单核细胞源性NK细胞的制作方法

本公开涉及产生和培养免疫感受态细胞的组合物、方法和装置，特别是本公开涉及来自全血的脐带血(cb)或外周血(pb)nk细胞。

背景技术：

背景描述包括可用于理解本公开的信息。这不是承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明有关，也不是承认明确或隐含引用的任何出版物为现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请通过引用并入，其程度与每个单独的出版物或专利申请被特别地和单独地指示通过引用并入的程度相同。在并入的参考文件中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用而在该参考文件中该术语的定义不适用。

自然杀伤(nk)细胞是一组先天免疫细胞，其常表现为细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞通过靶向释放颗粒溶素和穿孔素表现出抗体依赖性细胞毒性。大多数nk细胞具有特异性的细胞表面标记谱(例如，cd3^-、cd56⁺、cd16⁺、cd57⁺、cd8⁺)以及各种活化性和抑制性受体的集合。尽管最近nk细胞已经成为某些癌症治疗的重要组成部分，但由于全血中nk细胞的比例相对较低，产生大量nk细胞(尤其是自体nk细胞)一直是显著的障碍。

为了获得治疗上有意义数量的nk细胞和nk样细胞，可以从各种前体细胞产生nk细胞。例如，各种干细胞因子(scf)、flt3配体、白细胞介素(il)-2、il-7和il-15已经在各种体外诱导和扩增脐带血源性细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞的方法中被报道(anticancerresearch[抗癌研究]30:3493-3500(2010))。类似地，cd34⁺造血细胞可以暴露于il-12和其他药剂，如us2018/0044636中所报道的。在其他方法中，人成血管细胞顺序暴露于两种不同的细胞因子混合物，如wo2011/068896中所述，并且不同的细胞因子混合物与胚胎后造血干细胞一起使用，如wo2012/128622中所教导的。尽管这些方法中的至少一些提供了nk细胞的显著n倍扩增，但用于这种扩增的方法和试剂既需要时间又需要资源。此外，应当指出，许多已知的方法还需要在饲养细胞层上培养nk细胞，这从技术和监管角度来看常常是有问题的。

在更简单的方法中，急性髓系白血病(aml)细胞可以暴露于tpor激动剂，从而诱导aml细胞形成nk细胞。然而，这种方法作为治疗性细胞制剂的来源可能是不可行的。替代方法还依赖于在各种白细胞介素、干细胞因子和flt3配体存在下培养外周血细胞，如wo2011/103882中公开的。在另一种方法中，us2013/0295671教导了用抗cd16和抗cd3抗体以及细胞因子刺激已经存在的nk细胞的方法。虽然在程序上更简单，但这样的方法仍然需要对细胞进行精细的操作，并且由于所需的特定试剂而大大增加了成本。

在进一步已知的方法中，us10,125,351描述了使用脐带血或外周血作为细胞来源，所述细胞进行密度梯度分离以分离有核细胞，然后用含有干扰素、白细胞介素、cd3抗体和人白蛋白的培养基培养所述有核细胞。最有利的是，这样的方法适于在生物反应器中进行灌注培养，因此显著降低了操作困难。然而不幸的是，nk细胞的产量相对较低。

因此，即使本领域已知产生大量nk细胞的各种方法，但所有或几乎所有的方法都存在各种缺点。因此，需要提供生产大量nk细胞，特别是自体nk细胞的改进的系统和方法。此外，改进的系统和方法还将允许细胞培养的自动化，并将具有显著减少的试剂需求，以使这种方法在临床上和商业上可行。

技术实现要素：

发明人已经发现了能够以概念上简单和有效的方式产生和扩增nk细胞的组合物、方法和装置。有利地，nk细胞可以由从脐带或全血获得的血单核细胞(mnc)产生，而不分离cd34+造血干细胞(hsc)或nk细胞，并且不使用饲养层，优选地通过使用n-803和任选的抗cd16激动剂抗体和抗cd3抗体的富集方法。

在本发明主题的一个方面，发明人预期了一种生产nk细胞的方法，所述方法包括从生物流体中分离单核细胞的混合物的步骤，使单核细胞的混合物与抗cd16抗体和n-803接触以活化nk细胞的步骤，以及顺序地向活化的nk细胞供给含有n-803的培养基的另一步骤。

