通过核酸内切酶保护的靶向富集的制作方法

本发明属于遗传学研究领域，更具体地，属于靶向核酸分离领域，如用于遗传学研究中进一步分析或加工的文库制备。公开了用于降低核酸样品复杂度或富集核酸样品内靶核酸的新方法和组合物。

发明背景

遗传研究的重要组成是所定义的dna基因座的序列分析。这可以是对已知变体基因分型，或鉴定序列变化或变体。这类分析通常需要以多重方式完成，如需要在大量样品中分析特定基因座组。用于此的理想试验在需要筛选的样品及基因座数目方面灵活，高精度且适合不同测序平台。尝试提供包括富集步骤的试验但理想的是没有扩增。例如，us2014/0134610描述了降低复杂性的方法，使用ii型限制酶以片段化样品中的核酸，然后连接保护性接头且随后用核酸外切酶降解所有非捕获核酸。在wo2016/028887中，此方法如下改善：使用可编程的核酸内切酶，即crispr-核酸内切酶，片段化样品中的核酸。

crispr(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是含多个较短直接重复序列的基因座且在40％经测序的细菌和90％经测序的古生菌内发现。crispr重复序列形成获得性细菌免疫系统，抵御遗传学病原体如噬菌体和质粒。当细菌受到病原体攻击时，一小段病原体基因组通过crispr相关蛋白(cas)加工并纳入crispr重复序列之间的细菌基因组。crispr基因座接着转录并加工形成所谓的crrna，其包含约30bp与病原体基因组相同的序列。这些rna分子形成在后续感染之后识别病原体的基础并通过直接消化病原体基因组来导致病原体遗传因子沉默。cas蛋白cas9是来自酿脓链球菌(s.pyogenes)的ii型crispr-cas系统的主要成分，且在联合crrna和称为反式激活crrna(tracrrna)的第二rna时形成核酸内切酶，所述核酸内切酶靶向侵入的致病dna，以通过在crrna所定义基因组位置处引入dna双链断裂(dsb)而降解。此ii型crispr-cas9系统证明在生物化学中是方便有效的工具，通过靶向引入双链缺口和随后激活内源修复机制，能够在真核基因组感兴趣位点引入修饰。jinek等.(2012,science337:816-820)证明单链嵌合rna(单引导rna、srna、sgrna)能够联合cas9形成功能核酸内切酶，所述单链嵌合rna通过组合crrna和tracrrna基本序列到单一rna分子内生成。从不同细菌种群中鉴定了许多不同crispr-cas系统(zetsche等.2015cell163,759-771；kim等.2017,nat.commun.8,1-7；ran等.2015.nature520,186-191)。

除了rna指导用于引导核酸内切酶到核酸分子特定位置的crispr-cas系统，本领域已知使用dna或rna指导的其他核酸内切酶(doxzen等.2017,plosone12(5):e0177097；kaya等.2016,pnas卷113第15号,4057-4062)。

本领域仍然很需要灵活且精确的方法用于降低核酸复杂性。本领域尤其需要就一个或多个靶核酸片段富集样品的通用方法，例如用于遗传学研究的后续分析或加工。

本发明如下详述，允许高度简化的文库制备方法用于下游加工和/或分析。

发明概述

第一方面，本发明涉及从包含核酸分子的样品富集靶核酸片段的方法，其中靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二rna或dna指导的核酸内切酶复合物切割所述核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许所述核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；和

d)任选地，从步骤c)所得的消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段。

优选地，所述rna或dna指导的核酸内切酶复合物是grna-cas复合物。因此，本发明优选涉及从包含核酸分子的样品富集靶核酸片段的方法，其中所述靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二grna-cas复合物切割核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许所述核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；和

d)任选地，从步骤c)所得的消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段。

优选地，步骤b)如下进行：将第一和第二grna-cas复合物与核酸分子一起在约10-90℃，优选约37℃温育约1分钟-约18小时，优选约60分钟。

优选地，步骤c)如下进行：将经切割核酸分子与核酸外切酶在约10-90℃，优选约37℃温育约1分钟-约12小时，优选30分钟。

优选地，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一包含cas9蛋白。

优选地，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一包含sgrna。

优选地，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一包含作为不同分子的crrna及tracrrna。

优选地，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一能够诱导dsb。

优选地，所述第一和第二grna-cas复合物都能够诱导dsb。

优选地，在所述步骤b)中，第一和第二grna-cas复合物至少之一使核酸分子的一条链产生缺口，且其中核酸分子与至少第三grna-cas复合物接触，所述第三grna-cas复合物使互补链基本在所述第一或第二grna-cas复合物所形成的缺口的位置的互补位置产生缺口。

第二方面，本发明涉及从包含核酸分子的样品中制备接头连接的靶核酸片段的方法，其中所述靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含所述感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二grna-cas复合物切割所述核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许所述核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；

d)任选地，从步骤c所得消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段；和

e)使接头与靶核酸片段连接。

优选地，所述接头是序列接头。

第三方面，本发明涉及从包含核酸分子的样品测序靶核酸片段的方法，其中所述靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含所述感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二grna-cas复合物切割所述核酸分子，从而产生包含所述感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许所述核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；

d)任选地，从步骤c所得的消化物纯化包含所述感兴趣的序列的靶核酸片段；

e)任选地，使接头与靶核酸片段连接；和

f)测序所述至少一个靶核酸片段。

优选地，本文所定义的方法对多个核酸样品平行进行。

优选地，所述核酸分子是基因组dna。

优选地，所述核酸分子是可从植物、动物、人或微生物获得的核酸分子。

第四方面，本发明涉及从核酸分子富集靶核酸片段的的成套试剂盒(kitofparts)，所述试剂盒包含：

-至少本文所定义的第一和第二grna-cas复合物以及

-核酸外切酶。

第五方面，本发明涉及本文所定义的第一和第二grna-cas复合物或本文所定义的成套试剂盒用于从核酸分子富集至少一个靶核酸片段的用途。

定义

本说明书和权利要求通篇使用了涉及方法、组合物、应用和本发明其他方面的各种术语。除非另有说明，这样的术语以本发明所属领域的通常意义给出。其他特别定义的术语以与本文所提供定义一致的方式解释。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料能用于实施本发明测试，但是优选的方法和材料如本文所述。

实施本发明所用常规技术的方法对技术人员是明显的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组dna、生物信息学、基因组学、测序和相关领域的常规技术实施为本领域技术人员熟知，且讨论于例如下列参考文献：sambrook等.《分子克隆.实验室手册》(molecularcloning.alaboratorymanual),第2版,冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress),纽约冷泉港,1989；ausubel等.《精编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology),约翰威利父子公司(johnwiley&sons),纽约,1987和定期更新；和《酶学方法》系列(theseriesmethodsinenzymology),学术出版社(academicpress),圣地亚哥。

除非上下文另有明确说明，“一(a、an)”和“所述”：这些单数形式术语包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括2个或更多细胞的组合等。

本文所用术语“约”用于描述并解释小变化。例如，该术语能指小于或等于±10％，如小于或等于±5％，小于或等于±4％，小于或等于±3％，小于或等于±2％，小于或等于±1％，小于或等于±0.5％，小于或等于±0.1％或者小于或等于±0.05％。另外，量、比例和其他数值有时在本文中以范围形式表示。应理解这种范围形式出于方便和简洁而使用，其应灵活理解包含明确指定为限值范围的数值，还包含该范围涵盖的所有单独数值或子区间，就如同各数值和子区间被明确指定。例如，约1-约200的范围内比例应理解为包含约1和约200的明确列举界限值，还包含单个比例如约2、约3和约4，以及子区间如约10-约50、约20-约100，等等。

本文所用术语“接头”是单链、双链、部分双链、y型或发夹核酸分子，其能附着优选连接其他核酸末端，例如双链dna分子的一条或两条链，且优选长度有限，如约10-约200、或约10-约100碱基、或约10-约80、或约10-约50、或约10-约30碱基对长度，并且优选是化学合成的。接头的双链结构可由彼此碱基配对的2个不同寡核苷酸分子形成，或由单一寡核苷酸链的发夹结构形成。显然，接头的可粘附末端能设计成与悬垂部分相容或任选地能与之连接，所述悬垂部分通过限制酶和/或可编程核酸酶切割来制备，可设计成与加入非模板延伸反应(如3’-a添加)后产生的悬垂部分相容，或可具有钝端。

“和/或”：术语“和/或”指其中所述的情况的一种或多种可能单独发生，或与所述的情况的至少一种，多至所述的情况的全部组合发生的情形。

用于核酸或核酸反应使用，“扩增”是指制备特定核酸如靶核酸或带标签核酸的拷贝的体外方法。多种扩增核酸方法为本领域已知，核酸反应包括聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应、转录介导扩增法如nasba(例如美国专利号5,409,818)、环介导扩增法(例如使用成环序列的“lamp”扩增，例如美国专利号6,410,278所述)和等温扩增反应。扩增的核酸可以是dna，包括以下、由其组成或从其衍生：dna或rna或dna与rna的混合物，包括经修饰的dna和/或rna。，无论起始核酸是dna、rna或两者，获自一个或多个核酸分子的扩增的产物(即“扩增产物”)可以是dna或rna，或dna与rna核苷或核苷酸的混合物，或其能包括经修饰的dna或rna核苷或核苷酸。

“拷贝”可以是但不限于某一序列，其与特定序列有全序列互补性或全序列相同性。或者，拷贝不必定与此特定序列具有完美序列互补性或相同性，例如允许一定程序的序列变化。例如，拷贝能包括核苷酸类似物如脱氧肌苷或脱氧尿苷，内部序列变化(如通过引物引入的序列变化，该引物所包含的序列与特定序列可杂交但不互补)，和/或扩增期间发生的序列错误。

术语“互补性”在本文中定义为序列与完全互补链(如第二或反链)的序列相同性。例如，100％互补(或全互补)的序列在本文理解为与互补链有100％序列相同性，且例如80％互补的序列在本文理解为与(全)互补链有80％序列相同性。

“包含”：此术语解释为包容性和开放性的，且不是排除性的。特别地，该术语和其变型指包含特定特征、步骤或组分。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。

