用于抑制PNPLA3表达的RNAI构建体的制作方法

本发明涉及调节含有patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)的肝脏表达的组合物和方法，特别是，本发明涉及用于经由rna干扰来降低pnpla3表达的基于核酸的治疗剂和使用这些基于核酸的治疗剂来治疗或预防肝病、例如非酒精性脂肪性肝病(nafld)的方法。

背景技术：

非酒精性脂肪性肝病(nafld)构成一系列肝脏病变，为世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻倍，且如今据估计影响了约20％世界人口(sattar等人(2014)bmj[英国医学杂志]349:g4596；loomba和sanyal(2013)naturereviewsgastroenterology&hepatology[自然评论，胃肠病和肝病]10(11):686-690；kim和kim(2017)clingastroenterolhepatol[临床胃肠病学和肝病学]15(4):474-485；petta等人(2016)digliverdis[消化病和肝病]48(3):333-342)。nafld开始于肝脏中的甘油三酯积累，且定义为个体中超过5％肝细胞中存在细胞质脂滴，该个体1)无明显饮酒史且2)其中其他类型肝病的诊断已被排除在外(zhu等人(2016)worldjgastroenterol[世界胃肠病学杂志]22(36):8226-33；rinella(2015)jama[美国医学会杂志]313(22):2263-73；yki-jarvinen(2016)diabetologia[糖尿病学]59(6):1104-11)。在一些个体中，肝脏中异位脂肪的积累(称为脂肪变性)引发炎症和肝细胞损伤，导致更晚期疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(nash)(rinella,同上)。截至2015年，预计有7500万至1亿美国人患有nafld；nash约占nafld诊断的10％-30％(rinella,同上；younossi等人(2016)hepatology[肝脏学]64(5):1577-1586)。

含有patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)，以前称为脂联素(adpn)和钙非依赖性磷脂酶a2-ε(ipla(2)ε)，为一种ii型跨膜蛋白(wilson等人(2006)jlipidres[脂类研究杂志]47(9):1940-9；jenkins等人(2004)jbiolchem[生物化学杂志]279(47):48968-75)。最初在脂肪细胞中鉴定为在小鼠脂肪形成期间诱导的膜相关性脂肪富集蛋白，其现在已充分表征为在其他组织(包括肝脏)中表达(wilson等人,同上；baulande等人(2001)jbiolchem[生物化学杂志]276(36):33336-44；moldes等人(2006)eurjendocrinol[欧洲内分泌学杂志]155(3):461-8；faraj等人(2006)jendocrinol[内分泌杂志]191(2):427-35；liu等人(2004)jclinendocrinolmetab[临床内分泌与代谢杂志]89(6):2684-9；lake等人(2005)jlipidres[脂类研究杂志]46(11):2477-87)。在无细胞生化系统中，重组pnpla3蛋白可以表现出三酰甘油脂肪酶或转酰基化活性(jenkins等人,同上；kumari等人(2012)cellmetab[细胞代谢]15(5):691-702；he等人(2010)jbiolchem[生物化学杂志]285(9):6706-15)。在肝细胞中，pnpla3在内质网和脂质膜上表达，且主要表现出三酰甘油水解酶活性(he等人,同上；huang等人(2010)procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]107(17):7892-7；ruhanen等人(2014)jlipidres[脂类研究杂志]55(4):739-46；pingitore等人(2014)biochimbiophysacta[生物化学与生物物理学报]1841(4):574-80)。尽管缺乏分泌信号，但数据表明pnpla3得以分泌且可在人血浆中作为二硫键依赖性多聚体出现(winberg等人(2014)biochembiophysrescommun[生物化学和生物物理学研究通讯]446(4):1114-9)。因此，靶向pnpla3功能的新颖治疗剂代表一种降低pnpla3水平和治疗肝病(例如非酒精性脂肪性肝病)的新方法。

技术实现要素：

本发明部分基于靶向pnpla3基因且降低肝细胞中pnpla3表达的rnai构建体的设计和产生。pnpla3表达的序列特异性抑制可用于治疗或预防与pnpla3表达相关的病症，例如肝脏相关疾病，例如单纯性脂肪肝(脂肪变性)非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化(肝脏不可逆晚期瘢痕形成)、或pnpla3相关性肥胖。因此，在一个实施例中，本发明提供一种包含有义链和反义链的rnai构建体，其中该反义链包含具有与pnpla3mrna序列互补的序列的区域。在某些实施例中，反义链包含具有来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸的区域。在一些实施例中，相对于不含这些变化的参照等位基因，本发明的rnai选择性抑制pnpla3-rs738409、pnpla3-rs738408和/或pnpla3-rs738409-rs738408次要等位基因。

在一些实施例中，本文所述的rnai构建体的有义链包含与反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。在这些和其他实施例中，有义链和反义链的长度各自为约15至约30个核苷酸。在一些实施例中，rnai构建体包含至少一个钝端。在其他实施例中，rnai构建体包含至少一个核苷酸突出端。此类核苷酸突出端可包含至少1至6个未配对核苷酸，且可位于有义链3'端、反义链3'端、或有义链和反义链两者的3'端。在某些实施例中，rnai构建体在有义链3'端和反义链3'端处包含两个未配对核苷酸的突出端。在其他实施例中，rnai构建体包含在反义链3'端处的两个未配对核苷酸突出端和有义链3'端/反义链5'端的钝端。

本发明的rnai构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸，包括对核糖环、核碱基或磷酸二酯主链具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，rnai构建体包含一种或多种经2'-修饰的核苷酸。此类经2'-修饰的核苷酸可包括经2'-氟修饰的核苷酸、经2’-o-甲基修饰的核苷酸、经2’-o-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2’-o-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(bna)、乙二醇核酸(gna)、反向碱基(例如反向腺苷)或其组合。在一个特定实施例中，rnai构建体包含一个或多个经2'-氟修饰的核苷酸、经2’-o-甲基修饰的核苷酸或其组合。在一些实施例中，rnai构建体的有义链和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。

在一些实施例中，rnai构建体包含至少一个主链修饰，例如经修饰的核苷酸间或核苷间键。在某些实施例中，本文所述的rnai构建体包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在特定实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于有义链和/或反义链的3'端或5'端。

在一些实施例中，本发明的rnai构建体的反义链和/或有义链可包含来自表1或2中列出的反义和有义序列的序列或由其组成。在某些实施例中，rnai构建体可为表1至2中任一个中列出的任一种双链体化合物。

附图说明

图1a-1d示出了针对体内剂量依赖性mrna敲低和功能耐久性的五种sirna分子的筛选。

图2a-2g示出了pnpla3sirna分子在小鼠体内对于肝重量、人pnpla3表达的确认、肝甘油三酯含量、血清timp1水平和脂肪变性或炎症的组织学指征的作用。

图3a-3g示出了pnpla3sirna分子在体内对于肝重量、人pnpla3表达的确认、肝甘油三酯含量、血清timp1水平和脂肪变性或炎症的组织学指征的作用。

图4a-4d示出了pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子挽救由于pnpla3^{rs738409-rs738408}过表达而导致的疾病相关表型、肝脏甘油三酯含量、血清timp1水平和脂肪变性或炎症的组织学指征的能力。

图5a-5l示出了pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子预防早期纤维化发展的能力。

图6a和6b示出了含有pnpla3次要等位基因靶序列的aav质粒的完整序列。在含有鼠cmv启动子、萤火虫萤光素酶报导基因和靶序列的部分标有下划线。

图7a和7b示出了含有pnpla3参照等位基因靶序列的aav质粒的完整序列。在含有鼠cmv启动子、萤火虫萤光素酶报导基因和靶序列的部分标有下划线。

图8示出了注射有表达人pnpla3次要等位基因靶序列的aav的小鼠(上部行)与注射有表达人pnpla3参考等位基因靶序列的aav的小鼠(下部行)相比的示例图像。在获取基线图像(第一列)后，向两只小鼠注射相同的sirna分子(d-2878，3mpk)。第2列至第5列分别是在第1、2、3和4周捕获的图像。已使用living软件将图像转换为灰度图。较亮区是低总通量[p/s]的区域，而较暗区是高总通量[p/s]的区域。在插图中(第2行和第4行)显示了在每周一次时间点处，经sirna处理的小鼠的相对百分比敲低，其归一化至经媒介物处理的小鼠。

图9示出了sirna分子d-2419的实例，展示体内剂量依赖性和等位基因选择性mrna的敲低和功能效力。(a)将sirna分子d-2419以3.0和10.0毫克/千克体重皮下注射到小鼠腹部。(b)数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的人pnpla3^{rs738409-rs738408}等位基因相比pnpla3^wt的平均相对mrna敲低百分比和平均值的标准误差。(c)来自两周处理组的肝脏针对甘油三酯含量进行处理以评估功能效力。(d)为了控制有效的galnac介导的sirna递送，以10毫克/千克递送d-2787(一种分别对人和小鼠hprt和hprt具有交叉反应性的sirna)，并且在两周后收获肝脏。数据表示在经d-2787处理的小鼠(n＝4)相比经媒介物处理的小鼠(n＝5)中hprtmrna和hprtmrna的拷贝。(e)数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的人hprt和小鼠hprtmrna的平均相对mrna敲低百分比和平均值的标准误差；其全部归一化至人tbp。(f)为了确认galnac受体在pxb肝细胞上的表达，在不存在和存在d-2419的情况下评估小鼠asgr1mrna和人asgr1mrna水平。

具体实施方式

本发明是关于用于调节含有patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)基因的表达的组合物和方法。在一些实施例中，基因可处于细胞或受试者内，例如哺乳动物(例如人)。在一些实施例中，本发明的组合物包含靶向pnpla3mrna且降低细胞或哺乳动物中的pnpla3表达的rnai构建体。此类rnai构建体可用于治疗或预防各种形式的肝脏相关疾病，例如单纯性脂肪肝(脂肪变性)非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化(肝脏不可逆晚期瘢痕形成)、或pnpla3相关性肥胖。

在2008年，一项探索与nafld相关的非同义序列变异或单核苷酸多态性(snp)的全基因组关联研究(gwas)将pnpla3中的变异体(rs738409[g]，编码i148m；可称为pnpla3-rs738409、pnpla3-ma或pnpla3-次要等位基因)鉴定为与肝脏脂肪含量显著相关。自该初始报告以来，随后的gwas确认pnpla3rs738409为nafld的主要遗传决定因素，其与以下显著相关：1)肝损伤的血清生物标志物丙氨酸转氨酶(alt)的水平升高，2)nafld发病率、进展和严重程度，3)肥胖和瘦型个体，以及4)显示与所有nafld阶段：脂肪变性、nash、肝硬化和肝细胞癌显著相关的唯一已知snp。许多gwas的共识表明pnpla3rs738409与nafld的关联性与年龄、性别、种族、代谢综合征、体重指数、胰岛素抗性和血清脂质无关。此外，来自多个来源的统计分析估计大约50％nafld患者携带pnpla3rs738409突变。对于pnpla3rs738409突变，患者可为纯合的或杂合的。另外地，已发现具有pnpla3rs738409突变的患者通常还携带3个碱基对的rs738408突变(tian等人(2010)naturegenetics[自然遗传学]42:21-23)。因此，患者可具有pnpla3-rs738409次要等位基因、pnpla3-rs738408次要等位基因或pnpla3-rs738409-rs738408双重次要等位基因突变(pnpla3-dma)。

研究人员已开发用于在体内探索pnpla3功能的小鼠模型。迄今为止，尚无可检测的代谢表型被鉴别为pnpla3缺陷或pnpla3过表达的结果。相比之下，pnpla3^i148m在转基因小鼠和敲入小鼠中的表达导致肝脏甘油三酯水平增加，类似于nafld。因此，总而言之，体内小鼠模型数据表明突变体pnpla3^i148m蛋白的表达，而非野生型蛋白质的过表达，为疾病表型的驱动因素。除了受nafld影响的个体中的次要等位基因的高频率和与疾病的主要关联之外，这些发现还强调pnpla3rs738409作为nafld的主要治疗靶标。

rna干扰(rnai)为将外源rna导入细胞，导致编码靶向蛋白的mrna特异性降解，从而导致蛋白质表达降低的过程。rnai技术和肝脏递送的进步以及通过其他基于rnai的疗法产生的不断增加的积极结果表明，rnai为通过直接靶向pnpla3i148m来治疗性治疗nafld的有力手段。许多gwas表明pnpla3rs738409对nafld发病率、进展和严重程度(gwas)的剂量依赖性作用；与杂合子携带者相比，对于纯合子携带者，优势比倾向于为双倍(若非更多)，但与野生型个体相比，对于杂合子仍然多至少两倍。因此，使用等位基因辨别特异性使pnpla3沉默既可为降低pnpla3i148m携带者中的肝甘油三酯的潜在手段，还可提供杂合子可获得益处而不使野生型等位基因沉默的情形。沿着这些线路，我们鉴别pnpla3i148m的snp特异性短干扰rna(sirna)且证明体外概念证据。使用肝细胞瘤细胞系hep3b(对于参考等位基因pnpla3i148i而言为纯合的)和hepg2(对于次要等位基因pnpla3i148m而言为纯合的)，我们鉴别能够特异性抑制pnpla3i148m基因表达的sirna序列。通过筛选过表达pnpla3i148i或pnpla3i148m的中国仓鼠卵巢(cho)细胞证实这些序列的抑制作用。使用在体内过表达人pnpla3i148m的腺相关病毒(aav)，然后我们证明了用次要等位基因特异性snp处理不仅特异性地降低小鼠中人pnpla3i148m的表达，而且还显著逆转通过过表达人pnpla3i148m而诱导的肝甘油三酯积累。

如本文所用，术语“rnai构建体”是指包含rna分子的试剂，当引入细胞时，该rna分子能够经由rna干扰机制下调靶基因(例如pnpla3)的表达。rna干扰为核酸分子以序列特异性方式(例如，经由经rna诱导的沉默复合物(risc)途径)诱导靶rna分子(例如经由信使rna或mrna分子)裂解和降解的过程。在一些实施例中，rnai构建体包含双链rna分子，其包含连续核苷酸的两条反平行链，其彼此充分互补以杂交形成双链体区。“杂交(hybridize或hybridization)”是指互补多核苷酸的配对，通常经由两个多核苷酸中互补碱基之间的氢键(例如瓦特生-克里克(watson-crick)、胡格斯丁(hoogsteen)或反向胡格斯丁氢键)。包含具有与靶序列(例如靶mrna)基本上互补的序列的区域的链被称为“反义链”。“有义链”是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的链。在一些实施例中，有义链可包含具有与靶序列基本上相同的序列的区域。

在一些实施例中，本发明是针对pnpla3的rnai。在一些实施例中，本发明是结合在pnpla3rs738409位点处的rnai。在一些实施例中，本发明是结合pnpla3rs738408位点处的rnai。在一些实施例中，本发明是结合在pnpla3rs738409rs738408位点处的rnai。在一些实施例中，本发明是相对于天然pnpla3序列(pnpla3-ref)优先结合pnpla3rs738409的rnai。在一些实施例中，本发明是相对于pnpla3-ref序列优先结合pnpla3rs738408的rnai。在一些实施例中，本发明是相对于pnpla3-ma优先结合pnpla3-dma的rnai。在一些实施例中，本发明是含有表1或2中可见的任何序列的rnai分子。

双链rna分子可包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括对核糖核苷酸的核糖、碱基或主链组分的修饰，例如本文所述或本领域已知那些。出于本披露的目的，术语“双链rna”涵盖用于双链rna分子(例如sirna、shrna等)中的任何此类修饰。

如本文所用，若包含第一序列的多核苷酸可与包含第二序列的多核苷酸杂交以在某些条件(例如生理条件)下形成双链体区，则第一序列与第二序列“互补”。其他这些条件可包括本领域普通技术人员已知的中等或严格杂交条件。若在一个或两个核苷酸序列的整个长度上包含第一序列的多核苷酸与包含第二序列的多核苷酸碱基配对而无任何错配，则认为第一序列与第二序列完全互补(100％互补)。若序列与靶序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，则序列与靶序列“基本上互补”。互补百分比可以通过将第一序列中与第二或靶序列中相应位置处的碱基互补的碱基数除以第一序列的总长度来计算。若在两个序列杂交时在30个碱基对的双链体区上存在不多于5个、4个、3个、2个或1个错配，则还可说序列与另一个序列基本上互补。通常，若存在如本文所定义的任何核苷酸突出端，则在确定两个序列之间的互补程度时不考虑这些突出端的序列。举例而言，长度为21个核苷酸的有义链和长度为21个核苷酸的反义链杂交形成在各链3'端具有2个核苷酸突出端的19个碱基对双链体区，这两条链将被认为是完全互补，如该术语在本文中所使用。

在一些实施例中，反义链的区域包含与靶rna序列(例如pnpla3mrna)的区域完全互补的序列。在此类实施例中，有义链可包含与反义链的序列完全互补的序列。在其他此类实施例中，有义链可包含与反义链的序列基本上互补的序列，例如，在由有义链和反义链形成的双链体区中具有1、2、3、4或5个错配。在某些实施例中，优选在末端区域内发生任何错配(例如在链5'端和/或3'端的6、5、4、3、2或1个核苷酸内)。在一个实施例中，由有义链和反义链形成的双链体区中的任何错配发生在反义链5'端的6、5、4、3、2或1个核苷酸内。

在某些实施例中，双链rna的有义链和反义链可为杂交形成双链体区但在其他情况下不连接的两个单独分子。由两条单独链形成的此类双链rna分子称为“小干扰rna”或“短干扰rna”(sirna)。因此，在一些实施例中，本发明的rnai构建体包含sirna。