在大多数典型的实例中，分离单核细胞的混合物的步骤使用密度梯度离心进行，和/或生物流体是全血或脐带血。因此，单核细胞的混合物一般将包括t细胞、nk细胞、nkt细胞，以及双阴性(dn)t细胞。虽然没有明确排除，但一般优选不对单核细胞的混合物进行富集nk细胞的进一步处理。

关于预期的抗cd16抗体，通常优选抗体是对人cd16具有特异性的单克隆抗体。最典型的是，抗cd16抗体以0.05-0.5mcg/ml的浓度存在，和/或n-803以0.1-1.0nm的浓度存在。在需要的情况下，预期的方法还可以包括接触混合物的步骤，所述步骤进一步包括使单核细胞的混合物与抗cd3抗体(例如，在0.1-1.0ng/ml的浓度)接触。

在一些实施例中，单核细胞的混合物包含约100-500x10⁶个细胞，和/或以约100-300ml的体积或在约1x10⁶个细胞/ml的细胞密度下进行接触混合物的步骤。优选地但不是必须地，含有n-803的培养基包括人ab血清和/或nkmacs^tm培养基(可从米莉生物技术公司(milenybiotech),friedrich-ebert-straβe68,51429bergischgladbach,德国购得)和氢化可的松(0.1-5um)。此外，预期顺序供给的步骤大约每72小时进行，和/或进行顺序供给的步骤直到达到大约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数为止。此外，向活化的nk细胞顺序地供给的步骤可以在单个容器中进行，并且接触单核细胞的混合物的步骤可以在同一容器中进行。

在其他实施例中，进行向活化的nk细胞顺序地供给的步骤，直到nk细胞富集到至少100倍扩增，和/或直到nk细胞构成所有活细胞的至少约80％或至少约90％。

因此，并且从不同的角度来看，发明人还预期了一种从单核细胞的混合物扩增nk细胞的方法，所述方法包括提供含有等于或小于5％nk细胞的单核细胞的混合物的步骤。在另一个步骤中，然后将单核细胞的混合物与抗cd16抗体和n-803接触以活化nk细胞，并且在另一个步骤中，向活化的nk细胞供给含有n-803的培养基。

优选地但不是必须地，单核细胞的混合物从全血或脐带血获得，或者单核细胞的混合物从相对于接收nk细胞的个体的mhc匹配的自体来源获得。在典型实施例中，含有等于或小于3％nk细胞的单核细胞的混合物，和/或可进一步包含t细胞、nkt细胞和dn细胞。关于培养基、抗cd16抗体、n-803和抗cd3抗体，适用与上述相同的考虑。

另外，预期供给步骤包括以大约每72小时的间隔顺序供给，供给步骤进行直到达到约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数为止，和/或向活化的nk细胞供给的步骤进行直到nk细胞富集到至少100倍扩增为止。在进一步的实施例中，预期以自动化的方式，优选在单个容器中进行向活化的nk细胞供给的步骤。

因此，在本发明主题的另一个方面中，发明人还考虑在自动化生物反应器中扩增nk细胞的方法。这样的方法通常包括在含有n-803和抗cd16抗体的活化培养基中孵育单核细胞的混合物足够时间以活化nk细胞的步骤，其中在孵育所述混合物的同时，单核细胞的混合物包含在细胞培养容器中。在另一个步骤中，当细胞在容器中时测量细胞的生长，并且根据预定的时间表和/或测量细胞生长的步骤的结果，自动地向细胞供给含有n-803的培养基。在另一个步骤中，根据预定的时间表和/或测量细胞生长的步骤的结果终止向细胞供给。

例如，合适的容器将具有约200ml至约2500ml的体积，和/或测量细胞生长的步骤透过容器的壁进行(例如，使用光学测量)。最优选的是，活化培养基含有浓度是0.1-1.0nm的n-803和浓度是0.05-0.5mcg/ml的抗cd16抗体。在其他实施例中，含有n-803的培养基含有浓度是0.1-1.0nm的n-803。最典型的是，足以活化nk细胞的时间是24小时至96小时，并且向细胞供给直到达到约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数，和/或直到nk细胞富集到至少100倍扩增。

