化学品公司(emdchemicalsinc.))的漏斗收集来自培养物的菌丝体，挤压干燥，然后转移至预冷的研钵和研杵中。将每个菌丝体制剂磨成细粉，并且用液氮保持冷冻。将共1-2g的粉末转移到50ml管中，并且使用植物maxi试剂盒(凯杰公司(qiageninc.))从研磨的菌丝体粉末中提取基因组dna。将预热至65℃的5ml缓冲液ap1(凯杰公司)添加到50ml管中，随后添加10μl的rna酶a100mg/ml储备溶液(凯杰公司)，并且在65℃下孵育2-3小时。添加共1.8ml的ap2缓冲液(凯杰公司)，并以3000-5000xg离心5分钟。将上清液倾析到置于50ml收集管中的qiashredder大核酸纯化柱(凯杰公司)中，并且在室温(15℃-25℃)下在甩平式转子中以3000-5000xg离心5分钟。将收集管中的流过液体转移到新50ml管中，同时不干扰沉淀。将1.5ml体积的缓冲液ap3/e(凯杰公司)添加到澄清的裂解液中，并且通过涡旋振荡立即混合。将包括可能形成的任何沉淀的样品(最多15ml)吸移到置于50ml收集管中的大核酸纯化柱(凯杰公司)中，并且在室温(15℃-25℃)下在甩平式转子中以3000-5000xg离心5分钟。弃去流过液体。将12ml的缓冲液aw(凯杰公司)添加到大核酸纯化柱中，并以3000-5000xg离心10分钟，以干燥该膜。弃去流过液体和收集管。将大核酸纯化柱转移到新50ml管中。将预热至65℃的0.5ml缓冲液ae(凯杰公司)直接吸移到大核酸纯化柱膜中，在室温(15℃-25℃)下孵育5分钟，然后以3000-5000xg离心5分钟以洗脱基因组dna。基因组dna的浓度和纯度通过在260nm和280nm处测量吸光度来确定。实例2：里氏木霉原生质体的产生与转化使用与penttila等人,1987,gene[基因]61:155-164类似的方案进行里氏木霉的原生质体制备与转化。简而言之，将里氏木霉在各自含有25mlypd培养基的两个摇瓶中在27℃下伴随90rpm的轻轻搅拌培养17小时。将菌丝体通过使用真空驱动一次性过滤系统(密理博公司(millipore))过滤来收集，并且用去离子水洗涤两次并用1.2m山梨醇洗涤两次。通过在34℃下伴随75-90rpm的轻轻振荡使洗涤的菌丝体悬浮于30ml含有5mg/ml的yatalasetm(美国宝生物工程株式会社(takarabiousa,inc.))和0.5mg/ml的壳多糖酶(西格玛化工有限公司)的1.2m山梨醇中60-75分钟来产生原生质体。将原生质体通过以834xg离心6分钟来收集，并且用冷的1.2m山梨醇洗涤两次。使用血细胞计数器对原生质体计数，并且使其重新悬浮至终浓度为1x108个原生质体/ml的stc。将大约1-10μg的dna添加至100μl的原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。对于含有潮霉素b抗性标记(hph)的dna，将内容物铺板在pda+1m蔗糖板上，并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由pda+潮霉素b组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素b，并且将板在30℃下孵育5-7天。实例3：用于修饰编码推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因(seqidno:1)的质粒(pnjoc577；seqidno:13)的构建通过使用hifidna组装克隆试剂盒(newengland公司(newenglandinc.))将5'靶向区域、hph(潮霉素磷酸转移酶)和tk(hsv-1胸苷激酶)盒、待用于切离该hph和tk盒的重复序列、以及3'靶向区域克隆至puc19(用hindiii和saci线性化)中来构建质粒，该质粒通过在编码推定的类固醇脱氢酶结构域的区域中引入导致大量连续氨基酸的截短或内部缺失的突变来修饰由tra1331w(seqidno:1)编码的蛋白质。使用如下引物组对5'靶向区域、hph和tk盒、用于切离该hph和tk盒的重复序列、以及3'靶向区域进行pcr扩增：onj587(seqidno:19)+onj605(seqidno:20)、onj610(seqidno:25)+onj611(seqidno:26)、onj606(seqidno:21)+onj607(seqidno:22)、以及onj608(seqidno:23)+onj609(seqidno:24)。使用热启动iidna聚合酶(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))根据制造商的说明书进行扩增反应。pcr由以下构成：5ngpjfys1579-41-11(wo2010/039840)(用于hph/tk盒的模板)或50ngbtr213基因组dna(wo2013/086633)作为模板、1xhf缓冲液、200μm的各dntp、500nm正向引物、500nm反向引物、1单位的热启动iidna聚合酶，并且添加无菌h2o至终体积为50μl。将反应在编程如下的bio-radc1000touchtm热循环仪(伯乐实验室公司(bio-radlaboratories))中孵育：1个循环，在98℃下持续3分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒，65℃下持续30秒，并且72℃下持续30秒(重复片段)或2.5分钟；以及一个循环，在72℃下持续5分钟。热循环后，pcr产物通过tbe缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳分离，并且从凝胶上切离与不同pcr产物相对应的条带(2354bp、4395bp、322bp和1986bp)并根据制造商的说明书使用凝胶和pcr清理试剂盒(马歇雷-纳格尔公司(macherey-nagel))进行纯化。将puc19在50μl反应中用hindiii和saci消化，该反应由以下构成：5μgpuc19、20单位的各hindiii-hf(newengland公司(newenglandinc.))和saci-hf(newengland公司)、1x缓冲液(newengland公司)、以及无菌h2o至终体积为50μl。将反应在37℃下孵育，然后在tbe缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳。从凝胶上切离2645bppuc19hindiii/saci片段，并根据制造商的说明书使用凝胶和pcr清理试剂盒(马歇雷-纳格尔公司)进行纯化。使用总体积为30μl的hifidna组装主混合物试剂盒(新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabs))将pcr产物和puc19hindiii/saci片段融合在一起，该试剂盒由1xhifi组装主混合物和0.04pmol的各pcr产物构成。将反应在50℃下孵育45分钟，然后置于冰上。根据制造商的说明书，将1μl反应物用于转化60μlstellartm感受态细胞(克隆技术实验室公司(clontechlaboratories,inc.))。将转化反应物铺板在两个2xyt+amp板上，并且在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用qiaprep质粒小提试剂盒(凯杰公司)从每种中制备质粒dna，并且针对用pvuii消化的片段的适当插入进行筛选。在限制性酶消化后，使用产生预期带型(4991bp、3362bp、2364bp、439bp和370bp)的质粒dna来创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司(illuminainc.))上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块(trimreadsmodule)修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至pnjoc577质粒(seqidno:13)的模型。基本变体检测模块(basicvariantdetectionmodule)用于检测任何单核苷酸多态性的存在。将具有预期核苷酸序列的质粒命名为pnjoc577(图1)。