当dsrna的两条基本上互补的链由单独rna分子组成时，那些分子不需要但可以共价连接。当两条链通过除形成双链体结构的一条链的3'端和相应另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链以外的方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。rna链可具有相同或不同数量的核苷酸。双链体中碱基对的最大数目为dsrna的最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任何突出端。除双链体结构外，rnai可包含一个或多个核苷酸突出端。

在其他实施例中，杂交形成双链体区的有义链和反义链可为单个rna分子的一部分，即有义链和反义链为单个rna分子的自身互补区的一部分。在此类情况下，单个rna分子包含双链体区(还称为茎区)和环区。有义链的3'端通过将形成环区的连续未配对核苷酸序列与反义链的5'端连接。环区通常具有足够的长度以允许rna分子自身向后折叠，使得反义链可以与有义链碱基配对以形成双链体或茎区。环区可包含从约3至约25、从约5至约15、或从约8至约12个未配对核苷酸。此类具有至少部分自身互补区的rna分子称为“短发夹rna”(shrna)。在一些实施例中，环区可包含至少1、2、3、4、5、10、20或25个未配对核苷酸。在一些实施例中，环区可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或更少未配对核苷酸。在某些实施例中，本发明的rnai构建体包含shrna。单个至少部分自身互补rna分子的长度可为从约35个核苷酸至约100个核苷酸、从约45个核苷酸至约85个核苷酸、或从约50至约60个核苷酸，且包含各自具有本文所述的长度的双链体区和环区。

在一些实施例中，本发明的rnai构建体包含有义链和反义链，其中反义链包含具有与pnpla3信使rna(mrna)序列基本上或完全互补的序列的区域。如本文所用，“pnpla3mrna序列”是指任何信使rna序列，包括编码pnpla3蛋白的剪接变异体，包括来自任何物种(例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物、人)的pnpla3蛋白变异体或同种型。pnpla3蛋白还称为脂联素(adpn)和钙非依赖性磷脂酶a2-ε(ipla(2)ε)。

pnpla3mrna序列还包括表达为其互补dna(cdna)序列的转录物序列。cdna序列是指表达为dna碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)而非rna碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶)的mrna转录物的序列。因此，本发明的rnai构建体的反义链可以包含具有与靶pnpla3mrna序列或pnpla3cdna序列基本上或完全互补的序列的区域。pnpla3mrna或cdna序列可包括但不限于任何pnpla3mrna或cdna序列，例如可衍生自ncbi参考序列nm_025225.2。

反义链的区域可以与pnpla3mrna序列的至少15个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在一些实施例中，反义链所包含互补区的pnpla3mrna序列的靶区域范围可为从约15至约30个连续核苷酸、从约16至约28个连续核苷酸、从约18至约26个连续核苷酸、从约17至约24个连续核苷酸、从约19至约25个连续核苷酸、从约19至约23个连续核苷酸、或从约19至约21个连续核苷酸。在某些实施例中，包含与pnpla3mrna序列基本上或完全互补的序列的反义链区域在一些实施例中可以包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸。在其他实施例中，反义序列包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少16、至少17、至少18或至少19个连续核苷酸。在一些实施例中，有义和/或反义序列包含来自表1或2中列出的序列且具有不多于1、2或3个核苷酸错配的至少15个核苷酸。

rnai构建体的有义链通常包含与反义链的序列充分互补，使得两条链在生理条件下杂交以形成双链体区的序列。“双链体区”是指两个互补或基本上互补的多核苷酸中的区域，这些多核苷酸通过瓦特生-克里克碱基配对或其他氢键相互作用彼此形成碱基对，以在两个多核苷酸之间产生双链体。rnai构建体的双链体区应具有足够的长度以允许rnai构建体进入rna干扰途径，例如通过使用dicer酶和/或risc复合物。例如，在一些实施例中，双链体区的长度为约15至约30个碱基对。在该范围内的双链体区的其他长度也是合适的，例如约15至约28个碱基对、约15至约26个碱基对、约15至约24个碱基对、约15至约22个碱基对、约17至约28个碱基对、约17至约26个碱基对、约17至约24个碱基对、约17至约23个碱基对、约17至约21个碱基对、约19至约25个碱基对、约19至约23个碱基对、或约19至约21个碱基对。在一个实施例中，双链体区的长度为约17至约24个碱基对。在另一个实施例中，双链体区的长度为约19至约21个碱基对。

在一些实施例中，本发明的rnai剂含有约24至约30个核苷酸的双链体区，其与靶rna序列(例如pnpla3靶mrna序列)相互作用，以指导靶rna裂解。不希望受理论束缚，引入细胞内的长双链rna可通过称为dicer的iii型内切核酸酶分解为sirna(sharp等人(2001)genesdev.[基因与发育]15:485)。dicer为一种核糖核酸酶-iii样酶，15将dsrna加工成具有特征性两个碱基3'突出端的19-23个碱基对短干扰rna(bernstein等人,(2001)nature[自然]409:363)。然后将sirna掺入经rna诱导的沉默复合物(risc)中，其中一个或多个解旋酶解开sirna双链体，使得互补反义链能够指导靶识别(nykanen等人,(2001)cell[细胞]107:309)。在与适当靶20mrna结合后，risc内的一种或多种内切核酸酶裂解靶标以诱导沉默(elbashir等人,(2001)genesdev.[基因与发育]15:188)。

对于其中有义链和反义链为两个单独分子(例如rnai构建体包含sirna)的实施例，有义链和反义链的长度不需要与双链体区的长度相同。例如，一条或两条链可能长于双链体区，且具有侧接双链体区的一个或多个未配对核苷酸或错配。因此，在一些实施例中，rnai构建体包含至少一个核苷酸突出端。如本文所用，“核苷酸突出端”是指延伸超出双链体区的链末端的一个或多个未配对核苷酸或核苷酸。当一条链的3'端延伸超出另一条链的5'端或当一条链的5'端延伸超出另一条链的3'端时，通常产生核苷酸突出端。核苷酸突出端的长度通常为1至6个核苷酸、1至5个核苷酸、1至4个核苷酸、1至3个核苷酸、2至6个核苷酸、2至5个核苷酸、或2至4个核苷酸。在一些实施例中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6个核苷酸。在一个特定实施例中，核苷酸突出端包含1至4个核苷酸。在某些实施例中，核苷酸突出端包含2个核苷酸。突出端中的核苷酸可为如本文所述的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一些实施例中，突出端包含5'-尿苷尿苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸。在此类实施例中，uu二核苷酸可包含核糖核苷酸或经修饰的核苷酸，例如经2'-修饰的核苷酸。在其他实施例中，突出端包含5'-脱氧胸苷-脱氧胸苷-3'(5'-dtdt-3')二核苷酸。

核苷酸突出端可位于一条或两条链的5'端或3'端。例如，在一个实施例中，rnai构建体包含反义链的5'端和3'端处的核苷酸突出端。在另一个实施例中，rnai构建体在有义链的5'端和3'端处包含核苷酸突出端。在一些实施例中，rnai构建体包含有义链的5'端和反义链的5'端的核苷酸突出端。在其他实施例中，rnai构建体包含有义链的3'端和反义链的3'端处的核苷酸突出端。

rnai构建体可以在双链rna分子的一端处包含单个核苷酸突出端且在另一个末端包含钝端。“钝端”意指有义链和反义链在分子末端完全碱基配对，且无未配对核苷酸延伸超出双链体区。在一些实施例中，rnai构建体包含有义链3'端的核苷酸突出端和有义链5'端和反义链3'端的钝端。在其他实施例中，rnai构建体包含反义链3'端处的核苷酸突出端和反义链5'端和有义链3'端的钝端。在某些实施例中，rnai构建体在双链rna分子两端处包含钝端。在此类实施例中，有义链和反义链具有相同长度，且双链体区的长度与有义链和反义链相同(即，该分子在其整个长度上为双链的)。

有义链和反义链可各自独立地具有约15至约30个核苷酸长度、约18至约28个核苷酸长度、约19至约27个核苷酸长度、约19至约25个核苷酸长度、约19至约23个核苷酸长度、约21至约25个核苷酸长度、或约21至约23个核苷酸长度。在某些实施例中，有义链和反义链的长度各自为约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、或约25个核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链具有相同的长度，但形成短于这些链使得rnai构建体具有两个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，rnai构建体包含(i)长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链3'端和反义链3'端有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在另一个实施例中，rnai构建体包含(i)长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链3'端和反义链3'端有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在其他实施例中，有义链和反义链具有相同长度且在其整个长度上形成双链体区，使得在双链分子的任一端上不存在核苷酸突出端。在一个此类实施例中，rnai构建体为钝端的且包含(i)其长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为21个碱基对的双链体区。在另一个此类实施例中，rnai构建体为钝端的且包含(i)其长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为23个碱基对的双链体区。

在其他实施例中，有义链或反义链长于另一条链，且两条链形成长度等于较短链长度使得rnai构建体包含至少一个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，rnai构建体包含(i)长度为19个核苷酸的有义链、(ii)长度为21个核苷酸的反义链、(iii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链3'端处的2个未配对核苷酸的单核苷酸突出端。在另一个实施例中，rnai构建体包含(i)长度为21个核苷酸的有义链、(ii)长度为23个核苷酸的反义链、(iii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链3'端处的2个未配对核苷酸的单核苷酸突出端。

本发明的rnai构建体的反义链可包含表1或表2中列出的任一反义序列的序列或任何这些反义序列的核苷酸1-19的序列。表1和6中列出的各反义序列包含19个连续核苷酸的序列(自5'末端开始计数之前19个核苷酸)，其与pnpla3mrna序列加上两个核苷酸突出端序列互补。因此，在一些实施例中，反义链包含seqidno:1-166或167-332中任一个的核苷酸1-19的序列。

经修饰的核苷酸

本发明的rnai构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸。“经修饰的核苷酸”是指对核苷、核碱基、戊糖环或磷酸基团具有一种或多种经化学修饰的核苷酸。如本文所用，经修饰的核苷酸不涵盖含有腺苷一磷酸、鸟苷一磷酸、尿苷一磷酸和胞苷一磷酸的核糖核苷酸，以及含有脱氧腺苷一磷酸、脱氧鸟苷一磷酸、脱氧胸苷一磷酸和脱氧胞苷一磷酸的脱氧核糖核苷酸。然而，rnai构建体可包含经修饰的核苷酸、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。将经修饰的核苷酸掺入双链rna分子的一条或两条链中可以改善rna分子的体内稳定性，例如通过降低分子对核酸酶和其他降解过程的易感性。还可通过掺入经修饰的核苷酸来增强rnai构建体降低靶基因表达的效力。

在某些实施例中，经修饰的核苷酸具有核糖的修饰。这些糖修饰可包括戊糖环的2'和/或5'位置处的修饰以及双环糖修饰。经2'-修饰的核苷酸是指具有戊糖环的核苷酸，该戊糖环在2'位置具有除h或oh以外的取代基。此类2'修饰包括但不限于2’-o-烷基(例如经o-c1-c10或o-c1-c10取代的烷基)、2’-o-烯丙基(o-ch2ch＝ch2)、2'-c-烯丙基、2'-氟基、2’-o-甲基(och3)、2’-o-甲氧基乙基(o-(ch2)2och3)、2’-ocf3、2’-o(ch2)2sch3、2’-o-氨基烷基、2'-氨基(例如nh2)、2’-o-乙胺、和2'-叠氮基。在戊糖环的5'位置处的修饰包括但不限于5'-甲基(r或s)；5'-乙烯基和5'-甲氧基。

“双环糖修饰”是指戊糖环的修饰，其中桥接基连接环的两个原子以形成第二环，产生双环糖结构。在一些实施例中，双环糖修饰包含戊糖环的4'与2'碳之间的桥接基。包含具有双环糖修饰的糖部分的核苷酸在本文中称为双环核酸或bna。示例性双环糖修饰包括但不限于α-l-亚甲基氧基(4'-ch2-o-2')双环核酸(bna)；β-d-亚甲基氧基(4'-ch2-o-2')bna(还称为锁核酸或lna)；乙烯氧基(4'-(ch2)2-o-2')bna；氨基氧基(4'-ch2-o-n(r)-2')bna；氧基氨基(4'-ch2-n(r)-o-2')bna；甲基(亚甲基氧基)(4'-ch(ch3)-o-2')bna(还称为约束乙基或cet)；亚甲基-硫代(4'-ch2-s-2')bna；亚甲基-氨基(4'-ch2-n(r)-2')bna；甲基碳环(4'-ch2-ch(ch3)-2')bna；丙烯碳环(4'-(ch2)3-2')bna；和甲氧基(乙烯氧基)(4'-ch(ch2ome)-o-2')bna(还称为约束moe或cmoe)。可以掺入本发明的rnai构建体中的这些和其他经糖修饰的核苷酸描述于美国专利号9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及deleavey和damha,chemistryandbiology[化学和生物学],第19卷:937-954,2012，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。

在一些实施例中，rnai构建体包含一个或多个经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、经2'-o-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2'-o-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(bna)、或其组合。在某些实施例中，rnai构建体包含一个或多个经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、经2'-o-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。在一个特定实施例中，rnai构建体包含一个或多个经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、或其组合。

rnai构建体的有义链和反义链均可包含一个或多个经修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在某些实施例中，有义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在一些实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在其他实施例中，反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在某些其他实施例中，有义链中的所有核苷酸和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在这些和其他实施例中，经修饰的核苷酸可为经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、或其组合。

在一些实施例中，有义链、反义链或两条链中的腺苷核苷酸之前的所有嘧啶核苷酸均为经修饰的核苷酸。例如，当序列5'-ca-3'或5'-ua-3'出现在任一链中时，胞苷和尿苷核苷酸为经修饰的核苷酸，优选经2'-o-甲基修饰的核苷酸。在某些实施例中，有义链中的所有嘧啶核苷酸均为经修饰的核苷酸(例如经2'-o-甲基修饰的核苷酸)，且在反义链中的序列5'-ca-3'或5'-ua-3'的所有出现中的5'核苷酸为经修饰的核苷酸(例如经2’-o-甲基修饰的核苷酸)。在其他实施例中，双链体区中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在此类实施例中，经修饰的核苷酸优选为经2’-o-甲基修饰的核苷酸、经2'-氟修饰的核苷酸、或其组合。

在rnai构建体包含核苷酸突出端的实施例中，突出端中的核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一个实施例中，突出端中的核苷酸为脱氧核糖核苷酸，例如脱氧胸苷。在另一个实施例中，突出端中的核苷酸为经修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，突出端中的核苷酸为经2’-o-甲基修饰的核苷酸、经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。

本发明的rnai构建体还可以包含一个或多个经修饰的核苷酸间键。如本文所用，术语“经修饰的核苷酸间键”是指除天然3'至5'磷酸二酯键外的核苷酸间键。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键为含磷核苷酸间键，例如磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸烷基酯(例如膦酸甲酯、3'-亚烷基膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如，3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代磷酸酯(p＝s)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一个实施例中，经修饰的核苷酸间键为2'至5'磷酸二酯键。在其他实施例中，经修饰的核苷酸间键为不含磷核苷酸间键，且因此可称为经修饰的核苷间键。此类不含磷键包括但不限于吗啉基键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷键(-o-si(h)2-o-)；硫化物、亚砜和砜键；甲酰基和硫代甲酰基键；含有烯烃的主链；氨基磺酸主链；亚甲基甲基亚氨基(-ch2-n(ch3)-o-ch2-)和亚甲基肼基键；磺酸盐和磺酰胺键；酰胺键；和具有混合n、o、s和ch2组分的其他键。在一个实施例中，经修饰的核苷间键为产生肽核酸或pna的基于肽的键(例如氨基乙基甘氨酸)，例如美国专利号5,539,082、5,714,331、和5,719,262中所述的那些。可以在本发明的rnai构建体中使用的其他合适的经修饰的核苷酸间和核苷间键描述于美国专利号6,693,187、美国专利号9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及deleavey和damha,chemistryandbiology[化学和生物学],第19卷:937-954,2012，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。

在某些实施例中，rnai构建体包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯核苷酸间键可以存在于rnai构建体的有义链、反义链或两条链中。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，两条链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。rnai构建体可以在有义链、反义链或两条链的3'-端、5'-端或3'-端和5'-端处包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，在某些实施例中，rnai构建体在有义链、反义链或两条链的3'-端处包含约1至约6或更多(例如，约1、2、3、4、5、6或更多)个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，rnai构建体在有义链、反义链或两条链的5'-端处包含约1至约6或更多(例如，约1、2、3、4、5、6或更多)个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，rnai构建体包含在有义链3'端处的单个硫代磷酸酯核苷酸间键和在反义链3'端的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施例中，rnai构建体在反义链3'端处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即在反义链3'端处的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在另一个实施例中，rnai构建体在反义链的3'端和5'端处包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在又另一个实施例中，rnai构建体包含反义链的3'端和5'端处的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键和有义链5'端处的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施例中，rnai构建体包含反义链3'端和5'端处的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键和有义链3'端和5'端处的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即，在反义链5'端和3'端处的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键和在有义链5'端和3'端处的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在一条或两条链包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键的任何实施例中，链内其余核苷酸间键可为天然3'至5'磷酸二酯键。例如，在一些实施例中，有义链和反义链的各核苷酸间键选自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一个核苷酸间键为硫代磷酸酯。

在rnai构建体包含核苷酸突出端的实施例中，突出端中的两个或更多个未配对核苷酸可通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在某些实施例中，反义链和/或有义链的3'端处的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在其他实施例中，反义链和/或有义链的5'端处的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在其他实施例中，任何核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。