“构建体”或“核酸构建体”或“载体”：这指人造核酸分子，产生自重组dna技术的使用且能用于向宿主细胞递送外源dna，通常目的是在宿主细胞中表达构建体上包含的dna区域。构建体的载体骨架可以是例如质粒，其中整合了(嵌合)基因，或如果适当转录调节序列(例如(诱导型)启动子)已存在，仅想要的核苷酸序列(如编码序列)整合在所述转录调节序列下游。载体可包含更多遗传因子以促进其在分子克隆中的应用，如选择性标记、多克隆位点等。

本文所用术语“双链”和“双链体”，描述碱基配对即杂交在一起的2条互补多核苷酸。互补核苷酸链在本领域也已知为反向互补。

本文所用术语“有效量”指足以引起想要的生物学效果的生物学活性剂的量。例如，在一些实施方案中，有效量核酸外切酶可指足以诱导未保护的核酸切割的核酸外切酶的量。本领域技术人员会理解，物质(agent)的有效量可根据多种因素变化，如所用的物质、使用所述物质的条件以及想要的生物学效果，例如待检测的核酸酶切割程度。

“示范性”：此术语指“用作示例、实例或说明”，且不应解释为排除本文公开的其他配置。

“表达”：这指其中可操作连接合适调控区尤其是启动子的dna区域转录成rna，其进而能翻译成蛋白或肽的过程。

“引导序列”在本文中应理解为指导rna或dna引导的核酸内切酶到rna或dna分子特定位点的序列。在grna-cas复合物的背景下，“引导序列”进一步在本文理解为sgrna或crrna的部分，其是使grna-cas复合物靶向双链dna特定位点所需的。

grna-cas复合物在本文中应理解为与引导rna复合或杂交cas蛋白，也称为crispr-核酸内切酶或crispr-核酸酶，其中引导rna可以是crrna和/或tracrrna或sgrna。

“相同性”和“相似性”能通过已知方法容易地计算。“序列相同性”和“序列相似性”能通过比对2个肽或2个核苷酸序列用总体或局部比对算法确定，取决于2个序列的长度。长度类似的序列优选用总体比对算法(如needlemanwunsch)比对，该算法优选在完整长度上比对序列，而长度显著不同的序列优选用局部比对算法(如smithwaterman)比对。当序列(优选通过例如程序gap或bestfit用默认参数比对时)共有至少某一最小百分比的序列相同性(如下所定义)时，序列可随后称为“大体相同”或“基本相似”。gap采用needleman和wunsch总体比对算法以在其完整长度(全长)上比对2个序列，使匹配数最大化且缺口数最小化。当2个序列具有相似长度时，总体比对适用于确定序列相同性。一般，采用gap默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)且空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，所用默认打分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白，默认打分矩阵是blosum62(henikoff&henikoff,1992,pnas89,915-919)。序列比对和序列相同性百分比的分数可用计算机程序测定，如gcgwisconsin包,10.3版,可获自accelrys公司(accelrysinc.),9685scranton路,圣地亚哥,ca92121-3752usa，或使用开源软件如程序“needle”(采用总体needlemanwunsch算法)或“water”(采用局部smithwaterman算法),embosswin2.10.0版，所用参数与上面gap相同，或使用默认设置(都用于“needle”和“water”且都用于蛋白及dna比对，默认空格罚分是10.0且默认空位延伸罚分0.5；默认打分矩阵是用于蛋白的blosum62和用于dna的dnafull)。当序列在长度方面显著不同时，优选局部算法如用smithwaterman算法的那些。

或者，相似性或相同性百分比可通过针对公开数据库搜索来确定，使用算法如fasta,blast等。因此，本发明的核酸和蛋白序列能进一步用作“查询序列”以针对公开数据库执行搜索，例如鉴定其他家族成员或相关序列。这类搜索能用altschul等.(1990)j.mol.biol.215:403—10的blastn和blastx程序(2.0版)实施。blast核苷酸搜索能用nblast程序,得分＝100,字长＝12执行，以获得本发明核酸分子的核苷酸序列同源物。blast蛋白搜索能用blastx程序,得分＝50,字长＝3执行，以获得本发明蛋白分子的氨基酸序列同源物。为获得空位比对用于比较目的，空位blast能如altschul等,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402所述使用。当使用blast和空位blast程序时，能采用各程序(如blastx和blastn)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

术语“核苷酸”包括但不限于天然存在的核苷酸，包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别是g、c、a和t)。术语“核苷酸”还意在包括以下这些部分：其不仅包含已知嘌呤与嘧啶碱基，还含有经修饰的其他杂环碱基。这类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶，酰化嘌呤或嘧啶，烷基化核糖或其他杂环。另外，术语“核苷酸”包含以下这些部分：其包含半抗原或荧光标记且可能不仅包含常规核糖及脱氧核糖，还含有其他糖。修饰核苷或核苷酸还包括糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基用卤素原子或脂族基取代，或作为醚、胺功能化，等等。

术语“核酸”、“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用以描述任何长度的聚合物，如大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500个碱基，大于1000个碱基，多至约10,000或更多个由核苷酸如脱氧核苷酸或核糖核苷酸构成的碱基，且可酶促或合成产生(例如pna，如美国专利号5,948,902和其中所引用参考文献所述)。所述核酸可与天然产生的核酸以序列特异性方式杂交，该方式与2个天然产生的核酸类似，如能参与watson-crick碱基配对相互作用。另外，核酸和多核苷酸可分离(且任选随后分段)自细胞、组织和/或体液。核酸可以是例如基因组dna(gdna)、线粒体、细胞游离dna(cfdna)、来自文库的dna和/或来自文库的rna。

本文所用术语“核酸样品”或“包含核酸的样品”指含核酸的任何样品，其中样品涉及材料或材料混合物，通常(尽管不必定)采用液体形式，包含一种或多种感兴趣的靶核苷酸序列。本发明方法中用作起始材料的核酸样品能来自任何来源，例如全基因组、染色体集合、单染色体、来自一个或多个染色体或转录的基因的一个或多个区域，且可直接纯化自生物来源或实验室来源如核酸库。核酸样品能获自同一个体，其可以是人或其他物种(如植物、细菌、真菌、藻类、古生菌等)，或来自同一物种的不同个体，或不同物种的不同个体。例如，核酸样品可来自细胞、组织、活组织检查、体液、基因组dna文库、cdna文库和/或rna文库。

术语“感兴趣的序列”、“感兴趣的靶核苷酸序列”和“靶序列”在本文中可互换使用，且包括但不限于优选存在于细胞内的任何基因序列，例如基因、部分基因或者基因内或邻近基因的非编码序列。感兴趣的靶序列可存在于染色体、附加体、细胞器基因组如线粒体或叶绿体基因组或能独立于遗传物质主体而存在的遗传物质，例如感染性病毒基因组、质粒、附加体，如转座子。感兴趣的序列可在基因的编码序列之内，转录的非编码序列之内，例如前导序列、尾随序列或内含子。所述感兴趣的核酸序列可存在于双链核酸或单链核酸。

感兴趣的序列可以是但不限于具有或疑似具有多态性如snp的序列。

本文所用术语“寡核苷酸”指核苷酸的单链多聚体，长度优选约2-200个核苷酸，或多至500个核苷酸。寡核苷酸可合成或酶促制备，在一些实施方案中，长度为约10-50个核苷酸。寡核苷酸能包含核糖核苷酸单体(即可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸可以是约10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-100、100-150、150-200或约200-250个核苷酸长度。

“植物”：这包括植物细胞、植物原生质体、能从其再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛以及在植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、外壳、梗、根、根尖、花药、谷粒等。植物的非限制性示例包括作物和栽培植物如大麦、卷心菜、油菜(canola)、木薯、花椰菜、菊苣、棉花、黄瓜、茄子、葡萄、辣椒、莴苣、玉米、甜瓜、油菜(oilseedrape)、土豆、南瓜、稻、黑麦、高粱、倭瓜、甘蔗、甜菜、向日葵、甜辣椒、番茄、西瓜、小麦和意大利青瓜。

“前间隔序列”是识别或可与引导rna内引导序列杂交的序列，更特定是crrna或在sgrna情况中，是引导rna的crrna部分，且位于靶序列中、处或附近。

“核酸内切酶”是在结合其靶或识别位点后，水解双链dna中至少一条链或一条rna分子链的酶，核酸内切酶在本文中应理解为位点特异性核酸内切酶且术语“核酸内切酶”和“核酸酶”在本文中可互换使用。限制性核酸内切酶在本文中应理解为同时水解双链体两条链的核酸内切酶，以在dna中引入双重链缺口。“切口”核酸内切酶是仅水解双链体中一条链的核酸内切酶，以生成“有切口的”而不是经切割的dna分子。

“核酸外切酶”在本文中定义为从多核苷酸末端(exo)切割一个或多个核苷酸的任何酶。

“降低复杂性”或“复杂性降低”在本文中应理解为复杂核酸样品减少，如衍生自基因组dna的样品，衍生自液体活检的cfdna，分离的rna样品等。复杂性减少可导致复杂起始材料内所包含的一种或多种特定靶序列或靶核酸片段(本文也命名为靶片段)富集和/或产生样品子集，其中该子集包含复杂起始材料内所包含的一种或多种特定靶序列或片段或者由其组成，而非靶序列或片段的量相较于起始材料即在复杂性减少前非靶序列或片段的量，下降至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。降低复杂性一般在进一步分析或方法步骤前实施，如扩增、条形编码、测序、确定表观遗传变异等。复杂性减少优选是可重复的复杂性减少，意味着当同一样品用相同方法降低复杂性时，获得相同或至少相当的子集，这与随机复杂性减少相反。降低复杂性方法的示例包括例如(keygenen.v.、thenetherlands；参见例如ep0534858)、任意引物pcr扩增、捕获探针杂交、dong所述方法(参见例如wo03/012118、wo00/24939)和索引链接(unraup.和deugauk.v.(1994)gene145:163-169)、wo2006/137733；wo2007/037678；wo2007/073165；wo2007/073171、us2005/260628、wo03/010328、us2004/10153所述方法、基因组分配(参见例如wo2004/022758)、基因表达系列分析(sage；参见例如velculescu等,1995,见上和matsumura等,1999,theplantjournal,卷20(6):719-726)以及sage改良(参见例如powell,1998,nucleicacidsresearch,卷26(14):3445-3446；和kenzelmann及1999,nucleicacidsresearch,卷27(3):917-918),microsage(参见例如datson等,1999,nucleicacidsresearch,卷27(5):1300-1307)、大规模并行签名测序(mpss；参见例如brenner等,2000,naturebiotechnology,卷18:630-634和brenner等,2000,pnas,卷97(4):1665-1670)、自消减cdna文库(laveder等,2002,nucleicacidsresearch,卷30(9):e38)、实时多重连接依赖性探针扩增(rt-mlpa；参见例如eldering等,2003,卷31(23):el53)、高覆盖率表达谱(hicep；参见例如fukumura等,2003,nucleicacidsresearch,卷31(16):e94)、roth等公开的通用微阵列系统(roth等,2004,naturebiotechnology,卷22(4):418-426)、转录组消减法(参见例如li等,nucleicacidsresearch,卷33(16):el36)和片段展示(参见例如metsis等,2004,nucleicacidsresearch,vol.32(16):el27)。