在本发明主题的又一个方面中，发明人还预期了一种细胞培养容器(例如，具有约200ml至约2500ml的体积)，其包含具有不同类型的免疫感受态细胞的培养基。最优选的是，所述培养基含有nk细胞(其量为全部活细胞的至少80％)、nkt细胞(其量为全部活细胞的等于或小于10％)、t细胞(其量为全部活细胞的等于或小于5％)、以及dnt细胞(其量为全部活细胞的等于或小于3％)。优选地，容器的至少一个壁具有光学透明部分，和/或nk细胞以全部活细胞的至少约90％的量存在。

从以下对优选实施例的详细描述以及附图中，各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中相同的数字表示相同的组成部分。

附图说明

图1描绘了示例性示意图，所述示例性示意图示出了从脐带血开始通过分离cbmc的过程，所述cbmc随后构成用于nk细胞富集/扩增的种子。

图2描绘了自动化环境(“盒中gmp”)中的代表性过程的示例性细节，以及各种成分的添加时间表。

图3通过数量和选择的流式细胞术特性针对nk细胞描绘了图2的过程的富集动力学的示例性结果。

图4描绘了图2的过程的各个细胞群体的动力学的示例性结果以及标记表达，尤其是大多数nk活化受体的显著表达的结果。

具体实施方式

随着免疫疗法在癌症治疗中的应用不断增加，生产足够数量的nk细胞，特别是自体nk细胞作为治疗实体已经变得至关重要。然而，目前的许多方法都需要使用饲养层或分离的cd34+造血干细胞(hsc)的分化，这是时间和资源密集型的。此外，由于需要各种操作步骤，这样的方法通常需要人的交互，并且容易受到污染。

在改进nk细胞的生产方法的努力中，发明人现已发现各种系统、组合物和方法，以简单有效的方式从含有单核细胞的生物流体(例如、全血、脐带血)中产生治疗上有意义的数量(例如，至少0.5x10⁹个nk细胞)，所述方式甚至可以在如图1中示意性地示出的获得单核细胞之后完全自动化。优选地，生物反应器是自包含的单元，并且将具有在板上的中央处理器和存储器(以执行用于各种活动(例如，用于流体运动的泵的运行、温度和气体调节、图像处理等)的可编程方案并生成调整就绪的报告)以及用于监测细胞培养物的显微镜(或其他光学单元)。

例如，在本文所预期的一种方法中，使用全外周血或脐带血作为起始材料，将其处理以获得单核细胞。最典型的是，可以使用常规的密度梯度离心(例如，使用ficoll-paque加^tm(亲水性可溶性多糖，密度1.077g/ml)，可从通用生命科学公司(gelifesciences商购))来进行处理。一旦从离心管中分离出单核细胞，将细胞洗涤并重新悬浮在活化培养基(例如，补充了10％人ab血清的nkmacs)中。活化培养基还包含浓度约0.4nm的n-803和浓度约1.0mcg/ml的抗cd16抗体。

最典型的是，单核细胞在约200ml的总体积中具有1-2x10⁶个细胞/ml的密度，并且细胞和培养基在单个容器中。约3-4天后，用含有n-803的新鲜培养基供给细胞，并且通过恢复、快速扩增和培养顶点，约每三天进行一次进一步的供给周期，如图2所示。当细胞达到所需的数量时，通常约为0.5-5.0x10⁹个总细胞和/或当达到所需的扩增(例如，至少100倍扩增)时，细胞被收获。值得注意的是，尽管表面上简单，但如此获得的细胞培养物在约三周后含有超过约85％的nk细胞、少于约8％的nkt细胞、少于约2.5％的t细胞和少于约1.2％的双阴性(dn)t细胞。此外，应当认识到，整个培养过程可以在自足式生物反应器内的单个容器中进行，这大大降低了污染的风险，并消除了培养步骤期间试剂和细胞的处理。图3描绘了nk生产的示例性结果，所述生产在23天内产生了约136倍的nk细胞扩增，从约480ml的最终体积中收获了总计1.17x10⁹个细胞。图4描绘了说明随时间变化跟踪t细胞、nk细胞、nkt细胞、dn细胞(连同cd16结果；左侧分图)的细胞组成的进一步实验数据。在图2和图3的过程中收获的细胞的最终表型结果显示在图4的右侧分图中。可以很容易地看出，检测到的标记是nk细胞的指示。

