人源化抗SIRPα抗体的制作方法

人源化抗sirp
α
抗体
技术领域
1.本发明涉及针对sirpα的人源化抗体以及这些抗体(任选地与抗癌治疗剂组合)在治疗癌症中的用途。


背景技术：

2.自20世纪90年代末以来，识别肿瘤细胞上的抗原的治疗性抗体已可用于治疗癌症。这些治疗性抗体可通过不同的途径对恶性细胞发挥作用。通过抗体与其恶性细胞上的靶标结合所触发的信号传导途径导致细胞增殖的抑制或凋亡。治疗性抗体的fc区可触发补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，cdc)、抗体依赖性细胞毒性(antibody
‑
dependent cellular cytotoxicity，adcc)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody
‑
dependent cellular phagocytosis，adcp)。另一种可能的机制可以是抗体依赖性诱导t细胞(cd8
+
和/或cd4
+
)抗肿瘤应答(抗体依赖性抗原呈递(antibody
‑
dependent antigen presentation，adap)；dilillo and ravetch cell 2015，161(5)，1035
‑
1045；bournazos and ravetch immunity 2017，47(2)，224
‑
233)。这通过在抗原呈递细胞(例如如树突细胞)上表达的fc受体来发生。然而，治疗性抗体作为单一治疗通常不够有效。改善治疗性抗体效力的一种选择是通过改善adcc和/或adcp。这已例如通过改善fc区对fcγ受体的亲和力，例如通过氨基酸替换(richards et al.mol.cancer ther.2008，7(8)，2517
‑
2527)或通过影响fc区的糖基化(hayes et al.j.inflamm.res.2016，9，209
‑
219)来完成。
3.改善治疗性抗体的adcc和/或adcp的另一种方式是通过将治疗性抗体与针对信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα，sirpα)的拮抗性抗体或抗cd47抗体组合(wo2009/131453)。当cd47(已发现其在至少数种人肿瘤类型中和/或上被上调)与在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞上表达的抑制性免疫受体sirpα结合时，sirpα传递防止通过免疫效应细胞的吞噬作用或其他fc受体依赖性细胞破坏机制破坏癌细胞的抑制信号。一种机制(假设抗cd47或抗sirpα抗体通过该机制发挥作用)是通过阻断通过cd47
‑
sirpα轴产生的抑制性信号传导，导致adcc和/或adcp和/或adap提高(tjeng et al.proc natl acad sci usa 2013，110(27)，11103
‑
11108；liu et al.nature med.2015，21(10)，1209
‑
1215)。
4.大多数与cd47
‑
sirpα相互作用相关的临床研究都已集中在抗cd47抗体作为单一治疗和作为与治疗性抗体组合的治疗二者上(weiskopf.eur.j.cancer 2017，76，100
‑
109；advani et al.n.engl.j.med.2018，379(18)，1711
‑
1721)。尽管事实上cd47在大多数正常组织中的细胞表面上广泛表达，但关于抗cd47抗体作为抗癌治疗剂的研究正在增多。
5.尚未对使用抗sirpα抗体的抗癌单一治疗或组合治疗进行临床研究。关于抗sirpα抗体的大部分工作是关于cd47
‑
sirpα相互作用的机制研究，并且已使用鼠抗sirpα抗体进行；例如报道了鼠12c4和1.23a提高经曲妥珠单抗调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347)。wo2015/138600公开了鼠抗人sirpα抗体kwar23及其嵌合fab片段，报道了其在体外提高西妥昔单抗介导的吞噬作用。wo2018/
026600中公开了具有包含n297a突变的人igg1fc部分的人源化kwar23。wo2013/056352公开了igg429am4
‑
5和其他igg4人抗sirpα抗体。以8mg/kg每周给药3次持续4周的igg429am4
‑
5降低了注射到nod scidγ(nsg)小鼠右股骨中的原代人急性髓性白血病(acute myeloid leukaemia，aml)细胞的白血病移植。wo2017/178653公开了与sirpα1和sirpα
bit
结合但不与sirpγ结合的嵌合抗sirpα抗体heflb。然而，虽然抗体在人源化之后保留与sirpα
bit
的结合，但其不再与sirpα1结合。例如，由于51.3％的白种人具有至少1个sirpα1等位基因，因此他们的免疫细胞(当杂合时至少部分地)对仅结合sirpα
bit
的抗体无反应(treffers et al.eur j immunol.2018，48(2)，344
‑
354)。wo2018/057669公开了针对人sirpα1和/或sirpα
bit
的结构域1的人源化鸡抗sirpα抗体。wo2018/107058公开了小鼠抗sirpα抗体3f9和9c2不与sirpβ
1v1
结合，并且他们得出结论，因此这些抗体是sirpα特异性的，平衡结合常数分别为1.0x10
‑8和8.0x10
‑8m。wo2018/190719公开了也与人sirpγ结合但不与人sirpβ1结合的人源化抗sirpα抗体。
6.人sirpα在其nh2端配体结合结构域中是高度多态性的(takenaka et al.nature immun.2007，8(12)，1313
‑
1323)：sirpα
bit
(v1)和sirpα1(v2)是两种最常见且最不同(13个残基不同)的多态物并且其对cd47的亲和力非常类似(hatherley et al.j.biol.chem.2014，289(14)，10024
‑
10028；treffers et al.eur j immunol.2018，48(2)，344
‑
354)。其他具有生化特征的人sirp家族成员是不结合cd47并具有至少两种多态性变体(sirpβ
1v1
和sirpβ
1v2
)的sirpβ1以及在t细胞和活化的nk细胞上表达并以与sirpα相比低约10倍的亲和力结合cd47的sirpγ(van beek et al.j immunol.2005，175(12)，7781
‑
7)。cd47
‑
sirpγ相互作用分别参与抗原呈递细胞与t细胞之间的接触、共刺激t细胞活化以及促进t细胞增殖(piccio et al.blood 2005，105，2421
‑
2427)。此外，cd47
‑
sirpγ相互作用在t细胞的跨内皮迁移中发挥作用(stefanidakis et al.blood 2008，112，1280
‑
1289)。
7.本领域已知的抗sirpα抗体的缺点是它们(i)对人sirpα不具有特异性，因为它们与其他人sirp家族成员例如人sirpγ结合，从而可导致不期望的副作用，或(ii)它们的特异性太有限，仅与一种sirpα等位基因变体结合——例如sirpα
bit
或sirpα1——从而使它们不太适用于单一或组合治疗，因为部分人群具有抗sirpα抗体不与其结合的sirpα等位基因变体。例如，现有技术抗体kwar23、se5a5、29am4
‑
5和12c4不具有特异性，因为它们还与人sirpγ结合，这可负面影响t细胞增殖和募集。相反，例如1.23a mab的特异性太强，并且仅识别人sirpα多态性变体sirpα1而不识别在至少白种人群中占优势的变体sirpα
bit
(zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347；treffers et al.eur j immunol.2018，48(2)，344
‑
354)。同样，wo2017/178653中公开的人源化抗体heflb的特异性太强，因为该抗体不与sirpα1结合(spr测量；参见实施例部分)并且不促进来自sirpα1携带者的免疫效应细胞的抗肿瘤活性，即使当存在sirpα
bit
的一个等位基因时(图3)。
8.仅后来公布的wo2018/210793公开了数种拮抗性嵌合抗sirpα抗体，其表现出与两种主要sirpα多态性变体sirpα
bit
和sirpα1的特异性结合，不与sirpγ结合并提高治疗性抗体(抗体2至9)的adcc。在wo2018/210793的表1中，公开了针对两种嵌合抗体的人源化变体(抗体10至16)。
9.总之，本领域仍然需要另外的和改善的抗sirpα抗体，其可单独或与另外的治疗性抗癌抗体组合用于抗癌治疗。更特别地，仍然需要拮抗性抗sirpα抗体，其与人sirpγ不结
合、结合低或结合降低，从而降低不期望副作用的风险，并且该抗sirpα抗体与人sirpα1多态性变体和人sirpα
bit
多态性变体二者结合以使其适用于大部分人群，包括sirpα1/sirpα
bit
杂合子、sirpα
bit
纯合子和sirpα1纯合子。需要具有这些特征的抗sirpα抗体，并且其降低抑制性，即shp
‑
1和/或shp
‑
2介导的sirpα信号传导。这样的抗体适用于单独或优选地与治疗性抗癌抗体组合用于抗癌治疗。


技术实现要素：

10.本发明涉及适用于单独或优选地与抗癌治疗(例如治疗性抗癌抗体)组合用于抗癌治疗的针对sirpα的人源化抗体。
11.在第一方面中，本发明涉及人源化抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区(heavy chain complementarity determining region，hcdr)和轻链互补决定区(light chain complementarity determining region，lcdr)hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
12.a.hcdr1，其包含seq id no：36；
13.b.hcdr2，其包含seq id no：44；
14.c.hcdr3，其包含seq id no：45；
15.d.lcdr1，其包含seq id no：39；
16.e.lcdr2，其包含seq id no：40；和
17.f.lcdr3，其包含seq id no：41。
18.在一个优选实施方案中，抗sirpα抗体或其抗原结合片段具有来自以下的一种或更多种特性：(a)如在25℃下使用如seq id no：51所示的人sirpα1胞外结构域通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance，spr)(优选biacore
tm
)所分析的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段以至少10
‑
10
m，优选至少10
‑
11
m的结合亲和力结合人sirpα1；(b)如在25℃下使用如seq id no：52所示的人sirpα
bit
胞外结构域通过spr(优选biacore
tm
)所分析的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段以至少10
‑
10
m，优选至少10
‑
11
m的结合亲和力结合人sirpα
bit
；(c)如在25℃下使用如seq id no：56所示的食蟹猴sirpα胞外结构域通过spr(优选biacore
tm
)所分析的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段以至少10
‑8m，优选至少10
‑9m的结合亲和力结合食蟹猴(cynomolgus monkey)sirpα；(d)如使用流式细胞术，优选使用荧光激活细胞分选(fluorescence
‑
activated cell sorting，facs)染色通过t细胞结合所测量的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段不结合人sirpγ；(e)如在25℃下使用如seq id no：55所示的人sirpγ胞外结构域通过spr(优选biacore
tm
)所分析的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段不结合人sirpγ；以及(f)如通过il
‑
2酶联免疫吸附点(enzyme
‑
linked immunosorbent spot，elispot)和/或t细胞增殖测定所确定的，所述抗sirpα抗体或其抗原结合片段不是免疫原性的。
19.在一个优选实施方案中，人源化抗sirpα抗体或其抗原结合片段：(a)如在25℃下使用如seq id no：51所示的人sirpα1胞外结构域通过spr(优选biacore
tm
)所分析的，以至少10
‑
10
m，优选至少10
‑
11
m的结合亲和力结合人sirpα1；(b)如在25℃下使用如seq id no：52所示的人sirpα
bit
胞外结构域通过spr(优选biacore
tm
)所分析的，以至少10
‑
10
m，优选至少10
‑
11
m的结合亲和力结合人sirpα
bit
；(c)阻断cd47与sirpα1和sirpα
bit
结合，优选地如通过
lymphoma，fl)和弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuse large b
‑
cell lymphoma，dlbcl)；肝细胞癌；多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)；膀胱癌；胃癌；卵巢癌；头颈癌；胰腺癌；肾癌；前列腺癌；肝细胞癌和肺癌。在一个优选实施方案中，所述治疗包括施用另外的抗癌治疗性化合物，例如如靶向治疗剂，优选免疫治疗剂。
27.在第五方面中，本发明涉及核酸分子，其包含编码根据本发明的人源化抗sirpα抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中优选地，核酸分子包含编码所述抗体的hcvr和lcvr中的至少一种的核苷酸序列，并且其中优选地，编码核苷酸序列与调节序列有效地连接以在宿主细胞中表达所述编码核苷酸序列。
28.在第六方面中，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的宿主细胞。
附图说明
29.图1.通过流式细胞术的抗体与表达sirpγ的人cd3+t细胞的结合。数据描述为平均荧光强度(mean fluorescence intensity，mfi)(图1a)和阳性细胞百分比(％)(图1b)。符号表示来自两个健康个体的测量值。
30.图2.以单独的曲妥珠单抗(tmab)、曲妥珠单抗与鼠12c4抗sirpα抗体(mu12c4)的组合、曲妥珠单抗与其中鼠12c4可变区接枝到人igg1恒定区上的抗体(12c4huigg1)的组合、以及曲妥珠单抗与其中鼠12c4可变区接枝到包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区上的抗体(12c4huigg1lala；在本文中也表示为12c4
‑
lala)的组合的细胞毒性％测量的adcc的比较，使用skbr3 her2阳性乳腺癌细胞作为靶细胞并且人中性粒细胞作为效应细胞进行测量。中性粒细胞从携带两个sirpα
