重组病毒载体和用于产生所述重组病毒载体的核酸的制作方法

文档序号：26406196发布日期：2021-08-24 16:20阅读：67来源：国知局

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本公开涉及分子生物学和基因疗法的领域。更具体地，本公开涉及用于产生重组病毒载体的组合物和方法。

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背景技术：

重组病毒载体，包括腺相关病毒载体(aav)，可用作基因递送剂，并且是人类基因疗法的有力工具。使用aav，可在体内和体外的各种细胞中实现高频稳定的dna整合和表达。与一些其他病毒载体系统不同，aav不需要活跃的细胞分裂来稳定整合到靶细胞中。

可使用病毒生产细胞系在培养物中产生重组aav载体。重组aav的产生通常需要细胞中三种元件的存在：1)包含转基因的核酸，所述转基因侧接aav反向末端重复(itr)序列，2)aavrep和cap基因，以及3)辅助病毒蛋白序列。这三种元件可提供在一个或多个质粒上，并且转染或转导到细胞中。

重组aav载体的产生和使用一直受到不能将转基因dna有效包装到病毒衣壳中并在靶细胞中有效表达转基因的限制。因此，本领域中需要用于产生重组aav载体的改进的组合物和方法。

技术实现要素：

本文描述了包含aav转移盒的核酸。所公开的核酸可用于产生重组腺相关病毒(aav)载体。所公开的核酸和转移盒包含在一种或多种疾病或病症的改善、治疗和/或预防中具有治疗功效的一种或多种转基因的序列。

在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸，所述核酸从5′至3′包含5′反向末端重复序列(itr)、启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3′itr。在一些实施方案中，所述转基因序列编码弗氏共济失调蛋白(fxn)蛋白。所述fxn蛋白可以是例如人fxn蛋白。在一些实施方案中，所述fxn蛋白具有seqidno：65的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸包含seqidno：28-64中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述5′itr与所述3′itr的长度相同。在一些实施方案中，所述5′itr和所述3′itr具有不同的长度。在一些实施方案中，所述5′itr和所述3′itr中的至少一者的长度是约110至约160个核苷酸。所述5’itr和所述3’itr中的至少一者可分离自或源自例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的基因组。在一些实施方案中，所述5’itr包含seqidno：1的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述3’itr包含seqidno：2的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述3’itr包含seqidno：3的序列，或与其至少95％同一的序列。

所述启动子可驱动转基因的表达。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子是野生型启动子的经修饰形式。例如，由于aav的包装限制，启动子的长度可减小。在一些实施方案中，所述启动子是野生型启动子的截短形式。

所述启动子可以是例如cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、ef-1α启动子、ef-1α短启动子、ef-1α核心启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子、gusb240启动子、gusb379启动子或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含选自seqidno：6-12中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述转基因序列是cpg优化的。在一些实施方案中，所述转基因序列包含seqidno：19或20，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述核酸包含紧邻所述转基因序列的5′的kozak序列。所述kozak序列可包含例如seqidno：17或18的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(sv40)、人α-珠蛋白、兔α-珠蛋白、人β-珠蛋白、兔β-珠蛋白、人胶原蛋白、多瘤病毒、人生长激素(hgh)和牛生长激素(bgh)的聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含seqidno：21-24中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述核酸还包含增强子。所述增强子可以是例如cmv增强子。在一些实施方案中，所述增强子包含seqidno：4或5的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述核酸还包含内含子序列。所述内含子序列可以是例如嵌合序列或杂合序列。在一些实施方案中，所述内含子序列包含分离自或源自以下基因中的一者或多者的序列：β-珠蛋白、鸡β-肌动蛋白、小鼠微小病毒和人igg。在一些实施方案中，所述内含子序列包含seqidno：13-16中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

在一些实施方案中，所述核酸还包含至少一个填充片段(stuffer)序列(例如，1、2、3、4或5个填充片段序列)。在一些实施方案中，所述至少一个填充片段序列包含seqidno：25-27中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

本文还提供了一种载体(例如，aav载体或质粒)，所述载体包含本公开的核酸。

还提供了一种细胞，所述细胞包含本公开的核酸。

还提供了一种产生重组aav载体的方法，所述方法包括使aav生产细胞与本公开的核酸或质粒/杆粒接触。还提供了一种通过这种方法产生的重组aav载体。所述重组aav载体可包含来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav和牛aav的衣壳蛋白。在一些实施方案中，与野生型aav衣壳蛋白相比，所述aav载体可包含具有一个或多个取代或突变的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述重组aav载体是单链的(ssaav)。在一些实施方案中，所述重组aav载体是自身互补的(scaav)。

还提供了包含本公开的核酸、质粒、杆粒、细胞或重组aav载体的组合物。

还提供了一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的核酸、质粒、细胞或重组aav载体。在一些实施方案中，所述受试者是人受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有弗里德赖希氏共济失调(frda)。

在下文阐述的具体实施方式中更详细地阐述了这些和其他实施方案。

附图说明

图1示出使用三重质粒转染方法的aav生产产率(载体基因组)。使用微滴数字pcr测定对aav载体进行定量。

图2示出与注射盐水的小鼠(组1)相比，用包装人fxn转基因的aav载体以5x10¹³vg/kg的剂量处理的fxn缺陷型fxn^flox/floxmckcre⁺)小鼠(组2)的存活百分比。

图3a-3c示出实验的结果，其中用盐水或包装人fxn转基因的aav载体(低剂量＝1x10¹³vg/kg，高剂量＝5x10¹³vg/kg)处理3周龄fxn缺陷型(fxn^flox/floxmckcre⁺)小鼠。在处理后3周将小鼠处死。图3a示出心脏组织中每微克宿主dna的人fxn载体dna的拷贝数。图3b示出fxnmrna的拷贝数，针对hprt(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸-核糖基转移酶)mrna归一化。nd＝未检测到。图3c示出fxn蛋白水平。

图4示出用不同剂量的aav9-fxn转导的培养的lec2细胞中人fxn(ng/mg)的表达。使用标准elisa测量人fxn水平。

图5示出使用本公开的aav转移盒产生aav的示例性方案的示意图。使用标准克隆技术将包含5’itr、启动子、转基因和3’itr的aav转移盒包装到质粒中。制备包含aavrep和cap序列的第二质粒和包含腺病毒辅助基因的第三质粒。将三种质粒转染到aav生产细胞系(例如hek293)中。细胞然后产生aav，所述aav可纯化和冷冻以供稍后使用。

具体实施方式

基因疗法在遗传疾病和病症，包括例如弗里德赖希氏共济失调(frda)的治疗和预防方面具有广阔前景。frda是通常由弗氏共济失调蛋白(fxn)基因中的突变引起的常染色体隐性遗传病症。在美国，每50,000人中约有1人患有frda。典型的发病年龄介于约5与约18岁之间。受试者的症状各不相同，但可包括(i)手臂和腿部协调感丧失(共济失调)，(ii)疲劳/能量缺乏和肌肉损失，(iii)视力障碍、听力损失和口齿不清，(iv)侵袭性脊柱侧凸(脊柱弯曲)，(v)糖尿病(通常胰岛素依赖性)，和(vi)严重心脏疾患(例如，肥厚型心肌病和心律失常)。患有frda的个体的脑力保持不变。目前没有针对frda的治疗；监测受试者以进行症状控制。因此，本领域需要治疗和/或预防frda的组合物和方法。

本文提供了包含用于产生aav载体的aav转移盒的核酸。所述aav载体可用于基因治疗应用，例如将治疗性转基因递送至细胞或有需要的受试者。本公开的aav转移盒和载体可用于治疗或预防各种遗传疾病和病症，如frda。

在本说明书中引用的所有论文、公布和专利都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已具体地且个别地指示将各个别论文、公布或专利以引用的方式并入一般，并且以引用的方式并入本文来公开和描述与所述公布引用的内容相关的方法和/或材料。

除非上下文另有说明，否则特别意图本文描述的各种特征可以任何组合使用。章节标题在本文出于组构目的使用，并且不意图是限制性的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的具体实施方式中所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的。

定义

在本文的描述和所附权利要求书中使用以下术语：

除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”也意图包括复数形式。

此外，如本文所用的术语“约”在指诸如多核苷酸或多肽序列的量或长度、剂量、时间、温度等的可测量值时意在涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。

同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方案(“或”)解释时缺少组合。

“核酸”或“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，例如rna、dna或dna-rna杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)。在一些实施方案中，本公开的核酸是单链或双链dna序列。核酸的长度可以是1-1,000、1,000-10,000、10,000-100,000、100,000-100万或大于100万个核苷酸。核酸通常将含有磷酸二酯键，但在一些情况下包括核酸类似物，所述核酸类似物可具有替代主链，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、o-甲基亚磷酰胺或p-乙氧基键联，或肽核酸主链和键联。其他类似物核酸包括具有正性主链、非离子主链和非核糖主链的核酸。含有一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内。核糖-磷酸主链的这些修饰可促进标记的添加，或增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。本公开的核酸可以是线性的，或者可以是环状的(例如，质粒)。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，但对于可构成蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数目没有设限。