实例4：由tra1331w编码的蛋白质修饰的里氏木霉菌株(njoc586)的构建如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将来自pnjoc577的大约2-4μg线性化tra1331w修饰盒(8871bppmei片段)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在pda+1m蔗糖板上并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由pda+潮霉素b组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素b，并且将板在30℃下孵育5-7天。接下来，将潮霉素抗性转化体转移至pda板上并在30℃下孵育5-7天。通过孢子pcr筛选转化体以正确整合tra1331修饰盒。对于每个转化体，用1μl无菌接种环收集孢子，并且将其悬浮于薄壁pcr管中的20μl稀释缓冲液(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司(thermoscientific))中。将每种孢子悬浮液用作pcr反应中的模板，以筛选tra1331w基因座处tra1331w修饰盒的整合。对各转化体进行两次pcr；一次用于整合5'位点，而另一次用于整合3'位点。使用退火至整合位点上游区域的引物和退火至hph和tk盒内区域的引物进行5'整合筛选。使用退火至整合位点下游区域的引物和退火至hph和tk盒内区域的引物进行3'整合筛选。每种pcr反应由以下构成：1μl孢子悬浮液、10pmol的各引物、10μl2xphiretm植物pcr缓冲液(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司)、0.4μlphiretm热启动iidna聚合酶(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司)、以及h2o至终体积为20μl。根据制造商的说明书进行热循环。使用tbe缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物。然后将产生所需pcr产物的转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至新pda板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。重复上述5’和3’整合验证pcr，并且使用tbe缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物。tra1331w修饰构建体pnjoc577含有侧接直接重复序列的hph和hsv-1tk盒，以促进hph和hsv-1tk盒的自发环，并通过两个重复序列之间的同源重组产生干净的tra1331w修饰。将来自具有正确整合的tra1331w修饰盒的转化体的孢子收集在h2o中，并且将稀释液铺板在含有1.5μm5-氟-2’-脱氧尿苷(fdu)的trmm板上，并在30℃下孵育5天，以便于鉴别已丢失hph和hsv-1tk盒的分离株。然后将fdu抗性分离株转移至pda板上，并通过孢子pcr验证hph和hsv-1tk盒的丢失。在该孢子pcr中，添加了三种引物；一种引物退火至hph和tk盒的上游区域，一种引物退火至3'整合位点之外的区域，而另一种引物退火至hph和tk盒内的区域。将引物设计成产生短的或长的pcr产物，这取决于hph和tk盒是否仍然存在。然后将已丢失hph和tk盒的转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至新pda板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认tra1331w基因中所需突变的存在，如实例2所述制备几个分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至tra1331w基因(seqidno:1)的模型。使用基本变体检测模块验证了所需突变的存在。将含有所需突变的分离株之一命名为njoc586，并保存用于进一步研究。实例5：用pnjoc383转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的pnjoc383(质粒，其含有嗜碱枝顶孢(acremoniumalcalophilum)cbs114.92溶菌酶表达盒，该表达盒侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:14和图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc587，并保存用于进一步研究。实例6：用pnjoc383转化里氏木霉tra1331w改良菌株(njoc586)如实例2所述产生里氏木霉njoc586原生质体。将大约1-10μg的pnjoc383(seqidno:14；图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc588，并保存用于进一步研究。实例7：溶菌酶活性测定(lsu(f)/ml)将来自发酵的全培养液在30℃下在旋转混合器(rotisseriemixer)中混合约2小时。在全培养液混合后，将所有样品在预稀释缓冲液中稀释100倍，然后使用旋转混合器再次混合约2小时。接下来，将100倍预稀释样品在0.1mtris-hcl、0.1mnacl、0.01％tritonx-100缓冲液ph7.5(样品缓冲液)中通过10倍系列稀释而稀释10000倍，随后是3倍系列稀释直至稀释样品的1/9。该方法与贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)的biomekfx和来自分子仪器公司(moleculardevices)的spectramax板读数仪联合使用。在样品缓冲液中，以0.05lsu(f)/ml浓度稀释溶菌酶标准品，并以0.002lsu(f)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共50μl转移至96孔平底板中。向各孔中添加50μl的25ug/ml荧光素缀合的细胞壁底物溶液，然后在环境温度下孵育45分钟。孵育期间，以15分钟的间隔监测96孔板在485nm(激发)/528nm(发射)处的反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。实例8：实验室规模发酵表明，由tra1331w编码的蛋白质的修饰导致溶菌酶生产率/产率的增加在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株njoc587和njoc588。使各菌株在30℃在两个pda板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司(applikonbiotechnology))。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用applikon1030控制系统将ph控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至14g/l/小时的速率给予大约7天的时间段。在第5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性测定。如实例7中所述测定溶菌酶表达水平。与njoc587相比，在njoc588菌株中观察到溶菌酶表达增加，表明所述编码天然推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的修饰有利于溶菌酶表达。实例9：tra1331w编码蛋白质(seqidno:3)的同源物的鉴别使用由tra1331w编码的蛋白质的氨基酸序列(seqidno:3)进行由黑曲霉、米曲霉和镶片镰孢基因组中的基因编码的蛋白质的同源物的blast搜索(e值：1.00e-5，字号：5)。获得了每种生物体的单个blast命中，并在表1中呈现：表1.在黑曲霉、米曲霉和镶片镰孢中鉴别的由tra1331w编码的蛋白质的同源物。seqidno:生物体6黑曲霉9米曲霉12镶片镰孢使用如上所述的尼德曼-翁施算法计算不同蛋白质之间的同一性百分比。两种蛋白质之间的同一性总结于表2中。表2.氨基酸％-同一性矩阵。将同一性表示为使用如本文别处描述的尼德曼-翁施算法计算的同一性百分比。根据表2，这些蛋白质具有显著的序列同一性，范围从大约39％至70％同一性(在更密切相关的黑曲霉和米曲霉蛋白质之间并未意外观察到最高同一性百分比)。