bit
等位基因的人供体中分离。采用递增浓度的曲妥珠单抗：分别为0、0.05、0.5和5μg/ml以及递增浓度的每种抗sirpα抗体(分别为0.2、2和20μg/ml)。
31.图3.针对与多种浓度(μg/ml)的基于现有技术的抗sirpα抗体组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带一个sirpα1和一个sirpα
bit
等位基因的杂合人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用g
‑
csf和ifnγo/n刺激的中性粒细胞进行实验。用delfia细胞毒性测定测量细胞毒性。
32.图4.针对与多种浓度(μg/ml)的具有包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区的本发明抗sirpα抗体1至6组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带一个sirpα1和一个sirpα
bit
等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用g
‑
csf和ifnγo/n刺激的中性粒细胞进行实验。用delfia细胞毒性测定测量细胞毒性。
33.图5.针对与多种浓度(μg/ml)的具有包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区的本发明抗sirpα抗体7至13组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带一个sirpα1和一个sirpα
bit
等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平
均值。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用g
‑
csf和ifnγo/n刺激的中性粒细胞进行实验。用delfia细胞毒性测定测量细胞毒性。
34.图6.针对与多种浓度(μg/ml)的基于现有技术的抗sirpα抗体组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带两个sirpα1等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用gm
‑
csf刺激100分钟的中性粒细胞进行实验，并且以
51
cr释放测定测量细胞毒性。
35.图7.针对与多种浓度(μg/ml)的具有包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区的本发明抗sirpα抗体7至13组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带两个sirpα1等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用gm
‑
csf刺激100分钟的中性粒细胞进行实验，并且以
51
cr释放测定测量细胞毒性。
36.图8.针对与多种浓度(μg/ml)的基于现有技术的抗sirpα抗体组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带两个sirpα
bit
等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用gm
‑
csf刺激100分钟的中性粒细胞进行实验，并且以
51
cr释放测定测量细胞毒性。
37.图9.针对与多种浓度(μg/ml)的具有包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区的本发明抗sirpα抗体1至6组合的经曲妥珠单抗(tmab；10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc(剂量响应曲线)。中性粒细胞从携带两个sirpα
bit
等位基因的人供体中分离。每个单独的中性粒细胞供体都用一个符号表示。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。使用用gm
‑
csf刺激100分钟的中性粒细胞进行实验，并且以
51
cr释放测定测量细胞毒性。
38.图10a至d.指定抗sirpα抗体与粒细胞(左图)、cd14
+
单核细胞(中图)和cd3
+
t细胞(右图)的结合，在代表性健康杂合sirpα1/sirpα
bit
供体的全血中如通过流式细胞术确定的。每个图中都提供了每种抗sirpα抗体的相关同种型对照。数据描述为中位荧光强度(median fluorescence intensity，mfi)。
39.图11.如通过流式细胞术确定的指定抗sirpα抗体与从健康供体的血沉棕黄层分离的表达sirpγ的人cd3
+
t细胞的结合。每个图中都提供了每种抗sirpα抗体的相关同种型对照。数据描述为平均荧光强度(mfi)。
40.图12a.如在不存在或存在浓度范围的抗体6或同种型对照的情况下使用jurkat sirpα
bit
信号传导细胞与jurkat e6.1细胞作为cd47配体细胞通过相对发光单位(relative luminescence unit，rlu)所测量的shp
‑
1向sirpα的募集。按以下确定最大信号的％：(rlu/最大刺激的rlu(无抗体)*100)。结果显示为两个独立实验的平均值+/
‑
sem。
41.图12b.如用jurkat sirpα
bit
信号传导细胞和jurkat e6.1细胞作为cd47配体细胞所测量的3.3μg/ml的指定抗sirpα抗体抑制sirpα
bit
信号传导的效力水平。效力水平按以下计算：100％
‑
3.3μg/ml化合物的
‘
最大信号％’值。结果显示为两个独立实验的平均值+/
‑
sem。
42.图13a至b.针对与本发明抗sirpα抗体6和指定参考抗体组合的经曲妥珠单抗(10μg/ml)调理的skbr3细胞的中性粒细胞介导的adcc。中性粒细胞从携带两个sirpα
bit
等位基因、携带两个sirpα1等位基因或携带一个sirpα
bit
和一个sirpα1等位基因的人供体中分离。柱是所有供体的平均值+/
‑
sem。使用未经处理的细胞和用10μg/ml曲妥珠单抗处理的细胞作为对照。对于每种抗体，在10、1、0.1和0.01μg/ml(从左到右)下做出剂量响应曲线。抗体6和参考抗体在图(a)中示出；同种型对照在图(b)中示出。数据针对对曲妥珠单抗的响应(设置为100％)归一化。如实验部分10中所示进行实验。
43.图14a至b.针对与本发明抗sirpα抗体6和指定参考抗体组合的经西妥昔单抗(5μg/ml)调理的a431细胞的中性粒细胞介导的adcc。中性粒细胞从携带两个sirpα
bit
等位基因、携带两个sirpα1等位基因或携带一个sirpα
bit
和一个sirpα1等位基因的人供体中分离。柱是所有供体的平均值。使用未经处理的细胞和用5μg/ml西妥昔单抗处理的细胞作为对照。对于每种抗体，在10、1、0.1和0.01μg/ml(从左到右)下做出剂量响应曲线。抗体6和参考抗体在图(a)中示出；同种型对照在图(b)中示出。将数据针对对西妥昔单抗的响应(设置为100％)归一化。如实验部分10中所示进行实验。
具体实施方式
44.定义
45.本说明书通篇使用的术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的单克隆抗体(monoclonal antibody，mab)。抗体可以是任何同种型，例如iga、ige、igg或igm抗体。抗体也可以是igga交叉同种型(kelton et al.chemistry and biology，2014，21，1603
‑
1609)。优选地，抗体是igg抗体，例如igg1、igg2、igg3或igg4抗体，更优选igg1或igg2抗体。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文中与抗体可互换使用。根据本发明的抗体优选地是人源化或人抗体。
46.基础的4链抗体单元是由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链构成的异四聚体糖蛋白(igm抗体由5个基础异四聚体单元以及被称为j链的另外的多肽组成，并因此包含10个抗原结合位点，而分泌iga抗体可聚合以形成包含2至5个基础4链单元以及j链的多价聚集体(assemblage))。在igg的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条l链通过一个共价二硫键与h链连接，而两条h链通过一个或更多个二硫键相互连接，取决于h链同种型。然而，igg可缺少一个或更多个二硫键，同时保留其功能。每条h和l链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条h链具有在n端的可变结构域(vh)，随后是三个恒定结构域(ch)(对于α和γ链中的每一个)以及四个ch结构域(对于μ和ε同种型)。通常来说，h链包含铰链区，通常在第一与第二恒定区之间。每条l链具有在n端的可变结构域(vl)，随后是在其另一端的恒定结构域(cl)。vl与vh对齐，并且cl与重链的第一恒定结构域(ch1)对齐。认为特定氨基酸残基在l链和h链可变结构域之间形成界面。vh和vl的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类抗体的结构和特性，参见例如basic and clinical immunology，第8版，daniel p.stites，abba i.terr and tristram g. parslow(eds.)，appleton&lange，norwalk，ct，
第71页和第6章(1994)。
47.来自任何脊椎动物物种的l链都可根据其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(ch)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分配为不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，具有的重链分别命名为α、δ、ε、γ和μ。基于相对较小的ch序列和功能差异，α和γ类进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
48.优选地，本发明的抗体是人源化或人抗体。甚至更优选地，抗体是人源化或人igg抗体，最优选人源化或人igg1mab。抗体可具有κ或λ轻链，优选κ轻链(例如，如seq id no：26所示)，即人源化或人igg1‑
κ抗体。本发明的抗体可包含经改造的恒定区，例如可将一个或更多个突变引入以例如提高半衰期和/或降低效应功能。
49.本文中使用的术语“单克隆抗体”和“mab”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即，除了可以以较小量存在的天然发生的可能突变之外，构成该群的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。已知本领域有数种方式产生单克隆抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过用代表期望抗原的肽混合物对动物进行免疫接种来产生。随后，可将b淋巴细胞分离并与骨髓瘤细胞融合，或者可在存在条件培养基和饲养细胞的情况下将单个b淋巴细胞培养数天。对含有产生的抗体的骨髓瘤或b淋巴细胞上清液进行测试以选择合适的b淋巴细胞或杂交瘤。可通过最初由et al.nature 1975，256，495
‑
497描述的杂交瘤方法从合适的杂交瘤制备单克隆抗体。或者，可裂解合适的b细胞或淋巴瘤，可将rna分离、逆转录并测序。可通过在细菌、真核动物或植物细胞中的重组dna方法来制备抗体(参见，例如，美国专利no.4,816,567)。
50.抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。术语“可变”是指可变结构域的某些区段在抗体之间在序列上差异很大的事实。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布于可变结构域的约110个氨基酸跨度(span)中。相反，可变区由15至30个氨基酸的被称为框架区(framework region，fr)的相对不变的段(stretch)组成，所述段由被称为“高变区”(hypervariable region，hvr)或“互补决定区”(complementarity determining region，cdr)的极度可变的较短区隔开，所述较短区各自约9至12个氨基酸长，但可更短或更长，例如本发明的mab中的hcdr1的长度为5个氨基酸残基。天然存在抗体的重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr，主要采用β片构造，通过三个cdr连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β片结构的一部分。每条链中的cdr通过fr紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的cdr一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见kabat et al.sequences of proteins of immunological interest，5th ed.public health service，national institutes of health，bethesda，md.1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应功能，例如使抗体参与adcc和/或adcp。重链的可变结构域可称为“vh”。轻链的可变结构域可称为“vl”。
51.本说明书通篇使用的术语“抗原结合片段”包括fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv和rigg片段，只要其表现出期望的生物学和/或免疫学活性即可。术语“抗原结合片段”还包括单链(single chain，sc)抗体、单结构域(single domain，sd)抗体、双抗体或微抗体。例如，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，被称为“fab”片段，以及残留“fc”片
段，该名称反映了容易结晶的能力。fab片段由整条l链以及h链的可变区结构域(vh)和一条重链的第一恒定结构域(ch1)组成。每个fab片段就抗原结合而言是单价的，即其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的f(ab’)2片段，其大致对应于两个二硫键连接的具有二价抗原结合活性的fab片段并且仍然能够交联抗原。fab’片段与fab片段的不同之处在于，在ch1结构域的c端处具有另外的数个残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。fab