如本文所用，术语“病毒载体”、“病毒载体”或“基因递送载体”是指用作核酸递送媒介物的病毒颗粒，并且其包含包装在病毒粒子内的载体基因组。本公开的示例性病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、慢病毒载体和逆转录病毒载体。

腺相关病毒或aav属于细小病毒科的依赖病毒属。4.7kb野生型aav基因组编码两个主要开放阅读框。rep基因表达病毒复制蛋白，并且cap基因表达病毒衣壳蛋白。aav基因组的末端是形成t形发夹结构的反向末端重复序列(itr)。尽管成熟aav病毒粒子在哺乳动物细胞中具有传染性，但复制型aav生命周期需要来自例如腺病毒或疱疹病毒的辅助功能。重组aav载体可通过用转基因表达盒替代野生型aav开放阅读框来生成。

如本文所述，aav可以是aav1型、aav2型、aav3型(包括3a和3b型)、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型、aav10型、aav11型、aav12型、aav13型、aavrh32.33型、aavrh8型、aavrh10型、aavrh74型、aavhu.68型、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、蛇aav、鬃狮蜥aav、aav2i8、aav2g9、aav-lk03、aav7m8、aavanc80、aavphp.b以及现在已知或后来发现的任何其他aav。参见，例如，bernardn.fields等人，virology，第2卷，第69章(第4版，lippincott-ravenpublishers)。已经鉴定了许多aav血清型和进化枝(参见例如，gao等人，(2004)j.virology78：6381-6388；moris等人，(2004)virology33-：375-383；和表1)。

表1：aav血清型和进化枝

术语“自身互补aav”或“scaav”是指重组aav载体，其形成自发退火的二聚体反向重复dna分子，与常规单链(ss)aav基因组相比产生更早且更稳健的转基因表达。值得注意的是，scaav只能容纳约2.4kb的基因组，是常规aav载体大小的一半。在一些实施方案中，可使用双载体策略来克服aav的小包装容量。例如，可使用顺式活化、反式剪接、重叠和杂合系统。

术语“aav转移盒”是指包含侧接第一和第二itr序列的转基因的核酸。在aav载体产生过程中，aav转移盒被包装到aav载体中。

术语“病毒生产细胞(viralproductioncell)”、“病毒生产细胞系”或“病毒生产细胞(viralproducercell)”是指用于产生病毒载体的细胞。hek293和239t细胞是常见的病毒生产细胞系。下面的表2列出了各种病毒载体的示例性病毒生产细胞系。

表2：示例性病毒生产细胞系

“hek293”是指最初来源于在组织培养中生长的人胚胎肾细胞的细胞系。hek293细胞系在培养中容易地生长，并且通常用于病毒生产。如本文所用，“hek293”还可指一种或多种变体hek293细胞系，即另外包含一种或多种遗传改变的源自原始hek293细胞系的细胞系。已经针对一种或多种特定应用开发和优化了许多变体hek293系。例如，293t细胞系含有sv40大t抗原，其允许含有sv40复制起点的转染质粒的附加型复制，从而增加所需基因产物的表达。

“sf9”是指昆虫细胞系，其是源自亲本草地夜蛾细胞系iplb-sf-21-ae的克隆分离株。sf9细胞可在没有血清的情况下生长，并且可贴壁或悬浮培养。

“转染试剂”是指增强核酸转移到细胞中的组合物。本领域常用的一些转染试剂包括结合至核酸和细胞表面的一种或多种脂质(例如，lipofectamine^tm)。

反向终端重复序列

反向末端重复序列或itr序列是aav原病毒整合和将aavdna包装成病毒粒子所需的最少序列。itr参与aav生命周期中的各种活动。例如，itr序列在转染后从质粒中切除、载体基因组的复制以及从宿主细胞基因组整合和拯救中发挥作用。

本公开的核酸可包含5’itr和/或3’itr。itr序列的长度可以是约110至约160个核苷酸，例如110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个核苷酸。在一些实施方案中，5′itr与3′itr的长度相同。在一些实施方案中，5′itr和3′itr具有不同的长度。在一些实施方案中，5’itr长于3’itr，并且在其他实施方案中，3’itr长于5’itr。

itr可分离自或源自任何aav的基因组，例如表1中列出的aav。在一些实施方案中，5’itr和3’itr中的至少一者分离自或源自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的基因组。在一些实施方案中，5’itr和3’itr中的至少一者可以是分离自或源自除aav以外的另一种细小病毒物种的成员的野生型或突变的itr。例如，在一些实施方案中，itr可以是分离自或源自博卡病毒或细小病毒b19的野生型或突变型itr。

在一些实施方案中，itr包含促进自身互补aav(scaav)的产生的修饰。在一些实施方案中，促进scaav的产生的修饰是从itr中缺失末端解链序列(trs)。在一些实施方案中，5’itr是野生型itr，并且3’itr是缺乏末端解链序列的突变型itr。在一些实施方案中，3’itr是野生型itr，并且5’itr是缺乏末端解析序列的突变的itr。在一些实施方案中，末端解链序列在5’itr和3’itr中均不存在。在其他实施方案中，促进scaav的产生的修饰是用不同的发夹形成序列，如shrna形成序列替代itr。

在一些实施方案中，5’itr或3’itr可包含seqidno：1的序列，或与其至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，5’itr或3’itr可包含seqidno：2的序列，或与其至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，5’itr或3’itr可包含seqidno：3的序列，或与其至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，5’itr包含seqidno：1的序列，并且3’itr包含seqidno：2的序列。在一些实施方案中，5’itr包含seqidno：1的序列，并且3′itr包含seqidno：3的序列。

在一些实施方案中，核酸可包含一个或多个“替代”itr，即与itr具有相同功能的非itr序列。参见例如，xie，j.等人，mol.ther.，25(6)：1363-1374(2017)。在一些实施方案中，itr被替代itr替代。在一些实施方案中，替代itr包含发夹形成序列。在一些实施方案中，替代itr是短发夹(sh)rna形成序列。

启动子、增强子、阻遏子和其他调控序列

基因表达可由核苷酸序列，如与基因可操作地连接的启动子、增强子和/或阻遏子控制。术语“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列(如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。

在一些实施方案中，本文所述的核酸或aav转移盒包含启动子。启动子可以是例如组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。如本文所用，术语“启动子”是指指导可操作连接的核酸的转录的一个或多个核酸控制序列。启动子可包括靠近转录起始位点的核酸序列，如tata元件。启动子还可包括可被转录因子结合的顺式作用多核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下呈活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控情况下呈活性的启动子。

可用于本文所述的核酸和盒的示例性启动子包括cmv启动子、sv40启动子(例如，sv40早期或晚期启动子)、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、ef-1α启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子、gusb240启动子(例如，人gusb240(hgusb240)启动子)、gusb379启动子(例如人gusb379(hgusb379)启动子)和磷酸甘油激酶(pgk)启动子(例如，人pgk(hpgk)启动子)。在一些实施方案中，ef-1α选自ef-1α野生型启动子、ef-1α短启动子和ef-1α核心启动子。在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、ef-1α短启动子、ef-1α野生型启动子、ef-1α核心启动子、hpgk启动子、hgusb240启动子和hgusb379启动子。在一些实施方案中，启动子包含seqidno：6-12中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

可用于本文所述的核酸和盒中的示例性组织特异性启动子和增强子的非限制性列表包括：hmg-coa还原酶启动子；固醇调控元件1(sre-1)；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pepck)启动子；人c反应蛋白(crp)启动子；人葡糖激酶启动子；胆固醇7-α水解酶(cyp-7)启动子；β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸转移酶启动子；胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp-1)启动子；醛缩酶b启动子；人转铁蛋白启动子；i型胶原启动子；前列腺酸性磷酸酶(pap)启动子；前列腺分泌蛋白94(psp94)启动子；前列腺特异性抗原复合物启动子；人腺激肽释放酶基因启动子(hgt-1)；肌细胞特异性增强子结合因子mef-2；肌肉肌酸激酶启动子；胰腺炎相关蛋白启动子(pap)；弹性蛋白酶1转录增强子；胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强子启动子；胰腺胆固醇酯酶基因启动子；子宫珠蛋白启动子；胆固醇侧链裂解(scc)启动子；γ-γ烯醇化酶(神经元特异性烯醇化酶，nse)启动子；神经丝重链(nf-h)启动子；人cgl-1/颗粒酶b启动子；末端脱氧转移酶(tdt)、λ5、vpreb和lck(淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶p561ck)启动子；人cd2启动子及其3′转录增强子；人nk和t细胞特异性活化(nkg5)启动子；pp60c-src酪氨酸激酶启动子；器官特异性新抗原(osn)，mw40kda(p40)启动子；结肠特异性抗原-p启动子；人α-乳白蛋白启动子；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pepck)启动子；her2/neu启动子；酪蛋白启动子；igg启动子；绒毛膜胚胎抗原启动子；弹性蛋白酶启动子；胆色素原脱氨酶启动子；胰岛素启动子；生长激素因子启动子；酪氨酸羟化酶启动子；白蛋白启动子；甲胎蛋白启动子；乙酰-胆碱受体启动子；乙醇脱氢酶启动子；α或β珠蛋白启动子；t细胞受体启动子；骨钙蛋白启动子；il-2启动子；il-2受体启动子；乳清(wap)启动子和mhcii类启动子。