为了进一步研究蛋白质之间的相关性，使用muscle算法版本3.8.31和默认参数来比对蛋白质(edgar,r.c.(2004).nucleicacidsresearch[核酸研究],32(5),1792-1797)。这一多重序列比对的结果示于图3中。如图3所示，这些蛋白质具有显著的氨基酸序列同一性，其中示出了高度保守氨基酸基序的几个延伸/区块，例如ygar和/或vphs[w/y]f和/或qc[a/v/s]rrl和/或lkkytlp和/或cphyt基序。总之，结果表明推定的酶可能在不同真菌宿主中发挥相似的功能。实例10：用于缺失编码推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因(seqidno:1)的质粒(pnjoc569；seqidno:27)的构建通过使用hifidna组装克隆试剂盒(newengland公司)将5'靶向区域、hph(潮霉素磷酸转移酶)和tk(hsv-1胸苷激酶)盒、待用于切离该hph和tk盒的重复序列、以及3'靶向区域克隆至puc19(用hindiii和saci线性化)中来构建质粒，该质粒用于缺失由tra1331w(seqidno:1)编码的整个蛋白质。使用如下引物组对5'靶向区域、hph和tk盒、用于切离该hph和tk盒的重复序列、以及3'靶向区域进行pcr扩增：onj587(seqidno:19)+onj588(seqidno:28)、onj595(seqidno:29)+onj596(seqidno:30)、onj592(seqidno:31)+onj593(seqidno:32)、以及onj589(seqidno:33)+onj590(seqidno:34)。使用热启动iidna聚合酶(赛默飞世尔科技公司)根据制造商的说明书进行扩增反应。pcr由以下构成：5ngpjfys1579-41-11(wo2010/039840)(用于hph/tk盒的模板)或50ngbtr213基因组dna(wo2013/086633)作为模板、1xhf缓冲液、200μm的各dntp、500nm正向引物、500nm反向引物、1单位的热启动iidna聚合酶，并且添加无菌h2o至终体积为50μl。将反应在编程如下的bio-radc1000touchtm热循环仪(伯乐实验室公司)中孵育：1个循环，在98℃下持续3分钟；35个循环，各在98℃下持续10秒，65℃下持续30秒，并且72℃下持续30秒(重复片段)或2.5分钟；以及一个循环，在72℃下持续5分钟。热循环后，pcr产物通过tbe缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳分离，并且从凝胶上切离与不同pcr产物相对应的条带(1587bp、4405bp、354bp和1571bp)并根据制造商的说明书使用凝胶和pcr清理试剂盒(马歇雷-纳格尔公司)进行纯化。将puc19在50μl反应中用hindiii和saci消化，该反应由以下构成：5μgpuc19、20单位的各hindiii-hf(newengland公司)和saci-hf(newengland公司)、1x缓冲液(newengland公司)、以及无菌h2o至终体积为50μl。将反应在37℃下孵育，然后在tbe缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳。从凝胶上切离2645bppuc19hindiii/saci片段，并根据制造商的说明书使用凝胶和pcr清理试剂盒(马歇雷-纳格尔公司)进行纯化。使用总体积为30μl的hifidna组装主混合物试剂盒(新英格兰生物实验室公司)将pcr产物和puc19hindiii/saci片段融合在一起，该试剂盒由1xhifi组装主混合物和0.04pmol的各pcr产物构成。将反应在50℃下孵育45分钟，然后置于冰上。根据制造商的说明书，将1μl反应物用于转化60μlstellartm感受态细胞(克隆技术实验室公司)。将转化反应物铺板在两个2xyt+amp板上，并且在37℃下孵育过夜。将推定的转化体菌落从选择板中分离，并且使用qiaprep质粒小提试剂盒(凯杰公司)从每种中制备质粒dna，并且针对用pvuii消化的片段的适当插入进行筛选。在限制性酶消化后，使用产生预期带型(4224bp、3117bp、2364bp、370bp、296bp)的质粒dna来创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至pnjoc569质粒(seqidno:27)的模型。基本变体检测模块用于检测任何单核苷酸多态性的存在。将具有预期核苷酸序列的质粒命名为pnjoc569(图4)。实例11：缺失编码推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的里氏木霉菌株(njoc584-5d8a)的构建如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将来自pnjoc569的大约2-4μg线性化tra1331w缺失盒(7716bppmei片段)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在pda+1m蔗糖板上并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由pda+潮霉素b组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素b，并且将板在30℃下孵育5-7天。接下来，将潮霉素抗性转化体转移至pda板上并在30℃下孵育5-7天。通过孢子pcr筛选转化体以正确整合tra1331缺失盒。对于每个转化体，用1μl无菌接种环收集孢子，并且将其悬浮于薄壁pcr管中的20μl稀释缓冲液(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司)中。将每种孢子悬浮液用作pcr反应中的模板，以筛选tra1331w基因座处tra1331w缺失盒的整合。对各转化体进行两次pcr；一次用于整合5'位点，而另一次用于整合3'位点。使用退火至整合位点上游区域的引物(onj632，seqidno:35)和退火至hph和tk盒内区域的引物(agjg685，seqidno:36)进行5'整合筛选。使用退火至整合位点下游区域的引物(onj633，seqidno:37)和退火至hph和tk盒内区域的引物(agjg604，seqidno:38)进行3'整合筛选。每种pcr反应由以下构成：1μl孢子悬浮液、10pmol的各引物、10μl2xphiretm植物pcr缓冲液(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司)、0.4μlphiretm热启动iidna聚合酶(phiretm植物直接pcr试剂盒，赛默科技公司)、以及h2o至终体积为20μl。根据制造商的说明书进行热循环。使用tbe缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物。然后将产生所需pcr产物的转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至新pda板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。重复上述5’和3’整合验证pcr，并且使用tbe缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物。来自pnjoc569的tra1331w缺失构建体含有侧接直接重复序列的hph和hsv-1tk盒，以促进hph和hsv-1tk盒的自发环，并通过两个重复序列之间的同源重组产生干净的tra1331w缺失。将来自具有正确整合的tra1331w修饰盒的转化体的孢子收集在h2o中，并且将稀释液铺板在含有1.5μm5-氟-2’-脱氧尿苷(fdu)的trmm板上，并在30℃下孵育5天，以便于鉴别已丢失hph和hsv-1tk盒的分离株。然后将fdu抗性分离株转移至pda板上，并通过孢子pcr验证hph和hsv-1tk盒的丢失。在该孢子pcr中，添加了三种引物；一种引物退火至hph和tk盒的上游区域，一种引物退火至3'整合位点之外的区域，而另一种引物退火至hph和tk盒内的区域。将引物设计成产生短的或长的pcr产物，这取决于hph和tk盒是否仍然存在。