’‑
sh是本文中对于fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离的巯基。f(ab’)2抗体片段最初作为fab’片段对产生，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条h链的c端部分。抗体的效应功能由fc区中的序列确定，该区也是由在某些类型细胞上发现的fc受体(fc receptor，fcr)识别的部分。“fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由以紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链fv(single
‑
chain fv，scfv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得重链和轻链可以以类似于双链fv种类的“二聚体”结构缔合。从这两个结构域的折叠中，产生为抗原结合贡献了氨基酸残基并对抗体赋予了抗原结合特异性的六个高变环(来自h和l链各3个环)。然而，即使单可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个cdr的fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。还缩写为“sfv”或“scfv”的“单链fv”是包含连接到单多肽链中的vh和vl抗体结构域的抗体片段。优选地，sfv多肽还包含vh与vl结构域之间的多肽接头，其使得sfv能够形成抗原结合所期望的结构。关于sfv的综述，参见pluckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies，vol.113，rosenburg and moore eds.，springer
‑
verlag，new york，pp.269
‑
315(1994)。“rigg”是指还原的igg，约75,000道尔顿，并且可通过仅选择性还原铰链区二硫键来产生，例如使用温和的还原剂，例如2
‑
巯基乙胺(2
‑
mea)。
52.术语“抗sirpα抗体”或“与sirpα结合的抗体”是指这样的抗体：其能够以足够的亲和力结合sirpα以使得该抗体可用作靶向sirpα的诊断和/或治疗剂。优选地，抗sirpα抗体与不相关、非sirp蛋白的结合程度小于抗体与sirpα结合的约10％，如通过例如放射免疫测定(radioimmunoassay，ria)、表面等离子体共振(spr)或酶联免疫吸附测定(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，elisa)所测量的。还可使用细胞微阵列技术，例如如通过retrogenix
tm
来描述(profile)与非相关靶标的结合。
[0053]“分离的抗体”是已从其天然环境的组分中被鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的治疗性用途的物质，并且可包含酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些优选实施方案中，抗体将被纯化至：(1)如通过劳里法(lowry method)确定的抗体的按重量计大于95％，并且最优选按重量计大于99％；(2)通过使用旋转杯序列分析仪(spinning cup sequenator)足以获得至少n端或内部氨基酸序列的残基的程度；或者(3)使用考马斯蓝或优选银染色剂在还原或非还原条件下通过sds
‑
page使其均质。由于抗体的天然环境的至少一种组分将不存在，因此分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体。然而，通常来说，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0054]“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则本文中使用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。本说明
书通篇使用的分子x与其配偶体y的结合亲和力是指特定抗原
‑
抗体相互作用的平衡解离常数(也称为“结合常数”；k
d
)。k
d
是解离速率(k
off
)与缔合速率(k
on
)之比。因此，k
d
等于k
off
/k
on
并表示为摩尔浓度(m)。由此可见，k
d
越小，结合的亲和力越强。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文中所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持更久的结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何方法都可用于本发明的目的。一些具体的说明性实施方案在下面描述。通常，k
d
值通过使用本领域已知的方法(例如e.s.day et al.anal.biochem.2013，440，96
‑
107)使用表面等离子体共振(spr)，通常使用生物传感器系统(例如biacore
tm
)来确定，例如如实施例部分中所述。或者，术语“结合亲和力”还可以是指用例如elisa测定确定的或如通过流式细胞术确定的产生半最大结合的抗体浓度(ec
50
)。
[0055]“结合”一个目的抗原或多个目的抗原(例如sirpα抗原靶标)的抗体是这样的抗体：其以足够的亲和力结合抗原以使得该抗体可用作靶向表达一种或更多种抗原的细胞或组织的治疗剂，并且不与其他蛋白质进行显著交叉反应。例如，根据本发明的抗sirpα抗体与人sirpα结合
‑
即，至少与人sirpα1和人sirpα
bit
结合，优选地与食蟹猴sirpα结合
‑‑‑
并且可与sirpβ
1v1
和/或sirpβ
1v2
结合，而它不与sirpγ或不相关蛋白质结合。在这样的一些实施方案中，如通过荧光激活细胞分选(facs)分析或放射免疫沉淀测定(radioimmunoprecipitation assay，ripa)所确定的，抗体与“非靶标”蛋白质的结合程度将优选小于约10％，更优选小于约5％，更优选小于约2％，更优选小于约1％的抗体与其特定靶蛋白的结合。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者“与其特异性结合”或者“对其具有特异性”意指与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的非经标记靶标)竞争来确定。在这种情况下，如果经标记靶标与探针的结合被过量的未经标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”一种或更多种特定多肽或者一种或更多种特定多肽靶标上的表位或者“与其特异性结合”或者“对其具有特异性”可例如通过对靶标(其可如上所述来确定)具有以下k
d
的分子来展示：至少约10
‑7m，优选至少约10
‑8m，更优选至少约10
‑9m，甚至更优选至少约10
‑
10
m，甚至更优选至少约10
‑
11
m，甚至更优选至少约10
‑
12
m或更大，如在25℃下通过spr确定的。
[0056]
本说明书通篇使用的术语“低亲和力”可与短语“不结合”或“不与...结合”互换，并且是指抗体与其抗原之间的结合亲和力，ec
50
大于1500ng/ml，如使用elisa测定所确定的，和/或其中在固定化抗原与抗体之间观察到有限的特异性结合或没有特异性结合，如优选地在25℃下通过spr所确定的，例如如当抗体与抗原之间的k
d
高于例如10
‑7m、高于10
‑6m或甚至更高，如在25℃下通过spr所确定的。
[0057]
本文中使用的术语“高亲和力”是指抗体与其抗原之间的结合亲和力，其中k
d
通常低于10
‑8m、10
‑9m、10
‑
10
m、10
‑
11
m或甚至更低，如在25℃下通过spr所确定的，如实施例中所述的。
[0058]“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是包含最小的来源于非人抗体的序列的抗体(例如，非人
‑
人嵌合抗体)。用于使非人抗体人源化的多种方法是本领域已知的。例如，h链的可变区(variable region，vr)(vh)和l链的可变区(vr)(vl)中的抗原结合cdr来
源于来自非人物种(通常为小鼠、大鼠或兔)的抗体。这些非人cdr以抗体的功能特性(例如结合亲和力和特异性)得到至少部分地保留这样的方式与vh和vl区的人框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)组合。人fr中所选择的氨基酸可交换为相应的原始非人物种氨基酸以进一步改进抗体性能，例如以改善结合亲和力，同时保留低免疫原性。或者，非人抗体可通过修饰其氨基酸序列来人源化，以提高与人中天然产生的抗体变体的相似性。例如，将原始非人物种fr的所选择的氨基酸交换为其相应的人氨基酸以降低免疫原性，同时保留抗体的结合亲和力。用于非人抗体人源化的示例性方法是winter和同事通过将cdr替换为人抗体的相应序列的方法(jones et al.nature 1986，321，522
‑
525；riechmann et al.nature 1988，332，323
‑
327；verhoeyen et al.science 1988，239，1534
‑
1536)。
[0059]
由此人源化的可变区通常将与人恒定区组合。一般而言，人源化抗体通常将包含两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的fr是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关于更多详细信息，参见jones et al.nature 1986，321，522
‑
525；riechmann et al.nature 1988，332，323
‑
327；和presta.curr.op.struct.biol.1992，2，593
‑
596。另见以下综述文章和其中引用的参考文献：vaswani and hamilton.ann.allergy，asthma and immunol.1998，1，105
‑
115；harris.biochem.soc.transactions 1995，23，1035
‑
1038；和hurle and gross.curr.op.biotech.(1994)，5，428
‑
433。
[0060]
当在本文中使用时，术语“高变区”、“hvr”是指抗体可变结构域的区域，其在序列上是高变的和/或形成负责抗原结合的结构上限定的环。通常来说，抗体包含六个高变区；三个在vh中(h1、h2、h3)且三个在vl中(l1、l2、l3)。本文中使用并涵盖了许多高变区描绘。高变区通常包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如，vl中的残基24至34(l1)、50至56(l2)和89至97(l3)，以及vh中的约31至35(h1)、50至65(h2)和95至102(h3)，当根据kabat编号系统进行编号时；kabat et al.sequences of proteins of immunological interest，5th ed.public health service，national institutes of health，bethesda，md，1991)；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，vl中的残基24至34(l1)、50至56(l2)和89至97(l3)，以及vh中的26至32(h1)、52至56(h2)和95至101(h3)，当根据chothia编号系统进行编号时；chothia and lesk.j.mol.biol.1987，196，901
‑
917)；和/或来自“高变环”/cdr的那些残基(例如，vl中的残基27至38(l1)、56至65(l2)和105至120(l3)，以及vh中的27至38(h1)、56至65(h2)和105至120(h3)，当根据imgt编号系统进行编号时；lefranc et al.nucl.acids res.1999，27，209
‑
212，ruiz et al.nucl.acids res.2000，28，219
‑
221)。任选地，抗体在以下点中的一处或更多处具有对称插入：vl中的28、36(l1)，63、74至75(l2)和123(l3)，以及vh中的28、36(h1)，63、74至75(h2)和123(h3)，当根据honneger和plunkthun(mol.biol.2001，309，657
‑
670)进行编号时。dondelinger et al.对数种编号系统及其用途进行了综述(dondelinger et al.frontiers in immunology，2018，9，art 2278)。本发明的抗体和抗原结合片段的hvr/cdr优选地根据kabat编号系统进行定义和编号。
[0061]“框架”或“fr”残基是除本文中限定的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
[0062]
本文中使用的“阻断”抗体或“拮抗(性)”抗体意指部分或完全阻止天然配体结合
al.cell rep.2018，23(13)，3946
‑
3959)。造血细胞上的fcr表达总结在bruhns andimmunol rev.2015，268(1)，25
‑
51第33页上的表2中。为了评估目的分子的adcc活性，可进行体外adcc测定，例如美国专利no.5,500,362或5,821,337中所述的测定或者例如实施例中所述的。用于这样的测定的有用效应细胞包括包含单核细胞和nk细胞的混合物的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)，或者分离的单核细胞、中性粒细胞或nk细胞。作为替代或补充，目的分子的adcc活性可在体内，例如在动物模型(例如clynes et al.proc.natl.acad.sci.(usa)1998,95，652
‑
656中所公开的动物模型)中或在公知的肿瘤模型(例如zhao et al，pnas 2011(参见以上)中描述的b16f10模型)中评估。“fc受体”或“fcr”描述与抗体fc区结合的受体。优选的fcr是野生型序列人fcr。此外，优选的fcr是结合igg抗体(γ受体)的fcr，并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体，其包含这些受体的等位基因变体和作为替代地剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“激活受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，主要差异在于其胞质结构域。激活受体fcγriia在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based activation motif，itam)。抑制受体fcγriib在细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based inhibition motif，itim)(参见综述m.inannu.rev.immunol.1997，15，203