基因表达也可受一个或多个远端“增强子”或“阻遏子”元件的控制，所述元件可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对处。增强子或阻遏子元件以与转录起始位点附近的顺式作用元件类似的方式调控转录，不同之处在于增强子元件可在距离转录起始位点一定距离处起作用。

在一些实施方案中，本文所述的核酸或aav转移盒包含增强子。增强子可与启动子可操作地连接。增强子可以是例如cmv增强子。在一些实施方案中，增强子包含seqidno：4或5的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

转基因

本文所述的核酸和aav转移盒可包含用于在靶细胞中表达的转基因序列。

转基因可以是任何一个或多个目标异源核酸序列。目标核酸可编码多肽，包括治疗性(例如，用于医学或兽医用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽或rna。在一些实施方案中，转基因是cdna序列。

在一些实施方案中，转基因编码治疗性多肽。治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调控因子蛋白(cftr)、肌营养不良蛋白(包括小型和微型肌营养不良蛋白，参见例如，vincent等人，(1993)naturegenetics5：130；美国专利公布号2003/017131；国际公布wo/2008/088895，wang等人，proc.natl.acad.sci.usa97：13714-13719(2000)；和gregorevic等人，mol.ther.16：657-64(2008))、肌生成抑制蛋白前肽、卵泡抑素、激活素11型可溶性受体、igf-1、抗炎多肽如iκb显性突变体、肌长蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白质(tinsley等人，(1996)nature384：349)、微型肌营养不良蛋白相关蛋白质、凝血因子(例如，因子viii、因子ix、因子x等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、ldl受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶a、支链酮酸脱氢酶、rp65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括rankl和vegf]、神经胶质源性生长因子、转化生长因子-α和-β等)、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶a、受体(例如肿瘤坏死生长因子可溶性受体)、s100a1、小清蛋白、腺苷酸环化酶6型、调节钙调控的分子(例如serca2a、pp1的抑制剂1及其片段)[例如，wo2006/029319和wo2007/100465])、影响g蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子如截短的组成型活性barkct、抗炎因子如irap、抗肌生成抑制蛋白蛋白、天冬氨酸酰化酶、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性mab是mab)、神经肽及其片段(例如甘丙肽、神经肽y(参见，u.s.7,071,172))、血管生成抑制剂如血管生成抑制蛋白(vasohibin)和其他vegf抑制剂(例如，血管生成抑制蛋白2[参见，wojp2006/073052])。其他说明性治疗性多肽包括自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、增强或抑制宿主因子转录的蛋白质(例如，与转录增强子或抑制因子元件连接的核酸酶死亡cas9、与转录增强子或抑制因子元件连接的锌指蛋白、与转录增强子或抑制因子元件连接的转录活化因子样(tal)效应物)、赋予对癌症疗法中使用的药物的抗性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、rb、wt-1)、trail、弗氏共济失调蛋白(fxn)、fas-配体和在有需要的受试者中具有治疗作用的任何其他多肽。转基因也可以是单克隆抗体或抗体片段，例如，针对肌生成抑制蛋白的抗体或抗体片段(参见例如，fang等人，naturebiotechnology23：584-590(2005))。治疗性多肽还包括编码报告多肽(例如酶)的那些。报告多肽是本领域已知的并且包括但不限于绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。

任选地，转基因编码分泌多肽(例如，在其天然状态下为分泌多肽或已进行工程化以被分泌(例如通过与本领域已知的分泌信号序列可操作缔合)的多肽)。

或者，在一些实施方案中，转基因可编码反义核酸；核酶(例如，如美国专利号5,877,022中所描述)；影响剪接体介导的/ram剪接的rna(参见，puttaraju等人，(1999)naturebiotech.17：246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)；干扰rna(rnai)，包括介导基因沉默的sirna、shrna或mirna(参见，sharp等人，(2000)science287：2431)；和其他非翻译rna，如“导向”rna等。示例性的非翻译rna包括针对多药耐药(mdr)基因产物的rnai(例如，用于治疗和/或预防肿瘤和/或施用至心脏以预防化学疗法造成的损伤)；针对肌生成抑制蛋白的rnai(例如，用于杜氏肌营养不良)；针对vegf的rnai(例如，用于治疗和/或预防肿瘤)；针对受磷蛋白的rnai(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如，andino等人，j.genemed.10：132-142(2008)和li等人，actapharmacolsin.26：51-55(2005))；受磷蛋白抑制性或显性阴性分子，如受磷蛋白s16e(例如，用于治疗心血管疾病，参见例如hoshijima等人nat.med.8：864-871(2002))；针对腺苷激酶的rnai(例如，用于癫痫)；以及针对病原体生物体和病毒(例如乙型和/或丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、cmv、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)的rnai。

此外，转基因序列可指导选择性剪接。为了说明，与肌营养不良蛋白外显子51的5′和/或3′剪接位点互补的反义序列(或其他抑制序列)可与u1或u7小核(sn)rna启动子结合递送以诱导此外显子的跳跃。例如，包含位于反义/抑制序列的5′的u1或u7snrna启动子的dna序列可包装在盒中并递送到本公开的aav载体中。

在一些实施方案中，转基因可指导基因编辑。例如，转基因可编码基因编辑分子，如导向rna或核酸酶。在一些实施方案中，转基因可编码锌指核酸酶、归巢核酸内切酶、talen(转录活化因子样效应物核酸酶)、ngago(agronaute核酸内切酶)、sgn(结构引导的核酸内切酶)或rgn(rna引导的核酸酶)如cas9核酸酶或cpf1核酸酶。

转基因可与宿主染色体上的基因座共享同源性并与其重组。例如，可利用这种方法来校正宿主细胞中的遗传缺陷。

转基因可以是免疫原性多肽，例如用于疫苗接种。转基因可编码本领域已知的任何目标免疫原，包括但不限于来自人免疫缺陷病毒(hiv)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、流感病毒、hiv或sivgag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。

根据本公开的病毒载体提供了用于将转基因递送至广泛范围的细胞(包括分裂细胞和非分裂细胞)中的手段。病毒载体可用于在体外将转基因递送至细胞中，例如以在体外产生多肽或用于离体基因疗法。病毒载体另外可用于将转基因递送至有需要的受试者的方法中，例如以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性rna。以此方式，可在受试者体内产生多肽或功能性rna。受试者可能需要所述多肽，因为受试者缺乏所述多肽。此外，可实施所述方法，因为在受试者中产生所述多肽或功能性rna可赋予一些有益作用。

病毒载体还可用于在培养的细胞或受试者中产生目标多肽或功能性rna(例如，使用受试者作为生物反应器以产生所述多肽或观察功能性rna对受试者的影响，例如，与筛选方法结合)。