然后将已丢失hph和tk盒的转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至新pda板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认tra1331w基因的所需缺失的存在，如实例2所述制备几个分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至tra1331w基因(seqidno:1)的模型。在插入缺失和结构变体(indelsandstructuralvariants)模块中验证了所需缺失的存在。将含有所需缺失的分离株之一命名为njoc584-5d8a，并保存用于进一步研究。实例12：用pnjoc383转化里氏木霉菌株njoc584-5d8a如实例2所述产生里氏木霉njoc584-5d8a原生质体。将大约1-10μg的pnjoc383(seqidno:14和图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc618-81d，并保存用于进一步研究。实例13：实验室规模发酵表明，由tra1331w编码的蛋白质的缺失也导致溶菌酶生产率/产率的增加在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株njoc587(对照)和njoc618-81d。使各菌株在30℃在两个pda板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用applikon1030控制系统将ph控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至14g/l/小时的速率给予大约7天的时间段。在第5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性测定。如实例7中所述测定溶菌酶表达水平。在所有测定时间点，与njoc587(图5)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株njoc618-81d中观察到溶菌酶表达增加。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的灭活有利于溶菌酶表达。实例14：用ptmmd-tl_脂肪酶转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的ptmmd-tl_脂肪酶(疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)hl703脂肪酶变体表达盒，其侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:39和图6)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc600-2a，并保存用于进一步研究。实例15：用ptmmd-tl_脂肪酶转化里氏木霉菌株njoc586如实例2所述产生里氏木霉njoc586原生质体。将大约1-10μg的ptmmd-tl_脂肪酶(疏棉状嗜热丝孢菌hl703脂肪酶变体表达盒，其侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:39和图6)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc609-1a，并保存用于进一步研究。实例16：脂肪酶lu(lxp)/ml活性测定该方法与贝克曼库尔特公司的biomekfx和来自分子仪器公司的spectramax板读数仪联合使用。在0.05mmops(3-(n-吗啉代)丙磺酸)、10mmcacl2、0.01％tritonx-100缓冲液ph7.5(样品缓冲液)中适当稀释培养物上清液，随后将稀释样品从0倍系列稀释至1/3倍至1/9倍。在样品缓冲液中，以4.0lu(lxp)/ml浓度稀释lipex标准品，并以0.197lu(lxp)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共20μl转移至96孔平底板中。将200μl的pnp-棕榈酸酯底物溶液(pnpp储备液为9.99％etoh中的7.8mmpnp-棕榈酸酯-工作溶液为：每升-500ml0.1mmopsph7.5，20mlpnpp储备液，100ml10％tritonx-100，14.7ml680mmcacl2，以及用h2o补足至一定体积)溶液添加至各孔中，然后在环境温度下孵育30分钟。孵育期间，经20分钟的时间段测量96孔板在光密度为405nm处的反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。实例17：实验室规模发酵表明，由tra1331w编码的蛋白质的缺失也导致脂肪酶生产率/产率的增加在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株njoc600-2a(对照)和njoc609-1a。使各菌株在30℃在两个pda板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用applikon1030控制系统将ph控制在4.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/l/小时的速率给予大约五天的时间段。在第2、3、4和5天收集样品(上清液)，并在5℃下储存，直至对其进行处理用于脂肪酶活性测定。如实例16中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与njoc600-2a对照(图7)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株njoc609-1a中观察到脂肪酶表达增加(改善范围为45％-132％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的灭活有利于脂肪酶表达。实例18：用psmai326转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的psmai326(质粒，其含有类芽孢杆菌属物种(paenibacillussp.)黄原胶酶变体表达盒，该表达盒侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:40和图8)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc608-1b，并保存用于进一步研究。实例19：用psmai326转化里氏木霉菌株njoc586如实例2所述产生里氏木霉njoc586原生质体。将大约1-10μg的psmai326(质粒，其含有类芽孢杆菌属物种黄原胶酶变体表达盒，该表达盒侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:40和图8)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc617-77c，并保存用于进一步研究。实例20：黄原胶酶xgu(a)活性测定在thermoarena30分析仪上运行该方法。用0.1maces(n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、0.056mnaoh、4mmcacl22h2o、0.025％l23ph7缓冲液(稀释缓冲液)适当稀释样品。使用稀释缓冲液对黄原胶酶标准品进行稀释，以制备7点曲线。将20μl的各样品和标准品添加至125μl0.1maces、0.056mnaoh(测定缓冲液)和50μl底物(0.1％(w/v)改性黄原胶、0.48％(v/v)乙醇、0.1maces、0.06mnaoh)中，并在50℃下孵育1200秒。向各反应中添加100μl的终止剂(50g/l酒石酸钾钠、20g/lpahbah(4-羟基苯甲酰肼)、5.52g/l乙酸铋(iii)、0.5mnaoh)，并在50℃下孵育1200秒。在405nm处进行终点测量。通过从生成的标准曲线外推来确定样品活性。实例21：实验室规模发酵表明，由tra1331w编码的蛋白质的缺失也导致黄原胶酶生产率/产率的增加在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株njoc608-1b(对照)和njoc617-77c。