“序列”或“核苷酸序列”：这指核酸的或核酸内的核苷酸的顺序。换言之，核酸中的任何核苷酸顺序可称为序列或核酸序列。例如，靶序列是dna双链体单链所包含的核苷酸的顺序。

本文所用术语“测序”指获得多核苷酸中至少10个连续核苷酸特性(如至少20、至少50、至少100或至少200或更多个连续核苷酸特性)的方法。术语“二代测序”指所谓的平行合成测序或连接平台测序，例如依诺米那(illumina)、美国生命技术公司(lifetechnologies)、pacbio和罗氏(roche)等目前所用。二代测序方法还可包括纳米孔测序法，如牛津纳米孔技术公司(oxfordnanoporetechnologies)商品化的那些，或基于电子检测的方法如美国生命技术公司商品化的离子激流技术。

“靶核酸片段”或“靶片段”可以是小或较长延伸片段或选定部分的核酸，单或双链，包含感兴趣的序列或由其组成，其优选是进一步分析或作用的目标，例如但不限于复制、扩增、测序和/或其他核酸检测过程。复杂性减少前，靶核酸片段优选包含在较大核酸分子内，如待分析样品中存在的较大的核酸分子内部。

感兴趣的序列可以是样品核酸内的任何序列，如基因、基因复合物、基因座、假基因、调节区、高重复区、多态性区域或其部分。感兴趣的序列也可以是含遗传或表观遗传变异的区域，所述变异指示表型或疾病。在一些方面，选择一组靶核酸片段进行富集，所述片段包含一种或多种感兴趣的序列，或由其组成。任选地，该组由结构或功能相关靶核酸片段组成。一个或多个靶片段能包含天然或非天然、人工、或非经典核苷酸，包括但不限于dna、rna、bna(桥连核酸)、lna(锁核酸)、pna(肽核酸)、吗啉代核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、表观遗传修饰的核苷酸如甲基化dna以及模拟物和其组合。优选地，这些感兴趣的序列是双链dna中单链dna链的小或较长连续核苷酸延伸片段(即多核苷酸)，其中所述双链dna还包含与所述双链dna互补链中靶序列互补的序列。由感兴趣的序列和其互补链组成的双链dna在本文中也命名为靶核酸片段双链dna。优选地，所述双链dna是基因组dna(gdna)和/或细胞游离dna(cfdna)。

发明详述

发明人发现功能性grna-cas复合物对经切割的片段具有意外的保护效果。事实上，看来切割后，经切割的片段受到保护抵御核酸外切酶切割。不想受理论约束，此保护归因于在核酸外切酶处理期间仍结合切割片段末端的复合物。因此，本发明方法意外显示例如本文所公开的靶富集的无扩增方法不需要连接保护性接头。

第一方面，提供从包含核酸分子的样品中富集至少一个靶核酸片段的方法。优选地，靶核酸片段包含感兴趣的序列。优选地，所述核酸片段包含在如下文详述的富集步骤前样品中存在的核酸分子内。因此优选地，所述靶核酸片段是样品中核酸分子的片段。

优选地，本发明涉及从包含核酸分子的样品富集靶核酸片段的方法，其中靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二grna-cas复合物切割所述核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；和

d)任选地，从步骤c)所得的消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段。

优选地，步骤b)中的rna或dna指导的核酸内切酶复合物是grna-cas复合物、grna-argonaute复合物和gdna-argonaute复合物至少之一。优选地，步骤b)中的rna或dna指导的核酸内切酶复合物是grna-cas复合物。

优选地，步骤c)中，所述至少第一和第二grna-cas复合物结合靶核酸片段。

优选地，步骤c)中，所述至少第一和第二grna-cas复合物在步骤c)期间或至少部分步骤c)期间保持结合靶核酸片段。

优选地，步骤c)中，靶核酸片段不被核酸外切酶消化，即在步骤c)中，靶核酸片段受到保护抵御核酸外切酶消化。

优选地，步骤c)中，仅一个或多个非靶核酸片段被核酸外切酶消化。

在步骤b)中，用至少第一和第二grna-cas复合物切割所述核酸分子。任选地，步骤b)能在使所述核酸分子接触第一和第二grna-cas复合物的步骤以及允许所述复合物切割所述核酸分子的步骤中进一步说明。因此，在一个实施方案中，步骤b)能进一步如下说明：

b1)使所述核酸分子接触第一和第二grna-cas复合物，其中所述第一复合物的grna引导所述第一复合物到感兴趣的序列上游的序列，且其中所述第二复合物的grna引导所述第二复合物到感兴趣的序列下游的序列；和

b2)允许所述第一和第二grna-cas复合物切割核酸分子，其中至少一个经切割的核酸分子是靶核酸片段，且至少1个、优选2个经切割的核酸分子是非靶核酸片段。

发明人意外发现向步骤b的消化物加入核酸外切酶，而不采取更多措施以保护靶核酸片段，引起所述感兴趣片段富集。换言之，意外地，不需要通过例如连接惰性接头的进一步保护来保护靶核酸片段免于核酸外切酶降解。因此，本发明方法优选不包括以下进一步步骤：在核酸外切酶处理步骤前，保护靶核酸片段，或靶核酸片段末端。在一个优选实施方案中，本文所定义的方法在核酸外切酶处理前没有加入保护性接头。此背景下，保护性接头在本文中应理解为特别设计成针对核酸外切酶消化保护被接头捕获的靶核酸片段的接头。这种接头优选通过纳入化学部分或阻断基(如硫代磷酸)或缺乏末端核苷酸(发夹或茎环接头或可环化接头)针对核酸外切酶降解提供保护。

本发明的方法例如用于富集核酸样品，优选用于帮助下游加工或分析所述样品内的一个或多个靶核酸片段。富集引起本发明方法步骤a)中用作起始材料的核酸样品复杂性降低和/或本发明方法步骤a)中用作起始材料的核酸样品的一个或多个靶核酸片段子集产生。

因此，本发明第一方面还提供至少：

i)一种用于降低包含感兴趣的序列的核酸样品复杂性的方法，包括如上所定义的步骤a)–c)和任选存在的步骤d)；

ii)一种用于提供核酸样品子集的方法，包括如上所定义的步骤a)–c)和任选存在的步骤d)，其中所述子集包含一个或多个靶核酸片段；和

iii)一种用于分离或获得包含感兴趣的序列(来自包含所述感兴趣的序列的核酸分子)的片段即靶核酸片段的方法，包括如上所定义的步骤a)–c)和任选存在的步骤d)。

降低核酸样品复杂性在核酸测序应用方面有特别的效用，尤其是在其中靶核酸片段是复杂样品(例如但不限于基因组)内的次要种类的样品中。富集或复杂性降低可显著降低所产生的测序数据的成本，因为复杂样品的大部分在测序前去除，而靶核酸片段被选择性保留，因而更高百分比的序列读取产生自感兴趣的序列。

在优选实施方案中，通过本文方法生成的富集的靶核酸片段用于单分子、实时测序反应，如来自太平洋生物科学公司(pacificbiosciences)、加利福尼亚州门洛帕克的测序。也考虑使用其他测序技术，例如纳米孔测序(如来自牛津纳米孔(oxfordnanopore))、测序(依诺米那)、tsms^tm测序(helicos)、ion测序(美国生命技术公司)、焦磷酸测序(如来自罗氏/454)、测序(美国生命技术公司)、微阵列测序(如来自昂飞公司(affymetrix))、桑格测序等。优选地，所述测序方法能够测序长模板分子，如>1000-10,000碱基或更多。优选地，所述测序方法能够在反应期间检测测序碱基修饰，如通过监测测序反应的动力学检测。优选地，所述测序方法能分析单模板分子的序列，如实时分析。受益于本发明复杂性降低的方法的更多应用包括但不限于克隆、扩增、诊断、预测、治疗诊断、遗传筛查等，任选地，用于多态性检测，例如但不限于癌症诊断测试。任选地，本文的方法生成的经富集的核酸用于评价表观遗传变异如dna甲基化的试验。dna甲基化能用本领域已知的任何适当试验评价，如亚硫酸氢盐转化测定与测序的组合。亚硫酸氢盐转化也称为亚硫酸氢盐处理，用于使未甲基化胞嘧啶脱氨基以在dna中生成尿嘧啶，其用于下游应用以评估dna甲基化状态。甲基化胞嘧啶受到保护免于转化成尿嘧啶，允许使用直接测序来以单核苷酸分辨率测定未甲基化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的位置。或者或另外，当分析未扩增的和任选地未修饰的dna时，dna修饰能从测序数据中直接检测，而无需额外特定试验。在未扩增的和未修饰的dna中检测dna修饰的示例是使用smrt测序技术，来自太平洋生物科学公司。该方法因而还可包括向人受试者报告检测到的突变或诊断的步骤。该方法因而还可包括生成报告的步骤，所述报告包含用本发明方法获得的发现。

所述至少第一和第二grna-cas复合物在本文中应理解为crispr相关(cas)蛋白或crispr核酸酶，各自与引导rna复合。crispr核酸酶包含核酸酶结构域和至少一个与引导rna相互作用的结构域。当与引导rna复合时，引导rna将crispr核酸酶指引到特定核酸序列。引导rna与crispr核酸酶以及特定靶核酸序列相互作用，从而一旦经引导序列指引到包含特定核酸序列的位点，crispr核酸酶能够在靶位点引入断裂。优选地，在核酸酶的1个或2个结构域都具有催化活性的情况中，crispr核酸酶分别能够在靶位点引入单或双链断裂。技术人员清楚了解如何设计引导rna，采用的方式是当联合crispr核酸酶时，实现在核酸分子预定的位点处引入单或双链断裂。