‑
234)。在ravetch and kinet.annu.rev.immunol.1991，9，457
‑
492；capel et al.immunomethods 1994，4，25
‑
34；和de haas et al.j.lab.clin.med.1995，126，330
‑
341中对fcr进行了综述。其他fcr，包括将来要被鉴定的那些，都被本文中的术语“fcr”涵盖。
[0069]“人效应细胞”是表达一种或更多种fcr并执行效应功能的白细胞。优选地，细胞表达fcγriia(中性粒细胞或单核细胞)或fcγriiia(nk细胞或单核细胞)并执行adcc效应功能。介导adcc的人白细胞的实例包括pbmc、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，其中优选中性粒细胞。效应细胞可从天然来源，例如从血液，优选地从人血液中分离。
[0070]
本文中使用的术语“治疗性抗体”是指适用于人治疗的如上文所限定的抗体或其抗原结合片段。适用于人治疗的抗体具有足够的品质、安全性和有效性以用于治疗特定的人疾病。品质可使用已建立的良好操作规范(good manufacturing practice)指南来评估；安全性和有效性通常使用已建立的药品监管当局(例如欧洲药品管理局(european medicines agency，ema)或美国食品和药物管理局(food and drug administration，fda))指南来评估。这些指南是本领域公知的。在本说明书中，术语“治疗性抗体”不包括抗sirpα抗体。本文中使用的术语“治疗性抗体”意指抗癌抗体，例如如抗cd20、抗her2、抗gd2、抗egfr或抗cd70抗体。
[0071]“序列同一性”和“序列相似性”可通过使用全局或局部比对算法(取决于两个序列的长度)对两个氨基酸序列或两个核苷酸序列进行比对来确定。相似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如needleman and wunsch)进行比对，该算法在整个长度上最佳地比对序列，而长度显著不同的序列优选地使用局部比对算法(例如smith waterman)进行比对。当序列(当通过例如程序gap或bestfit使用缺省参数进行最佳比对时)共有至少一定的最小百分比的序列同一性(如下文所限定)时，则它们可被称为“基本相同”或“基本相似”。gap使用needleman and wunsch全局比对算法以在两个序列的整个长度(全长)上对它们进行比对，使匹配数最大化并使空位(gap)数最小化。当两个序列具有相似长度时，全局比对适
合用于确定序列同一性。通常来说，使用gap缺省参数，其中空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)并且空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的缺省评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白质，缺省评分矩阵是blosum62(henikoff&henikoff.pnas 1992，89，915
‑
919)。用于百分比序列同一性的序列比对和评分可按以下来确定：使用计算机程序，例如gcg wisconsin包，版本10.3，可从accelrys inc.，9685scranton road，san diego，ca 92121
‑
3752美国获得；或者使用开源软件，例如程序“needle”(使用全局needleman wunsch算法)或“water”(使用局部smith waterman算法)(在embosswin版本2.10.0中)，使用与用于上述gap相同的参数或使用缺省设置(对于“needle”和对于“water”二者以及对于蛋白质和dna比对二者，缺省空位开放罚分是10.0并且缺省空位延伸罚分是0.5；缺省评分矩阵对于蛋白质是blossum62，而对于dna是dnafull)。当序列具有显著不同的总长度时，优选局部比对，例如使用smith waterman算法的那些。或者，可使用例如fasta、blast等的算法通过针对公共数据库进行检索来确定百分比相似性或同一性。
[0072]
一旦使用上述比对程序中的任一种比对两个氨基酸序列，给定氨基酸序列a与或针对给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(其或者可表述为给定氨基酸序列a与或针对给定氨基酸序列b具有或包含一定％的氨基酸序列同一性)如下计算：分数x/y的100倍，其中x是在序列比对程序的a与b比对中被该程序评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中y是b中总的氨基酸残基数。应理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的％氨基酸序列同一性将不等于b与a的％氨基酸序列同一性。
[0073]
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，可考虑所谓的“保守氨基酸替换”。“保守氨基酸替换”是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸残基的组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族
‑
羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是：缬氨酸
‑
亮氨酸
‑
异亮氨酸、苯丙氨酸
‑
酪氨酸、赖氨酸
‑
精氨酸、丙氨酸
‑
缬氨酸和天冬酰胺
‑
谷氨酰胺。对于每个天然存在氨基酸的示例性保守替换如下：ala到ser；arg到lys；asn到gln或his；asp到glu；cys到ser或ala；gln到asn；glu到asp；gly到pro；his到asn或gln；ile到leu或val；leu到ile或val；lys到arg、gln或glu；met到leu或ile；phe到met、leu或tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp或phe；以及val到ile或leu。
[0074]“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中应理解为意指由使用重组dna技术导致的人造核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在核酸分子，但是核酸构建体可包含(部分)天然存在核酸分子。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够在与这样的序列相容的宿主细胞或宿主生物体中实现基因表达的核苷酸序列。这些表达载体通常至少包含合适的转录调控序列，和任选地3’转录终止信号。也可存在影响表达所必需或有帮助的另外的要素，例如表达增强子元件。表达载体被引入到合适的宿主细胞中并能够在宿主细胞的体外细胞培养物中影响编码序列的表达。表达载体将适用于在本发明的宿主细胞或生物体中复制。
[0075]
本文中使用的术语“启动子”或“转录调控序列”是指这样的核酸片段：其用于控制一个或更多个编码序列的转录，并且相对于编码序列的转录起始位点的转录方向位于上
游，并且通过dna依赖性rna聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他dna序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的以直接或间接调节来自启动子的转录量而发挥作用的任何其他核苷酸序列)的存在在结构上被鉴定。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是例如通过应用化学诱导剂在生理上或发育上受到调节的启动子。
[0076]
本文中使用的术语“有效地连接”是指处于功能关系的多核苷酸元件的连接。当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸被“有效地连接”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则它与该编码序列有效地连接。有效地连接意指所连接的dna序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在阅读框中。
[0077]
本文中使用的术语“adc”是指通过接头与如上文所限定的治疗性抗体或其抗原结合片段缀合的细胞毒性药物。adc中的抗体或其抗原结合片段不是抗sirpα抗体。通常来说，细胞毒性药物是高度有效的，例如倍癌霉素(duocarmycin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮(pbd)二聚体、美登木素生物碱(maytansinoid)或奥瑞他汀(auristatin)衍生物。接头可以是可切割的，例如包含可切割的二肽缬氨酸
‑
瓜氨酸(valine
‑
citrulline，vc)或缬氨酸
‑
丙氨酸(valine
‑
alanine，va)，或者不可切割的，例如琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc)。
[0078]
本发明的抗体或其片段
[0079]
尽管已表明sirpα在肿瘤免疫逃逸机制中发挥重要作用，但目前没有针对sirpα的经批准治疗剂可用。
[0080]
sirpα(也称为cd172抗原样家族成员a、cd172a、shps
‑
1、myd
‑
1)是信号调节蛋白(signal regulatory protein，sirp)家族的成员，其是存在于免疫效应细胞上具有胞外ig样结构域的跨膜糖蛋白。cd47(也称为整合素相关蛋白(integrin
‑
associated protein)，iap)是sirpα的配体。sirpα的nh2端配体结合结构域是高度多态性的(takenaka et al.nature immun.2007，8(12)，1313
‑
1323)。然而，这种多态性不会显著影响与cd47的结合。sirpα
bit
(v1)和sirpα1(v2)是两个最常见且最不同(13个残基不同)的多态物(hatherley et al.j.biol.chem.2014，289(14)，10024
‑
10028)。除了cd47，sirpα还可被表面活性蛋白(sp
‑
a和sp
‑
d)结合(gardai et al 2003，janssen et al.2008，fournier et al.2012)。事实上，cd47可与sirpα结构域d1结合，而sp
‑
d可(同时)与sirpα结构域d3结合。像sirpα一样，表面活性蛋白与针对例如凋亡细胞和微生物的涉及巨噬细胞和/或中性粒细胞的固有免疫/炎性应答有关。其他具有生化特征的人sirp家族成员是sirpβ1和sirpγ。sirp家族命名在van den berg et al.j immunology 2005，175(12)，7788
‑
9中进行了描述。
[0081]
sirpβ1(也称为cd172b)不结合cd47(van beek et al.j.immunol.2005，175(12)，7781
‑
7787，7788
‑
7789)并且已知至少两个sirpβ1多态性变体，sirpβ
1v1
(ensp00000371018)和sirpβ
1v2
(ensp00000279477)。尽管sirpβ1的天然配体尚且未知，但使用抗sirpβ1特异性抗体的体外研究表明，sirpβ1的接合通过诱导dap12、syk和slp
‑
76的酪氨酸磷酸化并随后激活mek
‑
mapk
‑
肌球蛋白轻链激酶级联来促进巨噬细胞的吞噬作用(matozaki et al.j.biol.chem.2004，279(28)，29450
‑
29460)。人sirpβ1在髓样细胞，例如在单核细胞和粒细胞中表达，但不在淋巴细胞中表达(hayashi et al.j.of biol chem.2004，279(28)；
dietrich et al.the journal of immunology 2000，164，9
‑
12)。
[0082]
sirpγ(也称为cd172g)在t细胞和活化的nk细胞上表达，并以与sirpα相比低约10倍的亲和力与cd47结合。cd47
‑
sirpγ相互作用参与抗原呈递细胞与t细胞之间的接触、共刺激t细胞活化以及促进t细胞增殖(piccio et al.blood 2005，105，2421
‑
2427)。此外，cd47
‑
sirpγ相互作用在t细胞的跨内皮迁移中发挥作用(stefanidakis et al.blood 2008，112，1280
‑
1289)。wo2017/178653公开了由于sirpα与sirpγ之间序列的高相似性，特别是在与cd47相互作用的区，因此现有技术的抗sirpα抗体也结合sirpγ并在人中具有不期望的作用，例如抑制t细胞增殖和降低免疫应答。因此，假设不与t细胞上sirpγ结合的本发明的抗sirpα抗体对t细胞外渗具有较少抑制或没有抑制和/或对t细胞的跨内皮迁移具有较少抑制或没有抑制，如与结合t细胞上sirpγ的抗sirpα抗体相反。
[0083]
本发明涉及拮抗性抗sirpα抗体，其表现出与至少两种主要的人sirpα多态性变体sirpα
bit
和sirpα1的特异性结合。优选地，本发明的抗sirpα抗体对人sirpγ具有降低的、低的亲和力或最优选无亲和力(优选地如根据实施例部分通过cd3
+
t细胞facs染色或表面等离子体共振(优选biacore
tm
)测量的)。优选地，本发明的抗sirpα抗体对人sirpβ
1v1
和/或人sirpβ
1v2
具有降低的或低的亲和力。优选地，其提高治疗性抗体的adcc和/或adcp。在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体还与食蟹猴sirpα结合。
[0084]
拮抗性抗体对特定抗原具有亲和力，并且该抗体与其抗原的结合抑制受体上激动剂或反向激动剂的功能。在本发明的情况下，假设拮抗性抗sirpα抗体与sirpα的结合将阻止cd47与sirpα的结合。拮抗性抗sirpα抗体可与cd47结合的相同位点(即，正构位点(orthosteric site))结合，阻止cd47对sirpα的连接并因此抑制负调节免疫效应细胞的fc受体依赖性作用的信号传导。或者，拮抗性抗sirpα抗体可与紧密靠近cd47结合的位点结合，通过位阻阻止cd47与sirpα之间的相互作用。或者，在cd47相互作用位点远端的抗体可阻断cd47/sirpα结合，例如通过诱导非接受性构象。不希望受任何理论束缚，假设阻断cd47与sirpα的结合降低或阻止sirpα信号传导级联，降低或阻止优选至少60％，更优选至少65％、至少70％、至少75％，最优选至少80％，当在3.3μg/ml的抗sirpα抗体浓度下如实施例中所示测量时。
[0085]
如果抗体还与除靶标之外的其他抗原结合，例如与sirpβ