一般而言，本公开的核酸和病毒载体可用于递送编码多肽或功能性rna的转基因以治疗和/或预防递送治疗性多肽或功能性rna对其有益的任何疾病状态。说明性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调控因子蛋白)和其他肺部疾病、a型血友病(因子viii)、b型血友病(因子ix)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其他血液病症。阿尔茨海默氏病(gdf；脑啡肽酶)、多发性硬化症(β-干扰素)、帕金森氏病(神经胶质细胞系源性的神经营养因子[gdnf])、亨廷顿氏病(rnai以除去重复序列)、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)以及其他神经系统病症、癌症(内皮抑素、血管抑素、trail、fas-配体、细胞因子，包括干扰素；rnai，包括针对vegf或多重耐药基因产物mir-26a的rnai[例如，用于肝细胞癌])、糖尿病(胰岛素)、肌营养不良包括杜氏肌营养不良(肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子i、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌静止性肌生成抑制蛋白前肽的rnai、卵泡抑素、激活素ii型可溶性受体、抗炎性多肽如iκb显性突变体、肌长蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白质、微型肌营养不良蛋白相关蛋白质、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接接点以诱导外显子跳跃的反义或rnai[参见例如，wo/2003/095647]、针对u7snrna以诱导外显子跳跃的反义[参见例如，wo/2006/021724]和针对肌生成抑制蛋白或肌生成抑制蛋白前肽的抗体或抗体片段)和贝克尔肌营养不良、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、赫尔勒氏病(a-l-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原贮积病(例如，法布里病[a-半乳糖苷酶]和庞贝病[溶酶体酸性α-葡糖苷酶])和其他代谢病症、先天性肺气肿(α-1-抗胰蛋白酶)、莱施-奈恩综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)、尼曼-皮克病(鞘磷脂酶)、泰-萨二氏病(溶酶体氨基己糖苷酶a)、槭糖尿病(支链酮酸脱氢酶)、视网膜退行性疾病(以及其他眼睛和视网膜疾病；例如，用于黄斑变性的pdgf和/或用于治疗/预防例如i型糖尿病针对视网膜病症的血管生成抑制蛋白或其他vegf抑制剂或其他血管生成抑制剂)、实体器官疾病如脑(包括帕金森氏病[gdnf]、星形细胞瘤)[内皮抑素、血管抑素和/或针对vegf的rnai]、成胶质细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对vegf的rnai])、肝脏、肾脏、心脏包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(pad)(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂i(i-1)及其片段(例如ilc)、serca2a、调控受磷蛋白基因的锌指蛋白、barkct、[32-肾上腺素能受体、2-肾上腺素能受体激酶(bark)、磷酸肌醇-3激酶(pi3激酶)、s100a1、小清蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响g蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子如截短的组成型活性barkct；calsarcin，针对受磷蛋白的rnai；受磷蛋白抑制性或显性阴性分子如受磷蛋白s16e等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节病症(胰岛素样生长因子1和/或2)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、提高心脏移植物存活(超氧化物歧化酶)、aids(可溶性cd4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子i)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎性因子，如irap和tnfa可溶性受体)、肝炎(a-干扰素)、ldl受体缺乏症(ldl受体)、高血氨症(鸟氨酸转氨甲酰酶)、克拉伯氏病(半乳糖脑苷酯酶)、巴腾氏病、弗里德赖希氏共济失调(frda)、脊髓性脑共济失调包括sca1、sca2和sca3、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶、)、自身免疫性疾病等。本公开还可在器官移植后用于提高移植成功率和/或减少器官移植或辅助疗法的不利副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸以阻断细胞因子产生)。作为另一个实例，骨形态发生蛋白(包括bnp2、7等，rankl和/或vegf)可例如在癌症患者的骨折或手术切除之后与骨同种异体移植物一起施用。

在一些实施方案中，本公开的病毒载体可用于递送编码多肽或功能性rna的转基因以治疗和/或预防肝脏疾病或病症。肝脏疾病或病症可以是例如原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、纤维化、黄疸、原发性硬化性胆管炎(psc)、布-加综合征、血色素沉着病、威尔逊氏病、酒精性纤维化、非酒精性纤维化、肝脂肪变性、吉尔伯特氏综合征、胆道闭锁、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿拉吉欧综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积症、b型血友病、遗传性血管性水肿(hae)、纯合子家族性高胆固醇血症(hofh)、杂合子家族性高胆固醇血症(hefh)、冯吉尔克氏病(gsdi)、a型血友病、甲基丙二酸血症、丙酸血症、高胱氨酸尿症、苯丙酮尿症(pku)、1型酪氨酸血症、精氨酸酶1缺乏症、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶i缺乏症、1型瓜氨酸血症、希特林蛋白(citrin)缺乏症、1型克-纳二氏综合征、胱氨酸病、法布里病、糖原贮积病1b、lpl缺乏症、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、鸟氨酸移位酶缺乏症、1型原发性高草酸尿症或adascid。

本公开的病毒载体可用于递送用于产生诱导多能干细胞(ips)的转基因。例如，本公开的病毒载体可用于将一种或多种干细胞相关核酸递送至非多能细胞中，如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等。编码与干细胞相关的因子的转基因是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的此类因子的非限制性实例包括oct-3/4、sox家族(例如sox1、sox2、sox3和/或sox15)、k1f家族(例如klfl、khzklf4和/或klf5)、myc家族(例如c-myc、l-myc和/或n-myc)、nanog和/或lin28。

本公开的病毒载体可用于递送转基因以治疗和/或预防代谢病症如糖尿病(例如，胰岛素)、血友病(例如，因子ix或因子viii)、溶酶体贮积症如粘多糖贮积症(例如，sly综合征[β-葡糖醛酸酶]、赫尔勒综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、施艾综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、赫尔勒-施艾综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、圣菲利波综合征a型[肝素磺酰胺酶]、b型[n-乙酰氨基葡糖苷酶]、c型[乙酰基-辅酶a：α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]、d型[n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶]、莫尔基奥综合征a型[半乳糖-硫酸硫酸酯酶]、b型[β-半乳糖苷酶]、马-拉氏综合征[n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(α-半乳糖苷酶)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)或糖原贮积症(例如，庞贝病；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。

在一些实施方案中，所述转基因可用于治疗弗里德赖希氏共济失调。在一些实施方案中，所述转基因编码弗氏共济失调蛋白(fxn)蛋白。弗氏共济失调蛋白可以是例如人弗氏共济失调蛋白。下文提供了示例性人弗氏共济失调蛋白序列(seqidno：65)：

还参见uniprot登录号q16595，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，弗氏共济失调蛋白具有与人弗氏共济失调蛋白的序列至少90％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，弗氏共济失调蛋白具有与seqidno：65的序列至少90％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，人弗氏共济失调蛋白是弗氏共济失调蛋白的同种型、变体(例如选择性剪接变体)或突变体形式。在一些实施方案中，突变体弗氏共济失调蛋白具有表3中所示的一个或多个取代。

表3：示例性弗氏共济失调蛋白氨基酸取代

在一些实施方案中，转基因包含相对于野生型序列进行密码子优化的弗氏共济失调蛋白cdna。例如，可修饰cdna以除去隐蔽的剪接受体/供体位点、减少稀有密码子的使用、除去核糖体进入位点等。在一些实施方案中，转基因包含cpg优化的弗氏共济失调蛋白cdna。例如，可修饰cdna以减少cpg二核苷酸的数量。

在一些实施方案中，转基因包含弗氏共济失调蛋白cdna，所述弗氏共济失调蛋白cdna包含seqidno：19的序列或与其至少90％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，转基因包含弗氏共济失调蛋白cdna，所述弗氏共济失调蛋白cdna包含seqidno：20的序列或与其至少90％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的序列。

聚腺苷酸化(polya)信号

聚腺苷酸化信号是在几乎所有哺乳动物基因中发现的核苷酸序列，并且控制向基因转录本的3′端添加一串大约200个腺苷残基(poly(a)尾)。poly(a)尾有助于mrna稳定性，并且缺少poly(a)尾的mrna迅速降解。还有证据表明，poly(a)尾的存在通过影响翻译起始而对mrna的翻译能力有积极贡献。

在一些实施方案中，本公开的核酸和aav转移盒包含一种或多种聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述核酸和aav转移盒包含两种、三种、四种或更多种聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以是猿猴病毒40(sv40)、α-珠蛋白(例如，人α-珠蛋白、小鼠α-珠蛋白或兔α-珠蛋白)、β-珠蛋白(例如，人β-珠蛋白、小鼠β-珠蛋白或兔β-珠蛋白)、人胶原蛋白、多瘤病毒、人生长激素(hgh)或牛生长激素(bgh)或其变体的聚腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号，例如具有seqidno：21的序列的bgh聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是人生长激素(hgh)聚腺苷酸化信号，例如具有seqidno：22的序列的hgh聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是人β珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如具有seqidno：23的序列的人β珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如具有seqidno：24的序列的兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号包含seqidno：21-24中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号可以反向取向存在于核酸或盒中。在反向取向中，聚腺苷酸化信号可充当安全因子。例如，反向取向聚腺苷酸化信号可阻止启动子以相反取向的显著转录。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒包含两种聚腺苷酸化信号，如seqidno：21和22的聚腺苷酸化信号。在核酸或aav转移盒包含两种聚腺苷酸化信号的实施方案中，信号中的一者可以反向取向存在。

填充片段序列

aav载体通常接受具有确定大小范围的dna插入物，所述范围通常是约4kb至约5.2kb，或稍微更大。因此，对于较短的序列，可能需要在插入片段中包含额外的核酸，以达到aav载体可接受的所需长度。填充片段序列可分离自或源自已知基因或核酸序列的非编码区(例如，内含子区)。填充片段序列可以是例如长度介于1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000个核苷酸之间的序列。填充片段序列可位于核酸或盒中的任何所需位置，使得它不阻止功能或活性。