基于核心元件含量和序列，crispr核酸酶一般可以分成6个主要类型(i-vi型)，其进一步细分成亚型(makarova等,2011,natrevmicrobiol9:467-77和wright等,2016,cell164(1-2):29-44)。一般而言，crispr-cas系统复合物的2个关键元件是crispr核酸酶和crrna。crrna由短重复序列组成，所述序列散布有衍生自入侵dna的间隔序列。cas蛋白具有多种活性如核酸酶活性。因此，grna-cas复合物提供靶向特定序列以及根据序列的某些酶活性的机制。

i型crispr-cas系统通常包含有分开的解旋酶和dnase活性的cas3蛋白。例如，在1-e型系统中，crrna纳入称为cascade(用于抗病毒防御的crispr相关复合物)的多亚基效应复合物内(brouns等,2008,science321:960-4)，其特异性结合双螺旋dna并通过cas3蛋白激发降解(sinkunas等,2011,emsoj30:1335-1342；beloglazova等,2011,emboj30:616-627)。

ii型crispr-cas系统包含特征性cas9蛋白，这是一种单一蛋白(约160kda)，能够产生crrna且特异性切割双螺旋dna。cas9蛋白通常包含2个核酸酶结构域，即氨基末端附近的ruvc样核酸酶结构域和蛋白中间附近的hnh(或mcra样)核酸酶结构域。cas9蛋白的各核酸酶结构域专门用于切割双螺旋的一条链(jinek等,2012,science337(6096):816-821)。cas9蛋白是ii型crispr/-cas系统的cas蛋白示例并形成核酸内切酶，当联合crrna和称为反式激活crrna(tracrrna)的第二rna时，其靶向入侵病原体dna，通过在crrna所定义的病原体基因组中的位置处引入dna双链断裂(dsb)进行降解。jinek等.(2012,science337:816-820)证明通过融合crrna和tracrrna必要部分而生成的单链嵌合引导rna(本文的“sgrna”)能够联合cas9蛋白形成功能性核酸内切酶。

iii型crispr-cas系统包含聚合酶和ramp组件。iii型系统能进一步分成亚型iii-a和iii-b。iii-a型crispr-cas系统显示靶向质粒，iii-a型系统的聚合酶样蛋白参与特异性切割dna(marraffini和sontheimer,2008,science322:1843-1845)。iii-b型crispr-cas系统还显示靶向rna(hale等,2009,cell139:945-956)。

iv型crispr-cas系统包含csf1，一种未表征的蛋白质，被提议形成部分cascade样复合物，不过这些系统通常作为分离cas基因发现，而没有相关crispr阵列。

最近描述了v型crispr-cas系统，来自普氏菌(prevotella)和弗朗西斯氏菌(francisella)的成簇的规律间隔短回文重复序列1，或crispr/cpf1。cpf1基因与crispr基因座相关且编码使用crrna来靶向dna的核酸内切酶。cpf1是比cas9更小且更简单的核酸内切酶，其可克服crispr-cas9系统的一些限制。cpf1是单rna指导的核酸内切酶，没有tracrrna，且其使用富含t的前间隔序列毗邻基序。cpf1经交错dna双链断裂来切割dna(zetsche等(2015)cell163(3):759–771)。v型crispr-cas系统优选包含cpf1、c2c1和c2c3的至少一种。

vi型crispr-cas系统可包含cas13a蛋白，其包含rnasea活性。在靶核酸片段是rna的情况中，本发明方法的至少第一和第二grna-cas复合物可包含cas13a，例如但不限于来自韦德纤毛菌(leptotreichiawadee，lwcas13a)或沙氏纤毛菌(leptotrichiashahii，lshcas13a)的cas13a，如描述于gootenberg等,science.2017年4月28日；356(6336):438-442。

本发明的方法的第一和第二grna-cas复合物可包含上文所定义的任何crispr核酸酶。优选地，本发明的方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一包含ii型crispr核酸酶如cas9(例如seqidno:1的蛋白，其由seqidno:2编码，或seqidno:19的蛋白)或v型crispr核酸酶如cpf1(例如seqidno:3的蛋白，其由seqidno:4编码)或mad7(例如seqidno:20或21的蛋白)或其衍生蛋白，与所述蛋白在其全长上具有优选至少约70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性。

优选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一包含ii型crispr核酸酶，优选cas9核酸酶。

技术人员了解如何制备crispr-cas系统的不同组分，包括crispr核酸酶。在现有技术中，在其设计和应用方面有许多报道。参见例如haeussler等(jgenetgenomics.(2016)43(5):239-50.doi:10.1016/j.jgg.2016.04.008.)关于设计引导rna和其与cas蛋白(初始获自酿脓链球菌(s.pyogenes))组合应用的近期的综述，或lee等的综述(plantbiotechnologyjournal(2016)14(2)448–462)。

一般地，crispr核酸酶如cas9包含2个催化活性核酸酶结构域。例如，cas9蛋白能包含ruvc样核酸酶结构域和hnh样核酸酶结构域。ruvc和hnh结构域一起合作，都切割单链以在dna中产生双链断裂(jinek等,science,337:816-821)。失活crispr核酸酶包含修饰，从而没有核酸酶结构域显示切割活性。用于本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一的crispr核酸酶可以是crispr核酸酶变体，其中一个核酸酶结构域突变，从而其不再具有功能(即缺少核酸酶活性)，由此产生切口酶。一个示例是具有d10a或h840a突变的spcas9变体。优选地，第一和第二grna-cas复合物的核酸酶至少之一不是失活核酸酶。优选地，第一grna-cas复合物的crispr核酸酶是切口酶或(内切)核酸酶。优选地，第二grna-cas复合物的crispr核酸酶是切口酶或(内切)核酸酶。

本发明的方法的至少第一和第二grna-cas复合物可包含完整cas9蛋白或变体或由其组成，或可包含其片段。优选地，这类片段确实结合crrna和tracrrna或sgrna，但可缺乏核酸酶活性所需的一个或多个残基。

优选地，第一和第二grna-cas复合物至少之一包含cas9蛋白。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含cas9蛋白。cas9蛋白可衍生自酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)(spcas9；ncbi参考序列nc_017053.1；uniprotkb-q99zw2),嗜热脱氮芽孢杆菌(geobacillusthermodenitrificans)(uniprotkb-a0a178tej9),溃疡性棒状杆菌(corynebacteriumulcerous)(ncbirefs:nc_015683.1,nc_017317.1)；白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheria)(ncbirefs:nc_016782.1,nc_016786.1)；螺原体(spiroplasmasyrphidicola)(ncbiref:nc_021284.1)；中间普雷沃菌(prevotellaintermedia)(ncbiref:nc_017861.1)；台湾螺原体(spiroplasmataiwanense)(ncbiref:nc_021846.1)；海豚链球菌(streptococcusiniae)(ncbiref:nc_021314.1)；罗的海贝尔氏菌(belliellabaltica)(ncbiref:nc_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(psychroflexustorquisl)(ncbiref:nc_018721.1)；嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(ncbiref:yp_820832.1)；listeriainnocua(ncbiref:np_472073.1)；空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)(ncbiref:yp_002344900.1)；或脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)(ncbiref:yp_002342100.1)。涵盖了来自这些的cas9变体，具有与spcas9同源的失活的hnh或ruvc结构域，如spcas9_d10a或spcas9_h840a，或者在spcas9蛋白中对应d10或h840的位置处有等价取代的cas9，产生切口酶。

根据一个优选实施方案，可编程核酸酶能衍生自cpf1，如来自氨基酸球菌属(acidaminococcussp)的cpf1；uniprotkb-u2umq6。该变体可以是有失活的ruvc或nuc结构域的cpf1-切口酶，其中ruvc或nuc结构域不再具有核酸酶活性。技术人员清楚了解本领域可获得的技术，如定点诱变、pcr介导的突变和全基因合成，其允许失活核酸酶如失活ruvc或nuc结构域。带有失活的nuc结构域的cpf1切口酶示例是cpf1r1226a(参见gao等.cellresearch(2016)26:901–913,yamano等.cell(2016)165(4):949–962)。此变体中，nuc结构域内有精氨酸到丙氨酸(r1226a)转换，这使得nuc结构域失活。

所述至少第一和第二grna-cas复合物还包含指导复合物到核酸样品中限定的位点的crispr核酸酶相关的引导rna，也称为前间隔序列。引导rna包含使grna-cas复合物靶向前间隔序列的引导序列，所述前间隔序列优选在核酸分子中感兴趣的序列附近、在核酸分子中感兴趣的序列处或在核酸分子中感兴趣的序列内部，且可以是sgrna或crrna与tracrrna的组合(如用于cas9)或仅crrna(如在cpf1情况中)。任选地，在同一实验中可以使用多于一种类型的引导rna，例如针对2种或更多不同的感兴趣的序列，或甚至针对相同感兴趣的序列。

本文中应理解在用至少第一和第二grna-cas复合物切割前，感兴趣的序列存在于核酸样品。切割核酸样品可产生至少2个或更多核酸片段，其中至少一个核酸片段是靶核酸片段且至少一个核酸片段是非靶核酸片段。靶核酸片段包含感兴趣的序列或由其组成。因此，在切割核酸样品前，技术人员很清楚核酸样品涵盖靶核酸片段且在切割后靶核酸片段从核酸样品释放。发明人发现grna-cas复合物切割的核酸片段受到保护免于消化，优选核酸外切酶消化。

本发明的方法需要第一grna-cas复合物的grna指导所述第一复合物到核酸样品中的序列，从而第一grna-cas复合物在感兴趣的序列上游切割核酸样品，且第二复合物的grna指导第二grna-cas复合物到核酸样品中的序列，从而第二grna-cas复合物在感兴趣的序列下游切割核酸样品。

优选地，grna-cas复合物包含切割前间隔序列内核酸的crispr核酸酶。优选的crispr核酸酶是cas9。

由第一grna-cas复合物结合的前间隔序列可以是靶核酸片段和/或非靶核酸片段中的序列。同样，由第二grna-cas复合物结合的前间隔序列可以是靶核酸片段和/或非靶核酸片段中的序列。优选地，前间隔序列是与靶核酸片段和非靶核酸片段重叠的序列，即grna-cas复合物的切割位点在前间隔序列内。