关于合适的生物流体，通常预期流体可以是自体的，这是相对于将接收在本文中提出的方法中分离的nk细胞的个体而言。因此，特别优选的生物流体包括新鲜全血、脐带血(冷冻或新鲜)和在白细胞分离程序中分离的细胞。然而，应当理解，生物流体也可以是包含nk细胞(典型地在其他细胞类型中)的任何流体。例如，合适的替代生物流体包括来自同种异体供体的全血，所述全血可以与兼容的mhc类型匹配，也可以不匹配。因此，血库中接近过期日期的样品被视为适合使用，以及nk细胞接受体以外的个体新鲜捐献的全血或储存的脐带血。

同样，应当注意，分离或富集单核细胞的方式可以有很大的变化，并且本领域普通技术人员将容易地获知分离和富集的最适合方法。例如，在生物流体是全血或脐带血的情况下，优选使用任何合适的介质(例如，ficoll-hypaque)通过梯度密度离心处理流体。可替代地，可以通过白细胞单采直接从患者获得单核细胞，或者可以使用抗体去除生物流体中的红细胞。在仍进一步的方法中，可以使用磁珠分离来分离单核细胞，其中磁珠被包被或以其他方式偶联到结合单核细胞的抗体上。

同样，应当认识到，用于活化和供给的培养基的特殊性质不必局限于nkmacs培养基，而是所有已知的支持nk细胞生长的培养基都被认为适合于在此使用。然而，最优选的是使用限定的培养基，并且可以用人ab血清补充。

单核细胞的混合物中的nk细胞的活化优选使用抗cd16抗体和n-803的组合，以及任选地抗cd3抗体进行。本领域已知/市售的抗cd16抗体有各种来源，特别优选的抗cd16抗体具有激动剂(活化)活性并对人cd16是特异性的。然而，抗cd16抗体以外的活化剂也被认为适合于本文使用，包括抗cd16抗体片段和具有抗cd16抗体片段的融合蛋白。另外地或可替代地，预期的活化剂还包括cd314或nkg2d、天然细胞毒性受体cd335(nkp46)、cd336(nkp44)和cd337(nkp30)、cd226(dnam-1)、cd244(2b4)、cd158或携带短细胞质尾的杀伤免疫球蛋白样受体(kir)家族的成员(kir2ds和kir3ds)和cd94/nkg2c等。

抗cd16抗体的浓度通常遵循本领域已知的用于活化nk细胞的浓度。因此，抗cd16抗体的合适浓度将是约0.01-5.0mcg/ml，更典型地是约0.01-0.3mcg/ml，或是约0.05-0.5mcg/ml，或是约0.1-1.0mcg/ml，或是约1.0-5.0mcg/ml。关于暴露于抗cd16抗体的持续时间，通常预期单核细胞的混合物仅暴露于单个、两个或多个剂量的抗cd16抗体，最典型的是当单核细胞被分离并与活化培养基接触第一(和/第二和/或第三)次时。本领域普通技术人员将容易地认识到实现nk细胞活化的适当的时间表和剂量。最典型的是，单核细胞暴露于抗cd16抗体与单核细胞暴露于n-803同时进行。然而，在较不优选的实施例中，将单核细胞暴露于抗cd16抗体，顺序地是将单核细胞暴露于n-803(将单核细胞首先暴露于抗cd16抗体是优选顺序)。

在需要的情况下，活化还可包括使细胞与抗cd3抗体接触，典型地在使细胞与抗cd16抗体接触的同时。如上所述，抗cd3抗体的浓度将典型地遵循本领域已知的用于活化nk细胞的浓度。因此，抗cd3抗体的合适浓度将是约0.01-10.0ng/ml，更典型地是约0.01-0.1ng/ml，或是约0.1-0.5ng/ml，或是约0.3-1.0ng/ml，或是约1.0-5.0ng/ml。同样，关于暴露于抗cd3抗体的持续时间，通常预期单核细胞的混合物仅暴露于单个、两个或多个剂量的抗cd3抗体，最典型的是当单核细胞被分离并与活化培养基接触第一(和/第二和/或第三)次时。本领域普通技术人员将容易地认识到实现nk细胞活化的适当的时间表和剂量。