在一些实施方案中，本公开的核酸或aav转移盒包含填充片段序列。在一些实施方案中，填充片段序列包含内含子序列或源自内含子序列的序列。在一些实施方案中，填充片段序列是嵌合序列。在一些实施方案中，填充片段序列分离自或源自诸如α1-抗胰蛋白酶或白蛋白的基因。在一些实施方案中，填充片段序列选自seqidno：25-27中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

内含子序列

在一些实施方案中，本公开的核酸和/或转移盒可包含内含子序列。将内含子序列包含在中可将对有效核输出和翻译重要的因子募集至转录的mrna。因此，与不存在内含子序列时的表达相比，包含内含子序列可增强表达。

在一些实施方案中，内含子序列是杂合或嵌合序列。在一些实施方案中，内含子序列分离自或源自β-珠蛋白、鸡β-肌动蛋白、小鼠微小病毒(mvm)、因子ix、sv40和/或人igg(重或轻链)中的一者或多者的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列包含seqidno：13-16中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

kozak序列

kozak序列是以真核mrna的翻译起始位点为中心的短序列，其允许有效起始mrna的翻译。核糖体翻译机器识别kozak序列背景下的aug起始密码子。

在一些实施方案中，本公开的aav转移盒可包含kozak序列。kozak序列可增强转基因的翻译效率和总体表达。kozak序列可紧邻转基因序列的5′定位，或与转基因序列重叠。

本公开的核酸或aav转移盒中的kozak序列可以是共有序列或其经修饰型式。kozak序列可包含seqidno：17-18或66-70中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

核酸和aav转移盒

在一些实施方案中，核酸或腺相关病毒(aav)转移盒包含增强子、启动子、内含子序列、kozak序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号和/或填充片段序列中的一者或多者。在一些实施方案中，核酸或腺相关病毒(aav)转移盒包含增强子、启动子、内含子序列、kozak序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号和/或填充片段序列的任何组合。

在一些实施方案中，核酸或腺相关病毒(aav)转移盒从5′至3′包含5′反向末端重复序列(itr)、启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含5’itr、增强子、启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含5’itr、增强子、启动子、内含子序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含5’itr、启动子、内含子序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5′至3′包含5′itr、polya信号(反向取向)、启动子、内含子序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号、填充片段序列和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5′至3′包含5′itr、填充片段序列、聚腺苷酸化信号(反向取向)、启动子、内含子序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号、填充片段序列和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5′至3′包含5′itr、填充片段序列、聚腺苷酸化信号(反向取向)、启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号、填充片段序列和3’itr。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含5’itr、启动子、内含子序列、转基因序列、聚腺苷酸化信号、填充片段序列和3’itr。

在任何上述实施方案中，核酸或aav转移盒还可包含kozak序列。kozak序列可位于紧邻转基因序列的5′。kozak序列可具有seqidno：17-18中任一者的序列。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含表4中所示的元件或其任何子集。不同的示例性核酸或aav转移盒在表中的每一行示出。“x”表示所指示的元件包含在核酸或aav转移盒中。

在任何上述实施方案中，转基因序列可编码弗氏共济失调蛋白(fxn)蛋白。转基因序列可具有例如seqidno：19或seqidno：20的序列。在一些实施方案中，转基因可编码具有seqidno：65的序列的fxn蛋白。

在任何上述实施方案中，5’itr可具有seqidno：1的序列，并且3’itr可具有seqidno：2或3的序列。

在任何上述实施方案中，增强子可具有seqidno：4-5中任一者的序列。

在任何上述实施方案中，启动子可具有seqidno：6-12中任一者的序列。

在任何上述实施方案中，内含子序列可具有seqidno：13-16中任一者的序列。

在任何上述实施方案中，聚腺苷酸化信号可包含seqidno：21-24中任一者的序列。

在任何上述实施方案中，填充片段序列可包含seqidno：25-27中任一者的序列。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒从5’至3’包含表5中所示的元件和序列或其任何子集。不同的示例性核酸或aav转移盒在表的每一行示出。表中提供的数字对应于seqidno。

在一些实施方案中，核酸或aav转移盒包含seqidno：28-64中任一者的序列，或与其至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。

可使用标准分子生物学技术将本文所述的核酸和aav转移盒并入载体(例如，质粒或杆粒)中。载体(例如，质粒或杆粒)还可包含一种或多种在aav产生过程中使用的遗传元件，包括例如aavrep和cap基因，以及辅助病毒蛋白序列。

重组aav和aav产生方法

核酸和aav转移盒以及包含本文所述的核酸和aav转移盒的载体(例如，质粒)可用于产生重组aav载体。所述aav载体可包含单链基因组或双链基因组(即，scaav)。可使用本领域中已知的技术，如标准的三重转染或杆状病毒生产方法来产生高效价aav制剂。

通常，用于产生aav载体的方法包括4种组分：反式作用的质粒和顺式作用的转基因。这些组分包括：1)含有用于衣壳形成和复制的aavrep和cap基因的质粒，2)含有腺病毒辅助基因的质粒，3)含有由两个反向末端重复序列(itr)包围的转基因的盒，以及4)病毒包装细胞系。由于aav具有高度感染性，并且天然存在于较大百分比的人群体中，因此在使用前可针对瞬时野生型aav感染对细胞培养物和所有材料进行充分测试。

在一些实施方案中，用于产生重组aav载体的方法包括使aav生产细胞(例如，hek293细胞)与本公开的核酸、aav转移盒或载体(例如，质粒)接触。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述aav生产细胞与编码例如aavrep和cap基因以及辅助病毒蛋白质序列的一种或多种另外的载体(例如，质粒)接触。在一些实施方案中，所述方法还包括将aav生产细胞维持在使得产生aav的条件下。

在一些实施方案中，用于产生重组aav载体的方法包括使aav生产细胞(例如昆虫细胞，如sf9细胞)与包含本公开的核酸或aav转移盒的至少一种昆虫细胞相容性载体接触。“昆虫细胞相容性载体”是生物的或化学的任何化合物或制剂，所述制剂促进用核酸转化或转染昆虫细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞相容性载体是杆状病毒载体。在一些实施方案中，所述方法还包括将昆虫细胞维持在使得产生aav的条件下。

在一些实施方案中，将aav生产细胞用三种质粒转染(例如，使用转染试剂)：(1)包含本公开的核酸或aav转移盒的第一质粒，(2)包含aavrep和cap基因序列的第二质粒，和(3)包含辅助病毒蛋白序列的第三质粒。参见例如，图5。aav生产细胞可以是表2中列出的任何细胞。aav生产细胞随后可维持在使得产生aav的条件下。然后可使用标准技术，如氯化铯(cscl)梯度离心或柱色谱技术纯化aav。

所产生的重组aav载体可包含任何血清型，例如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav和牛aav的衣壳。在一些实施方案中，所产生的重组aav载体可包含与天然aav衣壳相比具有一种或多种氨基酸修饰(例如，取代和/或缺失)的衣壳蛋白。例如，重组aav载体可包含源自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav和牛aav的经修饰的aav衣壳。在一些实施方案中，所产生的aav载体是aav9。在一些实施方案中，所产生的aav载体是aav1。在一些实施方案中，所产生的aav载体是aav4。

重组aav载体可用于用转基因序列转导靶细胞，例如通过使所述重组aav载体与靶细胞接触。

组合物

还提供了包含本公开的核酸、aav转移盒、质粒、细胞或重组aav载体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是液体组合物。在一些实施方案中，所述组合物是固体组合物。

在一些实施方案中，提供了包含本公开的核酸、aav转移盒、质粒、细胞或重组aav载体的药物组合物。除了核酸、aav转移盒、质粒、细胞或重组aav载体之外，根据本公开以及根据本公开使用的药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他材料(例如稀释剂、佐剂、填充剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、增溶剂、表面活性剂(例如，润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂)。此类材料应优选是无毒的。合适的载体、稀释剂、赋形剂等可在标准制药教科书中找到。参见例如，handbookofpharmaceuticaladditives，第2版(m.ash和i.ash编)，2001(synapseinformationresources，inc.，endicott，newyork，usa)；remington′spharmaceuticalsciences，第20版，lippincott，williams&wilkins出版，2000；以及handbookofpharmaceuticalexcipients，第2版，1994。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服、或通过注射，例如皮肤、皮下或静脉内注射。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊可包含固体载体如明胶。

对于静脉内、皮肤或皮下注射、或在痛苦部位处的注射，药物组合物可呈肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是无热原的并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。合适的溶液可包含例如等渗媒介物，如氯化钠、林格氏溶液和/或乳酸林格氏溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

治疗方法

本公开的aav载体，包括使用本公开的核酸或aav转移盒制备的aav载体，可用于治疗或预防有需要的受试者的疾病、病症或其他疾患。受试者可以是哺乳动物或禽类。在一些实施方案中，哺乳动物是猫、狗、小鼠、大鼠、马、牛、猪、豚鼠或非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。人可以是儿科受试者、成人受试者或老年受试者。