在某些实施例中，掺入本发明的rnai构建体的一条或两条链中的经修饰的核苷酸具有核碱基(在本文中还称为“碱基”)的修饰。“经修饰的核碱基”或“经修饰的碱基”是指除天然存在的嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶以外的碱基。经修饰的核碱基可为合成的或天然存在的修饰，包括但不限于通用碱基、5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤(x)、次黄嘌呤(i)、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、和腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

在一些实施例中，经修饰的碱基为通用碱基。“通用碱基”是指碱基类似物，其与rna和dna中的所有天然碱基不加区别地形成碱基对，而不改变所得双链体区的双螺旋结构。通用碱基是本领域普通技术人员已知的，且包括但不限于肌苷、c-苯基、c-萘基和其他芳族衍生物、唑类甲酰胺和硝基唑衍生物，诸如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、和6-硝基吲哚。

可以掺入本发明的rnai构建体中的其他合适的经修饰碱基包括在herdewijn,antisensenucleicaciddrugdev.[反义核酸药物开发],第10卷:297-310,2000和peacock等人,j.org.chern.[有机化学期刊],第76卷:7295-7300,2011中描述的那些，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。本领域普通技术人员充分了解到鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可被其他核碱基替代，例如上述经修饰的核碱基，而基本上不改变包含携带此置换核碱基的核苷酸的多核苷酸的碱基配对特性。

在本发明的rnai构建体的一些实施例中，有义链、反义链或反义链和有义链的5'端包含磷酸酯部分。如本文所用，术语“磷酸酯部分”是指包括未经修饰的磷酸酯(-o-p＝o)(oh)oh)以及经修饰的磷酸酯的末端磷酸酯基团。经修饰的磷酸酯包括磷酸酯，其中一个或多个o和oh基团被h、o、s、n(r)或烷基取代，其中r为h、氨基保护基团或未经取代或经取代的烷基。示例性磷酸酯部分包括但不限于5'-一磷酸；5'-二磷酸；5'-三磷酸；5'-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)；5'-腺苷帽或任何其他经修饰或未经修饰的核苷酸帽结构；5'-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯)；5'-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯)；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯、5'-氨基磷酸酯；5'-乙烯基磷酸酯；5'-烷基膦酸酯(例如烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等)；和5'-烷基醚膦酸酯(例如，烷基醚＝甲氧基甲基、乙氧基甲基等)。

可掺入本发明的rnai构建体中的经修饰的核苷酸可具有本文所述的多于一种化学修饰。例如，经修饰的核苷酸可以具有对核糖的修饰以及对核碱基的修饰。举例而言，经修饰的核苷酸可包含2'糖修饰(例如2'-氟基或2'-甲基)且包含经修饰的碱基(例如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶)。在其他实施例中，经修饰的核苷酸可以包含糖修饰以及对5'磷酸的修饰，当经修饰的核苷酸掺入多核苷酸时，这些修饰将产生经修饰的核苷酸间或核苷间键。例如，在一些实施例中，经修饰的核苷酸可包含糖修饰，例如2'-氟修饰、2’-o-甲基修饰、或双环糖修饰、以及5'硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施例中，本发明的rnai构建体的一条或两条链包含经2'修饰的核苷酸或bna与硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。在某些实施例中，本发明的rnai构建体的有义链和反义链均包含经2'-氟修饰的核苷酸、经2’-o-甲基修饰的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。包含经修饰的核苷酸和核苷酸间键的示例性rnai构建体显示在表2中。

rnai构建体的功能

优选地，本发明的rnai构建体降低或抑制pnpla3在细胞、特别是肝细胞中的表达。因此，在一个实施例中，本发明提供一种通过使细胞与本文所述的任何rnai构建体接触来降低细胞中的pnpla3表达的方法。细胞可为体外或体内的。pnpla3表达可以通过测量pnpla3mrna、pnpla3蛋白或与pnpla3表达相关的另一种生物标志物的量或水平来评估。可以相对于未用rnai构建体处理或用对照rnai构建体处理的细胞或动物中的pnpla3表达来确定用本发明的rnai构建体处理的细胞或动物中的pnpla3表达的降低。例如，在一些实施例中，通过以下步骤来评估pnpla3表达的降低：(a)测量用本发明的rnai构建体处理的肝细胞中的pnpla3mrna的量或水平、(b)测量用对照rnai构建体(例如，针对未在肝细胞中表达的rna分子的rnai剂或具有无义或乱序序列的rnai构建体)处理或不用构建体处理的肝细胞中的pnpla3mrna的量或水平、和(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量pnpla3mrna水平与来自(b)中的对照细胞的经测量pnpla3mrna水平。在比较之前，可以将处理细胞和对照细胞中的pnpla3mrna水平归一化至对照基因(例如18s核糖体rna)的rna水平。pnpla3mrna水平可通过多种方法测量，包括rna印迹分析、核酸酶保护测定、荧光原位杂交(fish)、逆转录酶(rt)-pcr、实时rt-pcr、定量pcr等。

在其他实施例中，通过以下步骤来评估pnpla3表达的降低：(a)测量用本发明的rnai构建体处理的肝细胞中的pnpla3蛋白质的量或水平、(b)测量用对照rnai构建体(例如，针对未在肝细胞中表达的rna分子的rnai剂或具有无义或乱序序列的rnai构建体)处理或不用构建体处理的肝细胞中的pnpla3蛋白质的量或水平、和(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量pnpla3蛋白质水平与来自(b)中的对照细胞的经测量pnpla3蛋白质水平。测量pnpla3蛋白水平的方法为本领域普通技术人员已知，包括免疫印迹、免疫测定(例如elisa)和流式细胞术。用于评估pnpla3蛋白表达的示例性基于免疫测定的方法描述于实例2中。实例3描述了一种用于使用rnafish测量pnpla3mrna的示例性方法。任何能够测量pnpla3mrna或蛋白质的方法可用于评估本发明的rnai构建体的功效。

在一些实施例中，评估pnpla3表达水平的方法在体外在天然表达pnpla3的细胞(例如肝细胞)或已经工程化以表达pnpla3的细胞中进行。在某些实施例中，这些方法在体外在肝细胞中进行。合适的肝细胞包括但不限于原代肝细胞(例如人、非人灵长类动物或啮齿动物肝细胞)、hepad38细胞、huh-6细胞、huh-7细胞、huh-5-2细胞、bnlcl2细胞、hep3b细胞或hepg2细胞。在一个实施例中，肝细胞为hep3b细胞。在另一个实施例中，肝细胞为hepg2细胞。

在其他实施例中，评估pnpla3表达水平的方法在体内进行。rnai构建体和任何对照rnai构建体可以施用至动物(例如啮齿动物或非人灵长类动物)且在处理后，在自动物收获的肝组织中评估pnpla3mrna或蛋白质水平。可替代地或另外地，可以在经处理的动物中评估与pnpla3表达相关的生物标志物或功能表型。

在某些实施例中，通过本发明的rnai构建体，使pnpla3的表达在肝细胞中降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。在一些实施例中，通过本发明的rnai构建体，使pnpla3的表达在肝细胞中降低至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少85％。在其他实施例中，通过本发明的rnai构建体，使pnpla3的表达在肝细胞中降低约90％或更多，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多。pnpla3表达的降低百分比可通过本文所述的任何方法以及本领域已知的其他方法测量。例如，在某些实施例中，本发明的rnai构建体在体外在hep3b细胞(含有野生型pnpla3)中以5nm将pnpla3表达抑制至少45％。在相关实施例中，本发明的rnai构建体在体外在hep3b细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。在其他实施例中，本发明的rnai构建体在体外在hep3b细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％。在某些实施例中，本发明的rnai构建体在体外在hepg2细胞(含有pnpla3-rs738409-rs738408双重次要等位基因)中以5nm将pnpla3表达抑制至少45％。在相关实施例中，本发明的rnai构建体在体外在hepg2细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。在其他实施例中，本发明的rnai构建体在体外hepg2细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％。在某些实施例中，本发明的rnai构建体在体外在表达人pnpla3i148i或i148m细胞的cho转染细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少45％。在相关实施例中，本发明的rnai构建体在体外在表达人pnpla3i148i或i148m的cho转染细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。在其他实施例中，本发明的rnai构建体在体外在表达人pnpla3i148i或i148m的cho转染细胞中以5nm将pnpla3表达抑制至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％。如实例2和3中所述，可以使用包括rnafish或微滴式数字pcr在内的多种技术测量pnpla3的降低。

在一些实施例中，计算ic50值以评估本发明的rnai构建体抑制肝细胞中的pnpla3表达的效力。“ic50值”为实现50％生物或生物化学功能抑制所需的剂量/浓度。任何特定物质或拮抗剂的ic50值可以通过构建剂量-反应曲线且在任何测定中检查不同浓度的物质或拮抗剂对表达水平或功能活性的影响来确定。给定拮抗剂或物质的ic50值可以通过确定抑制一半最大生物反应或天然表达水平所需的浓度来计算。因此，任何rnai构建体的ic50值可以通过在任何测定中确定抑制肝细胞中的一半天然pnpla3表达水平(例如对照肝细胞中的pnpla3表达水平)所需的rnai构建体的浓度来计算，这些测定例如实例中描述的免疫测定或rnafish测定或微滴式数字pcr测定。本发明的rnai构建体可以小于约20nm的ic50抑制肝细胞(例如hep3b细胞)中的pnpla3表达。例如，rnai构建体以以下ic50抑制肝细胞中的pnpla3表达：约0.001nm至约20nm、约0.001nm至约10nm、约0.001nm至约5nm、约0.001nm至约1nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约5nm、或约0.1nm至约1nm。在某些实施例中，rnai构建体以约1nm至约10nm的ic50抑制肝细胞(例如hep3b细胞)中的pnpla3表达。本发明的rnai构建体可以小于约20nm的ic50抑制肝细胞(例如hepg2细胞)中的pnpla3表达。例如，rnai构建体以以下ic50抑制肝细胞中的pnpla3表达：约0.001nm至约20nm、约0.001nm至约10nm、约0.001nm至约5nm、约0.001nm至约1nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约5nm、或约0.1nm至约1nm。在某些实施例中，rnai构建体以约1nm至约10nm的ic50抑制肝细胞(例如hepg2细胞)中的pnpla3表达。本发明的rnai构建体可以小于约20nm的ic50抑制肝细胞(例如表达人pnpla3i148i或i148m的cho转染细胞)中的pnpla3表达。例如，rnai构建体以以下ic50抑制肝细胞中的pnpla3表达：约0.001nm至约20nm、约0.001nm至约10nm、约0.001nm至约5nm、约0.001nm至约1nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约5nm、或约0.1nm至约1nm。在某些实施例中，rnai构建体以约1nm至约10nm的ic50抑制肝细胞(例如表达人pnpla3i148i或i148m的cho转染细胞)中的pnpla3表达。

本发明的rnai构建体可使用本领域已知的技术，例如使用常规核酸固相合成来容易地制成。rnai构建体的多核苷酸可使用标准核苷酸或核苷前体(例如亚磷酰胺)在合适的核酸合成仪上组装。自动化核酸合成仪由若干供货商商业销售，包括来自应用生物系统公司(appliedbiosystems)(加利福尼亚州福斯特城)的dna/rna合成仪、来自生物自动化公司(bioautomation)(德克萨斯州欧文市)的mermade合成仪、和来自通用电气医疗集团生命科学部(gehealthcarelifesciences)(宾夕法尼亚州匹兹堡)的oligopilot合成仪。

2'甲硅烷基保护基团可与核糖核苷的5'位酸不稳定性二甲氧基三苯甲基(dmt)结合使用，以通过亚磷酰胺化学合成寡核苷酸。已知最终脱保护条件不会显著降解rna产物。所有合成均可在任何自动或手动合成仪中以大、中、小规模进行。合成还可以在多个孔板、柱或载玻片中进行。

2’-o-甲硅烷基可以经由暴露于氟离子来除去，氟离子可以包括任何氟离子源，例如含有与无机相对离子配对的氟离子的那些盐，例如氟化铯和氟化钾，或含有与有机相对离子配对的氟离子的那些盐，例如四烷基氟化铵。冠醚催化剂可以与无机氟化物组合用于脱保护反应中。优选的氟离子源为四丁基氟化铵或氨基氢氟化物(例如，将hf水溶液与三乙胺组合在偶极非质子溶剂如二甲基甲酰胺中)。

选择用于亚磷酸三酯和磷酸三酯上的保护基团可以改变三酯对氟化物的稳定性。磷酸三酯或亚磷酸三酯的甲基保护可以稳定与氟离子的键联且提高制程产率。

由于核糖核苷具有反应性2'羟基取代基，因此可能需要用与5'-o-二甲氧基三苯甲基保护基正交的保护基团(例如对用酸处理稳定的保护基团)保护rna中的反应性2'位置。甲硅烷基保护基团符合该标准，且可以在最终的氟化物去保护步骤中容易地除去，这可以导致最少rna降解。

四唑催化剂可用于标准亚磷酰胺偶联反应。优选催化剂包括例如四唑、s-乙基-四唑、苄基硫代四唑、对硝基苯基四唑。

如本领域普通技术人员可以理解的，合成本文所述的rnai构建体的其他方法对于普通本领域普通技术人员而言为显而易见的。另外地，各种合成步骤可以交替序列或顺序进行，以得到所需化合物。其他合成化学转化、保护基团(例如，对于碱基上存在的羟基、氨基等)和可用于合成本文所述rnai构建体的保护基团方法(保护和去保护)为本领域已知的且包括例如以下中描述的那些：r.larock,comprehensiveorganictransformations[全面有机转换],vchpublishers[vch出版社](1989)；t.w.greene和p.g.m.wuts,protectivegroupsinorganicsynthesis[有机合成中的保护基团],第2版,编辑：johnwileyandsons[约翰威立父子公司],(1991)；l.fieser和m.fieser,fieserandfieser'sreagentsfororganicsynthesis[费塞尔和用于有机合成的费塞尔试剂],johnwileyandsons[约翰威立父子公司](1994)；以及l.paquette编辑,encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis[有机合成试剂百科全书],johnwileyandsons[约翰威立父子公司](1995)，及其后续版本。rnai剂的定制合成还可自若干商业供货商处获得，包括dharmacon公司(dharmacon,inc.)(科罗拉多州拉斐特)、axo实验室股份有限公司(axolabsgmbh)(德国库尔姆巴赫)和ambion公司(ambion,inc.)(加利福尼亚州福斯特城)。

本发明的rnai构建体可包含配体。如本文所用，“配体”是指能够直接或间接与另一种化合物或分子相互作用的任何化合物或分子。配体与另一种化合物或分子的相互作用可引发生物反应(例如，启动信号转导级联反应，诱导受体介导的内吞作用)或者可仅为物理缔合。配体可以修改所连接的双链rna分子的一种或多种特性，例如rna分子的药效学、药动学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除特性。

配体可包含血清蛋白(例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白)、胆固醇部分、维生素(生物素、维生素e、维生素b12)、叶酸部分、类固醇、胆汁酸(例如胆酸)、脂肪酸(例如棕榈酸、肉豆蔻酸)、碳水化合物(例如葡聚糖、短梗霉聚糖、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)、糖苷、磷脂、或抗体或其结合片段(例如，将rnai构建体靶向特定细胞类型，例如肝脏的抗体或结合片段)。配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、texaphyrin、sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如edta)、亲脂性分子，例如金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二o(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、03-(油酰基)石胆酸、03-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如，触角肽、tat肽、rgd肽)、烷化剂、聚合物，诸如聚乙二醇(peg)(例如，peg-40k)、聚氨基酸和多胺(诸如精胺、亚精胺)。

在某些实施例中，配体具有内体溶解特性。内体溶解配体促进内体裂解和/或本发明的rnai构建体或其组分自细胞的内体转运到细胞质。内体溶解配体可为聚阳离子肽或肽模拟物，其显示ph依赖性膜活性和融合性。在一个实施例中，内体溶解配体在内体ph下呈现其活性构象。“活性”构象为如此构象，其中内体溶解配体促进内体裂解和/或本发明的rnai构建体或其组分自细胞的内体转运到细胞质。示例性内体溶解配体包括gala肽(subbarao等人,biochemistry[生物化学],第26卷:2964-2972,1987)、eala肽(vogel等人,j.am.chern.soc.[美国化学会志],第118卷:1581-1586,1996)和其衍生物(turk等人,biochem.biophys.acta[生物化学与生物物理学报],第1559卷:56-68,2002)。在一个实施例中，内体溶解组分可含有化学基团(例如氨基酸)，其响应于ph的变化将经历电荷或质子化的变化。内体溶解组分可为直链或支链的。

在一些实施例中，配体包含脂质或其他疏水分子。在一个实施例中，配体包含胆固醇部分或其他类固醇。据报道经胆固醇缀合的寡核苷酸较其未经缀合对应物更具活性(manoharan,antisensenucleicaciddrugdevelopment[反义核酸药物开发],第12卷:103-228,2002)。包含用于与核酸分子缀合的胆固醇部分和其他脂质的配体还已描述于美国专利号7,851,615、7,745,608、和7,833,992，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。在另一个实施例中，配体包含叶酸部分。与叶酸部分缀合的多核苷酸可以经由经受体介导的胞吞作用途径被细胞摄取。此类叶酸-多核苷酸缀合物描述于美国专利号8,188,247中，其通过引用以其全文特此并入。