关于n-803，预期n-803(与人序列的il-15n72d:il-15rαsu/igg1fc复合物；参见us2019/0023766，可从免疫生物公司(immunitybio)购得)优选作为活化和供给培养基中的试剂。然而，具有il-15活性的各种替代试剂也被认为适用于本文。在本上下文中，并且不希望受任何理论或假设的约束，发明人预期n-803通过连续的信号传导使nk细胞能够生长和扩增。相反，il-15作为分离的细胞因子具有非常短的寿命并且信号传导活性典型地非常短。在将il-15作为分离的细胞因子添加到生长培养基中的情况下，信号传导将是脉冲的或间歇的。相反，在提供n-803的情况下，il-15的稳定性显著延长，信号传导被认为是连续的。此外，应认识到n-803还提供了生理上下文(即，il-15r-α链)和作为超级激动剂的n72d形式。因此，任何稳定的il-15化合物也明确地被认为适合于在此使用。在进一步的预期方面，il-15(重组的、重组表达的或分离的)和/或n-803可以至少部分地由txm型融合蛋白复合物替代或补充，特别优选的融合蛋白复合物描述于wo2018/165208(其通过引用并入本文)中。例如，预期的txm型融合蛋白复合物将包括选自由il-7、il-18和il-21组成的组的至少一种另外的细胞因子。因此，在其他合适的选择中，预期的txm融合复合物包括il-18/il-7txm和/或il-18/il-21txm。

例如，所有影响il-15信号传导的化合物和复合物都被认为适用于本文，只要这样的化合物和复合物具有比分离/重组和纯化的单独il-15更长的血清半衰期。此外，通常优选稳定的il-15化合物将包括il-15和/或il-15rα的至少部分人序列。例如，合适的化合物包括p22339(il-15和il-15rα链的sushi结构域的复合物，其具有将il-15/sushi结构域复合物与igg1fc连接以增加其半衰期的二硫键；参见nature,scientificreports[自然，科学报道](2018)8:7675)，以及xmab24306(其为il-15/il-15rα-fc异二聚体(参见例如，wo2018/071919))。

在进一步特别预期的实施例中，单核细胞的混合物在从生物流体中分离之后，与含有抗cd16(和任选的抗cd3)抗体和n-803的培养基一起放置到细胞培养容器中，以活化nk细胞。最优选的是，所述容器是具有至少一个壁(或其部分)对光透明的细胞培养瓶，从而可以用显微镜或其他光学仪器观察细胞形状、染色和/或生长。因此，应当注意，可以在生物反应器中连续地或周期性地监测细胞，并且因此获得的测量值(例如细胞大小、细胞数目、细胞分布等)可以用于触发或修改逻辑耦合到生物反应器的控制单元中的自动供给时间表。最典型的，如图2所示，向新鲜培养基供给n-803可以使用预定义的时间表来执行，典型地每三天一次，其中优选地每次供给将包括n-803以保持连续信号传导。虽然图2中所示的比体积适合于将nk细胞扩增到与细胞生长一致的细胞密度，但应当理解，可以调节体积以适应特定的生长模式。为此，还应当理解，供给可以是连续的，或者预定的体积可以响应于在容器中观察到的生长动力学而改变。

在大多数情况下，培养结束时nk细胞的产量典型地为全部活细胞的至少80％、或至少82％、或至少85％、或至少88％、或至少90％、或至少92％、或至少94％，剩余为nkt细胞、dnt细胞和t细胞。例如，剩余的nkt细胞将典型地等于或少于10％、或等于或少于8％、或等于或少于7％、或等于或少于6％的全部活细胞，而剩余的t细胞将典型地等于或少于5％、或等于或少于4％、或等于或少于3％、或等于或少于2％的全部活细胞，并且剩余的dnt细胞将典型地等于或少于3％、或等于或少于2％、或等于或少于1.5％、或等于或少于1％的全部活细胞。