优选地，前间隔序列的位置取决于本发明方法所用的crispr核酸酶。作为非限制性示例，crispr核酸酶spcas9切割前间隔序列内的核酸。因此，当cas9用于本发明方法时，优选前间隔序列部分位于靶核酸片段且部分位于非靶片段，即前间隔序列在靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠。由此，优选地，第一和第二grna-cas复合物至少之一的grna引导序列能够与选自下组的前间隔序列杂交：

a)靶核酸片段中包含的前间隔序列杂交；

b)非靶核酸片段中包含的前间隔序列杂交；和

c)在靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠的前间隔序列。

a)在一个实施方案中，所述第一grna-cas复合物和第二grna-cas复合物至少之一的grna引导序列能够与一段序列杂交，所述序列是靶核酸片段的序列或是其部分，或与相反链中的其互补序列杂交，例如在核酸片段是双链的情况中。换言之，在此实施方案中，所述由第一和第二grna-cas复合物至少之一靶向的前间隔序列是靶核酸片段的序列或位于其中。优选地，由至少第一grna-cas复合物靶向的前间隔序列是靶核酸片段序列的5’-末端或位置与其毗邻，或其互补序列，且优选由至少第二grna-cas复合物靶向的前间隔序列是靶核酸片段序列的3’-末端或位置毗邻其，或其互补序列。毗邻可以是直接毗邻，或优选距离不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个连续核苷酸。核苷酸数目可以取决于本发明方法所用crispr核酸酶。

b)在一个实施方案中，所述第一grna-cas复合物和第二grna-cas复合物至少之一的grna引导序列能够与一段序列杂交，所述序列会形成或形成部分非靶核酸片段，或与相反链中的其互补序列杂交，在核酸样品是双链核酸的情况中。换言之，在此实施方案中，所述由第一和第二grna-cas复合物至少之一靶向的前间隔序列位置几乎毗邻或直接毗邻在切割后会形成靶核酸片段的序列。优选地，当片段存在于核酸样品或其互补序列时，由第一grna-cas复合物靶向的前间隔序列几乎在靶核酸片段5’-末端侧翼，优选直接在5’-末端侧翼。优选地，当片段存在于核酸样品或其互补序列时，由第二grna-cas复合物靶向的前间隔序列在靶核酸片段3’-末端侧翼，或直接在3’-末端侧翼。优选地，前间隔序列与核酸样品中靶核酸片段序列各5’末端或3’末端之间的距离不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸。核苷酸数目可能取决于本发明方法所用crispr核酸酶。

c)在一个优选实施方案中，所述第一grna-cas复合物和第二grna-cas复合物至少之一的引导序列能够与一段序列杂交，所述序列在非靶核酸片段和靶核酸片段之间重叠。优选地，所述至少第一或第二grna-cas复合物的引导序列能够与一段序列杂交，所述序列在非靶核酸片段3’末端和靶核酸片段5’末端之间重叠。优选地，所述至少第一或第二grna-cas复合物的引导序列能够与一段序列杂交，所述序列在非靶核酸片段5’末端和靶核酸片段3’末端之间重叠。换言之，在此实施方案中，优选的是，由至少所述第一或第二grna-cas复合物靶向的前间隔序列在非靶核酸片段3’末端和靶核酸片段5’末端之间重叠(当所述片段存在于核酸样品时，即在核酸样品切割前)。

作为非限制性示例，spcas9可在20nt前间隔序列内位置3与4之间切割。因此，在其3’-末端的靶核酸片段可包含前间隔序列的3nt且在其5’-末端的非靶核酸片段可包含前间隔序列的17nt。同样，如果前间隔序列在互补链上，在其3’-末端的靶核酸片段可包含前间隔序列的17nt且在其5’-末端的非靶核酸片段可包含前间隔序列的3nt。由此，在前间隔序列是20个连续核苷酸的示例中，前间隔序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15,16、17、18或19个核苷酸可存在于非靶核酸片段3’-末端，并且分别地，前间隔序列的19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸可存在于靶序列5’-末端，这取决于本发明方法所用crispr核酸酶类型。

优选地，由至少第一或第二grna-cas复合物靶向的前间隔序列在非靶核酸片段5’-末端与靶核酸片段3’-末端之间重叠(当所述片段存在于核酸样品时，即在核酸样品切割前)。作为前间隔序列是20个核苷酸的非限制性示例，前间隔序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,13,14、15,16、17、18或19个核苷酸可存在于非靶核酸片段5’-末端，前间隔序列的各19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸可存在于靶序列3-末端，这取决于本发明方法所用crispr核酸酶类型。

在一个优选实施方案中，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一结合靶核酸片段内的序列。优选地，所述第一和第二grna-cas复合物都结合靶核酸片段内的序列。

或者或另外，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一结合非靶核酸片段内的序列。优选地，所述第一和第二grna-cas复合物都结合非靶核酸片段内的序列。

或者或另外，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一结合在靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠的序列。优选地，所述第一和第二grna-cas复合物都结合在靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠的序列。

在一个优选实施方案中，所述第一和第二grna-cas复合物至少之一在切割后仍分别结合靶核酸片段的5’-末端或3’-末端。优选地，在切割后，至少一种grna-cas复合物保持结合靶核酸片段的5’-末端且一种grna-cas复合物保持结合靶核酸片段的3’-末端。不同的是，grna-cas复合物优选在靶核酸片段两边的侧翼。

因为除了前间隔序列，grna-cas复合物还需要前间隔序列邻近基序(pam)序列用于识别，grna应设计成使得所靶向的前间隔序列毗邻这类pam序列，这取决于所用的grna-cas复合物。pam序列对crispr/cas核酸内切酶活性是必需的，相对较短，因而通常在一定长度的任意给定序列中多次存在。例如，酿脓链球菌cas9蛋白的pam基序是ngg，其确保就任何给定基因组序列而言，存在多种pam基序且能设计许多不同引导rna。另外，引导rna还能设计成靶向同一双链序列的相反链。直接毗邻pam的序列被纳入引导rna。根据所用crispr-cas复合物，其可能长度不同。例如，用于在cas9sgrna中靶向序列的最优长度是20nt。根据所用crispr/cas核酸内切酶，复合物随后在离pam的不同距离处诱导2条dna链的切口。例如，酿脓链球菌cas9蛋白在pam序列上游3bp处诱导2条dna链的切口，以产生钝性dnadsb。根据例如所用crispr-cas复合物，用于切割核酸样品的pam位点可存在于所产生核酸片段或所产生非靶核酸片段。

优选地，核酸样品中的感兴趣的序列侧翼是pam序列或包含优选在感兴趣的序列末端附近的pam序列，所述pam序列已知用于和本文所定义复合物的crispr-系统核酸酶相互作用(例如参见ran等2015,nature520:186-191)。另外或替代地，pam序列优选在由第一和第二grna-cas复合物至少之一靶向的前间隔序列侧翼。

例如，若所述crispr核酸酶是酿脓链球菌cas9，pam序列可具有序列5’-ngg-3’。例如，对于嗜热脱氮芽孢杆菌t12cas9(例如参见wo2016/198361)，pam序列可具有序列5’-nnnncnna-3’。用于cas9核酸内切酶的更多已知pam序列是：iia型5'-nggnnnn-3'(酿脓链球菌)、5'-nngtnnn-3'(巴氏链球菌(streptococcuspasteurianus))、5'-nnggaan-3'(嗜热链球菌(streptococcusthermophilus))、5'-nngggnn-3'(金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus))以及iic型5'-nggnnnn-3'(白喉棒状杆菌(corynebacteriumdifteriae))、5'-nngggtn-3'(红嘴鸥弯曲杆菌(campylobacterlari))、5'-nnncatn-3'(细小棒菌(parvobaculumlavamentivorans))和5'-nnnngta-3'(灰色奈瑟球菌(neiseriacinerea))。本领域技术人员因而能够设计grna以使来自样品核酸的靶序列片段化。

适合作为crrna和tracrrna用作grna-cas复合物中grna的分子为本领域熟知(参见例如wo2013142578和jinek等,science(2012)337,816-821)。

在一个实施方案中，所述crrna至少之一包含能与感兴趣的序列，优选本文所定义感兴趣的序列，杂交或在其附近杂交的序列。因此优选地，所述crrna至少之一包含与感兴趣的序列中序列完全互补的序列，即感兴趣的序列包含前间隔序列。

在一个实施方案中，所述至少一种crrna包含能与感兴趣的序列，优选本文所定义感兴趣的序列，的互补序列杂交或在其附近杂交的序列。因此优选地，所述crrna至少之一包含与感兴趣的序列或部分感兴趣的序列有完全序列相同性的核苷酸序列。

优选地，一种或多种crrna还能够与tracrrna复合。用于本发明方法的crrna至少之一能包含未修饰或天然存在的核苷酸或者由其组成。或者或另外，至少一种crrna能包含修饰或非天然存在的核苷酸或者由其组成，优选这类化学修饰的核苷酸用于保护crrna免于降解。在一个实施方案中，所述用于本发明方法的至少2种或所有crrna能包含修饰或非天然产生核苷酸或者由其组成。

在本发明的一个实施方案中，所述至少一种crrna可以包含核糖核苷酸和非核糖核苷酸。所述至少一种crrna能包含一个或多个核糖核苷酸以及一个或多个脱氧核糖核苷酸。

所述至少一种crrna可包含一个或多个非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物，如有硫代磷酸连接的核苷酸、在核糖环2'与4'碳之间包含亚甲桥的锁核酸(lna)核苷酸、桥接核酸(bna)、2’-o-甲基类似物、2'-脱氧类似物、2'-氟类似物或其组合。修饰的核苷酸可包含选自但不限于下组的修饰的碱基：2-氨基嘌呤、5-溴-尿苷、假尿苷、肌苷和7-甲基鸟苷。

所述至少一种crrna可如下化学修饰：在一个或多个末端核苷酸处并入2'-o-甲基(m)、2'-o-甲基3'硫代磷酸酯(ms)、2'-o-甲基3'thiopace(膦酰乙酸酯)(msp)或其组合。这种化学修饰crrna能包含相较未修饰crrna增加的稳定性和/或活性(hendel等,2015,natbiotechnol.33(9)；985-989)。在某些实施方案中，所述至少一种crrna在与前间隔序列杂交的区域中包含核糖核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物能并入经工程化的crrna结构，例如但不限于在与前间隔序列杂交的序列中，在与tracrrna相互作用的序列中或这些序列之间。