鉴于pnpla3在肝脏细胞(例如肝细胞)中表达，在某些实施例中，期望将rnai构建体特异性递送至那些肝细胞。在一些实施例中，rnai构建体可以通过使用与肝细胞表面上表达的蛋白质结合或相互作用的配体而特异性靶向肝脏。例如，在某些实施例中，配体可包含特异性结合肝细胞上表达的受体的抗原结合蛋白(例如抗体或其结合片段(例如fab、scfv))。

在某些实施例中，配体包含碳水化合物。“碳水化合物”是指由一个或多个具有至少6个碳原子(可为直链、支链或环状)和与各碳原子键合的氧、氮或硫原子的单糖单元构成的化合物。碳水化合物包括但不限于糖(例如，单糖、二糖、三糖、四糖和含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)和多糖，例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。在一些实施例中，掺入配体中的碳水化合物为选自戊糖、己糖或庚糖的单糖和包括此类单糖单元的二糖和三糖。在其他实施例中，掺入配体中的碳水化合物为氨基糖，例如半乳糖胺、葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺和n-乙酰葡糖胺。

在一些实施例中，配体包含己糖或己糖胺。己糖可选自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或果糖。己糖胺可选自果糖胺、半乳糖胺、葡糖胺或甘露糖胺。在某些实施例中，配体包含葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺或葡糖胺。在一个实施例中，配体包含葡萄糖、葡糖胺或n-乙酰葡糖胺。在另一个实施例中，配体包含半乳糖、半乳糖胺或n-乙酰基-半乳糖胺。在特定实施例中，配体包含n-乙酰基-半乳糖胺。包含葡萄糖、半乳糖和n-乙酰基-半乳糖胺(galnac)的配体特别有效于将化合物靶向肝细胞。参见例如d'souza和devarajan,j.controlrelease[j.controlrelease],第203卷:126-139,2015。可以掺入本发明的rnai构建体中的含galnac或半乳糖的配体的实例描述于美国专利号7,491,805、8,106,022、和8,877,917，美国专利公开号20030130186；和wipo公开号wo2013166155，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。

在某些实施例中，配体包含多价碳水化合物部分。如本文所用，“多价碳水化合物部分”是指包含两个或更多个能够独立地与其他分子结合或相互作用的碳水化合物单元的部分。例如，多价碳水化合物部分包含两个或更多个由碳水化合物组成的结合结构域，其可以结合两个或更多个不同分子或同一分子上的两个或更多个不同位点。碳水化合物部分的化合价表示该碳水化合物部分内的单个结合结构域的数目。例如，关于碳水化合物部分的术语“单价”、“二价”、“三价”和“四价”分别是指具有一个、两个、三个和四个结合结构域的碳水化合物部分。多价碳水化合物部分可包含多价乳糖部分、多价半乳糖部分、多价葡萄糖部分、多价n-乙酰基-半乳糖胺部分、多价n-乙酰基-葡糖胺部分、多价甘露糖部分、或多价岩藻糖部分。在一些实施例中，配体包含多价半乳糖部分。在其他实施例中，配体包含多价n-乙酰基-半乳糖胺部分。在这些和其他实施例中，多价碳水化合物部分为二价、三价或四价的。在此类实施例中，多价碳水化合物部分可为双触角或三触角的。在一个特定实施例中，多价n-乙酰基-半乳糖胺部分为三价或四价的。在另一个特定实施例中，多价半乳糖部分为三价或四价的。用于掺入本发明的rnai构建体中的示例性含三价和四价galnac的配体在下文详细描述。

配体可以直接或间接地连接或缀合到rnai构建体至rna分子上。例如，在一些实施例中，配体直接共价连接至rnai构建体的有义链或反义链。在其他实施例中，配体经由接头共价连接至rnai构建体的有义链或反义链。配体可以连接到本发明的rnai构建体的多核苷酸(例如有义链或反义链)的核碱基、糖部分或核苷酸间键。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合或连接可发生在包括环内和环外原子在内的任何位置。在某些实施例中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位连接至配体。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合或连接还可发生在任何位置处。在一些实施例中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以连接至配体。与核苷酸的糖部分的缀合或连接可以发生在任何碳原子处。糖部分的可连接至配体的示例性碳原子包括2'、3'和5'碳原子。1'位置还可以连接至配体，例如在碱性残基中。核苷酸间键还可以支持配体连接。对于含磷键(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，配体可直接连接至磷原子或与磷原子键合的o、n或s原子上。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如pna)，配体可连接至胺或酰胺的氮原子或连接至相邻碳原子。

在某些实施例中，配体可以连接有义链或反义链的3'端或5'端。在某些实施例中，配体共价连接至有义链的5'端。在其他实施例中，配体共价连接至有义链的3'端。例如，在一些实施例中，配体连接至有义链的3'末端核苷酸。在某些这样的实施例中，配体连接在有义链的3'末端核苷酸的3'位置处。在替代性实施例中，配体连接在有义链的3'端附近，但在一个或多个末端核苷酸之前(即在1、2、3或4个末端核苷酸之前)。在一些实施例中，配体连接在有义链的3'末端核苷酸的糖的2'位置处。

在某些实施例中，配体经由接头连接至有义链或反义链。“接头”为将配体共价连接到rnai构建体的多核苷酸组分的原子或原子团。接头可为从约1至约30个原子长度、从约2至约28个原子长度、从约3至约26个原子长度、从约4至约24个原子长度、从约6至约20个原子长度、从约7至约20个原子长度、从约8至约20个原子长度、从约8至约18个原子长度、从约10至约18个原子长度、和从约12至约18个原子长度。在一些实施例中，接头可包含双官能连接部分，其通常包含具有两个官能团的烷基部分。选择一个官能团以结合目标化合物(例如rnai构建体的有义链或反义链)，且选择另一个官能团以基本上结合任何选定基团，例如本文所述的配体。在某些实施例中，接头包含重复单元，例如乙二醇或氨基酸单元的链结构或寡聚物。通常用于双官能连接部分的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在一些实施例中，双官能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和度(例如，双键或三键)等。

可用于将配体连接至本发明的rnai构建体中的有义链或反义链的接头包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、6-氨基己酸、经取代的c1-c10烷基、经取代或未经取代的c2-c10烯基或经取代或未经取代的c2-c10炔基。此类接头的优选取代基包括但不限于羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

在某些实施例中，接头为可裂解的。可裂解接头为在细胞外足够稳定，但是在进入靶细胞后经裂解以释放接头保持在一起的两个部分的接头。在一些实施例中，可裂解接头在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如经选择以模拟或代表细胞内条件)中比在受试者血液中或在第二参考条件下(其可以例如经选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)裂解快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多、或至少100倍。

可裂解接头易受裂解剂影响，例如ph、氧化还原电位或降解分子的存在。通常，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。此类降解剂的实例包括：经选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，诸如硫醇，其可通过还原来使氧化还原可裂解接头降解；酯酶；可形成酸性环境的内体或药剂，例如产生ph5或更低的那些；通过充当一般酸来使酸可裂解接头水解或降解的酶、肽酶(可为底物特异性的)、和磷酸酶。

可裂解的接头可包含对ph敏感的部分。人血清的ph为7.4，而平均细胞内ph略低，范围为从约7.1-7.3。内体具有更高酸性ph，在5.5-6.0范围内，且溶酶体具有约5.0的甚至更高酸性ph。一些接头将具有可裂解基团，其在优选ph下裂解，从而将rna分子自配体释放到细胞内，或进入细胞的所需区室。

接头可包括可由特定酶裂解的可裂解基团。掺入接头中的可裂解基团的类型可取决于待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包括酯基的接头连接至rna分子。肝细胞富含酯酶，且因此该接头在肝细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地裂解。富含酯酶的其他类型的细胞包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。当靶向富含肽酶的细胞(例如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。

通常，可以通过测试降解剂(或条件)裂解候选接头的能力来评估候选可裂解接头的适用性。还期望还测试候选可裂解接头在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对裂解的相对易感性，其中第一条件经选择为指示靶细胞中的裂解，而第二条件经选择为指示其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的裂解。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评估且通过对整个动物进行进一步评估来确认可能是有用的。在一些实施例中，有用候选接头在细胞中(或在经选择以模拟细胞内条件的体外条件下)与血液或血清(或在经选择以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，裂解快至少2、4、10、20、50、70或100倍。

在其他实施例中，使用氧化还原可裂解接头。氧化还原可裂解接头在还原或氧化时裂解。还原性可裂解基团的实例为二硫键连接基团(-s-s-)。为确定候选可裂解接头是否为合适的“可还原裂解接头”，或者例如适合与特定rnai构建体和特定配体一起使用，可以使用一种或多种本文所述的方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(dtt)或本领域已知的其他还原剂一起温育来评估候选接头，其模拟将在细胞(例如靶细胞)中观察到的裂解速率。候选接头还可以在经选择以模拟血液或血清条件的条件下进行评估。在特定实施例中，候选接头在血液中裂解至多10％。在其他实施例中，有用候选接头在细胞中(或在经选择以模拟细胞内条件的体外条件下)与血液(或在经选择以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，降解快至少2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、70倍或100倍。

在又其他实施例中，基于磷酸酯的可裂解接头通过降解或水解磷酸基团的试剂来裂解。水解细胞中的磷酸酯基团的试剂的实例为酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的可裂解基团的实例为-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、-o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。具体实施例包括-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-sp(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、-s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-、-o-p(s)(h)-s-。另一具体实施例为-o-p(o)(oh)-o-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评估。

在其他实施例中，接头可包含酸可裂解基团，这些基团为在酸性条件下裂解的基团。在一些实施例中，酸可裂解基团在ph为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中裂解，或通过试剂诸如可充当一般酸的酶裂解。在细胞中，特定的低ph细胞器，例如内体和溶酶体，可以为酸可裂解基团提供裂解环境。酸可裂解连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可裂解基团可具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。一特定实施例为当连接至酯(烷氧基)的氧的碳为芳基、经取代的烷基或叔烷基诸如二甲基、戊基或叔丁基时。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评估。

在其他实施例中，接头可包含基于酯的可裂解基团，这些基团通过细胞中的酶，例如酯酶和酰胺酶来裂解。基于酯的可裂解基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解基团具有通式-c(o)o-或-oc(o)-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评估。

在其他实施例中，接头可以包含基于肽的可裂解基团，这些基团通过细胞中的酶，例如肽酶和蛋白酶来裂解。基于肽的可裂解基团为在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解基团不包括酰氨基团(-c(o)nh-)。酰氨基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键为在氨基酸之间形成的特殊类型的酰胺键，以产生肽和蛋白质。基于肽的裂解基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，且不包括完整酰胺官能团。基于肽的可裂解连接基团具有通式-nhchrac(o)nhchrbc(o)-，其中ra和rb为两个相邻氨基酸的r基团。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评估。

适合于将配体连接到本发明的rnai构建体中的有义链或反义链的其他类型的接头为本领域已知的，且可以包括以下中描述的接头：美国专利号7,723,509、8,017,762、8,828,956、8,877,917、和9,181,551，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。

在某些实施例中，共价连接至本发明的rnai构建体的有义链或反义链的配体包含galnac部分，例如多价galnac部分。在一些实施例中，多价galnac部分为三价galnac部分且连接至有义链的3'端。在其他实施例中，多价galnac部分为三价galnac部分且连接至有义链的5'端。在又其他实施例中，多价galnac部分为四价galnac部分且连接至有义链的3'端。在其他实施例中，多价galnac部分为四价galnac部分且连接至有义链的5'端。

在一些实施例中，可以通过施用编码和控制rnai构建体的细胞内表达的载体，将本发明的rnai构建体递送至目标细胞或组织。“载体”(在本文中还称为“表达载体”)为物质组合物，其可用于将目标核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于直链多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒、和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。载体可以在活细胞中复制，或者可以合成制成。

通常，用于表达本发明的rnai构建体的载体将包含一个或多个与编码rnai构建体的序列可操作地连接的启动子。本文所用短语“可操作地连接”或“在转录控制下”是指启动子相对于多核苷酸序列处于正确位置和方向，以控制rna聚合酶的转录起始和多核苷酸序列的表达。“启动子”是指由启动基因序列特异性转录所需的细胞合成机制或经引入的合成机制识别的序列。合适的启动子包括但不限于rnapoli、polii、hi或u6rnapoliii、和病毒启动子(例如人巨细胞病毒(cmv)立即早期基因启动子、sv40早期启动子、和劳斯氏肉瘤病毒长末端重复)。在一些实施例中，hi或u6rnapoliii启动子为优选的。启动子可为组织特异性或诱导型启动子。特别感兴趣的是肝特异性启动子，例如来自人α！-抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、血红素结合蛋白基因、和肝脂肪酶基因的启动子序列。诱导型启动子包括由蜕皮激素、雌激素、孕酮、四环素、和异丙基-pd1-硫代半乳糖苷(iptg)调节的启动子。

在rnai构建体包含sirna的一些实施例中，两条单独链(有义链和反义链)可以自单个载体或两个单独载体表达。例如，在一个实施例中，编码有义链的序列与第一载体上的启动子可操作地连接，且编码反义链的序列与第二载体上的启动子可操作地连接。在此实施例中，第一载体和第二载体例如通过感染或转染共同引入靶细胞，使得有义链和反义链一旦转录，将在细胞内杂交以形成sirna分子。在另一个实施例中，有义链和反义链由位于单一载体中的两个单独启动子转录。在一些此类实施例中，编码有义链的序列与第一启动子可操作地连接，且编码反义链的序列与第二启动子可操作地连接，其中第一启动子和第二启动子位于单个载体中。在一个实施例中，载体包含与编码sirna分子的序列可操作地连接的第一启动子和在相反方向上与相同序列可操作地连接的第二启动子，使得自第一启动子转录序列使得sirna分子的有义链得以合成，且自第二启动子转录序列使得sirna分子的反义链得以合成。

在rnai构建体包含shrna的其他实施例中，编码单个至少部分自身互补的rna分子的序列与启动子可操作地连接以产生单个转录物。在一些实施例中，编码shrna的序列包含通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列，以在转录后产生shrna的茎和环结构。

在一些实施例中，编码本发明的rnai构建体的载体为是病毒载体。适用于表达本文所述rnai构建体的各种病毒载体系统包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体、马洛尼鼠白血病病毒)、腺相关病毒载体；单纯疱疹病毒载体；sv40载体；多瘤病毒载体；乳头状瘤病毒载体；小核糖核酸病毒载体；和痘病毒载体(例如痘苗病毒)。在某些实施例中，病毒载体为逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)。

适用于在本发明中使用的各种载体、用于将编码sirna或shrna分子的核酸序列插入载体中的方法、和将载体递送至目标细胞的方法均处于本领域普通技术人员的能力范围内。参见例如dornburg,genetherap.[基因疗法],第2卷:301-310,1995；eglitis,biotechniques[生物技术],第6卷:608-614,1988；miller,humgenetherap.[人类基因疗法],第1卷:5-14,1990；anderson,nature[自然],第392卷:25-30,1998；rubinsonda等人,nat.genet.[自然遗传学],第33卷:401-406,2003；brummelkamp等人,science[科学],第296卷:550-553,2002；brummelkamp等人,cancercell[癌细胞],第2卷:243-247,2002；lee等人,natbiotechnol[自然生物技术],第20卷:500-505,2002；miyagishi等人,natbiotechnol[自然生物技术],第20卷:497-500,2002；paddison等人,genesdev[基因发育],第16卷:948-958,2002；paul等人,natbiotechnol[自然生物技术],第20卷:505-508,2002；sui等人,procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊],第99卷:5515-5520,2002；和yu等人,procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊],第99卷:6047-6052,2002，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。

本发明还包括药物组合物和配制品，其包含本文所述的rnai构建体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类组合物和配制品可用于降低有需要的受试者中pnpla3的表达。当考虑临床应用时，将以适合于预期应用的形式制备药物组合物和配制品。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。

短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用至动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂”包括可接受用于配制药物，例如适合施用至人类的药物的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途为本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的rnai构建体不兼容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分还可掺入组合物中，条件是它们不会使组合物的载体或rnai构建体失活。

用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、待治疗的疾病或障碍的类型和程度、或施用剂量。在一些实施例中，基于预期递送途径配制药物组合物。例如，在某些实施例中，配制药物组合物以用于肠胃外递送。肠胃外递送形式包括静脉内、动脉内、皮下、鞘内、腹膜内或肌内注射或输注。在一个实施例中，配制药物组合物以用于静脉内递送。在此实施例中，药物组合物可包括基于脂质的递送媒介物。在另一个实施例中，配制药物组合物以用于皮下递送。在此实施例中，药物组合物可包括靶向配体(例如，本文所述的含有galnac的配体)。

在一些实施例中，药物组合物包含有效量的本文所述rnai构建体。“有效量”为足以产生有益或需要的临床结果的量。在一些实施例中，有效量为足以降低受试者肝细胞中的pnpla3表达的量。在一些实施例中，有效量可为足以仅部分降低pnpla3表达的量，例如，降低至与人杂合子中野生型pnpla3等位基因的表达相当的水平。据报道，与非携带者相比，功能丧失的pnpla3变异体等位基因的人杂合子携带者具有较低非hdl胆固醇血清水平和较低冠状动脉疾病和心肌梗塞风险(nioi等人,newenglandjournalofmedicine[新英格兰医学杂志],第374卷第22期:2131-2141,2016)。因此，不受理论束缚，据信pnpla3表达的部分降低可足以实现血清非hdl胆固醇的有益降低和冠状动脉疾病和心肌梗塞的风险降低。