因此，并且从不同的角度来看，应当理解，本文所预期的系统和方法能够显著地高扩增nk细胞，并且典型的扩增相对于最初存在于单核细胞的混合物中的nk细胞的数量是至少80倍、或至少100倍、或至少120倍、或至少130倍、或至少140倍。鉴于活化和培养的方式非常简单(一锅法)，这种扩增尤为显著。实际上，一旦将单核细胞的混合物放入细胞培养容器中，整个过程将在同一容器中继续进行，并且仅通过添加培养基来维持，如图2中示意性地示出的。因此，完全避免了复杂的处理和昂贵的试剂，并大大降低了污染的风险。

虽然不限于本发明的主题，但因此预期nk细胞在培养环境中扩增和/或活化，所述培养环境允许连续监测、连续管理co2和o2水平、以及连续监测以检测细胞密度(例如汇合)。在这些环境的其他选项中，特别优选的环境是自动化细胞培养和收获装置，如在例如wo2015/165700中所描述的。这种“盒中gmb”系统有利地允许对供给时间表的控制、气体控制、允许实时检测细胞密度、生长(动力学)和细胞健康，以及由于显著降低的处理要求而显著降低污染的可能性。

在进一步预期的方面，应当注意，本文所述的系统和方法有利地还允许产生cd56^暗和cd56^亮nk细胞，特别是在nk细胞由外周血产生的情况下。根据进一步的培养条件，cd56^亮nk细胞随后可分化为cd56^暗细胞。这样的不同的nk细胞群体由于其不同的成熟和细胞毒性谱，可用于不同的治疗选择。此外，应当理解，所述组合物、系统和方法也将适合于在适当的刺激和培养下产生nkt细胞。

实例

鉴于上述，并如下面更详细地提供的，一种示例性方法需要通过单个ficoll离心步骤分离cbmc或pbmc，随后将细胞与约0.4nmn-803和约0.1mcg/ml抗cd16抗体(例如，克隆b73.1，可从bd生物科学公司(bdbiosciences)购得)以及任选地约0.5ng/ml抗cd3抗体在具有10％人ab血清的nkmacs培养基中孵育。典型地，以百万个细胞/ml的150mlcbmc作为与上述试剂一起的起始材料。n-803情况下使用培养基进行稀释，每周两次，方案为与现有体积相比1:2和1:10，针对最终浓度的相应n-803浓度为0.4nm。

材料：来自脐带和外周血的mnc，抗cd16抗体，加利福尼亚州圣地亚哥bd生物科学公司；具有nk补充物的nkmacs培养基，用于表型分型的染色抗体(acd3、acd16、acd56、ankp30、ankp44、ankp46、ankg2a、ankg2d、atigit、acd34、atrail、acd57、acxcr3和accr5)，加利福尼亚州圣地亚哥梅旖旎生物技术公司(miltenyibiotec)；人ab血清，加利福尼亚州圣地亚哥阿瑟斯生物制品公司(accessbiologicals)；n-803，gmp盒装试剂盒，加利福尼亚州卡尔弗城(culvercity)南特公司(nantbioinc.)。

方法：mnc是从脐带血或外周血中新鲜分离出来的。用完全nkmacs培养基(nkmacs+补充剂+10％hu-ab-血清)洗涤两次。将mnc悬浮于密度为1x10^6个细胞/ml的150ml培养基中。150ml细胞悬浮液中补充acd16抗体(1mcg/ml)和n-803(0.4nm)。进一步的gmp试剂盒装在盒中并且方案通过vivabio网络门户上传。将含有完整细胞因子和抗体的细胞悬浮液转移到细胞袋中，通过盒-试剂盒内细胞注射口注射150ml细胞悬浮液。gmp盒开始成像，并且细胞按照如图2所述的方案中所写的步骤繁殖。盒中的细胞以图2所述的交替方式补充10x细胞因子培养基或2x细胞因子培养基。定期监测nk富集(cd3、cd56和cd16表达的表型)和细胞健康(细胞数量、生存力和细胞密度)，并绘制在图3和图4a中的曲线图中。从盒中富集后收获细胞，并测量基于nk细胞的受体的表达，用于如图4所示的完整表征。

如本文所使用的，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物的步骤，以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，经由皮下或真皮下注射施用细胞或外泌体。然而，在其他设想的方面，施用还可以是静脉内注射。可替代地或另外地，可以从患者的细胞中分离抗原呈递细胞或使其生长，在体外感染，并然后输送至患者。因此，应理解，可以将设想的系统和方法视为用于高度个性化癌症治疗的完整药物发现系统(例如，药物发现、治疗方案、验证等)。