1v1
、sirpβ
1v2
和sirpγ结合，尤其是当抗体以高亲和力与那些抗原结合时，则这样的抗原可起到抗体吸收(sink)的作用。因此，假设通过使脱靶抗体结合最小化，降低了任何抗体吸收作用，这可导致与还具有相同特征的抗体相比，在较低剂量下的效力或在相同剂量下的较高作用。
[0086]
目前对sirpβ1的作用了解较少。因此，优选的是本发明的抗体对两种多态性变体(sirpβ
1v1
和sirpβ
1v2
)具有相对低的结合亲和力。然而，已报道sirpα(通过基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，itim进行信号传导)和sirpβ1(通过基于免疫受体酪氨酸的激活基序，itam进行信号传导)的激活对免疫效应细胞(例如巨噬细胞和pmn/中性粒细胞)的功能具有相反的作用(van beek et al.j.immunol.2005，175(12)，7781
‑
7787，7788
‑
7789)。此外，已报道鼠sirpβ1受体的触发促进巨噬细胞的吞噬作用(hayashi et al.j.biol.chem.2004，279(28)，29450
‑
29460)。liu et al.(j.biol.chem.2005，280(43)，36132
‑
36140)指出抗体介导的sirpβ1连接增强了fmlp驱动的pmn跨上皮迁移。不希望受任何理论束缚，可想象的是，也与sirpβ1结合的抗sirpα阻断抗体可对sirpα和sirpβ1具有相反的作用。为了获得对抗
肿瘤细胞应答的最大刺激，需要通过阻断sirpα同时限制或避免影响sirpβ1功能并同时避免通过与sirpγ结合来阻断适应性免疫细胞(即t细胞)来刺激固有免疫细胞(例如pmn/中性粒细胞和/或巨噬细胞)的活性的抗体。
[0087]
本发明的抗体优选地具有所有以下特征：(i)其能够阻断cd47与sirpα
bit
和sirpα1的结合，(ii)其不与人cd3
+
t细胞结合，以及(iii)其能够降低sirpα信号传导。优选地，其与sirpβ
1v1
和/或sirpβ
1v2
具有降低的或低的结合，如通过spr所测量的。相比之下，已知的抗sirpα抗体并没有在单一抗体中结合所有期望的特异性：能够阻断cd47与sirpα
bit
和sirpα1结合的所有抗体也显示出与sirpγ结合，而heflb能够阻断sirpα
bit
而不与sirpγ结合，但不具有结合更不用说阻断sirpα1的能力。能够结合sirpα1和sirpα
bit
二者而不结合sirpγ的一些其他现有技术抗体不能够阻断cd47与sirpα的结合，并且因此不能或仅在高ic
50
浓度下阻断sirpα信号传导，如通过阻断shp
‑
1的募集所测量的。尽管se5a5能够结合和阻断sirpα1和sirpα
bit
二者，但其不能够阻断sirpα信号传导，如通过阻断shp
‑
1的募集所测量的。这些特征如实施例中所述或提及的来确定。
[0088]
在第一方面中，本发明提供了与sirpα结合的抗体或其抗原结合片段。本发明的抗sirpα抗体优选地是分离的抗体。优选地，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段与灵长类sirpα结合，更优选地与人sirpα结合，最优选地至少与等位基因变体sirpα1和sirpα
bit
结合。在一个优选实施方案中，与现有技术抗体相比，所述抗体或其抗原结合片段与sirpγ具有降低的结合，更优选地具有低的结合，最优选地不结合，优选地如根据实施例或如实施例中所示的biacore实验使用人cd3
+
t细胞facs染色所测量的。优选地，抗体或其抗原结合片段提高治疗性抗体的adcc和/或adcp。优选地，当使用如实施例中所使用的delfia或
51
cr释放测定测量时，与单独的曲妥珠单抗相比，本发明的抗sirpα抗体在0.1μg/ml抗sirpα抗体下将10μg/ml曲妥珠单抗的adcc提高至少1.2；更优选至少1.3；更优选至少1.4；更优选至少1.5；更优选至少1.6；更优选至少1.7；更优选至少1.8；更优选至少1.9；更优选至少2.0；更优选至少2.1；更优选至少2.2；最优选至少2.3倍。
[0089]
作为替代地或与本文中另一些实施方案中的任一个组合，在一个优选实施方案中，本发明的抗sirpα抗体是人源化或人抗sirpα抗体，并且根据本发明的抗原结合片段是如上文所限定的来自人源化或人抗sirpα抗体的抗原结合片段。更优选地，本发明的抗sirpα抗体是人源化抗sirpα抗体并且本发明的抗原结合片段来源于人源化抗sirpα抗体。
[0090]
根据本发明的人源化抗体或其抗原结合片段优选地在施用该抗体或片段的对象中几乎不引发至不引发针对该抗体的免疫原性应答。原始的非人抗体，例如啮齿动物抗体(例如小鼠或大鼠抗体)或兔抗体或非人
‑
人嵌合抗体，可潜在地引发人抗非人动物抗体应答，在这种情况下，在宿主对象中，与原始非人抗体相比或与非人
‑
人嵌合抗体相比，根据本发明的人源化抗体或其抗原结合片段以显著降低的水平引发和/或预期引发免疫原性应答。优选地，所述人源化抗体引发和/或预期引发最小人抗非人抗体应答或不引发人抗非人抗体应答。免疫原性测试可通过例如在baker et al.immunogenicity of protein therapeutics 2010，1(4)，314
‑
322；harding et al.mabs 2010，2(3)，256
‑
265；或joubert et al.plos.one 2016，11(8)，e0159328中所述的本领域已知方法进行。最优选地，本发明的抗体引发处于或低于临床可接受水平的人抗非人动物抗体应答，特别是人抗兔抗体(human anti
‑
rabbit antibody，hara)应答。将抗体人源化并保留对抗原的高亲和力和其
他有利的生物学特性也很重要。
[0091]
可使用以下方法来确定cdr：kabat(在kabat et al.sequences of proteins of immunological interest，5th ed.public health service，national institutes of health，bethesda，md 1991，nih publication no.91
‑
3242，pp.662，680，689中)、chothia(chothia and lesk.j.mol.biol.1987，196，901
‑
917；antibody engineering vol.2，chapter 3 by martin，2010，kontermann and d
ü
bel eds.springer
‑
verlag berlin heidelberg)或imgt(lefranc.the immunologist 1999，7，132
‑
136)。本文中使用的重链和轻链的cdr是使用kabat确定的，并在如表1a中所示的seq id no下的序列表中示出。在本发明的上下文中，eu编号用于表明在抗体的重链和轻链恒定区中的位置。表述“eu编号”是指如在kabat et al.sequences of proteins of immunological interest，5th ed.public health service，national institutes of health，bethesda，md 1991，nih publication no.91
‑
3242，pp.662，680，689中的eu索引。
[0092]
在一个优选实施方案中，本发明涉及抗sirpα抗体，优选人源化抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的重链互补决定区(hcdr)和轻链互补决定区(lcdr)hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3：(a)hcdr1包含shgis(seq id no：36)；hcdr2包含tigtgvityfaswakg(seq id no：44)；hcdr3包含gsawndpfdp(seq id no：45)；lcdr1包含qasqsvygnndla(seq id no：39)；lcdr2包含lastlat(seq id no：40)；lcdr3包含lgggddeadnt(seq id no：41)；(b)hcdr1包含syvmg(seq id no：30)；hcdr2包含iisssgspyyaswvng(seq id no：31)；hcdr3包含vgplgvdyfni(seq id no：32)；lcdr1包含rasqsinsyla(seq id no：33)；lcdr2包含sasflys(seq id no：34)；lcdr3包含qswhyisrsyt(seq id no：35)；(c)hcdr1包含shgis(seq id no：36)；hcdr2包含tigtgvityyaswakg(seq id no：37)；hcdr3包含gsawndpfdy(seq id no：38)；lcdr1包含qasqsvygnndla(seq id no：39)；lcdr2包含lastlat(seq id no：40)；lcdr3包含lgggddeadnv(seq id no：46)；(d)hcdr1包含shgis(seq id no：36)；hcdr2包含tigtgvityyaswakg(seq id no：37)；hcdr3包含gsawndpfdy(seq id no：38)；lcdr1包含qasqsvygnndla(seq id no：39)；lcdr2包含lastlat(seq id no：40)；lcdr3包含lgggddeadnt(seq id no：41)；以及(e)hcdr1包含shgis(seq id no：36)；hcdr2包含tigtggityyaswakg(seq id no：42)；hcdr3包含gsawndpfdi(seq id no：43)；lcdr1包含qasqsvygnndla(seq id no：39)；lcdr2包含lastlat(seq id no：40)；lcdr3包含lgggddeadnt(seq id no：41)。更优选地，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段包含选自以下的hcdr和lcdr：(a)hcdr1包含shgis(seq id no：36)；hcdr2包含tigtgvityfaswakg(seq id no：44)；hcdr3包含gsawndpfdp(seq id no：45)；lcdr1包含qasqsvygnndla(seq id no：39)；lcdr2包含lastlat(seq id no：40)；lcdr3包含lgggddeadnt(seq id no：41)；(b)hcdr1包含syvmg(seq id no：30)；hcdr2包含iisssgspyyaswvng(seq id no：31)；hcdr3包含vgplgvdyfni(seq id no：32)；lcdr1包含rasqsinsyla(seq id no：33)；lcdr2包含sasflys(seq id no：34)；lcdr3包含qswhyisrsyt(seq id no：35)。
[0093]
作为替代地或与前述实施方案中的任一个组合，在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段具有以下功能特性中的一种或更多种。
[0094]
优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的
k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα1，如在25℃下使用如seq id no：51所示的人sirpα1胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα
bit
，如在25℃下使用如seq id no：52所示的人sirpα
bit
胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以低于10
‑7m的k
d
，更优选以低于10
‑8m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑9m的k
d
结合食蟹猴sirpα，如在25℃下使用如seq id no：56所示的食蟹猴sirpα胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以不可检测的方式结合人sirpγ，如根据实施例通过cd3
+
t细胞facs染色所测量的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段不结合人sirpγ，如在25℃下使用如seq id no：55所示的人sirpγ胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段不是免疫原性的，如通过il
‑
2 elispot和/或t细胞增殖测定所确定的。优选地，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以中等至低的亲和力结合人sirpβ
1v2
，如在25℃下使用如seq id no：54所示的人sirpβ
1v2
胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。优选地，k
d
高于10
‑
10
m，更优选高于10
‑9m。优选地，与sirpβ
1v2
的中等至低的亲和力组合，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以高于10
‑
11
m，更优选高于3x10
‑
11
m，甚至更优选高于10
‑
10
m，甚至更优选高于10
‑9m的k
d
结合sirpβ
1v1
，如在25℃下使用如seq id no：53所示的人sirpβ
1v1
胞外结构域通过表面等离子体共振(优选biacore
tm
)所分析的。这些测定在实施例中被描述或提及。
[0095]
作为替代地或与前述实施方案中的任一个组合，在一个优选实施方案中，本发明涉及如上文所限定的抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其中使用cd3
+
t细胞染色和/或spr(二者均如实施例中所述)，所述抗体显示出与人sirpα
bit
和人sirpα1二者的特异性结合并且以不可检测的方式与人sirpγ结合。在一个实施方案中，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα
bit
；并且以低于10
‑8m的k
d
，更优选以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα1，其中k
d
在25℃下用spr测量(参见实施例)。优选地，本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段以高于10
‑8m的k
d
，更优选以高于10
‑7m的k
d
，更优选以高于10
‑6m的k
d
，甚至更优选以高于10
‑5m的k
d
与sirpγ结合，最优选其中不可检测到结合，其中k
d
在25℃下用spr测量(参见实施例)。
[0096]