或者或另外，化学修饰核苷酸能位于与前间隔序列杂交的序列5’和/或3’。化学修饰的序列能进一步位于与tracrrna相互作用的序列的5’和/或3’。

在一个优选实施方案中，所述至少一种crrna的长度可以是至少约15、20、25、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，所述至少一种crrna的长度小于约75、50、45、40、35、30、25或约20个核苷酸。优选地，用于本发明方法的crrna长度是约20-100、25-80、30-60或约35-50个核苷酸长度。

与前间隔序列杂交的crrna序列部分设计成与前间隔序列有足够互补性，以与前间隔序列杂交并指导所复合的核酸酶的序列特异性结合。前间隔序列优选毗邻前间隔序列邻近基序(pam)序列，该pam序列可与本文所定义的rna指导的crispr系统核酸内切酶复合物中crispr核酸酶相互作用。例如，在crispr核酸酶是酿脓链球菌cas9的情况中，pam序列优选是5’-ngg-3’，其中n可以是t、g、a或c中的任何一种。技术人员能够改造crrna以靶向任何所需序列，优选通过改造序列成与任何所需前间隔序列至少部分互补，从而与其杂交。优选地，部分crrna序列与其对应的前间隔序列之间的互补性用适当比对算法最优比对时，是至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％。与前间隔序列互补的部分crrna序列可以是至少约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，与dna靶序列互补的序列小于约75、50、45、40、35、30、25、20个核苷酸长度。优选地，与dna序列互补的序列长度是至少17个核苷酸。优选地，互补crrna序列是约10-30个核苷酸长度，约17–25个核苷酸长度或约15-21个核苷酸长度。与前间隔序列互补的部分crrna优选是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长度，优选20或21个核苷酸，优选20个核苷酸。

与tracrrna相互作用的crrna的部分设计成与tracrrna有足够互补性，以与tracrrna杂交并指导所复合的核酸酶到前间隔序列。优选地，此部分crrna序列与其tracrrna对应部分之间的互补性用适当比对算法最优比对时，是至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％。与tracrrna相互作用的部分crrna优选是至少约5、10、15、20、22、25、30、35、40、45或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，与tracrrna相互作用的部分crrna小于约60、55、50、45、40、35、30或35个核苷酸长度。优选地，与tracrrna相互作用的部分crrna是约5–40、10-35、15-30、20-28个核苷酸长度。与tracrrna相互作用的部分crrna长度优选是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明方法所用的至少第一和第二grna-cas复合物分别包含第一和第二crrna。然而，第一和第二grna-cas复合物可包含相同的tracrrna。

tracrrna优选包含一个或多个结构基序，其能与本文所定义的复合物的crispr系统核酸酶相互作用。优选地，tracrrna还能与本文所定义的crrna相互作用。tracrrna和crrna可通过crrna与tracrrna之间碱基配对来杂交。tracrrna优选能够与crispr系统核酸酶和crrna形成复合物。crrna能够复合tracrrna并能与靶序列杂交，从而指导核酸酶到靶序列。

tracrrna可包含一个或多个茎环结构，如1、2、3或更多个茎环结构。

tracrrna能包含未修饰或天然存在的核苷酸，或由其组成。或者或另外，tracrrna能包含修饰或非天然存在的核苷酸，或由其组成，优选这类化学修饰核苷酸用于保护tracrrna免于降解。

在本发明的一个实施方案中，所述tracrrna包含核糖核苷酸和非核糖核苷酸。tracrrna能包含一个或多个核糖核苷酸以及一个或多个脱氧核糖核苷酸。

tracrrna可包含一个或多个非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物，如有硫代磷酸连接的核苷酸、在核糖环2'与4'碳之间包含亚甲桥的锁核酸(lna)核苷酸、桥接核酸(bna)、2’-o-甲基类似物、2'-脱氧类似物、2'-氟类似物或其组合。修饰核苷酸可包含选自但不限于下组的修饰碱基：2-氨基嘌呤、5-溴-尿苷、假尿苷、肌苷和7-甲基鸟苷。

tracrrna可如下化学修饰：在一个或多个末端核苷酸处纳入2'-o-甲基(m)、2'-o-甲基3'硫代磷酸酯(ms)、2'-o-甲基3'thiopace(膦酰乙酸酯)(msp)或其组合。这种化学修饰tracrrna能包含相较未修饰tracrrna增加的稳定性和/或活性(hendel等,2015,natbiotechnol.33(9)；985-989)。在某些实施方案中，所述tracrrna在与crrna相互作用的区域中包含核糖核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，所述脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物能纳入改造的tracrrna结构，例如但不限于在与crrna相互作用的序列中，在与crispr系统核酸酶相互作用的序列中或这些序列之间。

或者或另外，化学修饰核苷酸能位于与crrna相互作用的序列的5’和/或3’。化学修饰核苷酸能进一步位于与crispr系统核酸酶相互作用的序列的5’和/或3’。

在一个优选实施方案中，所述tracrrna长度可以是约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，所述tracrrna小于约200、180、160、140、120、100、95、90、85、80或75个核苷酸长度。tracrrna长度优选是约30–120、40-100、50-90或约60-80个核苷酸长度。

与crispr系统核酸酶相互作用的tracrrna序列部分设计成足以指导复合核酸酶到靶序列。与crispr系统核酸酶相互作用的tracrrna序列的部分可以是约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，所述与crispr系统核酸酶相互作用的序列小于约120、100、80、72、70、60、55、50、45、40、30或20个核苷酸长度。优选地，与crispr系统核酸酶相互作用的tracrrna序列部分是约20-90、30-85、35-80、40–75或50-72个核苷酸长度。优选地，与crispr系统核酸酶相互作用的tracrrna部分是约40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76个核苷酸长度。

与crrna相互作用的tracrrna序列部分设计成与crrna有足够互补性，以与crrna杂交并指导所复合的核酸酶到靶序列。优选地，此部分tracrrna序列与其crrna对应部分之间的互补性用适当比对算法最优比对时，是至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％。与crrna相互作用的tracrrna的部分优选是至少约5、10、15、20、22、25、30、35、40、45或更多个核苷酸长度。在一些优选实施方案中，所述与crrna相互作用的tracrrna的部分小于约60、55、50、45、40、35、30或35个核苷酸长度。在一个优选实施方案中，所述与crrna相互作用的tracrrna部分是约5–40、10-35、15-30、20-28个核苷酸长度。优选地，与crrna相互作用的部分长度是约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。

优选地，crrna和tracrrna连接在一起形成sgrna。crrna和tracrrna能连接，优选共价连接，使用本领域已知的任何常规方法。例如，crrna和tracrrna的常规连接描述于jinek等.(同上)和wo13/176772，其通过引用纳入本文。crrna和tracrrna能共价连接，使用例如接头核苷酸或通过crrna3'末端与tracrrna5'末端直接共价连接。优选地，所述至少第一和第二grna-cas复合物的grna设计成在核酸样品用至少第一和第二grna-cas复合物温育后，来自核酸样品的核酸内所含靶核酸片段从所述核酸中切下。另外，优选第一grna设计成第一grna-cas复合物在核酸样品切割后结合靶核酸片段。另外，优选第二grna设计成第二grna-cas复合物在核酸样品切割后结合靶核酸片段。优选地，靶核酸片段存在于核酸样品时，侧翼是至少一个非靶核酸片段。优选地，靶核酸片段存在于核酸样品时，2边侧翼都是非靶核酸片段，即一个非靶核酸片段直接存在于靶核酸片段5’且一个非靶核酸片段直接存在于靶核酸片段3’。

优选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一包含sgrna用于使crispr核酸酶优选cas9，靶向靶核酸片段中的序列。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含sgrna以用于使各第一和第二grna-cas复合物靶向靶核酸片段中的序列。本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一优选包含sgrna以用于使crispr核酸酶优选cas9，靶向毗邻优选直接毗邻靶核酸片段的序列，此时该片段包含于核酸样品内。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含sgrna用于使各第一或第二grna-cas复合物，靶向毗邻优选直接毗邻靶核酸片段的序列，其中靶核酸包含于核酸样品内。

优选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一包含sgrna以用于使crispr核酸酶优选cas9，靶向靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠的序列，此时该片段包含于核酸样品内。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含sgrna以用于使各第一或第二grna-cas复合物，靶向靶核酸片段与非靶核酸片段之间重叠的序列，其中靶核酸包含于核酸样品内。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含sgrna以用于使各第一或第二grna-cas复合物，分别靶向靶核酸片段5’-末端与非靶核酸片段3’-末端之间重叠的序列以及靶核酸片段3’-末端与非靶核酸片段5’-末端之间重叠的序列，此时靶核酸包含于核酸样品内。

或者，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物至少之一包含二元引导rna以使crispr核酸酶优选cas9，靶向核酸样品中的序列，即靶核酸片段中存在的或非靶核酸片段中存在的前间隔序列。二元引导rna(dgrna)在本文中应理解为包含crrna和tracrrna作为单独但优选杂交的分子，或由其组成。任选地，本发明方法的第一和第二grna-cas复合物都包含dgrna用于使各第一或第二grna-cas复合物靶向前间隔序列。

优选地，第一和第二grna-cas复合物至少之一能够诱导双链断裂(dsb)。优选地，第一和第二grna-cas复合物都能够诱导核酸样品中的双链断裂(dsb)。

或者，第一和第二grna-cas复合物至少之一是切口酶，本文表示为第一或第二grna-cas-切口酶复合物，其能够在双螺旋dna的仅一条链上产生缺口。在本发明的这个实施方案中，步骤b)中，加入额外即第三grna-cas复合物，其能够在双螺旋dna的互补链上产生缺口，大致在第一或第二grna-cas-切口酶复合物产生缺口的互补位置。大致在互补位置产生缺口优选引起核酸样品中的双链(即钝的或交错的)断裂。