本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都将并入说明书中，就如同在本文中单独引用一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本披露的全部范围，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践要求保护的发明所必需的。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不背离本文所披露的概念的全部范围的情况下，除了已经描述的那些以外，还可以进行许多其他修改。因此，本披露主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求书提及选自由a、b、c……和n组成的组的某物的至少一种的情况下，该文字应当被解释为只需要该组中的一个要素，而不是a加n、或b加n等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种富集nk细胞的方法，所述方法包括：

从生物流体中分离单核细胞的混合物，并使所述单核细胞的所述混合物与抗cd16抗体和n-803接触以活化nk细胞；并且

向所活化的nk细胞顺序地供给含有n-803的培养基，直到所活化的nk细胞构成全部活细胞的至少约80％或直到所活化的nk细胞富集到至少80倍扩增。

2.如权利要求1所述的方法，其中分离所述单核细胞的所述混合物的步骤使用密度梯度离心进行。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物流体是全血或脐带血。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中单核细胞的所述混合物包含t细胞、nk细胞、nkt细胞和dnt细胞。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中不对单核细胞的所述混合物进行富集nk细胞的进一步处理。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd16抗体是对人cd16具有特异性的单克隆抗体。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物包含约100-500x10⁶个细胞。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述混合物的步骤是以约100-300ml的体积或以约1x10⁶个/ml的细胞密度进行的。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗cd16抗体以0.05-0.5mcg/ml的浓度存在。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述n-803以0.1-1.0nm的浓度存在。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述混合物的步骤还包括使所述单核细胞的所述混合物与抗cd3抗体接触。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗cd3抗体以0.1-1.0ng/ml的浓度存在。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有n-803的培养基包含人ab血清。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有n-803的培养基包含nkmacs培养基。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述顺序地供给的步骤约每72小时进行一次。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行所述顺序地供给的步骤，直到达到约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在单个容器中进行向所活化的nk细胞顺序地供给的步骤。

18.如权利要求17所述的方法，其中接触所述单核细胞的所述混合物的步骤在所述单个容器中进行。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行向所活化的nk细胞顺序地供给的步骤，直到nk细胞富集到至少100倍扩增。

20.删除。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行向所活化的nk细胞顺序地供给的步骤，直到nk细胞构成全部活细胞的至少约90％。

22.一种从单核细胞的混合物扩增nk细胞的方法，所述方法包括：

提供含有等于或少于5％nk细胞的所述单核细胞的混合物；

使所述单核细胞的所述混合物与抗cd16抗体和n-803接触以活化nk细胞；并且

向所活化的nk细胞供给含有n-803的培养基，直到所活化的nk细胞构成全部活细胞的至少约80％或直到所活化的nk细胞富集到至少80倍扩增。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物从全血或脐带血获得。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物是相对于接收所述nk细胞的个体从mhc匹配的同种异体来源获得。

25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物包含等于或少于3％nk细胞。

26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的所述混合物还包含t细胞、nkt细胞和dn细胞。

27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述抗cd16抗体是对人cd16具有特异性的单克隆抗体。

28.如权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述抗cd16抗体以0.05-0.5mcg/ml的浓度存在。

29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述n-803以0.1-1.0nm的浓度存在。

30.如权利要求22-29中任一项所述的方法，其中接触所述混合物的步骤还包括使所述单核细胞的所述混合物与抗cd3抗体接触。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗cd3抗体以0.1-1.0ng/ml的浓度存在。

32.如权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述含有n-803的培养基包含人ab血清。

33.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述供给步骤包括以约每72小时的间隔顺序地供给。

34.如权利要求22-33中任一项所述的方法，其中进行所述供给步骤，直到达到约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数。