作为替代地或与前述实施方案中的任一个组合，在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段：(a)以低于10
‑8m的k
d
，更优选以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα1，如在25℃下使用如seq id no：51所示的人sirpα1胞外结构域通过表面等离子体共振(spr；优选地通过biacore
tm
)所分析的(参见实施例)；(b)以低于10
‑9m的k
d
，更优选以低于10
‑
10
m的k
d
，甚至更优选以低于10
‑
11
m的k
d
结合人sirpα
bit
，如在25℃下使用如seq id no：52所示的人sirpα
bit
胞外结构域通过spr(优选地通过biacore
tm
)所分析的(参见实施例)；(c)阻断cd47与sirpα1和sirpα
bit
结合，优选地如通过spr(优选地通过biacore
tm
)通过从捕获的cd47中的解离所分析的；以及(d)以不可检测的方式结合人sirpγ，如通过cd3
+
t细胞流式细胞术，优选荧光激活细胞分选(facs)染色，和/或spr(二者均如实施例中所述)所测量的。优选地，与前述实施方案组合，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以中等至低的亲和力结合人sirpβ
1v2
，如在25
°
(2下使用如
seq id no：54所示的人sirpβ
1v2
胞外结构域通过spr(优选地通过biacore
tm
)所分析的。优选地，k
d
高于10
‑
10
m，更优选高于10
‑9m。优选地，与sirpβ
1v2
的中等至低的亲和力组合，抗sirpα抗体或其抗原结合片段以高于10
‑
11
m，更优选高于3x10
‑
11
m，甚至更优选高于10
‑
10
m，甚至更优选高于10
‑9m的k
d
结合sirpβ
1v1
，如在25℃下使用如seq id no：53所示的人sirpβ
1v1
胞外结构域通过spr(优选地通过biacore
tm
)所分析的。这些测定在实施例中被描述或提及。
[0097]
作为替代地或与前述实施方案中的任一个组合，在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其中：(a)所述抗体的重链可变结构域包含4个重链框架区hfr1至hfr4，和3个互补决定区hcdr1至hcdr3，其以hfr1
‑
hcdr1
‑
hfr2
‑
hcdr2
‑
hfr3
‑
hcdr3
‑
hfr4的顺序有效地连接，其中每个重链框架区与seq id no：1、3至6、8、10至15中任一个的框架氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或优选具有100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：1、3至6、8、10至15中任一个的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；以及(b)所述抗体的轻链可变结构域包含4个轻链框架区lfr1至lfr4，和3个互补决定区lcdr1至lcdr3，其以lfr1
‑
lcdr1
‑
lfr2
‑
lcdr2
‑
lfr3
‑
lcdr3
‑
lfr4的顺序有效地连接，其中每个轻链框架区与seq id no：2、7或9中任一个的框架氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或优选具有100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：2、7或9中任一个的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换。在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其中：(a)所述抗体的重链可变结构域包含4个重链框架区hfr1至hfr4，和3个互补决定区hcdr1至hcdr3，其以hfr1
‑
hcdr1
‑
hfr2
‑
hcdr2
‑
hfr3
‑
hcdr3
‑
hfr4的顺序有效地连接，其中每个重链框架区与seq id no：8的框架氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或优选具有100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：8的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；并且(b)所述抗体的轻链可变结构域包含4个轻链框架区lfr1至lfr4，和3个互补决定区lcdr1至lcdr3，其以lfr1
‑
lcdr1
‑
lfr2
‑
lcdr2
‑
lfr3
‑
lcdr3
‑
lfr4的顺序有效地连接，其中每个轻链框架区与seq id no：9的框架氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或优选具有100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：9的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换。
[0098]
优选地，存在于重链可变结构域的fr1、fr2、fr3和fr4的每个位置(根据kabat编号)处的氨基酸残基如表8至11中分别对于fr1、fr2、fr3和fr4，或其保守氨基酸替换所示，以及存在于轻链可变结构域的fr1、fr2、fr4的每个位置(根据kabat编号)处的氨基酸残基优选地如表12至14中分别对于fr1、fr2和fr4，或其保守氨基酸替换所示。然而，更优选地，对于框架区内任何位置的框架氨基酸残基选自表8至14中相应位置所示的氨基酸残基。
[0099]
根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段，优选地包含选自以下的hcdr、lcdr以及重链和轻链框架区：(a)hcdr1包含seq id no：36；hcdr2包含seq id no：44；hcdr3包含seq id no：45；lcdr1包含seq id no：39；lcdr2包含seq id no：40；lcdr3包含seq id no：41；hfr1至hfr4与seq id no：8的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选
100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：8的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；lfr1至lfr4与seq id no：9的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：9的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换；(b)hcdr1包含seq id no：30；hcdr2包含seq id no：31；hcdr3包含seq id no：32；lcdr1包含seq id no：33；lcdr2包含seq id no：34；lcdr3包含seq id no：35；hfr1至hfr4与seq id no：1、3、4、5、14或15中任一个的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：1、3、4、5、14或15中任一个的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；lfr1至lfr4与seq id no：2的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：2的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换；(c)hcdr1包含seq id no：36；hcdr2包含seq id no：37；hcdr3包含seq id no：38；lcdr1包含seq id no：39；lcdr2包含seq id no：40；lcdr3包含seq id no：46；hfr1至hfr4与seq id no：6或13的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：6或13的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；lfr1至lfr4与seq id no：7的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：7的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换；(d)hcdr1包含seq id no：36；hcdr2包含seq id no：37；hcdr3包含seq id no：38；lcdr1包含seq id no：39；lcdr2包含seq id no：40；lcdr3包含seq id no：41；hfr1至hfr4与seq id no：6、10或11的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：6、10或11的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；lfr1至lfr4与seq id no：9的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：9的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换；以及(e)hcdr1包含seq id no：36；hcdr2包含seq id no：42；hcdr3包含seq id no：43；lcdr1包含seq id no：39；lcdr2包含seq id no：40；lcdr3包含seq id no：41；hfr1至hfr4与seq id no：12的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：12的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；lfr1至lfr4与seq id no：9的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中
lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：9的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换。更优选地，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含seq id no：36的hcdr1；包含seq id no：44的hcdr2；包含seq id no：45的hcdr3；包含seq id no：39的lcdr1；包含seq id no：40的lcdr2；和包含seq id no：41的lcdr3；其中(i)hfr1至hfr4与seq id no：8的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中hfr1至hfr4与seq id no：8的不同之处在于一个或更多个如表8至11中所限定的氨基酸替换；并且(ii)lfr1至lfr4与seq id no：9的框架氨基酸序列具有至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％或最优选100％的氨基酸同一性，或者其中lfr1、lfr2和/或lfr4与seq id no：9的不同之处在于一个或更多个如表12至14中所限定的氨基酸替换。
[0100]
作为替代地或与前述实施方案组合，在一个优选实施方案中，框架替换限于表8至14中提供的残基。因此，优选的是在构架区内的其他位置处不进行替换，并且还优选的是替换限于表8至14中所示的残基或其保守氨基酸替换。
[0101]
作为替代地或与前述实施方案组合，在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段包含选自以下的hcvr和lcvr：(a)seq id no：8的hcvr氨基酸序列；seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(b)seq id no：1的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(c)seq id no：3的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(d)seq id no：4的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(e)seq id no：5的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(f)seq id no：6的hcvr氨基酸序列；seq id no：7的lcvr氨基酸序列；(g)seq id no：10的hcvr氨基酸序列；seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(h)seq id no：6的hcvr氨基酸序列；seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(i)seq id no：11的hcvr氨基酸序列；seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(j)seq id no：12的hcvr氨基酸序列；seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(k)seq id no：13的hcvr氨基酸序列；seq id no：7的lcvr氨基酸序列；(1)seq id no：14的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列；以及(m)seq id no：15的hcvr氨基酸序列；seq id no：2的lcvr氨基酸序列。更优选地，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段包含选自以下的hcvr和lcvr：(a)seq id no：8的hcvr氨基酸序列和seq id no：9的lcvr氨基酸序列；(b)seq id no：1的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(c)seq id no：3的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(d)seq id no：4的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(e)seq id no：5的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列；(f)seq id no：14的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列；以及(g)seq id no：15的hcvr氨基酸序列和seq id no：2的lcvr氨基酸序列。最优选地，根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段包含seq id no：8的hcvr氨基酸序列和seq id no：9的lcvr氨基酸序列。