使各菌株在30℃在两个pda板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用applikon1030控制系统将ph控制在4.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/l/小时的速率给予大约七天的时间段。在第2-7天收集样品(上清液)，并在5℃下储存，直至对其进行处理用于黄原胶酶活性测定。如实例20中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与njoc608-1b对照(图9)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株njoc617-77c中观察到黄原胶酶表达增加(改善7％-28％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的灭活有利于黄原胶酶表达。实例22：用ptmmd-mf_溶菌酶转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的ptmmd-mf_溶菌酶(质粒，其含有弗格斯毁丝霉(myceliophthorafergusii)溶菌酶表达盒，该表达盒侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:41和图10)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc601-5a，并保存用于进一步研究。实例23：用ptmmd-mf_溶菌酶转化里氏木霉菌株njoc586如实例2所述产生里氏木霉njoc586原生质体。将大约1-10μg的ptmmd-mf_溶菌酶(质粒，其含有弗格斯毁丝霉溶菌酶表达盒，该表达盒侧接frt-f和frt-f3位点，用于在宿主菌株中含有frt-f和frt-f3位点的四个基因座处进行flp介导的整合；seqidno:41和图10)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加peg缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加stc(1ml)，并且将内容物铺板在cove板上进行amds选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个cove板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml5-氟胞嘧啶(5-fc)(西格玛化工有限公司)的cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-fc的cove2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-fc的新cove2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在pda+1m蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至cove2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pnjoc383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组dna，并将其用于创建配对末端测序文库，并在nextseqtm500系统(依诺米那公司)上使用2x150bp化学法进行测序。用clcgenomicsworkbench11.0.1版(凯杰公司)进行序列分析。使用修剪读段模块修剪读段。使用具有高严格度设置的将读段映射至参考值模块将读段映射至cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座(seqidno:15-18)的模型。将具有在所有四个位点处正确整合的分离株之一命名为njoc610-2b，并保存用于进一步研究。实例24：溶菌酶lsu(a)活性测定该方法与贝克曼库尔特公司的biomekfx和来自分子仪器公司的spectramax板读数仪联合使用。在0.1m乙酸盐、50mmnacl、0.01％tritonx-100缓冲液ph4.5(样品缓冲液)中适当稀释全培养液样品，随后将稀释样品从0倍系列稀释至1/3倍至1/9倍。在样品缓冲液中，以50lsu(a)/ml浓度稀释溶菌酶标准品，并以2.469lsu(a)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共20μl转移至96孔平底板中。向各孔中添加200μl0.26g/l溶壁微球菌(micrococcuslysodeikticus)底物溶液，然后在环境温度下孵育75分钟。孵育完成后，获得96孔板在450nm处的光密度。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。实例25：实验室规模发酵表明，由tra1331w编码的蛋白质的缺失也导致m.f.溶菌酶生产率/产率的增加在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株njoc601-5a(对照)和njoc610-2b。使各菌株在30℃在两个pda板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自pda板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用applikon1030控制系统将ph控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5l/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/l/小时的速率给予大约七天的时间段。在第4、5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性(lsu(a))测定。如实例24中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与njoc601-5a对照(图11)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株njoc610-2b中观察到m.f.溶菌酶表达增加(改善6％-47％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的tra1331w基因的灭活有利于m.f.溶菌酶表达。实例(黑曲霉)材料与方法除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行dna操作和转化：sambrook等人(1989)molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],coldspringharborlab.[冷泉港实验室],coldspringharbor[冷泉港],纽约州；ausubel,f.m.等人(编辑)"currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南]",johnwileyandsons(约翰威立父子公司),1995；harwood,c.r.,和cutting,s.m.(编辑)"molecularbiologicalmethodsforbacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方法]".johnwileyandsons(约翰威立父子公司),1990。购买的材料(大肠杆菌和试剂盒)使用大肠杆菌dh5α(东洋公司(toyobo))用于质粒构建和扩增。使用qiagenplasmid试剂盒(凯杰公司)来回收扩增的质粒。使用dna连接试剂盒(宝生物公司(takara))或t4dna连接酶(宝灵曼公司(boehringermannheim))来进行连接。使用扩展(expand)tmpcr系统(宝灵曼公司)来进行聚合酶链式反应(pcr)。qiaquicktm凝胶提取试剂盒(凯杰公司)被用于纯化pcr片段并从琼脂糖凝胶中提取dna片段。