作为非限制性示例，例如第三grna-cas-切口酶的前间隔序列优选是互补链中的序列，该序列与第一grna-cas-切口酶复合物靶向的前间隔序列互补，或在互补链上游或下游方向移动约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个核苷酸内的序列。例如，在第一grna-cas复合物是grna-cas-切口酶复合物的情况中，第三grna-cas-切口酶复合物能在步骤b中加入，导致通过所述第一和第三grna-cas-切口酶复合物在感兴趣的序列一侧诱导的双链断裂，其可以是钝端，此时实际相反位置被所述第一和第三复合物形成切口，或可以是交错的，此时被所述第一和第三复合物形成缺口的位置不完全是相反的。同样，除了所述第一和第三grna-cas-切口酶复合物外，使用第二和更多如第四grna-cas-切口酶复合物可产生本发明方法步骤b)所得靶核酸片段的2个钝或交错末端。在一些情况中，例如在后续定向接头连接的情况中，可能需要在本发明方法步骤b所生成靶核酸片段的1个或2个末端处产生交错末端。

本发明的方法的步骤b)可如下进行：将所述至少第一和第二grna-cas复合物与核酸样品一起温育，所用条件和时间适合grna-cas复合物诱导至少一个单链断裂，任选地双链断裂，例如但不限于本文所提供实施例中详述的条件。任选地，所述温育在约10-90℃，优选约37℃进行约1分钟-约18小时，优选约60分钟。

发明人发现由grna-cas切割的靶核酸片段受到保护免于核酸外切酶处理。因此，从核酸切割靶核酸片段后，立即加入核酸外切酶以消化一种或多种非靶核酸。靶核酸片段受到保护免于降解，而未保护片段被降解，引起靶片段富集或复杂性减少。因而，本发明的方法采用去除不需要的(非靶)核酸样品部分的方法，而不是移出感兴趣部分，从而回避了复杂的亲和性选择方案。

核酸外切酶可以是核酸外切酶i、iii、v、vii、viii或相关酶，或其任何组合。核酸外切酶iii识别切口并延伸切口到空位，直至形成一段ssdna。核酸外切酶vii能降解此ssdna。核酸外切酶i也降解ssdna。exoiii和exovii是核酸外切酶的优选组合，用于本发明方法步骤c)。

核酸外切酶v能够以3’到5’和5’到3’方向降解ssdna及dsdna。因此，在一个优选实施方案中，本发明方法步骤c)的核酸外切酶是能够以3’到5’和5’到3’方向降解ssdna及dsdna的核酸外切酶，优选核酸外切酶v。

关于降解非靶序列的更多信息提供于美国专利公开号2014/0134610，其通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

另外，核酸内切酶即限制性酶可用于降解未保护片段，与本发明方法步骤c)的核酸外切酶消化一起、之前、之后或其任何组合。本文应理解用于本发明方法的限制性酶优选根据一个或多个感兴趣靶序列选择，所述序列用本发明方法富集，因为一种或多种限制性酶优选不应具有一个或多个感兴趣靶序列内存在的识别位点，但优选应具有剩余核酸样品即一个或多个非靶核酸片段中一个或多个位置处存在的识别位点。在本发明方法步骤c)的核酸外切酶处理之前或甚至步骤b)的切割反应之前，限制性酶消化的益处是这种消化产生片段，如果该片段不受grna-cas复合物保护，则更易由步骤c)的核酸外切酶消化。

实施步骤c)和任选存在的核酸内切酶步骤，所用条件和时间足以使核酸外切酶(和任选存在的核酸内切酶)降解几乎所有未保护片段，例如但不限于本文所提供实施例详述的条件。优选地，以足以使核酸外切酶(和任选存在的核酸内切酶)降解所有未保护的片段的条件和时间实施步骤c)。步骤c)在约10-90℃，优选约37℃，优选进行约1分钟-约12小时，优选30分钟。

在步骤c)后，可以灭活核酸外切酶和任选存在的核酸内切酶，通过例如但不限于至少一种蛋白酶如蛋白酶k处理或者热灭活。这类技术是本领域标准且技术人员直接理解如何灭活核酸外切酶和任选存在的核酸内切酶。优选的灭活步骤是在约50-90℃，优选约75℃的温度加热样品，持续约1–120分钟，优选约10分钟。灭活步骤优选在本发明方法步骤c)与d)之间。

在本发明步骤c)后，富集了一个或多个靶核酸片段的样品可接受纯化步骤如基于ampure珠的纯化工艺，以去除复合物、酶、游离核苷酸、可能的游离接头和可能的小、非靶核酸片段。靶核酸片段可在纯化后回收，并接受进一步加工和/或分析如单分子测序。

本发明方法还可包含尺寸选择步骤。任选地，尺寸选择步骤在本发明方法步骤b)之前、步骤b)与c)之间或步骤c)之后进行。

靶核酸片段长度可变，但优选至少200、500、1000、3000、5000、7000、10,000、15,000或20,000(多至至少100,000)个碱基长度。长度主要取决于预期用途，在一些最优实施方案中，基于待使用特定测序技术的平均读数长度。

本文中应理解有效量的组分用于本发明方法。例如，步骤b)中加入的至少第一和第二grna-cas复合物以足以诱导样品内一个或多个核酸分子切割的量提供。另外，步骤c)所加入核酸外切酶施用的量足以降解样品或起始材料内至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的非靶核酸片段。

本发明方法可包含一个或多个纯化步骤，优选本文所定义步骤c)之后。任选存在的纯化步骤是蛋白酶k处理。或者或另外，所述纯化可包括下列步骤：

i.使步骤c)后所得的经消化的核酸样品暴露于一个或多个固体支持物，所述支持物特异且有效结合一个或多个靶核酸片段；和任选地，

ii.洗涤所述一个或多个固体支持物，并从所述一个或多个固体支持物洗脱靶核酸片段。

所述一个或多个固体支持物可以是但不限于ampure珠。由于纯化后获得至少一个分离靶核酸片段，本文所定义的方法也可视作从核酸样品分离一个或多个靶核酸片段的方法。

本发明的方法之后可以是测序一个或多个靶核酸片段的步骤。因此，本文所定义方法还可视作测序来自核酸样品的一个或多个靶核酸片段的方法。

任选地，本发明方法还包含扩增步骤。优选地，此扩增在核酸外切酶处理即本文所定义步骤c)后进行。扩增能通过pcr或本领域已知任何扩增方法完成。

本发明的方法也可包括连接一个或多个接头到靶核酸片段的步骤。优选地，这类接头连接在本文所定义步骤c)后进行。这些一个或多个接头可包含功能结构域，优选选自限制性位点结构域、捕获结构域、测序引物结合位点、扩增引物结合位点、检测结构域、条形码序列、转录启动子结构域和pam序列或其任何组合。条形码可以是但不限于样品条形码或独特的分子标识符(umi)。

在尤其优选的实施方案中，所述一个或多个接头是测序接头，例如包含的功能结构域允许罗氏454a和454b测序、illumina^tmsolexa^tm测序、应用生物系统公司(appliedbiosystems)的solid^tm测序、太平洋生物科学公司的smrt^tm测序、pollonatorpolony测序、牛津纳米孔技术或全基因组测序。

根据接头设计，接头可以是单链、双链、部分双链、y型、发夹或可环化接头。任选地，能使用一个或多个接头。任选地，能使用一组或多组的2个接头，其中一组的第一接头旨在靶核酸片段5’末端侧连接且组的第二接头旨在靶核酸片段3’末端侧连接。组内第一和第二接头优选各包含相容性引物结合序列，从而接头连接的片段易用相容性引物对扩增或测序。

在一个优选实施方案中，本发明方法没有扩增和/或克隆步骤。减少扩增步骤是有益的，因为表观遗传学信息(例如5-mc、6-ma等)会在扩增子中丧失。进一步扩增能在扩增子中引入变化(如通过扩增期间的错误)，从而其核苷酸序列不反映初始样品。类似地，靶区域克隆到另一生物体内通常不维持初始样品核酸中存在的修饰，因此，在优选实施方案中，待富集用于进一步分析的靶序列通常不在本文方法中扩增和/或克隆。

茎环或发夹接头是单链的，但其末端互补，从而接头自身回折以产生双链部分和单链环。茎环接头能连接线性、双链核酸末端。例如，茎环接头连接双链靶核酸片段末端，从而没有末端核苷酸(例如任何空位被填充且连接，分别使用聚合酶和连接酶)时，所得分子缺乏末端核苷酸，而不是在各末端携带单链环。

靶核酸片段能连接可环化接头。此方面中，含靶序列的片段可如下环化：通过相容性结构在片段任一侧自身环化(其可由接头连接或经连接接头的限制性酶消化引起)，或通过杂交与所需片段末端互补的选择探针。延伸和最终连接步骤形成了共价闭合的环状，任选地，双链多核苷酸。

本文中应理解核酸样品包含至少一个靶核酸片段。不同的是，核酸样品因而可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个靶核酸片段，例如至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000或更多个靶核酸片段，其中优选样品内的各靶核酸片段具有不同序列。本发明方法可提供来自核酸样品的这些靶核酸片段同步富集。因此任选地，本发明方法步骤b)中，加入多组的至少第一和第二grna-cas复合物以从核酸样品富集、分离或测序多个靶核酸片段。优选地，这些多组的第一和第二grna-cas复合物可包含相同crispr核酸酶，但其grna不同。例如，对于各靶核酸片段，可使用2个不同grna分子，如一个grna纳入第一grna-cas复合物，另一grna纳入第二grna-cas复合物。对于例如至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000或更多个靶核酸片段，优选至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000或更多组grna分子，优选至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000或更多个不同grna分子，可用于本发明方法。

任选地，本发明方法是多路的，即同时施用于多个核酸样品，例如用于至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或更多个核酸样品。所述方法可就多个样品平行实施，其中“平行”在本文中应理解为几乎同时，但各样品在单独反应管或容器中处理。另外或替代地，本发明方法的一个或多个步骤可在合并样品上进行。为追溯富集、分离和/或测序片段到初始样品，片段可用标识符作标签，然后合并样品。这类标识符能是任何可检测实体，例如但不限于放射性或荧光标记，但优选是特定核苷酸序列或核苷酸序列组合，优选具有定义长度。另外或替代地，样品能用聪明的混同策略合并，例如但不限于2d和3d合并策略，从而合并后，各样品分别包含于至少2或3个池。特定靶片段能追溯到初始样品，使用含有特定富集、分离和/或测序靶片段的各池坐标。