35.如权利要求22-34中任一项所述的方法，其中进行向所活化的nk细胞供给的步骤，直到nk细胞富集到至少100倍扩增。

36.如权利要求22-35中任一项所述的方法，其中以自动化方式进行向所活化的nk细胞供给的步骤。

37.如权利要求22-35中任一项所述的方法，其中在单个容器中进行向所活化的nk细胞供给的步骤。

38.一种在自动化生物反应器中扩增nk细胞的方法，所述方法包括：

将单核细胞的混合物在含有n-803和抗cd16抗体的活化培养基中孵育足以活化nk细胞的时间；

其中单核细胞的所述混合物在孵育所述混合物的同时被包含在细胞培养容器中；

当所述细胞在所述容器中时，测量所述细胞的生长；

向所述细胞自动地供给含有n-803的培养基，直到所活化的nk细胞构成全部活细胞的至少约80％或直到所活化的nk细胞富集到至少80倍扩增，其中所述供给由预定的时间表和/或来自测量所述细胞的生长的步骤的结果控制；

终止向所述细胞供给，其中所述终止由预定的时间表和/或来自测量所述细胞的生长的步骤的结果控制。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述容器的体积是约200ml至约2500ml。

40.如权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述测量所述细胞的生长的步骤透过所述容器的壁进行。

41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述测量所述细胞的生长的步骤使用光学测量。

42.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述活化培养基含有浓度是0.1-1.0nm的n-803和浓度是0.05-0.5mcg/ml的抗cd16抗体。

43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述足以活化nk细胞的时间是24小时至96小时。

44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述含有n-803的培养基含有浓度是0.1-1.0nm的n-803。

45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中向所述细胞供给直到达到约0.5-5.0x10⁹个细胞的总细胞数。

46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中向所述细胞供给直到nk细胞富集到至少100倍扩增。

47.一种含有不同类型的免疫感受态细胞的细胞培养容器，所述细胞培养容器包含：

培养基，所述培养基中放置有

nk细胞，其量是全部活细胞的至少80％；

nkt细胞，其量等于或少于全部活细胞的10％；

t细胞，其量等于或少于全部活细胞的5％；以及

dnt细胞，其量等于或少于全部活细胞的3％。

48.如权利要求47所述的细胞培养容器，其中所述容器的体积是约200ml至约2500ml。

49.如权利要求47-48中任一项所述的细胞培养容器，其中所述容器的至少一个壁具有光学透明部分。

50.如权利要求47-49中任一项所述的细胞培养容器，其中所述nk细胞以全部活细胞的至少约90％的量存在。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

根据第19(1)条的声明

辩论

专利局认为权利要求1-3、22-25相比于d1缺乏创造性，并认为相比于d1的不同特征很容易从d1的公开中得出。申请人谨出于多个原因表示不同意：

首先，d1要求首先从pbmc中分离nk细胞，然后与培养基一起孵育。因此，在d1中已经分离/富集了nk细胞。相反，本申请权利要求书中要求从单核细胞的混合物中富集nk细胞。d1完全没有教导培养过程中nk细胞的富集，而是依赖于使用常规方法进行的事先分离。

其次，d1教导将已经分离的nk细胞暴露于抗cd16抗体，以证明cd16依赖性adcc。换句话说，d1使用抗cd16抗体来降低细胞毒性。相反，本申请权利要求书中要求将单核细胞的混合物暴露于抗cd16抗体以活化和富集混合物中的nk细胞。

第三，d1教导了使用n-803增加已经分离的nk细胞的细胞毒性。相反，本申请权利要求书中要求将活化的nk细胞供给到混合物中，直到获得nk细胞的最小分数或扩增。

专利局认为权利要求38-40和47-49相比于d1和d2缺乏创造性，基本上是在辩论相比于d1和d2的不同特征可以很容易地从d1和d2的公开中得出。申请人谨出于多个原因表示不同意：

关于d1的缺点，适用与上述相同的考虑和辩论。此外，关于d2，必须认识到，其使用il-2和抗cd3抗体进行nk细胞扩增，这与本申请所要求保护的主题完全不一致。而且，d2中nk细胞的产率显著低于申请人要求保护的产率。关于权利要求47-50，要注意的是，用d1(因为使用先前分离的nk细胞)和d2(因为nk细胞的产率大大降低)的方法不能实现这种组成。

总之，在d1和d2中没有教导或建议如本发明所要求保护的组成和方法步骤，专利局也没有论证这些组成和方法步骤可以从任何其他现有技术获得。

结论

权利要求1-19和21-50在本申请中未决。申请人请求授权所有未决权利要求。