酶用于dna操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可获得自新英格兰生物实验室公司)，并且根据制造商的说明书使用。质粒pbluescriptiisk-(斯特拉塔吉恩(stratagene)#212206)。由构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pgpd)和构巢曲霉色氨酸合酶终止子(ttrpc)驱使的包含构巢曲霉pyrg基因和单纯性疱疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的phuda801(wo2012/160093)的衍生物phuda963描述于wo2012/160093的实例4中。包含嗜碱枝顶孢溶菌酶(aa溶菌酶)基因的pjal1470描述于wo2015144936a1中。微生物菌株在wo2012/160093的实例14中描述，表达宿主菌株黑曲霉c5553和m1816(c5553的pyrg-表型/尿苷营养缺陷型)由诺维信公司(novozymes)分离并为从土壤分离的黑曲霉nn049184的衍生物。对c5553和m1816进行了基因修饰，以破坏淀粉糖苷酶活性的表达。培养基cove痕量金属溶液由以下构成：0.04gnab4o7·10h2o、0.4gcuso4·5h2o、1.2gfeso4·7h2o、0.7gmnso4·h2o、0.8gna2moo2·2h20、10gznso4·7h2o、以及补足至1升的去离子水。50xcove盐溶液由以下构成：26gkcl、26gmgso4·7h2o、76gkh2po4、50mlcove痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水。cove培养基由以下构成：342.3g蔗糖、20ml50xcove盐溶液、10ml1m乙酰胺、10ml1.5mcscl2、25g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。cove-n-gly板由以下构成：218g山梨醇、10g甘油、2.02gkno3、50mlcove盐溶液、25g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。cove-n(tf)由以下构成：342.3g蔗糖、3gnano3、20mlcove盐溶液、30g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。cove-n顶层琼脂糖由以下构成：342.3g蔗糖、3gnano3、20mlcove盐溶液、10g低熔点琼脂糖、以及补足至1升的去离子水。cove-n由以下构成：30g蔗糖、3gnano3、20mlcove盐溶液、30g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。stc缓冲液由以下构成：0.8m山梨醇、25mmtrisph8、以及25mmcacl2。stpc缓冲液由以下构成：在stc缓冲液中的40％peg4000。lb培养基由以下构成：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、以及补足至1升的去离子水。lb加氨比西林板由以下构成：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g细菌培养用琼脂、以100μg/ml的氨比西林、以及补足至1升的去离子水。ypg培养基由以下构成：10g酵母提取物、20g细菌培养用蛋白胨、20g葡萄糖、以及补足至1升的去离子水。soc培养基由以下构成：20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、0.5gnacl、10ml250mmkcl、以及补足至1升的去离子水。tae缓冲液由以下构成：4.84gtris碱、1.14ml冰乙酸、2ml0.5medtaph8.0、以及补足至1升的去离子水。曲霉属的转化曲霉属物种的转化可以使用用于酵母转化的一般方法实现。以下描述了用于本发明的优选程序。将黑曲霉宿主菌株接种至100ml的补充有10mm尿苷的ypg培养基上，并且在32℃以80rpm孵育16小时。将球粒进行收集并且用0.6mkcl洗涤，并且将其重新悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(glucanextm，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml0.6mkcl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体，然后用stc缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x107个原生质体/ml。将大约4μg的质粒dna添加至100μl原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加1ml的sptc，并且将原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加10ml的50℃cove或cove-n顶层琼脂糖之后，将反应倾倒于cove或cove-n(tf)琼脂板上，并且将板于30℃孵育5天。实例1中的pcr扩增3步循环：1.预变性：94℃，2min。2.变性：94℃，15sec。3.退火：tm-[5-10]℃*，30sec。4.扩展：68℃，1min./kb5.重复步骤#2-4，共进行35个循环。用于aa溶菌酶产生的实验室规模罐培养按补料分批发酵进行发酵(h.pedersen2000,applmicrobiolbiotechnol[应用微生物学与生物技术],53:272-277)。将所选择菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移到罐中用于酶产生的进一步培养。在ph4.75下在34℃下培养8天，用葡萄糖和铵进行给料而不过度给予(其阻止酶产生)。使用培养液进行酶测定。序列seqidno:4：黑曲霉类固醇脱氢酶基因组dna序列seqidno:5：黑曲霉类固醇脱氢酶编码序列(或cdna)seqidno:6：黑曲霉类固醇脱氢酶氨基酸序列实例26：在黑曲霉中的类固醇脱氢酶基因的破坏类固醇脱氢酶基因破坏质粒pihar473的构建构建质粒pihar473以包含黑曲霉类固醇脱氢酶基因的5’和3’侧翼区，这两个侧翼区通过与其终止子重复序列一起的作为选择性标记的构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrg)，和人单纯疱疹病毒1(hsv-1)胸苷激酶基因分离。该hsv-1胸苷激酶基因位于类固醇脱氢酶基因的3’侧翼区的3’端，允许没有正确地靶向类固醇脱氢酶基因座的黑曲霉转化体的反向选择。以如下所述的几个步骤构建质粒。使用以下引物产生包含黑曲霉类固醇脱氢酶的3’侧翼区的pcr产物：seqidno:42：引物ih1232-3'sted-f：5'-aactctctcctctagattatgtagcatgagaccagcgggga-3'seqidno:43：引物ih1233-3'sted-r：5'-acaggagaattcttaattaaagtccggggtggggagttttcaggc-3'如材料与方法中所述，在由大约100ng的黑曲霉nn049184的基因组dna构成的反应中通过pcr扩增所需片段。将反应在编程如下的c1000touchtm热循环仪中孵育：1个循环，在94℃下持续2分钟；35个循环，各在94℃下持续15秒，55℃下持续30秒，并且68℃下持续2分钟；以及在4℃保持。将生成的1,500bppcr片段通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将质粒phuda963用xbai和paci(新英格兰生物实验室公司)消化，并且通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中将8,153bp片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。根据制造商的说明书，通过使用in-fusion试剂盒(克罗泰克实验有限公司(clontechlaboratories,inc.))将8,153bp片段连接到1,500bppcr片段上。