本发明的rnai构建体的有效量可为从约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重、约0.05mg/kg体重至约75mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重、约1mg/kg至约30mg/kg体重、约2.5mg/kg体重至约20mg/kg体重或约5mg/kg体重至约15mg/kg体重。在某些实施例中，本发明的rnai构建体的单一有效剂量可为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。包含有效量的rnai构建体的药物组合物可以每周、每两周、每月、每季度或每半年施用。准确确定有效量和施用频率可以基于若干因素，包括患者大小、年龄和一般状况、待治疗的障碍类型(例如心肌梗塞、心力衰竭、冠状动脉疾病、高胆固醇血症)、使用的特定rnai构建体和施用途径。可以使用常规方法和/或在合适的动物模型中测试来确定本发明的任何特定rnai构建体的有效剂量和体内半衰期的估计值。

施用本发明的药物组合物可以经由任何常规途径，只要靶组织可经由该途径获得。此类途径包括但不限于肠胃外(例如，皮下、肌内、腹膜内或静脉内)、经口、经鼻、经颊、皮内、经皮、和舌下途径，或通过直接注射入肝脏组织或经由肝门静脉递送。在一些实施例中，肠胃外施用药物组合物。例如，在某些实施例中，静脉内施用药物组合物。在其他实施例中，皮下施用药物组合物。

胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒、和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、和脂质体，可以用作本发明的rnai构建体或编码此类结构的载体的递送媒介物。适用于递送本发明的核酸的市售脂肪乳液包括ii、iii、nutrilipid、和其他类似脂质乳液。用作体内递送媒介物的优选胶体系统为脂质体(即人工膜囊泡)。本发明的rnai构建体可以包封在脂质体内或可以与其形成复合物、特别是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，本发明的rnai构建体可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。合适脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、和二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc))、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg))、和阳性的(例如，二油酰四甲基氨基丙基(dotap)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dotma))。此类胶体分散系统的制备和使用为本领域熟知的。示例性配制品还披露于美国专利号5,981,505；美国专利号6,217,900；美国专利号6,383,512；美国专利号5,783,565；美国专利号7,202,227；美国专利号6,379,965；美国专利号6,127,170；美国专利号5,837,533；美国专利号6,747,014；和w003/093449。

在一些实施例中，本发明的rnai构建体完全包封于脂质配制品中，例如，以形成splp、psplp、snalp、或其他核酸-脂质颗粒。如本文所用，术语“snalp”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括splp。如本文所用，术语“splp”是指包含包封于脂质囊泡内的质粒dna的核酸-脂质颗粒。snalp和splp通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，peg-脂质缀合物)。snalp和splp特别可用于全身应用，因为它们在静脉内注射后表现出延长的循环寿命，且在远程部位(例如，与施用部位物理分离的部位)处积聚。splp包括“psplp”，其包括pct公开号wo00/03683中所述的经包封缩合剂-核酸复合物。核酸-脂质颗粒通常具有约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、或约70nm至约90nm的平均直径，且基本上无毒。另外，核酸当存在于核酸-脂质颗粒中时在水溶液中对用核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒和其制备方法披露于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432，以及pct公开号wo96/40964。

适于可注射使用的药物组合物包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。通常，这些制剂为无菌的且流动到易于注射的程度。制剂在制造和储存条件下应保持稳定，且应防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。合适的溶剂或分散介质可包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。恰当流动性可例如通过使用衣料诸如卵磷脂、在分散液情况下通过保持所需粒度且通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以通过将活性化合物按需要以适当量与任何其他成分(例如以上列举的)一起掺入溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散液，该无菌媒介物含有基础分散介质和所需其他成分，例如，如上所列举的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生一种或多种活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。

本发明的组合物通常可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括例如衍生自无机酸(例如盐酸或磷酸)或衍生自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(由游离氨基形成)。用游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，通常将溶液适当地缓冲，且首先例如用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选地，如本领域普通技术人员已知的，特别是根据本披露，使用无菌含水介质。举例说明，可将单剂量溶于1ml等渗nacl溶液中，且添加到1000ml皮下注射液中或在所建议输注部位注射(参见例如“remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿制药科学]”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。对于人类施用，制剂应符合fda标准所要求的无菌、产热原性、一般安全性和纯度标准。在某些实施例中，本发明的药物组合物包含无菌盐水溶液和本文所述的rnai构建体或由其组成。在其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的rnai构建体和无菌水(例如注射用水，wfi)或由其组成。在其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的rnai构建体和磷酸盐缓冲盐水(pbs)或由其组成。

在一些实施例中，本发明的药物组合物与用于施用的装置一起包装或储存于该装置内。用于可注射配制品的装置包括但不限于注射口、预填充注射器、自动注射器、注射泵、体内注射器、和注射笔。用于雾化或粉末配制品的装置包括但不限于吸入器、吹入器、吸气器等。因此，本发明包括施用装置，其包含本发明的用于治疗或预防一种或多种本文所述障碍的药物组合物。

抑制pnpla3表达的方法

本发明还提供抑制细胞中的pnpla3基因表达的方法。这些方法包括使细胞与有效抑制细胞中的pnpla3表达的量的rnai剂(例如双链rnai剂)接触，从而抑制细胞中的pnpla3表达。细胞与rnai剂(例如双链rnai剂)的接触可以在体外或体内进行。使体内细胞与rnai剂接触包括使受试者(例如人受试者)体内的细胞或细胞群与rnai剂接触。体外和体内接触细胞的方法的组合也是可能的。

本发明提供用于在有需要的受试者中降低或抑制pnpla3表达的方法以及治疗或预防与pnpla3表达或活性相关的病症、疾病或障碍的方法。“与pnpla3表达相关的病症、疾病或障碍”是指其中pnpla3表达水平发生改变或pnpla3表达水平升高与发展病症、疾病或障碍的风险增加相关的病症、疾病或障碍。

如上所述，接触细胞可为直接的或间接的。此外，可以经由靶向配体实现与细胞接触，该靶向配体包括本文所述或本领域已知的任何配体。在优选实施例中，靶向配体为碳水化合物部分，例如galnac3配体或将rnai剂引导至目标位点的任何其他配体。

在一个实施例中，使细胞与rnai接触包括经由促进或实现摄取或吸收至细胞中来“引入”或“将rnai递送到细胞中”。rnai的吸收或摄取可以通过无辅助扩散或活性细胞过程或通过辅助剂或装置发生。将rnai引入细胞可为体外和/或体内。例如，对于体内引入，可以将rnai注射到组织部位或全身施用。体外引入到细胞包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂质转染。其他方法在下文中描述和/或在本领域中为已知的。

如本文所用，术语“抑制”可与“降低”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语互换使用，且包括任何水平的抑制。

短语“抑制pnpla3表达”旨在是指抑制任何pnpla3基因(例如小鼠pnpla3基因、大鼠pnpla3基因、猴pnpla3基因、或人pnpla3基因)以及pnpla3基因的变异体或突变体的表达。因此，pnpla3基因可为野生型pnpla3基因、突变体pnpla3基因(例如产生淀粉样蛋白沉积的突变体pnpla3基因)、或遗传操作细胞、细胞群、或有机体背景下的转基因pnpla3基因。

“抑制pnpla3基因的表达”包括任何水平的pnpla3基因抑制，例如，至少部分阻抑pnpla3基因的表达。可以基于与pnpla3基因表达相关的任何变量的水平或水平变化，例如pnpla3mrna水平、pnpla3蛋白水平、或淀粉样沉积物的数量或程度来评估pnpla3基因的表达。可以在单个细胞或细胞群中评估该水平，包括例如衍生自受试者的样品。

可以通过与pnpla3表达相关的一个或多个变量的绝对或相对水平与对照水平相比的降低来评估抑制。对照水平可为本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平、或由未经处理或用对照(例如仅缓冲对照或非活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。在本发明方法的一些实施例中，pnpla3基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

pnpla3基因表达的抑制可以通过以下来证明：与第一细胞或细胞群基本相同但未进行过如此处理的第二细胞或细胞群(对照细胞)相比，由pnpla3基因被转录且已经被处理(例如，通过使一个或多个细胞与本发明的rnai剂接触，或通过将本发明的rnai剂施用至存在细胞的受试者)的第一细胞或细胞群(此类细胞可以存在于例如来自受试者的样品中)表达的mrna的量降低，使得pnpla3基因的表达受到抑制。在优选实施例中，通过使用下式将经处理细胞中的mrna水平表示为对照细胞中的mrna水平的百分比来评估抑制：

可替代地，可以根据与pnpla3基因表达功能性相关的参数的减小来评估pnpla3基因表达的抑制，该参数例如pnpla3蛋白表达或hedgehog途径蛋白活性。pnpla3基因沉默可以在表达pnpla3的任何细胞中组成型或通过基因组工程，且通过本领域已知的任何测定来确定。

pnpla3蛋白表达的抑制可以通过细胞或细胞群表达的pnpla3蛋白水平(例如，来源于受试者的样品中表达的蛋白水平)的降低来证明。如上所述，为评估mrna阻抑，经处理细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比。

可用于评估pnpla3基因表达抑制的对照细胞或细胞群包括尚未与本发明的rnai剂接触的细胞或细胞群。例如，对照细胞或细胞群可以源自在用rnai剂治疗受试者之前的个体受试者(例如，人或动物受试者)。

可以使用本领域已知用于评估mrna表达的任何方法确定由细胞或细胞群表达的pnpla3mrna水平或循环pnpla3mrna水平。在一个实施例中，通过检测经转录多核苷酸或其部分，例如pnpla3基因的mrna来确定样品中的pnpla3表达水平。可以使用rna提取技术自细胞中提取rna，这些提取技术包括例如使用酸性酚/异硫氰酸胍提取(rnazolb；生物起源公司(biogenesis))、rneasyrna制备试剂盒(凯杰公司(qiagen))或paxgene(瑞士普里阿勒蒂克斯公司(preanalytix，switzerland))。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连续测定、rt-pcr、rna酶保护测定(melton等人,nuc.acidsres.[核酸研究]12:7035)、rna印迹法、原位杂交、和微阵列分析。可以使用pct/us2012/043584中描述的方法检测循环pnpla3mrna，该专利通过引用特此并入。

在一个实施例中，使用核酸探针确定pnpla3表达水平。如本文所用，术语“探针”是指能够选择性结合特定pnpla3的任何分子。探针可由本领域普通技术人员合成，或衍生自适当生物制剂。探针可以经专门设计以用于标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于rna、dna、蛋白质、抗体、和有机分子。

经分离的mrna可用于杂交或扩增测定，这些测定包括但不限于dna印迹或rna印迹分析、聚合酶链反应(pcr)分析和探针阵列。一种用于确定mrna水平的方法包括使经分离的mrna与可与pnpla3mrna杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将mrna固定于固体表面上且与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行经分离的mrna且将mrna自凝胶转移至膜，例如硝酸纤维素。在替代性实施例中，将一个或多个探针固定于固体表面上，且使mrna与一个或多个探针接触，例如在affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地使用适用于确定pnpla3mrna水平的已知mrna检测方法。

用于确定样品中的pnpla3表达水平的替代性方法包括对样品中的例如mrna进行核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cdna)的过程，例如通过rt-pcr(实验实施例阐述于mullis,1987,美国专利号4,683,202中)、连接酶链反应(barany(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88:189-193)、自我持续序列复制(guatelli等人(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(kwoh等人(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:1173-1177)、q-β复制酶(lizardi等人(1988)bio/technology[生物技术]6:1197)、滚环复制(lizardi等人,美国专利号5,854,033)或者任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域普通技术人员熟知的技术检测经扩增的分子。若这些分子以极低数量存在，则这些检测方案尤其可用于检测核酸分子。在本发明的特定方面中，pnpla3表达水平通过定量荧光rt-pcr(即taqman^tm系统)确定。可以使用膜印迹(例如用于杂交分析，例如rna印迹、dna印迹、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体支持物)来监测pnpla3mrna的表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，这些专利通过引用并入本文。pnpla3表达水平的确定还可包括在溶液中使用核酸探针。

在优选实施例中，使用分支dna(bdna)测定或实时pcr(qpcr)评估mrna表达水平。在本文提供的实例中描述且举例说明这些方法的用途。

可以使用本领域已知用于测量蛋白质水平的任何方法来确定pnpla3蛋白质表达水平。这些方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相层析(hplc)、薄层层析(tlc)、超扩散层析、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱、比色测定、分光亮度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、免疫印迹、放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。

在一些实施例中，可以通过检测或监测pnpla3疾病症状的减轻来监测本发明的方法的功效，例如四肢、面部、喉、上呼吸道、腹部、躯干、和生殖器的水肿肿胀，前驱症状；喉肿胀；非瘙痒性皮疹；恶心；呕吐；或腹痛的减轻。可以使用本领域已知的任何方法在体外或体内评估这些症状。

在本发明的方法的一些实施例中，将rnai剂施用至受试者，使得rnai剂递送至受试者体内的特定部位。可以使用来自受试者内特定部位的液体或组织的样品中的pnpla3mrna或pnpla3蛋白水平或水平变化的测量结果来评估pnpla3表达的抑制。在优选实施例中，这些部位选自由肝、脉络丛、视网膜、和胰腺组成的组。该部位还可为来自任一上述部位的细胞的小部分或子组。该部位还可包括表达特定类型受体的细胞。

治疗或预防pnpla3相关疾病的方法

本发明提供治疗和预防方法，其包括向患有pnpla3相关疾病、障碍和/或病症或易于发展pnpla3相关疾病、障碍和/或病症的受试者施用包含rnai的组合物、包含rnai剂的药物组合物、或包含本发明的rnai的载体。pnpla3相关疾病的非限制性实例包括例如脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝脏中的脂肪积累、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪性肝病(nafld)。在一个实施例中，pnpla3相关疾病为nafld。在另一个实施例中，pnpla3相关疾病为nash。在另一个实施例中，pnpla3相关疾病为脂肪肝(脂肪变性)。在另一个实施例中，pnpla3相关疾病为胰岛素抗性。在另一个实施例中，pnpla3相关疾病并非胰岛素抗性。

在某些实施例中，本发明提供一种用于在有需要患者中降低pnpla3表达的方法，其包括向患者施用本文所述的任何rnai构建体。如本文所用，术语“患者”是指哺乳动物，包括人，且可与术语“受试者”互换使用。优选地，与未接受rnai构建体的患者中的pnpla3表达水平相比，患者肝细胞中的pnpla3表达水平在施用rnai构建体后降低。

本发明的方法可用于治疗患有pnpla3相关疾病的受试者，例如受益于pnpla3基因表达和/或pnpla3蛋白产生得以降低的受试者。在一方面中，本发明提供降低患有非酒精性脂肪性肝病(nafld)的受试者中含有patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)基因表达水平的方法。在另一方面中，本发明提供降低患有nafld的受试者中的pnpla3蛋白水平的方法。本发明还提供降低患有nafld的受试者中的hedgehog途径的活性水平的方法。

在另一方面中，本发明提供治疗患有nafld的受试者的方法。在一方面中，本发明提供治疗患有pnpla3相关疾病的受试者的方法，这些疾病例如脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝脏中的脂肪积累、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪性肝病(nafld)。本发明的治疗方法(和用途)包括向受试者例如人施用治疗有效量的本发明的靶向pnpla3基因的rnai剂、或包含本发明的靶向pnpla3基因的rnai剂的药物组合物、或包含靶向pnpla3基因的rnai剂的本发明的载体。

在一方面，本发明提供预防患有nafld的受试者中的至少一种症状的方法，这些症状例如存在hedgehog信号传导途径升高、疲劳、虚弱、体重减轻、食欲不振、恶心、腹痛、蜘蛛样血管、皮肤和眼睛发黄(黄疸)、瘙痒、腿部液体积聚和肿胀(水肿)、腹部肿胀(腹水)、和精神错乱。这些方法包括向受试者施用治疗有效量的rnai剂，例如本发明的dsrna、药物组合物或载体，从而预防患有将受益于pnpla3基因表达降低的障碍的受试者中的至少一种症状。

在另一方面中，本发明提供治疗有效量的本发明的rnai剂用于治疗受试者的用途，该受试者例如受益于pnpla3基因表达的降低和/或抑制的受试者。在另一方面中，本发明提供本发明的靶向pnpla3基因的rnai剂例如dsrna或包含靶向pnpla3基因的rnai剂的药物组合物在制备用于治疗受试者的药物中的用途，该受试者例如受益于pnpla3基因表达和/或pnpla3蛋白产生的降低和/或抑制的受试者，例如患有将受益于pnpla3基因表达降低的障碍例如pnpla3相关疾病的受试者。

在另一方面中，本发明提供本发明的rnai(例如dsrna)用于预防患有可受益于pnpla3基因表达和/或pnpla3蛋白质产生的降低和/或抑制的障碍的受试者中的至少一种症状的用途。

在另一方面中，本发明提供本发明的rnai剂在制备药物中的用途，该药物用于预防患有受益于pnpla3基因表达和/或pnpla3蛋白质产生的降低和/或抑制的障碍例如pnpla3相关疾病的受试者中的至少一种症状。

在一个实施例中，将靶向pnpla3的rnai剂施用至患有pnpla3相关疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(nafld))的受试者，使得当将dsrna剂施用至受试者时，pnpla3基因例如在受试者的细胞、组织、血液或其他组织或液体中的表达降低至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、或更多。

本发明的方法和用途包括施用本文所述的组合物，以使靶pnpla3基因的表达降低，例如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或约80小时。在一个实施例中，靶pnpla3基因的表达降低延长的持续时间，例如至少约两天、三天、四天、五天、六天、七天或更多天，例如约一周、两周、三周、或约四周或更长时间。