本发明方法的核酸样品可来自任何来源，如人、动物、植物、微生物，且可以是任何种类，如细胞内源或外源，例如基因组dna、染色体dna、人工染色体、质粒dna或游离型dna、cdna、rna、线粒体、或人工文库如bac或yac等。dna可以是核或细胞器dna。dna优选是染色体dna，优选细胞内源。

另一方面，本发明提供用于上文所定义的方法的成套试剂盒。优选地，所述试剂盒包含至少以下之一：

-一个或多个小瓶，包含本文所定义的至少第一和第二grna-cas复合物；

-一个或多个小瓶，包含至少第一和第二grna，用于复合crispr-cas蛋白形成grna-cas复合物，以及包含所述crispr-cas蛋白的另一小瓶；

-另一小瓶，包含一种或多种核酸外切酶以降解非靶核酸；和

-任选存在的小瓶，包含一种或多种限制性酶以降解非靶核酸。

任选地，试剂盒还包含一个或多个本文所定义接头，有一个或多个上文所示小瓶或在单独小瓶中。试剂盒优选包含至少2、4、10、20、30或50个小瓶，含有本文所定义一种或多种grna。试剂盒内任何小瓶的体积优选不超过100ml、50ml、20ml、10ml、5ml、4ml、3ml、2ml或1ml。

试剂可以冻干形式存在，或溶于适当缓冲液。试剂盒还可包含完成本发明所需的任何其他组分，如缓冲液、吸量管、微量滴定板和书面说明。用于本发明的试剂盒的这类其他组分是技术人员已知的。

最后，提供本文所定义的至少第一和第二grna-cas复合物或成套试剂盒用于从核酸样品富集至少一个靶核酸片段的用途。更具体地，提供所述至少第一和第二grna-cas复合物用于保护靶核酸片段免于核酸外切酶降解的用途。

附图说明

图1：λdna中的pcii限制性核酸内切酶识别位点和cas9sgrna位置。指示片段尺寸以及用cas9靶向的片段。

图2：经消化的dna样品的电泳分析。a)pcii消化的λdna，没有cas9靶向和保护。b)pcii消化的λdna，有cas9靶向和保护。

图3：femto脉冲(advancedanalytical)分析经消化的甜瓜dna，使用靶向423个基因组基因座的cas9，每个基因座具有5.1-5.6kbp的尺寸，池为1406sgrna。在靶基因座侧翼序列中设计sgrna。实际靶向区域的总长是～5.5kbp。可见大小为～6.4kbp的清晰峰值。所量的(sized)长度的差异正常，这归因于量度(sizing)的不准确。左侧第一泳道是经消化的甜瓜dna，第二泳道是标记。

图4：femto脉冲(advancedanalytical)分析选定尺寸的dna。从图3所示样品可见，片段选择范围是2.5kbp–10kbp，使用sagesciencebluepippin。左侧第一泳道是经消化且选定尺寸的dna，第二泳道是标记。

图5：甜瓜(melonvedrantais)基因组区域的igv可视化，将在富集操作后获得的读取进行作图到所述区域。灰盒描述就2个靶基因座而言的相对读数覆盖范围(上部)，下面显示作图的读数。靶向基因座指示为作图读数下的黑条。在这些黑条下方，用于这些基因座的所用sgrna位置以黑线指示。显示的是，富集的读取在选定sgrna位置开始且完全涵盖靶向基因座。

实施例

实施例1

材料与方法

共3μgλdna(seqidno:5、genbank登录号j02459.1)(10μl300ng/μl)用限制性核酸内切酶pcii(新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))消化，通过加入下列组分、2μl10xneb3.1缓冲液(新英格兰生物实验室)、3μlpcii核酸内切酶(10u/μl)和5μl无核酸酶水进行。所得20μl反应混合物在37℃温育1小时，之后酶通过80℃温育20分钟灭活。λdna中2个pcii识别位点的概览如图1所示。

pcii限制性酶切的λdna中的2个特定位点用cas9和2个为这些靶向位点设计的sgrna来靶向。第一sgrna(sgrna9)具有seqidno:13并靶向具有seqidno:14的前间隔序列。第二sgrna(sgrna13)具有seqidno:15并靶向具有seqidno:16的前间隔序列。反应条件是：20μlpcii限制性酶切的λdna(见上)、1μl10xneb3.1缓冲液、3μl0.3μmsgrna9、3μl0.3μmsgrna13、1.8μlcas9蛋白(新英格兰生物实验室)和1.2μl无核酸酶水。30μl反应混合物在37℃温育1小时。

未保护片段通过用核酸外切酶v温育来去除。为此，向12.5μlcas9反应物加入下列组分：1.75μl10xneb3.1缓冲液、3.0μl10mmatp(新英格兰生物实验室)、1.0μl10u/μlexov核酸外切酶(新英格兰生物实验室)和11.75μl无核酸酶水。所得30μl反应混合物在37℃温育30分钟。蛋白通过75℃温育10分钟灭活。

进行下列对照反应：

1.仅限制性酶切λdna。为此，仅实施上述pcii限制性反应。

2.将pcii限制性酶切的λdna与核酸外切酶v温育。为此，pcii限制性酶切λdna后，加入下列组分：1.0μl10xneb3.1缓冲液、3.0μl10mmatp、1.0μl10u/μlexov核酸外切酶和5.0μl无核酸酶水。30.0μl反应混合物在37℃温育30分钟。核酸外切酶通过75℃温育10分钟灭活。

所有样品用ampurexp溶液(贝克曼库尔特(beckmancoultier)，美国加利福尼亚布州布雷亚)纯化，珠与样品之比为0.8x。结合后，珠用70％乙醇洗2次，结合的dna在10μl无核酸酶水洗脱。

洗脱的dna用femto脉冲(advancedanalytical)分析。

结果

femto脉冲分析结果如图2所示：简言之；

·用pcii限制性酶消化的λdna显示以下长度的预期片段:～600bp(seqidno:6)–～9,000bp(seqidno:8)–～40,000bp(seqidno:7)

·用pcii限制性酶消化且后续用exov核酸外切酶温育的lambdadna没有显示剩余片段，表明缺乏核酸外切酶保护

·用pcii限制性酶消化并用带sgrna9和13的cas9靶向的λdna显示以下长度的预期片段:～600bp(seqidno:6)–～9,000bp(2x)(seqidno:11和12)–～10,000bp(seqidno:10)–～20,000bp(seqidno:9)。seqidno:9的最后的(3’)～500bp如seqidno:17所示且seqidno:11的最初的(5’)～500bp如seqidno:18所示。seqidno:10在其5’末端包含seqidno:14的前间隔序列的部分且在其3’末端包含seqidno:16的前间隔序列的部分。

·用pcii限制性酶消化并用具有sgrna9和13的cas9靶向且后续用exov核酸外切酶温育的λdna意外显示长度～10,000bp的片段(seqidno:10)。

结论

crispr系统核酸酶复合物能够保护dna免于核酸外切酶降解。

实施例2

材料、方法与结果

为研究对作物dna的方法，sgrna设计成靶向甜瓜(melonvedrantais)基因组dna中的423个基因座，这些靶标各具有5.1-5.9kbp长度。对于各靶标，一对至少2个sgrna设计成靶向各靶标侧翼500bp的上游和下游区域，其中各sgrna包含20nt长的引导序列，其在基因组内独特。

总共48个反应，各包含9μl115.6ng/μl(＝～1μg)甜瓜dna，总体积为25μl，由以下组成：2.5μl10xneb3.1缓冲液(新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabsinc.))、0.18μl16.58μmsgrna混合物、0.15μl20μm酿脓链球菌(s.pyrogenes)cas9核酸酶(新英格兰生物实验室公司)和13.17μl无核酸酶水。

反应混合物(16μl)在室温预温育10分钟，然后加入甜瓜dna(9μl)。25μl反应在37℃温育1小时。未保护片段通过用核酸外切酶v温育来移出。对此，平分25μlcas9反应，向各12.5μl加入下列组分、2μl10xneb3.1缓冲液、2.0μl50mmatp(新英格兰生物实验室公司)、2.5μl10u/μl核酸外切酶v核酸外切酶(新英格兰生物实验室公司)和1μl无核酸酶水。所得20μl反应混合物在37℃温育60分钟。蛋白通过70℃温育30分钟灭活。

为水解肽键，向20μl反应混合物加入1μl20mg/ml蛋白酶k(罗氏)并室温温育10分钟。

所有样品用ampurepb珠溶液(太平洋生物科学公司)纯化，珠与样品之比为0.45x。合并所有96个反应的反应混合物。结合磁体后，珠用70％乙醇洗2次。珠干燥1分钟且结合的dna在50μl无核酸酶水中洗脱。

洗脱的dna用femto脉冲(advancedanalytical)分析。结果如图3所示。

使用bluepippin(sagescience)对洗脱的dna进行尺寸选定(2.5kbp–10kbp)。作为分离基质，采用bluepippin无染料0.75％琼脂胶盒。特定大小的产物用qiaquickpcr纯化试剂盒(凯杰(qiagen))纯化。纯化的dna在10μl无核酸酶水中洗脱。洗脱的dna用femto脉冲(advancedanalytical)分析。结果如图4所示。

洗脱的dna用于测序文库制备，用于牛津纳米孔(oxfordnanopore)minion系统测序。文库制备和测序根据厂商说明书实施。

所得的序列读取用厂商设置进行质量过滤，通过的读数针对甜瓜全基因组参考序列作图。为将读取作图，使用标准设置的minimap2.11-r797。从作图的读取，仅有单一作图位置的那些用于进一步分析。所得的作图的读取用igv软件(博德研究所(broadinstitute))呈现。图5提供此图用于基因组内分开约47kbp的2个靶。在可视化呈现中，还描绘所靶向的基因座和用于靶向基因座的sgrna的位置。

结论

crispr系统核酸酶复合物能够保护dna免于核酸外切酶降解，导致所靶向的感兴趣的区域的dna富集。

序列表

<110>主基因有限公司

<120>通过核酸内切酶保护的靶向富集

<130>p6080445pct

<150>18208936.7

<151>2018-11-28

<160>21

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1368

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>cas9

<400>1

metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval

151015

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130135140

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135513601365

<210>2

<211>4104

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>sequenceencodingcas9

<400>2

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