本公开的aav载体或包含所述aav载体的组合物可在体内或离体与细胞接触。然后可将细胞维持在足以在细胞中表达转基因的条件下。

本公开的aav载体或包含所述aav载体的组合物可施用于有需要的受试者。可通过本领域中已知的任何方式施用。任选地，病毒载体和/或组合物以治疗有效剂量在药学上可接受的载体中递送。在一些实施方案中，递送治疗有效剂量的病毒载体和/或组合物。

待施用于受试者的病毒载体和/或组合物的剂量取决于施用模式、待治疗和/或预防的疾病或疾患、个体受试者的疾患、特定病毒载体或组合物、待递送的核酸等，并且可以常规方式确定。用于实现治疗作用的示例性剂量是至少约10⁵、至少约10⁶、至少约10⁷、至少约10⁸、至少约10⁹、至少约10¹⁰、至少约10¹¹、至少约10¹²、至少约10¹³、至少约10¹⁴、至少约10¹⁵个转导单位，任选地约10⁸至约10¹³个转导单位的效价。

在特定实施方案中，可采用多于一次施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以在各种时间间隔(例如，每天、每周、每月、每年等)时期内实现所需的基因表达水平。

示例性施用方式包括口服、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内(包括施用至骨骼肌、膈肌和/或心肌)、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，施用至皮肤和粘膜表面，包括气道表面和经皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，至肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。也可向肿瘤施用(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗和/或预防的疾患的性质和严重程度以及所使用的特定载体的性质。

在一些实施方案中，aav载体或包含所述载体的组合物可通过直接注射到心脏或中枢神经系统(cns)组织中来施用。在一些实施方案中，aav载体或包含所述载体的组合物可颅内递送，包括鞘内、神经内、脑内或心室内施用。在一些实施方案中，aav载体或包含所述载体的组合物可通过经由心外膜注射、随后小切口开胸术、通过冠状动脉内注射或通过心内膜心肌注射直接施用到心肌中而递送至心脏。

还可通过递送包含病毒载体和/或衣壳的储库来实现递送至靶组织。在代表性实施方案中，包含病毒载体和/或衣壳的储库被植入骨骼、心脏和/或膈肌组织中，或者组织可与包含病毒载体和/或衣壳的膜或其他基质接触。在美国专利号7,201,898中描述了此类可植入基质或基底。

施用aav可在靶细胞或组织中产生稳健且持久的转基因表达。例如，转基因表达可持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月或更长。

在一些实施方案中，用于治疗有需要的受试者的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的核酸、aav转移盒、质粒、细胞或重组aav。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者患有弗里德赖希氏共济失调。施用可产生受试者的cns组织(例如，神经元组织)或心脏组织中治疗有效量的fxn蛋白表达。

在一些实施方案中，施用可使得弗里德赖希氏共济失调的一种或多种症状减轻。例如，施用可(1)改善受试者的手臂和腿部的协调(共济失调)，(2)增加受试者的能量水平和/或减少疲劳和肌肉损失，(3)改善受试者的视力、听力损失或言语，(3)减少脊柱侧凸或其进展速率，(4)改善糖尿病的症状如胰岛素敏感性，或(5)减轻心脏疾患，如肥厚型心肌病或心律失常。由于治疗所致的受试者的改善可以是与治疗前的受试者相比或与患有弗里德赖希氏共济失调的典型受试者相比的改善。

在一些实施方案中，施用可使得受试者的寿命延长。例如，与患有弗里德赖希氏共济失调的典型受试者相比，施用可使受试者的寿命延长约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约5-10年或大于10年。

实施例

仅出于说明目的而包括在本文中的以下实施方案并非旨在是限制性的。

实施例1：在哺乳动物细胞中制备重组aav载体

提供了三种质粒。第一质粒包含转移盒，所述转移盒包含侧接两个itr(seqidno：1、seqidno：2或3)的编码人弗氏共济失调蛋白(seqidno：19或20)的cdna，并且具有seqidno：28-64中任一者的序列。第二质粒包含编码rep和cap基因的序列。第三质粒包含aav产生所需的各种“辅助”序列(e4、e2a和va)。

使用合适的转染试剂(例如lipofectamine^tm)将这三种质粒转染到病毒生产细胞(例如hek293)中。在37℃下孵育预定时间段后，从培养基中收集aav颗粒或裂解细胞以释放aav颗粒。然后对aav颗粒进行纯化、滴定，并且可储存在-80℃以供稍后使用。

实施例2：在昆虫细胞中制备重组aav载体

提供了第一重组杆状病毒载体。第一重组杆状病毒载体包含转移盒序列，所述转移盒序列包含侧接两个itr(seqidno：1、seqidno：2或3)的编码人弗氏共济失调蛋白(seqidno：19或20)的cdna，其中所述转移盒具有seqidno：28-64中任一者的序列。

昆虫细胞(例如，sf9)在悬浮培养中与第一重组杆状病毒载体和至少一种包含编码aavrep和cap蛋白的序列的额外重组杆状病毒载体共感染。在28℃下孵育预定时间段后，从培养基中收集aav颗粒或裂解细胞以释放aav颗粒。然后对aav颗粒进行纯化、滴定，并且可储存在-80℃以供稍后使用。

实施例3：包装fxn转基因的重组aav在体内转导心脏细胞并延长fxn缺陷型小鼠的寿命

使用标准克隆技术(fxn质粒)制备包含aav转移盒(seqidno：32)的质粒，所述aav转移盒包含人fxn转基因。制备包含fxn质粒、包含编码aavrep和cap(aav9)基因的序列的第二质粒和包含编码aav辅助序列的序列的第三质粒的组合物，并用于使用标准“三重转染”方案转染hek293细胞。将hek293细胞保持在标准培养条件(37℃，5％co2)下，以产生重组的自身互补的aav9载体。此程序重复数次，并使用量化aav9载体产量。如图1所示，每次运行中包装fxn转基因的aav9(aav9-fxn)的产量介于10¹³与10¹⁴个载体基因组之间。

重组aav9-fxn用于转导培养中的lec2细胞。图4示出用不同剂量的aav9-fxn转导的培养的lec2细胞中人fxn(ng/mg)的表达。在使用较高剂量的载体时观察到hfxn的更高表达。

重组aav9-fxn还用于感染心肌和骨骼肌中缺乏fxn的小鼠(fxn^flox/floxmckcre⁺)。在3周龄时用盐水或aav9-fxn(5x10¹³vg/kg)处理小鼠，并监测存活率。如图2所示，用aav9-fxn处理显著增加了寿命。注射盐水的小鼠的中值存活期是64天，而注射aav9-fxn的小鼠的中值存活期是138.5天。

在单独的实验中，将fxn缺陷型小鼠在3周龄时用盐水或低或高剂量的aav9-fxn(分别1x10¹³或5x10¹³vg/kg)处理。在处理后3周将小鼠处死，并且分析心脏组织。如图3a所示，在来自aav9-fxn处理的小鼠的心脏组织中可检测到人fxn(hfxn)dna。hfxndna被转录成rna(图3b)并翻译成蛋白质(图3c)。较高剂量的aav9-fxn导致心脏样品中较高的fxndna、rna和蛋白质水平。

总之，这些数据表明包含fxn转基因的本公开的aav转移盒可用于产生重组aav载体，并且可用于体内转导受试者的细胞。

编号的实施方案

尽管具有随附权利要求，但是本公开阐述本公开的以下编号的实施方案：

1.一种核酸，所述核酸从5′至3′包含：5′反向末端重复序列(itr)；启动子；转基因序列；聚腺苷酸化信号；以及3′itr；其中所述转基因序列编码弗氏共济失调蛋白(fxn)蛋白。

2.如实施方案1所述的核酸，其中所述5’itr和所述3’itr中的至少一者的长度是约110至约160个核苷酸。

3.如实施方案1或2所述的核酸，其中所述5’itr与所述3’itr的长度相同。

4.如实施方案1或2所述的核酸，其中所述5’itr和所述3’itr具有不同的长度。

5.如实施方案1-4中任一项所述的核酸，其中所述5’itr和所述3’itr中的至少一者分离自或源自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的基因组。

6.如实施方案1所述的核酸，其中所述5’itr包含seqidno：1的序列，或与其至少95％同一的序列。

7.如实施方案1-6中任一项所述的核酸，其中所述3’itr包含seqidno：2的序列，或与其至少95％同一的序列。

8.如实施方案1-7中任一项所述的核酸，其中所述3’itr包含seqidno：3的序列，或与其至少95％同一的序列。

9.如实施方案1-8中任一项所述的核酸，其中所述启动子驱动所述转基因的表达。

10.如实施方案1-9中任一项所述的核酸，其中所述启动子是组成型启动子。

11.如实施方案1-9中任一项所述的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。

12.如实施方案1-11中任一项所述的核酸，其中所述启动子是组织特异性启动子。

13.如实施方案1-12中任一项所述的核酸，其中所述启动子选自由以下组成的组：cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、ef-1α启动子、ef-1α短启动子、ef-1α核心启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子、gusb240启动子、gusb379启动子和磷酸甘油激酶(pgk)启动子。