根据本发明的方法和用途施用dsrna可使得患有pnpla3相关疾病(例如，非酒精性脂肪性肝病(nafld))的患者中此类疾病或障碍的严重程度、体征、症状和/或标志物降低。在这种情况下，“降低”是指此水平的统计学显著降低。降低可为例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％。可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物或适用于所治疗或靶向预防的特定疾病的任何其他可测量参数的水平来评估疾病的治疗或预防功效。通过测量这些参数中的任一个或任何参数组合来监测治疗或预防功效为在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以例如通过定期监测nafld症状、肝脏脂肪水平或下游基因的表达来评估nafld治疗功效。后续读数与初始读数的比较为医生提供治疗是否有效的指示。通过测量这些参数中的任一个或任何参数组合来监测治疗或预防功效为在本领域普通技术人员的能力范围内。与靶向pnpla3的rnai或其药物组合物的施用结合，“有效对抗”pnpla3相关疾病表明以临床上适当的方式施用至少对患者的统计学显著部分产生有益效果，例如改善症状、治愈、疾病减轻、生命延长、生活质量改善、或熟悉治疗nafld和/或pnpla3相关疾病和相关病因的医生普遍认为是积极的其他效果。

当疾病症态的一个或多个参数得到统计学显著改善时，或者由于未能恶化或在其他情况下预期会出现症状时，治疗或预防效果明显。例如，在可测量疾病参数中，至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％或更多有利变化可以指示有效治疗。还可以使用本领域已知的针对给定疾病的实验动物模型来判断给定rnai药物或该药物的配制品的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学显著降低时，证明了治疗功效。

可以向受试者施用治疗量的rnai，例如约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kgdsrna、2.6mg/kgdsrna、2.7mg/kgdsrna、2.8mg/kgdsrna、2.9mg/kgdsrna、3.0mg/kgdsrna、3.1mg/kgdsrna、3.2mg/kgdsrna、3.3mg/kgdsrna、3.4mg/kgdsrna、3.5mg/kgdsrna、3.6mg/kgdsrna、3.7mg/kgdsrna、3.8mg/kgdsrna、3.9mg/kgdsrna、4.0mg/kgdsrna、4.1mg/kgdsrna、4.2mg/kgdsrna、4.3mg/kgdsrna、4.4mg/kgdsrna、4.5mg/kgdsrna、4.6mg/kgdsrna、4.7mg/kgdsrna、4.8mg/kgdsrna、4.9mg/kgdsrna、5.0mg/kgdsrna、5.1mg/kgdsrna、5.2mg/kgdsrna、5.3mg/kgdsrna、5.4mg/kgdsrna、5.5mg/kgdsrna、5.6mg/kgdsrna、5.7mg/kgdsrna、5.8mg/kgdsrna、5.9mg/kgdsrna、6.0mg/kgdsrna、6.1mg/kgdsrna、6.2mg/kgdsrna、6.3mg/kgdsrna、6.4mg/kgdsrna、6.5mg/kgdsrna、6.6mg/kgdsrna、6.7mg/kgdsrna、6.8mg/kgdsrna、6.9mg/kgdsrna、7.0mg/kgdsrna、7.1mg/kgdsrna、7.2mg/kgdsrna、7.3mg/kgdsrna、7.4mg/kgdsrna、7.5mg/kgdsrna、7.6mg/kgdsrna、7.7mg/kgdsrna、7.8mg/kgdsrna、7.9mg/kgdsrna、8.0mg/kgdsrna、8.1mg/kgdsrna、8.2mg/kgdsrna、8.3mg/kgdsrna、8.4mg/kgdsrna、8.5mg/kgdsrna、8.6mg/kgdsrna、8.7mg/kgdsrna、8.8mg/kgdsrna、8.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、9.1mg/kgdsrna、9.2mg/kgdsrna、9.3mg/kgdsrna、9.4mg/kgdsrna、9.5mg/kgdsrna、9.6mg/kgdsrna、9.7mg/kgdsrna、9.8mg/kgdsrna、9.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、10mg/kgdsrna、15mg/kgdsrna、20mg/kgdsrna、25mg/kgdsrna、30mg/kgdsrna、35mg/kgdsrna、40mg/kgdsrna、45mg/kgdsrna或约50mg/kgdsrna。在一个实施例中，可以向受试者施用0.5mg/kg的dsrna。值和所述值的中间范围也是本发明的一部分。

施用rnai可以将例如在患者的细胞、组织、血液、尿液或其他隔室中的pnpla3蛋白水平的存在降低至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。

在施用全剂量rnai之前，可以向患者施用较小剂量，例如5％输注，且监测不良反应，例如过敏反应。在另一个实例中，可以监测患者的不需要的免疫刺激作用，例如增加的细胞因子(例如，tnf-α或inf-α)水平。

由于对pnpla3表达的抑制作用，根据本发明的组合物或由其制备的药物组合物可以提高生活质量。

本发明的rnai可以“裸”形式施用，其中经修饰或未经修饰的rnai剂直接悬浮在水性或合适缓冲溶剂中，作为“游离rnai”。在不存在药物组合物的情况下施用游离rnai。游离rnai可以处于合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐、或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(pbs)。可以调节含有rnai的缓冲溶液的ph和重量摩尔渗透压浓度，使其适合施用至受试者。

可替代地，本发明的rnai可以作为药物组合物，例如dsrna脂质体配制品施用。

受益于pnpla3基因表达的降低和/或抑制的受试者为患有如本文所述的非酒精性脂肪性肝病(nafld)和/或pnpla3相关疾病或障碍的受试者。

对受益于pnpla3基因表达的降低和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性和预防性治疗。

本发明进一步提供用于治疗受益于pnpla3基因表达的降低和/或抑制的受试者(例如，患有pnpla3相关疾病的受试者)的方法和rnai剂或其药物组合物与其他药物和/或其他治疗方法(例如与已知药物和/或已知治疗方法，例如目前用于治疗这些障碍的那些药物和/或方法)组合以用于治疗受益于pnpla3基因表达的降低和/或抑制的受试者的用途。

例如，在某些实施例中，靶向pnpla3基因的rnai与例如可用于治疗如本文其他地方所述的pnpla3相关疾病的药剂组合施用。例如，适用于治疗受益于pnpla3表达降低的受试者，例如患有pnpla3相关疾病的受试者的其他治疗剂和治疗方法，包括靶向pnpla3基因的不同部分的rnai剂、治疗剂、和/或用于治疗pnpla3相关疾病的程序、或任何前述的组合。

在某些实施例中，靶向pnpla3基因的第一rnai剂与靶向pnpla3基因的不同部分的第二rnai剂组合施用。例如，第一rnai剂包含形成双链区的第一有义链和第一反义链，其中该第一有义链的基本上所有核苷酸和该第一反义链的基本上所有核苷酸均为经修饰的核苷酸，其中该第一有义链与连接在3'端的配体缀合，且其中该配体为通过二价或三价支链接头连接的一个或多个galnac衍生物；且第二rnai剂包含形成双链区的第二有义链和第二反义链，其中第二有义链的基本上所有核苷酸和第二反义链的基本上所有核苷酸均为经修饰的核苷酸，其中第二有义链与连接在3'-端的配体缀合，且其中配体为通过二价或三价支链接头连接的一个或多个galnac衍生物。

在一个实施例中，第一和第二有义链的所有核苷酸和/或第一和第二反义链的所有核苷酸均包含修饰。

在一个实施例中，至少一个经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：3'末端脱氧胸腺嘧啶(dt)核苷酸、经2'-0-甲基修饰的核苷酸、经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、受约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、经2'-氨基修饰的核苷酸、经2'-o-烯丙基修饰的核苷酸、经2'-c-烷基修饰的核苷酸、经2'-羟基修饰的核苷酸、经2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2'-0-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、经四氢吡喃修饰的核苷酸、经1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、经环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'-磷酸的核苷酸、和包含5'-磷酸模拟物的核苷酸。

在某些实施例中，靶向pnpla3基因的第一rnai剂与靶向不同于pnpla3基因的基因的第二rnai剂组合施用。例如，靶向pnpla3基因的rnai剂可以与靶向scap基因的rnai剂组合施用。靶向pnpla3基因的第一rnai剂和靶向不同于pnpla3基因的基因(例如scap基因)的第二rnai剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。可替代地，靶向pnpla3基因的第一rnai剂和靶向不同于pnpla3基因的基因(例如scap基因)的第二rnai剂可以作为不同药物组合物的部分施用。

rnai剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以相同组合施用，例如肠胃外，或另外的治疗剂可以作为单独组合物的一部分或在不同时间和/或通过本领域已知或本文描述的另一种方法施用。

本发明还提供使用本发明的rnai剂和/或含有本发明的rnai剂的组合物来降低和/或抑制细胞中的pnpla3表达的方法。在其他方面，本发明提供本发明的rnai和/或包含本发明的rnai的组合物，其用于降低和/或抑制细胞中的pnpla3基因的表达。在又其他方面，提供本发明的rnai和/或包含本发明的rnai的组合物在制备用于降低和/或抑制细胞中的pnpla3基因表达的药物中的用途。在其他方面，本发明提供本发明的rnai和/或包含本发明的rnai的组合物，其用于降低和/或抑制细胞中的pnpla3蛋白产生。在又其他方面，提供本发明的rnai和/或包含本发明的rnai的组合物在制备用于降低和/或抑制细胞中的pnpla3蛋白质产生的药物中的用途。这些方法和用途包括使细胞与本发明的rnai(例如dsrna)接触，且将细胞维持足够时间以获得pnpla3基因的mrna转录物的降解，从而抑制pnpla3基因的表达或抑制细胞中的pnpla3蛋白质产生。

可以通过本领域已知的任何方法评估基因表达的降低。例如，pnpla3表达的降低可以通过使用本领域普通技术人员的常规方法，例如rna印迹、qrt-pcr确定pnpla3的mrna表达水平；通过使用本领域普通技术人员的常规方法，例如免疫印迹法、免疫学技术、流式细胞术方法、elisa确定pnpla3的蛋白质水平；和/或通过确定pnpla3的生物学活性来确定。

在本发明的方法和用途中，细胞可以在体外或体内接触，即细胞可以处于受试者体内。

适用于使用本发明的方法进行处理的细胞可为表达pnpla3基因的任何细胞，例如来自患有nafld的受试者的细胞或包含含有pnpla3基因或pnpla3基因的部分的表达载体的细胞。适用于本发明的方法和用途的细胞可为哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(例如人细胞或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(如牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞、或水牛细胞)、鸟类细胞(例如鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，细胞为人细胞。

pnpla3基因表达可在细胞中被抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％。

pnpla3蛋白产生可以在细胞中被抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％。

本发明的体内方法和用途可包括向受试者施用含有rnai的组合物，其中rnai包括与待治疗的哺乳动物的pnpla3基因的rna转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗的生物体为人时，该组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包括但不限于皮下、静脉内、口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、实质内和鞘内)、肌内、透皮、气道(气溶胶)、鼻腔、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在某些实施例中，组合物通过皮下或静脉内输注或注射施用。在一个实施例中，组合物通过皮下注射施用。

在一些实施例中，经由长效注射施用。长效注射可以在延长的时间段内以一致方式释放rnai。因此，长效注射可减少获得所需效果，例如所需pnpla3抑制或治疗或预防效果所需要的给药频率。长效注射还可以提供更一致的血清浓度。长效注射可包括皮下注射或肌内注射。在优选实施例中，长效注射为皮下注射。

在一些实施例中，通过泵施用。泵可为外部泵或外科植入泵。在某些实施例中，泵为皮下植入渗透泵。在其他实施例中，泵为输注泵。输注泵可用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，输注泵为皮下输注泵。在其他实施例中，泵为将rnai递送至受试者的外科植入泵。

可以基于是否需要局部或全身治疗且基于待治疗的区域来选择施用方式。可以选择施用途径和施用部位以增强靶向。

在一方面中，本发明还提供用于抑制哺乳动物(例如人)中的pnpla3基因表达的方法。本发明还提供一种包含靶向哺乳动物细胞中的pnpla3基因的rnai(例如dsrna)的组合物，其用于抑制哺乳动物中pnpla3基因的表达。在另一方面中，本发明提供靶向哺乳动物细胞中的pnpla3基因的rnai(例如dsrna)在制备用于抑制哺乳动物中的pnpla3基因表达的药物中的用途。

这些方法和用途包括向哺乳动物(例如人)施用包含靶向哺乳动物细胞中的pnpla3基因的rnai(例如dsrna)的组合物且维持哺乳动物足够时间以获得pnpla3基因的mrna转录物的降解，从而抑制哺乳动物中的pnpla3基因的表达。

可以通过本领域已知的任何方法(例如本文所述的qrt-pcr)在经rnai施用的受试者的外周血样品中评估基因表达的降低。可以通过此项技术已知的任何方法和通过本文所述的方法(例如elisa或免疫印迹)评估蛋白质产生的减少。在一个实施例中，组织样品用作组织材料，用于监测pnpla3基因和/或蛋白质表达的减少。在另一个实施例中，血液样品用作组织材料，用于监测pnpla3基因和/或蛋白质表达的减少。

在一个实施例中，在施用rnai剂后靶标在体内进行risc介导的裂解的验证通过进行5'-race或本领域已知的方案的改进来完成(lashama等人,(2010)nucleicacidres.[核酸研究],38(3)p-el9)(zimmermann等人(2006)nature[自然]441:111-4)。

应当理解，本文披露的所有核糖核酸序列可以通过用胸腺嘧啶碱基取代序列中的尿嘧啶碱基而转化为脱氧核糖核酸序列。同样地，本文披露的所有脱氧核糖核酸序列可以通过用尿嘧啶碱基取代序列中的胸腺嘧啶碱基而转化为核糖核酸序列。本发明包括脱氧核糖核酸序列、核糖核酸序列和含有本文披露的所有序列的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的序列。

另外地，本文披露的任何核酸序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域普通技术人员将容易理解，在某些情况下，描述经修饰的多核苷酸的命名诸如“rna”或“dna”为任意的。例如，包含在核糖上具有2'-oh取代基且具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸的多核苷酸可以描述为具有经修饰的糖的dna分子(2'-oh取代dna的天然2'-h)或描述为具有经修饰的碱基(胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶)取代rna的天然尿嘧啶)的rna分子。

因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的核酸序列)旨在涵盖含有天然或经修饰rna和/或dna的任何组合的核酸，包括但不限于具有经修饰核苷碱基的这些核酸。作为另一个实例且为非限制性，具有序列“atcgatcg”的多核苷酸涵盖具有经修饰或未经修饰的此序列的任何多核苷酸，包括但不限于包含rna碱基的化合物，例如具有序列“aucgaucg”的那些化合物、和具有一些dna碱基和一些rna碱基的那些化合物(例如“aucgatcg”)、和具有其他经修饰碱基的多核苷酸(例如“atmecgaucg”)，其中mec表示在5-位包含甲基的胞嘧啶碱基。

以下实例，包括所进行的实验和所实现的结果，仅用于说明目的，且不应解释为限制所附权利要求的范畴。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用并入的相同的程度。然而，本文对参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献为本发明的先前技术。在通过引用并入的参考文献中所提供的任何定义或术语与在本文中所提供的术语和讨论不同的情况下，以本发明术语和定义为准。

等同物

认为前述书面说明是足以能够使本领域普通技术人员来实践本发明。前述描述和实例详述本发明的某些优选实施例，且描述由发明人所考虑的最佳模式。然而，将理解的是无论前述内容如何详细地出现在文本中，本发明可以按多种方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释。

仅出于说明目的提供以下实例(包括进行的实验和达成的结果)且其不意在解释为限制本发明。

本文所述的所有动物实验均由美商安进公司(amgen)研究动物护理和使用委员会(iacuc)批准，且根据实验室动物护理和使用指南第8版(国家研究委员会(美国))、实验室动物护理和使用指南更新委员会、实验室动物研究所(美国)、和国家科学院出版社(美国)(2011)实验室动物护理和使用指南第8版(国家科学院出版社(华盛顿特区))来进行护理。将小鼠单独圈养在22℃±2℃、具有12小时光照；12小时黑暗周期的空调房间内(0600-1800小时)。除非另有说明，否则动物可随意获得常规食物(envigo公司，2920x；或另外规定的食物)且通过自动浇水系统获得水(反渗透纯化)。在结束时，在深度麻醉下通过心脏穿刺收集血液，且然后根据实验室动物护理评估和认证协会(aaalac)指南，通过二次物理方法实施安乐死。

实例1：经修饰的pnpla3sirna分子的选择、设计和合成

使用人pnpla3转录物(nm_025225.2)的生物信息学分析鉴定靶向含有patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)的治疗性sirna分子的最佳序列的鉴定和选择。表1显示鉴定为具有治疗特性的序列。在整个各种序列中，invab为反向a碱性，invda为反向脱氧胸苷，gna为乙二醇核酸，dt为脱氧胸苷，且dc为脱氧胞嘧啶。