将1μl反应混合物转化到dh5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体铺板在lb加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用qia小量制备试剂盒，将质粒dna从几个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒dna。将一种质粒命名为pihar473-3’sted。使用以下引物产生包含黑曲霉类固醇脱氢酶的5’侧翼区的pcr产物：seqidno:44：引物ih1230-5'sted-f：5'-gtggcggccgcgtttaaacatccctattttaaataccgagtatg-3'seqidno:45：引物ih1231-5'sted-r：5'-tcagtcacccggatccctaatggtggcagtcgtgttggatgcct-3'如材料与方法中所述，在由大约100ng的黑曲霉nn049184的基因组dna构成的反应中通过pcr扩增所需片段。将反应在编程如下的c1000touchtm热循环仪中孵育：1个循环，在94℃下持续2分钟；35个循环，各在94℃下持续15秒，55℃下持续30秒，并且68℃下持续2分钟；以及在4℃保持。将1,500bppcr片段通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将质粒pihar473-3’sted用pmei和bamhi(新英格兰生物实验室公司)消化，并且通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中将9,653bp片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。根据制造商的说明书，通过使用in-fusion试剂盒(克罗泰克实验有限公司)将9,653bp片段连接到1,500bppcr片段上。将5μl连接混合物转化到dh5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体铺板在lb加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用qia小量制备试剂盒，将质粒dna从几个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒dna。将一种质粒命名为pihar473(seqid:46，图12)。在黑曲霉菌株m1816中的类固醇脱氢酶基因的破坏通过在32℃下持续16小时，伴随80rpm的轻轻搅拌，在补充有10mm尿苷的100ml的ypg培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株m1816的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6mkcl洗涤，并且将其重新悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(glucanextm，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml0.6mkcl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体。将原生质体通过衬有的漏斗，过滤到50ml无菌塑料离心管中，并且用0.6mkcl进行洗涤以提取受陷的原生质体。通过以2,000rpm离心15分钟收集合并的滤液和上清液。弃去上清液，并且用10-25ml的stc洗涤该球粒，并且以2,000rpm再次离心10分钟，然后用stc缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x107个原生质体/ml。将大约4μg的pihar473添加至1ml原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml的sptc，并且将原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml的50℃cove-n顶层琼脂糖之后，将混合物倾倒于cove-n板上，并且将板于30℃孵育7天。用无菌牙签将这些生长转化体转移到补充有1.5um5-氟-2-脱氧尿苷(fdu)(杀死表达在pihar473上存在的单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的细胞的试剂)的cove-n板上。将单孢子分离株转移至cove-n-gly板上。通过dna印迹(southernblot)分析来筛选包含用来破坏类固醇脱氢酶基因的pihar473的黑曲霉菌株m1816的可能的转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的ypg培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有的漏斗来收集生物质。根据制造商的说明书，使研磨的菌丝体经受使用土壤用fastdnaspin试剂盒(mp生物医疗公司(mpbiomedicals))的基因组dna制备。进行dna印迹分析，以确认类固醇脱氢酶基因座的破坏。用spei来消化来自每个转化体的5μg的基因组dna。基因组dna消化反应由以下构成：5μg基因组dna、1μlspei、2μl10xnebcutsmart缓冲液、以及补足至20μl的水。在37℃，将基因组dna消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用tae缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用印迹至hybondn+(ge医疗集团生命科学部(gehealthcarelifesciences)，曼彻斯特，新罕布什尔州，美国)持续大约1小时。将膜与481bp地高辛标记的黑曲霉类固醇脱氢酶探针杂交，其中使用如下所示的引物ih1252-ste-prof(正义)和ih1253-ste-500r(反义)，通过pcr，通过掺入地高辛-11-dutp合成该探针：seqidno:47：引物ih1252-ste-prof：5'-atactctccgtcagcatcctgccag-3'seqidno:48：引物ih1253-ste-500r：5'-ctgctccttcgatccataaggcaac-3'扩增反应(50μl)由以下构成：200μmpcrdig标记混合物(罗氏应用科学部(rocheappliedscience)，帕洛阿尔托(paloalto)，加利福尼亚州(ca)，美国)、0.5μm引物，通过kod-plus(东洋公司)，使用pihar473作为模板，终体积为50μl。将扩增反应在编程如下的c1000touchtm热循环仪中孵育：1个循环，在94℃下持续2分钟；30个循环，各在94℃下持续15秒，55℃下持续30秒，并且68℃下持续30秒；且保持在4℃下。将pcr产物通过使用tae缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将0.5kb片段从该凝胶切离，并且使用凝胶提取试剂盒进行提取。将变性的探针直接添加至digeasyhyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2xssc中、室温、5min洗涤两次；并且在0.1xssc中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig检测系统和cpd-star(罗氏公司(roche))进行化学发光检测。将dig-标记的dna分子量标记ii(罗氏公司)用于标准标记。选择在类固醇脱氢酶基因座处产生正确整合的菌株474p2-1和474p2-5(杂交带从5118bp移至7612bp)用于随后的实验。实例27：474p2-1和474p2-5中aa溶菌酶的表达如wo2012/160093中所述进行染色体插入至具有amds选择性标记的aa溶菌酶基因(wo2015144936a1中描述的pjal1470)的黑曲霉474p2-1和474p2-5中。通过flp重组酶将aa溶菌酶表达质粒靶向至四个预先指定的基因座，它们是甘露糖基转移酶(alg2)、葡萄糖激酶(guka)、酸稳定性淀粉酶(asaa)和多铜氧化酶(mcoh)。还进行了染色体插入至aa溶菌酶基因的参考类固醇脱氢酶-野生型黑曲霉c5553中。将生长良好的菌株进行纯化，并且对其进行dna印迹分析以确认是否将aa溶菌酶基因正确引入mcoh、guka、asaa和alg2基因座处。