14.如实施方案13所述的核酸，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。

15.如实施方案13所述的核酸，其中所述启动子是ef-1α启动子、ef-1α短启动子或ef-1α核心启动子。

16.如实施方案13所述的核酸，其中所述启动子是gusb240启动子。

17.如实施方案13所述的核酸，其中所述启动子是gusb379启动子。

18.如实施方案13所述的核酸，其中所述启动子是pgk启动子。

19.如实施方案1-12中任一项所述的核酸，其中所述启动子包含选自seqidno：6-12中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

20.如实施方案1-19中任一项所述的核酸，其中所述fxn蛋白是人fxn蛋白。

21.如实施方案1-20中任一项所述的核酸，其中所述fxn蛋白具有seqidno：65的序列，或与其至少95％同一的序列。

22.如实施方案1至21中任一项所述的核酸，其中所述转基因序列是cpg优化的。

23.如实施方案1-21中任一项所述的核酸，其中所述转基因序列包含seqidno：19或20，或与其至少95％同一的序列。

24.如实施方案1-24中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含紧邻所述转基因序列的5′的kozak序列。

25.如实施方案24所述的核酸，其中所述kozak序列包含seqidno：17或18的序列，或与其至少95％同一的序列。

26.如实施方案1-25中任一项所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(sv40)、人α-珠蛋白、兔α-珠蛋白、人β-珠蛋白、兔β-珠蛋白、人胶原蛋白、多瘤病毒、人生长激素(hgh)和牛生长激素(bgh)的聚腺苷酸化信号。

27.如实施方案26所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号。

28.如实施方案26所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号是人生长激素聚腺苷酸化信号。

29.如实施方案26所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号是人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。

30.如实施方案26所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号是兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。

31.如实施方案1-25中任一项所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号包含seqidno：21-24中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

32.如实施方案1-31中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含增强子。

33.如实施方案32所述的核酸，其中所述增强子是cmv增强子。

34.如实施方案32所述的核酸，其中所述增强子包含seqidno：4或5的序列，或与其至少95％同一的序列。

35.如实施方案1-34中任一项所述的核酸，其中所述盒还包含内含子序列。

36.如实施方案35所述的核酸，其中所述内含子序列是嵌合序列。

37.如实施方案35所述的核酸，其中所述内含子序列是杂合序列。

38.如实施方案35所述的核酸，其中所述内含子序列包含分离自或源自β-珠蛋白、鸡β-肌动蛋白、小鼠微小病毒和人igg中的一者或多者的内含子序列的序列。

39.如实施方案35所述的核酸，其中所述内含子序列包含seqidno：13-16中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

40.如实施方案1-39中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含至少一个填充片段序列。

41.如实施方案40所述的核酸，其中所述核酸包含两个填充片段序列。

42.如实施方案40所述的核酸，其中所述至少一个填充片段序列包含seqidno：25-27中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

43.如实施方案1所述的核酸，其中所述核酸包含seqidno：28-64中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。

44.一种质粒，所述质粒包含实施方案1-43中任一项所述的核酸。

45.一种细胞，所述细胞包含实施方案1-43中任一项所述的核酸或实施方案44所述的质粒。

46.一种产生重组aav载体的方法，所述方法包括使aav生产细胞与实施方案1-43中任一项所述的核酸或实施方案44所述的质粒接触。

47.一种重组aav载体，所述重组aav载体通过实施方案46所述的方法产生。

48.如实施方案47所述的重组aav载体，其中所述重组aav载体是单链aav(ssaav)。

49.如实施方案47所述的重组aav载体，其中所述重组aav载体是自身互补aav(scaav)。

50.如实施方案47-49中任一项所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的衣壳蛋白。

51.如实施方案47-49中任一项所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含与野生型aav衣壳蛋白相比具有一个或多个取代或突变的衣壳蛋白。

52.一种组合物，所述组合物包含实施方案1-43中任一项所述的核酸、实施方案44所述的质粒、实施方案45所述的细胞或实施方案47-51中任一项所述的重组aav载体。

53.一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1-43中任一项所述的核酸、实施方案44所述的质粒、实施方案45所述的细胞或实施方案47-41中任一项所述的重组aav载体。

54.如实施方案53所述的方法，其中所述受试者患有弗里德赖希氏共济失调。

55.如实施方案53或54所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

56.如实施方案53-55中任一项所述的方法，其中所述核酸、所述质粒、所述细胞或所述重组aav载体通过直接注射到中枢神经系统中来施用。

上文是对本发明的说明，而不应理解为对本发明进行限制。本发明由以下权利要求所限定，所述权利要求的等效物包括在其中。

序列表

<110>斯特里迪比奥公司

<120>重组病毒载体和用于产生所述重组病毒载体的核酸

<130>strd-011/01wo331843-2071

<150>us62/770,202

<151>2018-11-21

<160>70

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>141

<212>dna

<213>依赖细小病毒腺相关病毒血清型2(dependoparvovirusadeno-associatedvirusserotype2)

<400>1

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<210>2

<211>113

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>3'itr

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<210>3

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>3'itr

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<212>dna

<213>未知(unknown)

<220>

<223>巨细胞病毒属

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<210>5

<211>286

<212>dna

<213>未知(unknown)

<220>

<223>巨细胞病毒属

<400>5

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<210>6

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<212>dna

<213>原鸡(gallusgallus)

<400>6

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cggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg276

<210>7

<211>227

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>7

gcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtc60

ggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtg120

tactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgcc180

gtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacgcgtaag227

<210>8

<211>1182

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>8

gctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggg60

gaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg120

atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcag180

tagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccg240

tgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaatta300

cttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtggg360

tgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcc420

tggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgct480

gctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttc540

tggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggg600

gccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctg660

cgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtg720

cctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggca780

ccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgg840

aggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggccttt900

ccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctc960

gattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcg1020

atggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatg1080

taattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcag1140

acagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga1182

<210>9

<211>212

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ef1a核心启动子

<400>9

gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaa60

ccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctcc120

gcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttc180

tttttcgcaacgggtttgccgccagaacacgc212

<210>10

<211>511

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>10

ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctc60

tgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtc120

cgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcc180

tgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaac240

ggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagc300

gcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcag360

cggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcct420

gcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccct480

cgttgaccgaatcaccgacctctctccccag511

<210>11

<211>240

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>11

cggctggggctgagggtgagggtcccgtttccccaaaggcctagcctggggttccagcca60

caagccctaccgggcagcgcccggccccgcccctccaggcctggcactcgtcctcaacca120

agatggcgcggatggcttcaggcgcatcacgacaccggcgcgtcacgcgacccgccctac180

gggcacctcccgcgcttttcttagcgccgcagacggtggccgagcgggggaccgggaagc240

<210>12

<211>379

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>12

attcctgctgggaaaagcaagtggaggtgctccttgaagaaacagggggatcccaccgat60

ctcaggggttctgttctggcctgcggccctggatcgtccagcctgggtcggggtggggag120

cagacctcgcccttatcggctggggctgagggtgagggtcccgtttccccaaaggcctag180

cctggggttccagccacaagccctaccgggcagcgcccggccccgcccctccaggcctgg240

cactcgtcctcaaccaagatggcgcggatggcttcaggcgcatcacgacaccggcgcgtc300

acgcgacccgccctacgggcacctcccgcgcttttcttagcgccgcagacggtggtcgag360

cgggggaccgggaagctta379

<210>13

<211>229

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>内含子序列-杂合

<400>13

ggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgccc60

gccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcc120

tccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggt180

attaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcag229

<210>14

<211>476

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>14

gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgt60

cataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatt120

tgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaat180

actttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgca240

ccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcata300

taaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagc360

tacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctga420

gtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag476

<210>15

<211>133

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>内含子序列-嵌合

<400>15

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgaga60

cagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcc120

tttctctccacag133

<210>16

<211>97

<212>dna

<213>猿猴病毒40(simianvirus40)