表1.针对pnpla3的sirna序列

为提高pnpla3sirna序列的效力和体内稳定性，将化学修饰掺入pnpla3sirna分子中。具体地，将核糖的2'-o-甲基和2'-氟修饰掺入pnpla3sirna内的特定位置。硫代磷酸酯核苷酸间键还掺入在反义和/或有义序列的末端处。下表2描述各经修饰的pnpla3sirna的有义和反义序列的修饰。表2和本申请其他部分中的核苷酸序列根据以下符号列出：a、u、g和c＝相应的核糖核苷酸；dt＝脱氧胸苷；da＝脱氧腺苷；dc＝脱氧胞苷；dg＝脱氧鸟苷；invdt＝反向脱氧胸苷；invda＝反向脱氧腺苷；invdc＝反向脱氧胞苷；invdg＝反向脱氧鸟苷；a、u、g和c＝相应的2'-o-甲基核糖核苷酸；af、uf、gf和cf＝相应的2'-脱氧-2'-氟代(“2'-氟代”)核糖核苷酸；ab＝无碱基；meo-i＝2’甲氧基肌苷；gna＝乙二醇核酸；sgna＝带有3'硫代磷酸酯的乙二醇核酸；lna＝锁核酸。在序列中插入“s”表明两个相邻核苷酸通过硫代磷酸二酯基团(例如硫代磷酸酯核苷酸间键)连接。除非另有说明，否则所有其他核苷酸通过3'-5'磷酸二酯基团连接。表2中的各sirna化合物包含19个碱基对的双链体区，在两条链的3'端具有2个核苷酸突出端，或在一端或两端具有钝化物。galnac3k2ahxc6为：

表2.针对具有修饰的pnpla3的sirna序列

实例2：所选择pnpla3sirna分子在rnafish测定中的功效

制备一组经完全化学修饰的sirna，包括跨越pnpla3中的rs738409和/或rs738408snp的sirna，且测试体外mrna敲低的效力和选择性。各sirna双链体由两条链组成，即有义链或“随从”链和反义或“引导”链。链长21或23个核苷酸，具有19个互补碱基对。在一些情况下，存在两个碱基对3'突出端。制备sirna，其中用2'-ome或2'-f基团取代各核苷酸的核糖中的天然2'-oh。任选地，用硫代磷酸酯替换一条或两条链上的磷酸二酯核苷酸间键以减少核酸外切酶的降解。

使用384孔格式的体外sirna转染测定，然后进行荧光原位杂交靶向核糖核酸分子(rnafish)测定来评估各sirna分子在降低pnpla3表达中的功效，以确定ic50和最大活性值。该测定在人肝细胞癌细胞系hep3b细胞(atcchb-8064)和表达人pnpla3i148i的中国仓鼠卵巢(cho)细胞上进行。在37℃和5％co2下，将人肝细胞癌hepb3维持在emem培养基(atcc30-2003)中，该培养基补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌剂。在37℃和5％co2下，将表达人pnpla3i148i的cho细胞维持在含有50％cd-cho(生命技术公司(lifetechnologies))、50％ex-cellcho5培养基(西格玛公司(sigma))、8mml-谷氨酰胺、1xht、1％抗生素/抗真菌剂、和10μg/ml嘌呤霉素的培养基中。

对于hep3b细胞测定，根据制造商的建议，在384孔板(珀金埃尔默公司(perkinelmer))中以10μg/孔制备sirna分子和lipofectaminernaimax转染试剂(生命技术公司(lifetechnologies))在emem培养基(atcc30-2003)中的转染复合物。对于cho人细胞测定，根据制造商的建议，在384孔板中以10μg/孔制备sirna分子和lipofectaminernaimax转染试剂在f12k培养基(联发科技(mediatech))中的转染复合物。将细胞在无抗生素/抗真菌剂的培养基中稀释至67,000个细胞/ml，且向各孔中添加30μl，在40μl培养基中最终密度为2000个细胞/孔。在室温下温育20分钟后，将板转移至37℃和5％co2培养箱中。将hep3b细胞转染测定温育72小时，且将cho人pnpla3i148i转染测定温育48小时。

收获时，将细胞在8％甲醛固定溶液(赛默科技公司(thermoscientific))中在室温下固定15分钟。然后将板通过连续50％、70％和100％乙醇洗涤进行脱水。然后将板密封且储存在-20℃。

使用affymetrixviewrnahc筛选测定试剂盒(qvp0011)、affymetrixviewhc信号扩增试剂盒3-plex(qvp0213)、和以下affymetrix基因特异性探针进行rnafish测定：pnpla3人0.33mlviewrnatype6(650标记)va6-20279-01和ppib人0.44mlviewrnatype1(488标记)va1-10148-01。

首先将板通过连续100％、70％和50％乙醇洗涤再水化。然后用pbs洗涤细胞，且随后根据试剂盒说明书进行透化和蛋白酶消化。根据制造商的方案制备目标工作探针组，将其添加孔中，且在40℃下温育3小时。遵循制造商的方案进行使用工作探针组、工作前置放大器、工作放大器和工作lp的连续杂交。最后，应用细胞核复染色(hoechst33342和cellmaskblue；分子探针公司(molecularprobes))。将板在室温下温育30分钟，用pbs洗涤，用80μl的pbs覆盖，且然后将板密封用于成像。

在operaphenix高含量筛选系统(珀金埃尔默公司(perkinelmer))上，使用针对hoechst33342和cellmaskblue的uv通道、针对类型1探针的488通道、和针对类型6探针的647通道，对所有板成像。

使用columbus软件分析rnafish数据，且使用genedatascreener生成影像。经cho转染的pnpla3i148i的测定结果如表3所示。经cho转染的pnpla3i148m的测定结果如表4所示。pnpla3敲低提供与对照相比的敲低百分比。负值表示pnpla3水平下降。

表3.经cho转染的pnpla3i148i的rnafish测定

表4.经cho转染的pnpla3i148m的rnafish测定

rnafish还在含有双突变体pnpla3-rs738408-rs738409的肝细胞系以及对照野生型细胞系hep3b上运行。将hep3b和hepg2细胞(购自atcc)在最小必需培养基(对于hep3b，来自康宁公司(corning)的mem，且对于hepg2，来自atcc的emem)中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(fbs，西格玛公司(sigma))和1％青霉素-链霉素(p-s，康宁公司(corning))。sirna转染如下进行：取决于细胞系，将1μl测试sirna和4μl普通mem或emem通过biomekfx(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))添加到经pdl涂布的cellcarrier-384ultra测定板(珀金埃尔默公司(perkinelmer))中。将5μl的lipofectaminernaimax(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))在普通mem或emem中预稀释(具体而言，对于hep3b，为在5μlmem中的0.035μlrnaimax，且对于hepg2，为在5μlemem中的0.06μl的rnaimax)，然后通过multidropcombi试剂分配器(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))分配到测定板中。在室温(rt)下温育sirna/rnaimax混合物20分钟后，使用multidropcombi试剂分配器，将补充有10％fbs和1％p-s的mem或emem中的30μlhep3b或hepg2细胞(每孔2000个细胞)添加至转染复合物中。将测定板在室温下温育20分钟，然后置于培养箱中。然后将细胞在37℃和5％co2下温育72小时。遵循制造方案(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))使用用于液体处理的内部组装的自动fish测定平台进行viewrnaish细胞测定。简言之，将细胞在4％甲醛(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))中在室温下固定15分钟，在室温下用去污剂透化3分钟，且然后在室温下用蛋白酶溶液处理10分钟。将靶特异性探针对(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))的温育进行3小时，而对于前置放大器、放大器和标记探针(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))各1小时。所有杂交步骤均在40℃下在cytomat2c-lin自动培养箱(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))中进行。在杂交反应后，将细胞用hoechst和cellmaskblue(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))染色30分钟，且然后在operaphenix(珀金埃尔默公司(perkinelmer))上成像。使用columbus影像数据存储和分析系统(珀金埃尔默公司(perkinelmer))分析影像以获得每个细胞的平均斑点计数。使用高(含有磷酸盐缓冲盐水，康宁公司(corning))和低(无靶探针对)对照孔来归一化斑点计数。绘制相对于总sirna浓度的归一化值，且将数据拟合到genedatascreener(基因数据公司(genedata))中的四参数s形模型以获得ic50和最大活性。hepg2细胞的测定结果如表5所示，且hep3b细胞的测定结果如表6所示。pnpla3敲低提供与对照相比的敲低百分比。负值表示pnpla3水平下降。在双链体运行超过一次的情况下，显示平均ic50，以及标准偏差。

表5.肝脏hepg2细胞的rnafish测定

表6.肝脏hep3b细胞的rnafish测定

实例3：用于pnpla3-rs738409和pnpla3-rs738409-rs738408的sirna的微滴式数字pcr测定

按照制造商方案，在optithaw培养基(xenotech公司目录号k8000)中解冻人原代肝细胞(xenotech公司/积水化学工业株式会社(sekisui)供体批号#hc3-38)，将细胞离心且在培养基抽吸后，重悬浮于optiplate肝细胞培养基(xenotech公司目录号k8200)中，且涂到96孔胶原蛋白涂布的平板中(葛莱娜公司(greiner)目录号655950)。在温育2-4小时后，除去培养基且用opticulture肝细胞培养基(xenotech公司目录号k8300)替换。添加opticulture培养基后2-4小时，通过自由摄取(无转染试剂)将经galnac缀合的sirna递送至细胞。将细胞在37℃和5％co2下温育24-72小时。然后用qiagenrlt缓冲液(79216)+1％2-巯基乙醇(西格玛公司(sigma)，m-3148)裂解细胞，且将裂解物储存于-20℃。根据制造商说明书，使用qiagenqiacubeht仪器(9001793)和qiagenrneasy96qiacubeht试剂盒(74171)纯化rna。使用qiaxpert系统(9002340)分析样品。使用appliedbiosystemshighcapacitycdnareversetranscription试剂盒(4368813)由rna样品合成cdna，根据制造商说明书组装反应，输入随样品而变化的rna浓度。在以下条件下在biorad四分体热循环仪(型号#ptc-0240g)上进行逆转录：25℃10分钟、37℃120分钟、85℃5分钟、然后(任选地)4℃无限保持。

根据制造商说明书，使用biorad的qx200autodg微滴式数字pcr系统进行微滴式数字pcr(ddpcr)。使用bioradddpcrsupermixforprobes(1863010)将反应装配到eppendorf透明96孔pcr板(951020303)中，且使用荧光标记pnpla3(idths.pt.58.21464637，引物与探针比率3.6:1和tbp(idt)hs.pt.53a.20105486，探针比率为3.6:1)和无rna酶的水(ambion公司，am9937)的qpcr测定。最终引物/探针浓度分别为900nm/250nm，输入在孔中不同的cdna浓度。使用bioradautodg微滴发生器(1864101)形成微滴，该发生器设置有制造商推荐的消耗品(bioraddg32滤筒1864108、biorad尖端1864121、eppendorfblue96孔pcr板951020362、biorad用于探针的微滴生成油1864110、和biorad微滴板组装)。使用以下条件在bioradc1000触摸热循环仪(1851197)上扩增微滴：在95℃下酶活化10分钟、在94℃下变性30秒、然后在60℃下退火/延伸1分钟、使用2℃/秒升温速率进行40个循环，在98℃下酶失活10分钟、然后(任选地)在4℃下无限保持。然后在bioradqx200微滴读出器上读取样品，该读出器测量与pnpla3或tbp浓度相关的fam/hex信号。使用biorad的quantasoft软件包分析数据。通过信道(荧光标记)对样品进行门控以确定各样品的浓度。然后将各样品表示为目标基因(pnpla3)浓度/持家基因(tbp)浓度的比率以便控制样品加载差异。然后将数据导入genedatascreener，其中将各测试sirna归一化至中性对照孔(仅缓冲液)的中值。ic50值在表7中报道。

表7.对原代肝细胞的ddpcr测定

实例4：在人源化小鼠模型中所选择pnpla3sirna分子的功效筛选

将在磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)中稀释至每只动物4e11至1e12病毒颗粒的相关腺病毒(aav；血清型aav8或aav7；无内毒素，由美商安进公司内部制备)静脉内注入c57bl/6ncrl雄性小鼠(查尔斯河实验室有限公司(charlesriverlaboratoriesinc.))的尾静脉，以驱动人pnpla3^wt(pnpla3-wt)、pnpla3^rs738409(pnpla3-i148m)、或pnpla3^{rs738409-rs738408}(pnpla3-i148mdm)在肝脏中的表达。小鼠通常为10-12周龄，且每组包括n＝4-6只动物。每轮筛选包括至少两个经媒介物处理的对照组：用媒介物处理的aav-空载体和aav-pnpla3^wt或pnpla3^rs738409和pnpla3^{rs738409-rs738408}。针对aav-pnpla3^wt、pnpla3^rs738409和/或pnpla3^{rs738409-rs738408}测试所有sirna。在aav注射后两周，将小鼠通过皮下注射，以用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的0.5、1.0、3.0或5.0毫克/千克动物的单剂量的sirnad-2324(0.5mm)处理。在sirna注射后8、15、22、28或42天，自动物收集肝脏，在液氮中快速冷冻，根据制造商说明书，使用qiacubeht仪器(凯杰公司(qiagen)，9001793)和rneasy96qiacubeht试剂盒(凯杰公司(qiagen)，74171)处理经纯化的rna。使用qiaxpert系统(凯杰公司(qiagen)，9002340)分析样品。用rq1无rna酶的dna酶(普洛麦格公司(promega)，m6101)处理rna，且使用taqman^tmrna-to-ct^tm1-step试剂盒(应用生物系统公司(appliedbiosystems)，4392653)制备实时qpcr。实时qpcr在quantstudioreal-timepcr机器上运行。结果基于人pnpla3的基因表达，其归一化至小鼠gapdh(来自英杰公司(invitrogen)的taqman^tm测定，分别为hs00228747_m1和4352932e)，且表示为人pnpla3mrna表达与经媒介物处理的对照动物相比的相对敲低。确定内源性小鼠pnpla3表达以用于比较(英杰公司(invitrogen)，mm00504420_m1)。

对于肝脏甘油三酯含量分析，将来自动物的约0.05-0.1毫克冷冻肝脏在一毫升异丙醇中匀浆化。在冰上温育一小时后，将样品在微量离心机中以10,000rpm旋转，且将上清液转移至清洁的深孔96孔板中。根据制造商说明书，使用比色infinity甘油三酯试剂(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，tr22421)和甘油三酯标准品(普安特科技公司(pointescientific)，t7531-std)确定甘油三酯含量。结果表示为每毫克组织的甘油三酯毫克数。

图1a-1d.在体内针对剂量依赖性mrna敲低和功能耐久性来筛选的5种sirna分子的实例。在静脉内aav注射后两周，用sirna处理表达人pnpla3^{rs738409-rs738408}的小鼠。每组n＝6只小鼠；数据表示为平均值和平均值的标准误差。(a)将sirna以0.5、1.0、3.0或5.0毫克/千克体重皮下注射到小鼠腹部。在sirna处理四周后，处死小鼠，且收集肝脏并处理以用于基因表达分析。数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的各组中的人pnpla3^{rs738409-rs738408}的平均相对敲低。(b)来自相同四周处理组的肝脏还针对甘油三酯含量进行处理以获得功能效力。数据表示每克经处理组织的甘油三酯的平均毫克数。(c)将sirna以1.0和3.0毫克/千克体重皮下注射到并行动物群的腹部。在sirna处理后六周收获小鼠以比较体内sirna分子的耐久性。收集肝脏且进行处理以进行基因表达分析。数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的各组中的人pnpla3^{rs738409-rs738408}的平均相对敲低。(d)来自相同六周处理组的肝脏还针对甘油三酯含量进行处理以随时间获得功能效力。数据表示每克经处理组织的甘油三酯的平均毫克数。

相对敲低的数据显示在表8-12中，期分别显示第8、15、22、28、和42天的相对敲低和各种剂量。pnpla3敲低为百分比，其中负值表明pnpla3水平降低。

表8.第8天pnpla3敲低测定

表9.第15天pnpla3敲低测定

表10.第22天pnpla3敲低测定

表11.第28天pnpla3敲低测定

表12.第42天pnpla3敲低测定

实例5：在人源化pnpla3^{rs738409-rs738408}小鼠模型中通过sirna分子预防和拯救nafld

通过用反式脂肪(占脂肪总量的45％)和糖较高的饮食(tetri2008)喂养小鼠来开发用于nafld/nash的“经美国生活方式诱导的肥胖综合征”或alios小鼠模型。对于这些研究，如前所述，向八至十周龄的c57bl/6ncrl雄性小鼠(查尔斯河实验室有限公司(charlesriverlaboratoriesinc.))注射aav空载体或aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}。在aav注射时，小鼠保持正常食物或接受alios饮食(envigo公司，td.06303)，配有由55％果糖和45％葡萄糖组成(分别为西格玛公司(sigma)，f0127和g7021)的饮用水直到收获。在先前实验中，确定pnpla3^{rs738409-rs738408}的过表达在此情况下加速和恶化nafld表型(数据未显示)。

在aav注射和饮食开始后两周，经由皮下注射，以用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的5.0毫克/千克动物的单剂量的sirnad-2324(0.5mm)或媒介物对照处理小鼠。每两周重复给药直至收获。在收获时，收集体重，然后在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺收集血清，然后获得肝重。经由10％中性缓冲福尔马林固定中叶，然后进行石蜡处理和包埋。如前所述，将肝脏其余部分快速冷冻以用于含量和基因表达分析。

如前所述，处理快速冷冻肝组织以用于rna和基因表达分析。结果显示为归一化至小鼠gapdh的指定基因的原始ct值和相对mrna表达。(来自英杰公司(invitrogen)的taqman^tm测定：人pnpla3,hs00228747_m1；小鼠pnpla3,mm00504420_m1；小鼠gapdh,4352932e)。

根据制造商说明书处理经福尔马林固定的组织以便进行苏木精和伊红染色(分别为达科公司(dako)，cs70030-2，cs70130-2)。通过经委员会认证的病理学家对脂肪变性和炎症进行评分。

血清分析包括timp1，其为一种与nash和nash相关性纤维化相关的生物标志物(youssani2011)。根据制造商说明书进行timp1elisa(研究开发系统公司(r&dsystems)，mtm100)。