以下用以制备非放射性探针的引物组被用来分析所选择的转化体。对于启动子区：seqidno:49：htjp-324aagggatgcaagaccaaaccseqidno:50：htjp-325tgaagaatttgtgttgtctgag将从所选择的转化体提取的基因组dna通过spei消化，然后用启动子区进行探测。通过正确基因引入事件，如上所述探测观察通过spei和mlui消化的6.7kb(alg2)、2.9kb(mcoh)、6.7kb(guka)和2.7kb(asaa)大小的杂交信号。在mcoh、guka、asaa和alg2基因座处给出4个拷贝基因的正确整合事件的菌株中，选择了一个具有来自各宿主(1470-474p2-1、1470-474p2-5、1470-c5553-13)的溶菌酶的菌株。实例28：类固醇脱氢酶基因破坏对酶产生的影响。来自474p2-1、474p2-5和c5553的一个菌株在实验室规模罐中发酵，并按照实例7中描述的材料与方法测定其酶活性(lsu(f)/ml活性)；结果示于下表中。类固醇脱氢酶被破坏的菌株显示出溶菌酶(lsu(f)/ml)活性比参考类固醇脱氢酶-玻璃发酵罐中的野生型菌株高约1.1倍(表3)。表3.从每个宿主菌株中选择的三个菌株的平均lsu(f)活性，其中将来自1470-c5553-13的平均lsu(f)产率归一化为1.00。实例(米曲霉)微生物菌株菌株at3091表达wo2006037328seqidno.:4中描述的布氏柠檬酸杆菌(citrobacterbraakii)植酸酶。该菌株含有8个布氏柠檬酸杆菌植酸酶基因拷贝，已经使用wo2012160093中描述的flp整合系统将其作为串联反向重复序列插入到四个单独染色体上的四个特定基因座上。用于制备菌株at3091的宿主源于wo2018167153实例4中描述的jal1903。米曲霉菌株的实验室规模罐培养按补料分批发酵进行发酵(h.pedersen2000,applmicrobiolbiotechnol[应用微生物学与生物技术],53:272-277)，其中将选择的菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移至罐中，用于进一步培养和酶产生。在34℃下进行培养持续8天。氨用于控制ph。在分批期阶段将ph保持在6，并且在补料浴(fedbath)中将ph保持在5.4。以麦芽糖浆进行补料。使用培养液进行酶测定。如wo2006037328实例4中所述进行植酸酶活性测量。实例29-具有截短型类固醇脱氢酶基因的植酸酶表达菌株的构建和测试为了制备由seqidno:7(基因组)和seqidno:8(cdna)编码的米曲霉类固醇脱氢酶的截短型类固醇脱氢酶(seqidno:9)，以模拟里氏木霉类固醇脱氢酶突变体(njoc586)，通过将密码子tat突变为tag，在氨基酸位置y234处引入终止密码子。为了引入终止密码子，如等人fungalgeneticsandbiology[真菌遗传学与生物学]115(2018)78-89所述进行寡核苷酸介导的crispr基因编辑，其具有将cas9替换为由incripta提供的mad7的修饰。用于突变的寡oat3303处于反义方向，并具有以下序列(seqidno:51)：tgctgcggaacaaggggtgggagggaagggtgtacttcttgagagagttaagctagtggtgggcgtcatgttgtaggccagat。将两个带下划线的核苷酸在pam位点引入了突变，以防止被mad7复合物进一步切割，而粗体的核苷酸将对应于y234的密码子改变为终止密码子。通过以下方式修饰pat1153(wo19046703，实例25)来构建crispr-mad7质粒pat3631(图13，seqid:52)：1)将cas9基因与mad7基因交换，2)将pyrg标记基因替换为bar基因(赋予对双丙氨磷的抗性)(thompson等人1987,emboj[欧洲分子生物学学会杂志],6:2519-2523)，以及3)将wa原型间隔子替换为靶向相应染色体序列的原型间隔子tctctcaagaagtacaccctt(seqidno:53)，其在紧邻靶序列的上游具有pam位点tttc。根据christensen等人,1988,biotechnology[生物技术]6:1419-1422进行at3091的曲霉属转化。简言之，使米曲霉菌丝体在富营养培养液中生长。通过过滤从培养液中分离出菌丝体。将酶制剂(诺维信公司)添加至渗透压稳定的缓冲液(例如用磷酸钠缓冲至ph5.0的1.2mmgso4)中的菌丝体中。将悬浮液在37℃下伴随搅拌孵育60分钟。通过(卡尔生化公司(calbiocheminc.))过滤原生质体，以去除菌丝体碎片。收获原生质体并且用stc洗涤两次。然后将原生质体重新悬浮于200-1000μlstc中。为了转化at3091，将1μg的质粒pat3631和100pmol的修复寡oat3303添加至100μl原生质体悬浮液中，然后添加200μlpeg缓冲液。将混合物在室温下孵育20分钟。收获原生质体，用1.2m山梨醇洗涤两次，并重新悬浮于200μl1.2m山梨醇中。当在含有1.0m蔗糖作为碳源和10mm尿素作为氮源以及100mg/l双丙氨膦的基本培养基琼脂板上选择转化体时，选择含有bar基因的转化体，因为其能够赋予对双丙氨膦的抗性(cove,1966,biochem.biophys.acta.[生物化学与生物物理学报]113:51-56)。在37℃下生长5-7天后，稳定的转化体看起来强力地生长并且使菌落形成孢子。通过非选择板上的分生孢子(即，不含双丙氨膦)纯化转化体一次，由此丢失crispr-mad7质粒。为了验证预期的突变，在选择的转化体上用以下引物进行pcr：oat3163：ctagcagtctcaatcgc(seqidno:54)oat3164：ttgaccgtgacaaagac(seqidno:55)并且使用如用于pcr的引物对所得404bppcr产物进行测序。选择一个具有引入的终止密码子的转化体at3944进行实验室罐发酵。如方法下所述进行at3091和at3944及植酸酶活性的发酵。从117.4小时直到发酵结束，at3944的植酸酶活性提高了1.4％-6.9％(在182.7小时结束时提高了约3％，图14)。结果表明，天然推定的类固醇脱氢酶的灭活对米曲霉中植酸酶的表达具有积极影响。本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。序列表<110>诺维信公司（novozymesa/s）<120>经修饰的丝状真菌宿主细胞<130>nz14838-wo-pct<160>55<170>patentin3.5版<210>1<211>1040<212>dna<213>里氏木霉<220><221>外显子<222>(1)..(574)<220><221>内含子<222>(575)..(651)<220><221>外显子<222>(652)..(1037)<400>1atggatggcatatcgaatctgctggccatgctcaacgtgagcgacctg48metaspglyileserasnleuleualametleuasnvalseraspleu151015acgccggcagaatggtgccaaatcttcttcgtcgccaacgctggcttc96thrproalaglutrpcysglnilephephevalalaasnalaglyphe202530atcctgatgctgcaagctctcccggacgacatgcgtcgggcgttgatg144ileleumetleuglnalaleuproaspaspmetargargalaleumet354045gactacggcgccagaagagccacgtcccgccaggcttccgcaaaaaag192asptyrglyalaargargalathrserargglnalaseralalyslys505560ggtcaggccgaggtacccaaggaaggcttcttcgacgtcttgacgagc240glyglnalagluvalprolysgluglyphepheaspvalleuthrser65707580tatggccaggtgccgcactcgtggttcatacacttctacatcacgtcc288tyrglyglnvalprohissertrppheilehisphetyrilethrser85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