[0102]
根据本发明的抗体除了与人(hu)sirpα
bit
和(hu)sirpα1结合之外，还可与食蟹猴(cy)sirpα结合，使得能够在相关动物模型中进行体内研究。不排除根据本发明的抗体对来自其他物种的sirpα的亲和力。
[0103]
不希望受任何理论束缚，认为根据本发明的抗体或其抗原结合片段可通过以下之一起作用。本发明的抗体可与cd47结合的相同位点结合，阻止cd47结合sirpα并因此抑制负
调节免疫效应细胞的fc受体依赖性作用的信号传导。
[0104]
根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段优选地比已知的抗sirpα抗体更具特异性，并且针对人sirpα
bit
和人sirpα1二者均显示出优异的亲和力，同时其对人sirpγ具有降低的、更优选低的亲和力，甚至更优选无可检测的亲和力，优选地如根据实施例使用人cd3
+
t细胞染色所测量的。
[0105]
在一些实施方案中，本发明的抗sirpα抗体包含轻链和/或重链抗体恒定区。可使用本领域已知的任何抗体恒定区。轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
[0106]
在一个具体实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的fc区。这样的抗sirpα抗体可适用于sirpα阳性肿瘤(优选肾细胞癌或黑素瘤)的单一治疗，因为其可诱导adcc和/或adcp(yanagita et al.jci insight 2017，2(1)，e89140)。不希望受任何理论束缚，认为这样的抗体对癌细胞的破坏至少部分地通过adcc发生。人免疫效应细胞具有多种活化fc受体，其在连接之后触发吞噬作用、胞啃作用(trogoptosis)、穿孔素和颗粒酶释放、细胞因子释放、adcc、adcp、adap和/或其他机制。这些受体的一些实例是fcγ受体，例如fcγri(cd64)、fcγrha(cd32a)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)、fcγriic(cd32c)和fcα受体fcαri(cd89)。多种天然抗体同种型与多种这些受体结合。例如igg1与fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia、fcγriiib结合；igg2与fcγriia、fcγriic、fcγriiia结合；igg3与fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia、fcγriiib结合；igg4与fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia结合；以及iga与fcαri结合。
[0107]
在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体包含iga或igg同种型的fc区。更优选的是包含igg1、igg2、igg3或igg4同种型的fc区的抗sirpα抗体；甚至更优选igg1、igg2或igg4同种型。最优选的是包含优选地如seq id no：24所示的igg1同种型的fc区的抗sirpα抗体。
[0108]
尽管包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的fc区的抗sirpα抗体适合于以用治疗性抗体的组合治疗来治疗表达cd47的癌症，但与包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的人fc区的治疗性抗体(曲妥珠单抗)(即能够诱导adcc和/或adcp的抗体)组合的嵌合抗sirpαigg1抗体的体外adcc实验未显示出adcc的提高，如基于使用鼠抗体的早期结果所预期的(图2)。不希望受任何理论束缚，认为对于抗sirpα抗体可发生kurlander效应(kurlander j immunol 1983，131(1)，140
‑
147)，该抗sirpα抗体可与治疗性抗体(在该情况下是曲妥珠单抗)竞争与免疫效应细胞(在该情况下是中性粒细胞)上的活化fc受体的结合。因此，抗sirpα的fc尾可与相关吞噬作用免疫效应细胞(例如粒细胞、巨噬细胞或树突细胞)上的fc受体顺式结合，从而降低或防止adcc和/或adcp和/或adap。因此，显示降低抗sirpα抗体的fc区与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体的结合(例如通过修饰fc尾)改善治疗性抗体(曲妥珠单抗)的adcc(图2)。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及抗sirpα抗体，所述抗sirpα抗体表现出与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体的结合降低和/或对其具有低亲和力，并且可有利地用于与治疗性抗体组合治疗，如在“本
发明的抗体或其片段的用途”部分中进一步说明的。这样的抗sirpα抗体可包含对fc受体具有低亲和力的天然fc区，例如如igg4或igg2fc，或者这样的抗sirpα抗体可包含经修饰fc区，其中当与相似的未经修饰fc区相比时，一个或更多个氨基酸已被其他氨基酸所替换。或者，酶促去糖基化降低fc与fcγ受体的结合，而无需氨基酸突变。在该上下文中，结合降低意味着包含经修饰fc区的抗sirpα抗体对活化fc受体的亲和力小于具有包含相似的未经修饰fc区的相同可变区的抗sirpα抗体的亲和力。优选地，亲和力降低至少2倍，优选至少3倍，优选至少4倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少50倍，优选至少100倍，优选至少1000倍。抗体对活化fc受体的结合亲和力通常使用spr或流式细胞术使用本领域已知的方法，例如harrison et al.in j.pharm.biomed.anal.2012，63，23
‑
28的方法来测量。与治疗性抗体组合的表现出与人fcα或fcγ受体的结合降低或者对其具有低亲和力的抗sirpα抗体通过提高免疫效应细胞的adcc和/或adcp和/或adap而在癌细胞的细胞破坏方面尤其有效。通常，根据本发明的抗sirpα抗体的fc区被修饰以降低与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体的结合。
[0109]
在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体包含经修饰fc区，其表现出与人fcα或fcγ受体的结合降低或者对人fcα或fcγ受体具有低亲和力，优选不与人fcα或fcγ受体结合。例如，igg1与fcγ受体的结合可通过替换选自以下的一个或更多个igg1氨基酸来降低：l234、l235、g237、d265、d270、n297、a327、p328和p329(eu编号)；igg2结合可通过引入例如以下氨基酸替换中的一个或更多个来降低：v234a、g237a、p238s、h268a、v309l、a330s和/或p331s；或者h268q、v309l、a330s和/或p331s(与igg1eu编号类似的编号)(vafa et al.methods 2014，65，114
‑
126)；igg3结合可通过引入例如氨基酸替换l234a和l235a，或氨基酸替换l234a、l235a和p331s来降低(leoh et al.mol.immunol.2015，67，407
‑
415)；以及igg4结合可通过引入例如氨基酸替换s228p、f234a和/或l235a(与igg1eu编号类似的编号)来降低(parekh et al.mabs 2012，4(3)，310
‑
318)。iga与fcα受体的结合可通过引入例如以下氨基酸替换中的一个或更多个来降低：l257r、p440a、a442r、f443r和/或p440r(序列编号，pleass et al.j.biol.chem.1999，271(33)，23508
‑
23514)。
[0110]
优选地，根据本发明的抗sirpα抗体包含经修饰fc区，其与包含野生型fc区的相同抗sirpα抗体相比，表现出与人fcα或fcγ受体的结合降低或者对人fcα或fcγ受体具有低亲和力，优选不与人fcα或fcγ受体结合。更优选地，经修饰fc区是igg同种型的fc区。甚至更优选地，经修饰fc区是igg1、igg2或igg4同种型的fc区。在一个优选实施方案中，根据本发明的抗sirpα抗体包含经修饰人igg1fc区，其在选自以下的一个或更多个位置处包含一个或更多个氨基酸替换：l234、l235、g237、d265、d270、n297、a327、p328和p329(eu编号)。
[0111]
在一个优选实施方案中，本发明的抗sirpα抗体包含经修饰人igg1fc区，其包含选自以下的一个或更多个氨基酸替换：l234a、l234e、l235a、g237a、d265a、d265e、d265n、d270a、d270e、d270n、n297a、n297g、a327q、p328a、p329a和p329g。更优选地，所述一个或更多个氨基酸替换选自l234a、l234e、l235a、g237a、d265a、d265e、d265n、n297a、p328a、p329a和p329g。或者优选地，所述一个或更多个氨基酸替换选自l234a、l234e、l235a、g237a、d265a、d265e、d265n、d270a、d270e、d270n、a327q、p328a、p329a和p329g。甚至更优选地，本发明的抗sirpα抗体包含经修饰人igg1fc区，其包含选自以下的一个或更多个氨基酸替换：l234a、l234e、l235a、g237a、d265a、d265e、d265n、p328a、p329a和p329g。在一个优选实施方
案中，所述经修饰人igg1fc区包含氨基酸替换：(i)l234a和l235a；(ii)l234e和l235a；(iii)l234a、l235a和p329a；或(iv)l234a、l235a和p329g。更优选地，所述经修饰人igg1fc区包含氨基酸替换：(i)l234a和l235a；或(ii)l234e和l235a。最优选地，所述经修饰人igg1fc区包含氨基酸替换l234a和l235a。与任一前述实施方案组合，在一个优选实施方案中，所述经修饰fc igg1区不包含氨基酸替换n297a或n297g。更优选地，所述经修饰fc igg1区在n297位不包含氨基酸替换。因此，优选的是在根据eu编号的297位的氨基酸残基是天冬酰胺。根据该实施方案的抗sirpα抗体优选地包含如seq id no：25所示的igg1基因型的经修饰fc区(在117和118位显示出具有l234a和l235a突变)。
[0112]
本发明的抗体或其片段的产生和纯化
[0113]
本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段可通过许多常规技术中的任一种制备。其通常将使用本领域已知的任何技术在重组表达系统中产生。参见例如shukla and(trends in biotechnol.2010，28(5)，253
‑
261)，harlow and lane.antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny，1988，以及sambrook and russell.molecular cloning：a laboratory manual，3rd edition，cold spring harbor laboratory，cold spring harbor laboratory press，ny，2001。本领域已知的任何表达系统均可用于制备本发明的重组多肽。一般而言，将宿主细胞用包含编码期望多肽的dna的重组表达载体来转化。
[0114]
在一个方面中，本发明因此涉及包含编码本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的核酸分子。一个核苷酸序列编码包含至少本发明抗sirpα抗体轻链可变结构域的多肽；另一核苷酸序列编码包含至少本发明抗sirpα抗体重链可变结构域的多肽。因此，在一个优选实施方案中，核酸分子包含编码所述抗体的hcvr和lcvr中至少一个的核苷酸序列。优选的核酸分子是表达载体，其中编码本发明的抗体多肽的核苷酸序列与表达调控序列，例如如启动子和前导序列(也称为信号肽、信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽或前导肽)有效地连接，用于在宿主细胞中表达所述编码核苷酸序列。对于重链的优选前导序列在seq id no：28中示出。对于轻链的优选前导序列在seq id no：29中示出。用于本发明的另一种合适的前导序列在seq id no：27中示出。
[0115]
在另一个方面中，本发明涉及包含如在本部分的上文所限定的核酸分子的宿主细胞。细胞优选地是分离的细胞或培养的细胞。在可使用的宿主细胞中有原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(escherichia coli)或杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物来源细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的一些实例包括中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，cho)细胞、猴肾细胞的cos
‑
7系(gluzman et al.cell 1981，23，175)、人胚肾(human embryonic kidney，hek)293细胞、l细胞、c127细胞、3t3细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(baby hamster kidney，bhk)细胞系和来源于非洲绿猴肾细胞系cvi的cvi/ebna细胞系，如mcmahan et al.embo j.1991，10，2821所述。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体例如由pouwels et al(cloning vectors：a laboratory manual，elsevier，new york，1985)所述。
[0116]
转化的细胞可在促进多肽表达的条件下培养。因此，在一个方面中，本发明涉及用于产生本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：在有益于