<400>16

gtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaa60

agaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctag97

<210>17

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>经修饰的kozak序列

<400>17

acccggagcagc12

<210>18

<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>共有kozak序列

<400>18

acagccacc9

<210>19

<211>633

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>19

atgtggactctcgggcgccgcgcagtagccggcctcctggcgtcacccagcccagcccag60

gcccagaccctcacccgggtcccgcggccggcagagttggccccactctgcggccgccgt120

ggcctgcgcaccgacatcgatgcgacctgcacgccccgccgcgcaagttcgaaccaacgt180

ggcctcaaccagatttggaatgtcaaaaagcagagtgtctatttgatgaatttgaggaaa240

tctggaactttgggccacccaggctctctagatgagaccacctatgaaagactagcagag300

gaaacgctggactctttagcagagttttttgaagaccttgcagacaagccatacacgttt360

gaggactatgatgtctcctttgggagtggtgtcttaactgtcaaactgggtggagatcta420

ggaacctatgtgatcaacaagcagacgccaaacaagcaaatctggctatcttctccatcc480

agtggacctaagcgttatgactggactgggaaaaactgggtgtactcccacgacggcgtg540

tccctccatgagctgctggccgcagagctcactaaagccttaaaaaccaaactggacttg600

tcttccttggcctattccggaaaagatgcttga633

<210>20

<211>633

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>弗氏共济失调蛋白cdna，cpg优化的

<400>20

atgtggactctggggaggagagcagtagctggcctcctggcatcacccagcccagcccag60

gcccagaccctcaccagggtccctagaccagcagagttggccccactctgtggcaggaga120

ggcctgaggacagacattgatgccacctgcacccccaggagagcaagttccaaccaaaga180

ggcctcaaccagatttggaatgtcaaaaagcagagtgtctatttgatgaatttgaggaaa240

tctggaactttgggccacccaggctctctagatgagaccacctatgaaagactagcagag300

gaaacactggactctttagcagagttttttgaagaccttgcagacaagccatacaccttt360

gaggactatgatgtctcctttgggagtggtgtcttaactgtcaaactgggtggagatcta420

ggaacctatgtgatcaacaagcagactccaaacaagcaaatctggctatcttctccatcc480

agtggacctaagaggtatgactggactgggaaaaactgggtgtactcccatgatggagtg540

tccctccatgagctgctggctgcagagctcactaaagccttaaaaaccaaactggacttg600

tcttccttggcctattctggaaaagatgcttga633

<210>21

<211>225

<212>dna

<213>家牛(bostaurus)

<400>21

ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccc60

tggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc120

tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt180

gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg225

<210>22

<211>477

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>22

gggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactcca60

gtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtcc120

ttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagaca180

acctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttgg240

ctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttg300

ttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacgg360

ggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccacct420

tggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtcctt477

<210>23

<211>395

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>人β珠蛋白聚腺苷酸化信号(反向取向)

<400>23

taaaatacagcatagcaaaactttaacctccaaatcaagcctctacttgaatccttttct60

gagggatgaataaggcataggcatcaggggctgttgccaatgtgcattagctgtttgcag120

cctcaccttctttcatggagtttaagatatagtgtattttcccaaggtttgaactagctc180

ttcatttctttatgttttaaatgcactgacctcccacattccctttttagtaaaatattc240

agaaataatttaaatacatcattgcaatgaaaataaatgttttttattaggcagaatcca300

gatgctcaaggcccttcataatatcccccagtttagtagttggacttagggaacaaagga360

acctttaatagaaattggacagcaagaaagcgagc395

<210>24

<211>56

<212>dna

<213>家兔(oryctolaguscuniculus)

<400>24

aataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctca56

<210>25

<211>133

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>嵌合内含子填充片段

<400>25

gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgaga60

cagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcc120

tttctctccacag133

<210>26

<211>500

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>a1at填充片段

<400>26

agagacacagtttttgctctggtgaattacatcttctttaaaggcaaatgggagagaccc60

tttgaagtcaaggacacagaggaagaggacttcctagtggaccaggtgaccaccttgaag120

gtgcctatgtaaaagcatttaggcatgtttaacatccagcactgtaagaagctgtccagc180

tgggtgctgctgtaaaaatacctgggcaatgccaccaccatcttcttcctgcctgatgag240

gggaaactacagcacctggaaaatgaactcacccactatattatcaccaagttcctggaa300

aatgaagacagaaggtctgccagcttacatttacccaaactgtcaattactggaacctat360

gatctgaagagcttcctgggtcaactgggcatcactaaggtcttcagcaatggggctgac420

ctctcctgggtcacagaggaggcacccctgaagctctccaaggccttgcataaggctgtg480

ctgaccatcaataagaaagg500

<210>27

<211>502

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>27

taagtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcttgctgctgctgag60

acttgccaagacctatgaaaccactctagagaagtgctgtgcctctgcagatcctcatga120

atgctatgccaaagtgttcagtgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaat180

caaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcactatt240

agttctttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaag300

aaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctg360

tgcagaagactatctatccttggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacacc420

agtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcaaccatgctt480

ttcagctctggaagttgatgaa502

<210>28

<211>2226

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>aav转移盒

<400>28

cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtc60

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcca120

actccatcactaggggttccttgcgtcgacaggcctcctaggcggaccgcttgcatgcac180

gcgttcgcgaagtactcacgtggacattgattattgactagttattaatagtaatcaatt240

acggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaat300

ggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgtt360

cccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaa420

actgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtc480

aatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcct540

acttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccac600

gttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttat660

tttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcgggg720

cggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcaga780

gcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaa840

agcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctcc900

gccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagc960

gggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaag1020

ggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcact1080

ttttttcaggttggaccggtacccggagcagcatgtggactctcgggcgccgcgcagtag1140

ccggcctcctggcgtcacccagcccagcccaggcccagaccctcacccgggtcccgcggc1200

cggcagagttggccccactctgcggccgccgtggcctgcgcaccgacatcgatgcgacct1260

gcacgccccgccgcgcaagttcgaaccaacgtggcctcaaccagatttggaatgtcaaaa1320

agcagagtgtctatttgatgaatttgaggaaatctggaactttgggccacccaggctctc1380

tagatgagaccacctatgaaagactagcagaggaaacgctggactctttagcagagtttt1440

ttgaagaccttgcagacaagccatacacgtttgaggactatgatgtctcctttgggagtg1500

gtgtcttaactgtcaaactgggtggagatctaggaacctatgtgatcaacaagcagacgc1560

caaacaagcaaatctggctatcttctccatccagtggacctaagcgttatgactggactg1620

ggaaaaactgggtgtactcccacgacggcgtgtccctccatgagctgctggccgcagagc1680

tcactaaagccttaaaaaccaaactggacttgtcttccttggcctattccggaaaagatg1740

cttgattctaggatccgactgcaggtaggtttaaacaagcttggtaccgtgattaatctt1800

cgaatgactgacctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgc1860

cttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattg1920

catcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagca1980

agggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggaga2040

tctgtgtgttggttttttgtgtgcgtacggagctaccaggtctcgagccatgggcgcgcc2100

atcgatgactagtccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgacca2160

aaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcaga2220

gaggga2226

<210>29

<211>2089

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>aav转移盒

<400>29

cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtc60

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcca120

actccatcactaggggttccttgcgtcgacaggcctcctaggcggaccgcttgcatgcac180

gcgttcgcgaagtactcacgtggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgccc240

acagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtgg300

cgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtggg360

ggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgcc420

gccagaacacgcgtaagggcgaattccagcacactggcggccgttactagagccatgcat480

gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgt540

cataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatt600

tgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaat660

actttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgca720

ccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcata780

taaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagc840

tacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctga900

gtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagcacc960

ggtacccggagcagcatgtggactctcgggcgccgcgcagtagccggcctcctggcgtca1020

cccagcccagcccaggcccagaccctcacccgggtcccgcggccggcagagttggcccca1080

ctctgcggccgccgtggcctgcgcaccgacatcgatgcgacctgcacgccccgccgcgca1140

agttcgaaccaacgtggcctcaaccagatttggaatgtcaaaaagcagagtgtctatttg1200

atgaatttgaggaaatctggaactttgggccacccaggctctctagatgagaccacctat1260

gaaagactagcagaggaaacgctggactctttagcagagttttttgaagaccttgcagac1320

aagccatacacgtttgaggactatgatgtctcctttgggagtggtgtcttaactgtcaaa1380

ctgggtggagatctaggaacctatgtgatcaacaagcagacgccaaacaagcaaatctgg1440

ctatcttctccatccagtggacctaagcgttatgactggactgggaaaaactgggtgtac1500

tcccacgacggcgtgtccctccatgagctgctggccgcagagctcactaaagccttaaaa1560

accaaactggacttgtcttccttggcctattccggaaaagatgcttgattctaggatccg1620

actgcaggtaggtttaaacaagcttggtaccgtgattaatcttcgaatgactgacctgtg1680

ccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaa1740

ggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagt1800

aggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaa1860

gacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggagatctgtgtgttggttttt1920

tgtgtgcgtacggagctaccaggtctcgagccatgggcgcgccatcgatgactagtccac1980

tccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgccc2040

gggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagaggga2089

<210>30

<211>1998

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>aav转移盒

<400>30