图2a-2g.为评估pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子d-2324防止与nafld相关的表型发展和pnpla3^{rs738409-rs738408}过表达的能力，小鼠接受aav8-空载体(ev)或aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}或媒介物，且保持正常饮食或过渡到alios饮食。aav注射后两周，每隔一周用sirna或媒介物处理小鼠，持续六周；共有三轮注射。在八周时间点收获小鼠。结果表示为组平均值和标准误差，每组n＝8。星号代表aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}群组的统计学显著性，其通过使用邓尼特氏多重比较检验(dunnett’smultiplecomparisonstest)的单向anova产生。(a)在收获时肝重(克)与体重(克)的比率。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，**＝0.0018，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(b)通过qpcr确认肝脏中的人pnpla3mrna表达和沉默。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将经alios喂养的pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(c)通过qpcr分析肝脏中的小鼠pnpla3mrna表达，表明内源性pnpla3未被经aav介导的过表达或sirna沉默显著改变。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将经食物喂养的无aav组与经alios喂养的pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(d)肝脏甘油三酯含量表示为每克肝组织的甘油三酯毫克数。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，*＝0.0393，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.0063。(e)血清timp1表示为每毫升血清的皮克数。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(f)基于h&e染色的脂肪变性的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著性，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.0012。(g)基于h&e染色的炎症的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。

图3a-3g.为评估pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子在疾病发作后阻止经pnpla3^{rs738409-rs738408}介导的疾病进一步发展的能力，小鼠接受aav8-空载体(ev)或aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}或媒介物，且保持常规的饮食或过渡到alios饮食。在aav注射和饮食改变八周后，每隔一周用sirna或媒介物处理小鼠，再持续八周；共有四轮注射。在十六周时间点收获小鼠。尽管在脂肪变性方面没有观察到变化，但若在疾病诱导后开始sirna治疗，则一些其他疾病相关终点显著减少。结果表示为平均值和标准误差，每组n＝8。星号代表aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}群组的统计学显著性，其通过使用邓尼特氏多重比较检验(dunnett’smultiplecomparisonstest)的单向anova产生。(a)在收获时肝重(克)与体重(克)的比率。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，***＝0.0006。(b)通过qpcr确认肝脏中的人pnpla3mrna表达和沉默。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将经alios喂养的pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(c)通过qpcr分析肝脏中的小鼠pnpla3mrna表达，表明内源性pnpla3未被经aav介导的过表达或sirna沉默显著改变。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将经食物喂养的无aav组与经alios喂养的pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(d)肝脏甘油三酯含量表示为每克肝组织的甘油三酯毫克数。经调整的p值：aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，*＝0.0403。(e)血清timp1表示为每毫升血清的皮克数。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，**＝0.0027，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.002。(f)基于h&e染色的脂肪变性的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，不显著。(g)基于h&e染色的炎症的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.0068。

图4a-4d.为评估pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子拯救由于过表达pnpla3^{rs738409-rs738408}导致的疾病相关表型的能力，将来自经alios喂养的经八周aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}-媒介物处理的小鼠的肝脏和血清与来自经alios喂养的经十六周媒介物或sirna处理的aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}小鼠的血清和肝脏进行比较。虽然在此时间点使用sirna处理未观察到脂肪变性的变化，但是与八周时的媒介物对照相比，在十六周时肝脏甘油三酯、血清timp1和炎症在统计学上均较低。结果表示为平均值和标准误差，每组n＝8。星号代表经八周aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}媒介物处理的群组的统计学显著性，其通过使用邓尼特氏多重比较检验的单向anova产生。(a)肝脏甘油三酯含量表示为每克肝脏组织的甘油三酯毫克数。经调整的p值：16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物，不显著；16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.0011。(b)血清timp1表示为每毫升血清的皮克数。经调整的p值：16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物，不显著；16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，*＝0.0134。(c)基于h&e染色的脂肪变性的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物，不显著；16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，不显著。(d)基于h&e染色的炎症的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物，不显著；16wkaav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，*＝0.0112。

实例6：在人源化pnpla3^{rs738409-rs738408}小鼠模型中通过sirna分子预防肝纤维化

由阿米林制药公司(amylinpharmaceuticals)开发的“amln”饮食(clapper2013)为alios饮食的改良版。饲料包括胆固醇(2％)和额外蔗糖的十倍增加。接受“amln”饮食的小鼠在20-30周后发展为轻度至中度纤维化(clapper，mells和kristiansen论文)。对于该研究，如上所述，向八至十周龄的c57bl/6ncrl雄性小鼠(查尔斯河实验室有限公司(charlesriverlaboratoriesinc.))注射aav-空载体或aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}，以加速疾病发作。在注射aav时，小鼠继续正常饮食或接受envigo公司饮食td.170748，配有由55％果糖和45％葡萄糖(分别为西格玛公司(sigma)，f0127和g7021)组成的饮用水，直至收获。

aav注射和饮食开始后两周，通过皮下注射以用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的5.0毫克/千克动物的单剂量的sirnad-2324(0.5mm)或媒介物对照处理小鼠。每两周重复给药直至收获。在收获时，收集体重，然后在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺收集血清，然后获得肝重。经由10％中性缓冲福尔马林固定中叶，然后进行石蜡处理和包埋。快速冷冻肝脏其余部分以用于基因表达分析。

如前所述，处理快速冷冻肝组织以用于rna和基因表达分析。结果显示为归一化至小鼠gapdh的指定基因的原始ct值和相对mrna表达。(来自英杰公司(invitrogen)的taqman^tm测定：人pnpla3，hs00228747_m1；小鼠pnpla3，mm00504420_m1；小鼠col1a1，mm00801666_g1；小鼠col3a1，mm01254471_g1；col4a1，mm01210125_m1；小鼠gapdh，4352932e)。col1a1、col3a1和col4a1为与肝星状细胞活化和肝纤维化相关的细胞外基质标记物(baiocchini2016)。

根据制造商说明书处理经福尔马林固定的组织以用于苏木精、伊红和马松三色(masson’strichrome)染色(分别为达科公司(dako)，cs70030-2、cs70130-2、ar17311-2)。在无抗原修复的情况下且使用达科公司(dako)自动染色器进行抗平滑肌肌动蛋白染色。使用peroxidazed1和sniper(分别为biocare，px968和bs966)处理载玻片，且用单克隆抗肌动蛋白、α-平滑肌抗体(西格玛公司(sigma)，f3777)染色，然后用兔抗-fitc(英杰公司(invitrogen)，711900)、envision-兔hrp聚合物(达科公司(dako)，k4003)、dab+(达科公司(dako)，k3468)、和苏木精染色。通过经委员会认证的病理学家对脂肪变性、炎症、卵圆细胞/胆管增生和asma阳性细胞的量进行评分。

根据制造商说明书分析血清的小鼠timp1(研究开发系统公司(r&dsystems)，mtm100)和小鼠细胞角蛋白18-m30(华美生物(cusabio)，csb-e14265m)。除timp1外，细胞因子18-m30已被确定为nafld/nash的潜在生物标志物，包括早期纤维化(neuman2014和yang2015)。图5a-5l.为评估pnpla3^{rs738409-rs738408}特异性sirna分子预防早期纤维化发展的能力，小鼠接受aav8-空载体(ev)或aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}或媒介物，且保持常规食物或过渡到amln饮食。在aav注射后两周，每隔一周用sirna、d-2324或媒介物处理小鼠，再持续十周；共有六轮注射。在十周时间点收获小鼠。结果表示为平均值和标准误差，经食物喂养的无aav+媒介物和经amln喂养的aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物，每组n＝8；经amln喂养的aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，每组n＝12。星号代表经aav8-pnpla3^{rs738409-rs738408}-媒介物处理的群组的统计学显著性，其通过使用邓尼特氏多重比较检验的单向anova产生。(a)在收获时肝重(克)与体重(克)的比率。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(b)通过qpcr确认肝脏中的人pnpla3mrna表达和沉默。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(c)通过qpcr分析肝脏中的小鼠pnpla3mrna表达，表明内源性pnpla3未被经aav介导的过表达或sirna沉默显著改变。归一化至小鼠gapdh的(左)原始ct值和(右)相对倍数mrna表达；将经食物喂养的无aav组与经amln喂养的pnpla3^{rs738409-rs738408}+媒介物和pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna组进行比较。(d)血清timp1表示为每毫升血清的皮克数。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(e)血清ck18m30表示为每毫升血清的皮克数。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(f)基于h&e染色的炎症的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，*＝0.0108，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(g)基于h&e染色的卵圆细胞/胆管增生的组织学指征，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**＝0.0081。(h)抗平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，*＝0.0101，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，***＝0.0002。(i)纤维化的马松三色染色，评分为：在正常范围内(0)、最小(1)、轻度(2)、中度(3)、和严重(4)。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，不显著，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，不显著。(j)通过qpcr获得肝脏中的小鼠col1a1mrna表达。归一化至小鼠gapdh的相对倍数mrna表达。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(k)通过qpcr获得肝脏中的小鼠col3a1mrna表达。归一化至小鼠gapdh的相对倍数mrna表达。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，****<0.0001，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，****<0.0001。(l)通过qpcr获得肝脏中的小鼠col4a1mrna表达。归一化至小鼠gapdh的相对倍数mrna表达。经调整的p值：无aav+媒介物组，****<0.0001，aav-ev+媒介物，***<0.0005，aav-pnpla3^{rs738409-rs738408}+sirna，**<0.0041。

实例7：使用生物发光成像小鼠模型筛选pnpla3sirna分子

向通常在10-12周大的balb/c雄性小鼠(查尔斯河实验室有限公司(charlesriverlaboratoriesinc.))注射用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的相关腺病毒(aav；血清型aavdj8；无内毒素，由美商安进公司内部制备)。以从5e11至7.5e11个病毒颗粒向每只动物施用aav，并且静脉内注入尾静脉中。使用鼠巨细胞病毒(cmv)启动子和萤火虫萤光素酶报导基因设计aav构建体，其中在3’端一串核苷酸含有人pnpla3^wt(参考等位基因)或人pnpla3^{rs738409-rs738408}(次要等位基因)sirna靶序列的区段，以及其他非snp跨越人pnpla3目标靶序列，如图6和7所示。

在aav注射后两周，根据制造商的说明书给小鼠注射redijectd-luciferin(珀金埃尔默公司(perkinelmer)，770504)。使用ivis光谱活体成像系统(spectruminvivoimagingsystem)(珀金埃尔默公司(perkinelmer))捕获小鼠体内的生物发光信号，并使用livingimage软件(珀金埃尔默公司(perkinelmer))进行分析。然后根据肝脏区域的总通量[光子/秒]信号将小鼠随机分为n＝5组。随机分到处理组后，向小鼠给药用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的单剂量的sirna(0.5mm)。经由皮下注射以指定的毫克/千克动物剂量施用sirna。针对每轮筛选和每种aav类型，包括一个经媒介物处理的对照组。

sirna注射后第1、2、3和4周，对小鼠进行重新成像，并使用为基线读数建立的相同定义的目标区域收集总通量[p/s]测量结果。对于每只动物，通过计算第1、2、3或4周的总通量相对于动物基线总通量的百分比变化来确定相对敲低百分比，将其归一化至相同时间点的媒介物对照组基线总通量的平均变化。例如，用sirna处理的动物的相对敲低计算如下：(第2周时的动物总通量)/(基线时的动物总通量)，归一化为平均值(第2周时媒介物动物的总通量/基线时媒介物动物的总通量)。图8描述了在sirna处理之前和之后，注射有表达人pnpla3次要等位基因靶序列或参考等位基因靶序列的aav的动物以及总通量随时间的变化的代表性图像。

表13.pnpla3敲低测定

实例8：嵌合人源化肝小鼠模型中pnpla3^{rs738409-rs738408}选择性sirna分子的功效确认

为了评估pnpla3次要等位基因选择性sirna在体内人肝细胞中的功效，使用了来自菲尼克斯生物公司(phoenixbioco.,ltd)(日本)的嵌合人源化肝pxb小鼠(miyamoto等人,(2017)xenobiotica[异形生物]47(12):1052-1063；tateno等人(2015)plosone[科学公共图书馆综合]10(11):e0142145.doi:10.1371/journal.pone.0142145)。研究开始时，雄性小鼠大约四个月大；移植后至少三个月。通过phoenixbio，确定小鼠的人肝细胞置换指数为90％-95％，并且根据先前的基因分型，小鼠对pnpla3^rs738409(批号bd195)是杂合的。到达后，按照菲尼克斯生物公司(phoenixbio)的建议，将小鼠置于prolabrmh3000食物上。经过一星期的驯化周期后，将饮食改为高脂肪果糖含量的nash诱导饮食(研究饮食公司(researchdiets)，d19021301)。在nash饮食一周后，根据体重测量结果将小鼠随机分组。经由皮下注射，以用磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，14190-136)稀释的3.0或10.0毫克/千克动物的单剂量的sirna(0.5mm)或仅接受媒介物来处理小鼠。在sirna注射后两周或四周，自动物收集肝脏，在液氮中快速冷冻，根据制造商说明书，使用qiacube自动化dna/rna分离纯化系统(automateddna/rnaisolationpurificationsystem)(凯杰公司(qiagen)和rneasyminiqiacube试剂盒(凯杰公司(qiagen)，74116)处理经纯化的rna。使用nanodrop^tm8000分光光度计(赛默科技公司(thermoscientific)，nd-8000-gl)分析样品。用rq1无rna酶的dna酶(普洛麦格公司(promega)，m6101)处理rna，并根据制造商的说明进行数字微滴式pcr(ddpcr)的制备。accuscript高保真第1链cdna合成试剂盒(赛默飞世尔公司(thermofisher)，200820)用于逆转录反应，并使用ddpcrsupermixforprobes(伯乐公司(biorad)，1863010)组装pcr反应。使用autodg液滴微滴式数字pcr系统(伯乐公司(biorad)，qx200)进行ddpcr。以下taqman^tm测定购自英杰公司(invitrogen)：人pnpla3(hs00228747_m1)，人asgr1(hs1005019_m1)，小鼠asgr1(mm01245581_m1)，和人pnpla3rs738409次要/参考等位基因辨别测定(c______7241_10)。以下测定购自集成dna技术公司(integrateddnatechnologiesinc.)：人tbp(hs.pt53a.20105486；引物与探针的比率为3.6:1)，人hprt1(hs.pt.39a.22214821；引物与探针的比率为3.6:1)，以及小鼠hprt(mm.pt.39a.22214828；引物与探针的比率为3.6:1)。人pnpla3、hprt和asgr1以及小鼠hprt和asgr1的结果表示为拷贝/20微升反应，其归一化至人tbp。人pnpla3、人hprt和小鼠hprt的数据也表示为与经媒介物处理的对照动物相比的mrna表达的相对敲低百分比。

对于肝脏甘油三酯含量分析，将来自小鼠的约0.05-0.1毫克冷冻肝脏在一毫升异丙醇中匀浆化。在冰上温育一小时后，将样品在微量离心机中以10,000rpm旋转，且将上清液转移至清洁的深孔96孔板中。根据制造商说明书，使用比色infinity甘油三酯试剂(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，tr22421)和甘油三酯标准品(普安特科技公司(pointescientific)，t7531-std)以及带有softmaxpro6软件的spectramaxplus酶标仪(分子装置公司(moleculardevices))确定甘油三酯含量。结果表示为每克肝组织的甘油三酯毫克数。

图9示出了sirna分子d-2419的实例，展示体内剂量依赖性和等位基因选择性mrna的敲低和功能效力。在nash饮食一周后，用sirna或媒介物处理对人pnpla3^{rs738409-rs738408}杂合的小鼠。(a)将sirna分子d-2419以3.0和10.0毫克/千克体重皮下注射到小鼠腹部。在sirna处理两周和四周后，处死小鼠，且收集肝脏并处理以用于分析。使用ddpcr和等位基因特异性两染料试剂来辨别pnpla3的次要等位基因与参考等位基因，数据表明pnpla3^{rs738409-rs738408}的剂量依赖性和等位基因选择性敲低，而pnpla3^wt没有可测量的变化。每组n＝5只小鼠；数据表示为平均值和平均值的标准误差。双向anova，**0.001，***<0.001，****<0.0001，ns＝不显著。(b)数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的人pnpla3^{rs738409-rs738408}等位基因相比pnpla3^wt的平均相对mrna敲低百分比和平均值的标准误差。相对于两周媒介物对照平均值的值均归一化至人tbp。(c)来自两周处理组的肝脏针对甘油三酯含量进行处理以评估功能效力。数据表示每克肝脏的甘油三酯的毫克数。每组n＝5只小鼠；数据表示为平均值和平均值的标准误差。单向anova，**0.01，ns＝不显著。(d)为了控制有效的galnac介导的sirna递送，以10毫克/千克递送d-2787(一种分别对人和小鼠hprt和hprt具有交叉反应性的sirna)，并且在两周后收获肝脏。数据表示在经d-2787处理的小鼠(n＝4)相比经媒介物处理的小鼠(n＝5)中hprtmrna和hprtmrna的拷贝。数据表示为平均值和平均值的标准误差。单向anova，*0.01。(e)数据表示在相对于经媒介物处理对照组设定的人hprt和小鼠hprtmrna的平均相对mrna敲低百分比和平均值的标准误差；其全部归一化至人tbp。(f)为了确认galnac受体在pxb小鼠肝细胞上的表达，在不存在和存在d-2419的情况下、在sirna注射后两周和四周时，评估小鼠asgr1mrna和人asgr1mrna水平。每组n＝5只小鼠；数据表示为平均值和平均值的标准误差。