多肽表达的条件下培养包含至少一种如本文中所限定的表达载体的细胞，以及任选地回收多肽。
[0117]
根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段可通过常规蛋白质纯化操作来回收，所述常规蛋白质纯化操作包括例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱(例如如蛋白a
‑
琼脂糖、蛋白g
‑
琼脂糖)、离子交换色谱(例如如阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式)或疏水相互作用色谱(参见例如low et al.j.chromatography b 2007，848，48
‑
63；shukla et al.j.chromatography b 2007，848，28
‑
39)。亲和色谱包括使用captureselect
tm
配体的亲和色谱，其提供基于骆驼科来源单结构域(vhh)抗体片段的独特亲和纯化溶液(参见例如eifler et al.biotechnology progress 2014，30(6)，1311
‑
1318)。考虑用于本文中的多肽包括基本上不含污染性内源物质的基本上均质的重组抗sirpα抗体多肽。
[0118]
考虑了本发明的抗sirpα抗体或抗原结合片段的氨基酸序列修饰。例如，可期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入到编码抗体的核酸中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或替换。进行缺失、插入和替换的任何组合以实现最终构建体，前提是最终构建体具有所期望的特征。氨基酸变化还可改变抗体或其抗原结合片段的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
[0119]
氨基酸序列插入包括长度为一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的一些实例包括具有n端甲硫氨酰基残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体或其抗原结合片段的另外的插入变体包括与提高抗体或抗原结合片段的血清半衰期的酶或多肽的融合。
[0120]
另一种类型的变体是氨基酸替换变体。这些变体在抗体或其抗原结合片段中具有至少一个氨基酸残基被不同的残基替代。抗体或其抗原结合片段的这样的替换诱变包括如上所述的fr改变以及如上所述的降低fc区与fc受体的结合以防止受体活化的改变。
[0121]
抗体的另一种类型的氨基酸变体改变了抗体或其抗原结合片段的原始糖基化模式。改变意指缺失在抗体或其抗原结合片段中发现的一个或更多个碳水化合物部分，和/或添加一个或更多个不存在于抗体或其抗原结合片段中的糖基化位点。多肽的糖基化通常是n
‑
连接或o
‑
连接。n
‑
连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺
‑
x
‑
丝氨酸和天冬酰胺
‑
x
‑
苏氨酸(其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是对于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中任何这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。o
‑
连接的糖基化是指将单糖或单糖衍生物n
‑
乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接到羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5
‑
羟基脯氨酸或5
‑
羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列来方便地实现向抗体添加糖基化位点(对于n
‑
连接的糖基化位点)。还可通过向原始抗体序列添加或将原始抗体序列替换为一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于o
‑
连接的糖基化位点)。编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)，或通过对所述抗体或其抗原结合片段的较早制备的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导(或定点)诱变、pcr诱变以及盒式诱变来制备。
[0122]
包含本发明的抗体或其片段的组合物
[0123]
在另一方面中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段、或其药物衍生物或前药，以及一种或更多种可药用赋形剂，例如如可药用载体、辅料或载剂。优选地，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段以及可药用赋形剂。
[0124]
这样的药物组合物用于向对象施用。根据本发明的药物组合物可通过向有此需要的对象施用有效量的组合物来用于下文所述的治疗方法中。本文中使用的术语“对象”是指归类为哺乳动物的所有动物，并且包括但不限于灵长类和人。对象优选地是人。
[0125]
本文中使用的术语“可药用赋形剂”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸附延迟剂等(参见例如handbook of pharmaceutical excipients，rowe et al.eds.7th edition，2012，www.pharmpress.com)。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。可接受的赋形剂(包括载体或稳定剂)在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和另一些碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，例如钠；金属复合物(例如，zn
‑
蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨酯(例如tween
tm
)、泊洛沙姆(例如pluronics
tm
)、羟丙基
‑
β
‑
环糊精或聚乙二醇(peg)。
[0126]
补充的活性化合物也可并入到本发明的药物组合物中。因此，在一个具体实施方案中，对于所治疗的特定适应证，本发明的药物组合物在必要时还可包含多于一种活性化合物，优选具有不会彼此产生不利影响的互补活性的那些。这样的其他活性剂的有效量尤其取决于药物组合物中存在的本发明抗sirpα抗体或其抗原结合片段的量、疾病或病症或治疗的类型等。
[0127]
在一个实施方案中，本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段与保护所述化合物免于从身体中迅速消除的载体一起制备，所述载体例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统，例如脂质体。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对本领域技术人员来说将是明显的。脂质体悬浮液，包括靶向脂质体也可用作可药用载体。这些可根据本领域技术人员已知的，例如如美国专利no.4,522,811或wo2010/095940中所述的方法来制备。
[0128]
本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段的施用途径可以是经口、肠胃外、通过吸入或表面。本文中使用的术语“肠胃外”包括静脉内、动脉内、淋巴管内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。优选静脉内形式的肠胃外施用。“全身施用”意指经口、静脉内、腹膜内和肌内施用。当然，对于治疗或预防作用所需的抗体量将随所选抗体、所治疗病症的性质和严重程度以及对象而变化。另外，抗体可通过脉输注例如用降低剂量的抗体适当地施用。优选
and peptide therapy in autoimmune diseases，marcel dekker，new york，n.y.；baert et al.(2003)new engl.j.med.1999，348，601
‑
608；milgrom et al.new engl.j.med.1999，341，1966
‑
1973；slamon et al.new engl.j.med.2001，344，783
‑
792；beniaminovitz et al.new engl.j.med.2000，342，613
‑
619；ghosh et al.new engl.j.med.2003，348，24
‑
32；lipsky et al.new engl.j.med.2000，343，1594
‑
1602)。
[0135]
适当剂量的确定由临床医师进行，例如使用本领域已知或怀疑会影响治疗或者预测会影响治疗的参数或因素。通常来说，剂量以略低于最佳剂量的量开始，并且此后以小增量提高，此后直到相对于任何负面副作用实现期望的或最佳的作用。重要的诊断措施包括例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平的症状的那些。抗体或抗体片段可通过连续输注或者通过以例如1天、1周或每周1至7次的间隔的剂量来施用。或者，抗体或抗体片段可每天一次、每隔一天、每周2至3次、每2周一次、每3周一次、每6周一次来施用。优选的剂量方案是涉及避免显著不期望副作用的最大剂量或剂量频率的方案。总的或平均每周剂量一般地为至少0.05μg/kg体重，更一般地为至少0.2μg/kg，最一般地为至少0.5μg/kg，通常为至少1μg/kg，更通常为至少10μg/kg，最通常为至少100μg/kg，优选为至少0.2mg/kg，更优选为至少1.0mg/kg，最优选为至少2.0mg/kg，最佳地为至少10mg/kg，更最佳地为至少25mg/kg，并且最最佳地为至少50mg/kg(参见，例如，yang et al.new engl.j.med.2003 349，427
‑
434；herold et al.new engl.j.med.2002，346，1692
‑
1698；liu et al.j.neurol.neurosurg.psych.1999，67，451
‑
456；portielje et al.cancer immunol.immunother.2003，52，133
‑
144)。优选地，总的或平均每周剂量为0.001至100mg/kg体重，优选约0.01至约50mg/kg体重，优选约0.05至约30mg/kg体重，最优选约0.1至10mg/kg体重。
[0136]
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
[0137]
本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段优选地与如将在以下部分中更详细描述的治疗性抗体组合使用，并且可与其他药物组合使用。治疗性抗体可形成相同组合物的一部分，或作为单独的组合物提供以用于在同一时间或在不同时间施用。作为替代地或与前述实施方案的任一个组合，任何其他药物可形成相同组合物的一部分，或作为单独的组合物提供以用于在同一时间或在不同时间施用。
[0138]
优选地，本发明的药物组合物为冻干饼(冻干粉)的形式，其需要在静脉内施用之前(水性)溶解(即重构)，或者为冷冻(水性)溶液的形式，其需要在施用之前解冻。最优选地，药物组合物为冻干饼的形式。用于包含在根据本发明的药物组合物中(冷冻干燥之前)中的合适的可药用赋形剂包括缓冲剂溶液(例如在水中包含盐的柠檬酸、乙酸、组氨酸或琥珀酸)、冻干保护剂(例如蔗糖、海藻糖)、张力调节剂(例如氯化钠)、表面活性剂(例如聚山梨酯或羟丙基
‑
β
‑
环糊精)和填充剂(例如甘露醇、甘氨酸)。用于经冷冻干燥的蛋白质制剂的赋形剂针对其在冷冻干燥过程期间以及在储存期间防止蛋白质变性的能力来选择。
[0139]
本发明的抗体或其片段的用途
[0140]
本发明的抗sirpα抗体、其抗原结合片段和药物组合物将可用于治疗其中sirpα表达或sirpα和cd47表达，优选过表达的疾病、病症和适应证，特别是用于治疗表达cd47的癌症。
[0141]
因此，在另一方面中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物，其用作药物。
[0142]
在另一方面中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物，其用于治疗癌症，优选地用于治疗表达cd47的癌症。
[0143]
已发现cd47在数种人肿瘤类型中表达，包括急性髓性白血病(aml)；乳腺癌；慢性髓性白血病(cml)；慢性淋巴性白血病(cll)；急性淋巴细胞白血病(all)；非霍奇金淋巴瘤(nhl)，包括滤泡性淋巴瘤(fl)和弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)；肝细胞癌；多发性骨髓瘤(mm)；膀胱癌；结肠癌；胃癌；卵巢癌；头颈癌；神经母细胞瘤；黑素瘤；骨肉瘤；胰腺癌；肾癌；前列腺癌；肝细胞癌；肺癌和其他实体瘤(chao et al.curr opin immunol.2012，24(2)，225
‑
232；chao et al.cell 2010，142(5)，699
‑
713；et al.mol cancer ther.2018)。已观察到这些肿瘤中的数种肿瘤与其正常细胞对应物相比表达提高(russ et al.blood rev.2018，doi：10.1016/j.blre.2018.04.005)。已假设
‑
与其他假设的cd47机制一起——肿瘤细胞中的cd47上调使肿瘤能够通过逃避吞噬作用来逃避固有免疫系统的监视(chao et al.curr opin immunol.2012，24(2)，225
‑
232)。
[0144]
有趣的是，yanagita et al.报道了人肾细胞癌和黑素瘤高表达sirpα(yanagita et al.jci insight 2017，2(1)，e89140)。另外，在一些神经母细胞瘤细胞上和急性髓性白血病(aml)中也已发现了sirpα表达。sosale et al.报道了肺癌和胶质母细胞瘤中的sirpα表达(sosale et al.mol.ther.methods clin.dev.2016，3，16080)。chen et al.报道了星形细胞瘤和胶质母细胞瘤上的sirpα表达(chen et al.cancer res 2004，64(1)，117
‑
127)。间皮瘤和b细胞淋巴瘤也可以是sirpα阳性。因此，在另一方面中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物，其用于治疗其中sirpα表达的疾病、病症或适应证，特别是用于治疗表达sirpα的癌症，例如如人肾细胞癌和黑素瘤，以及用于自身免疫病，例如如类风湿性关节炎、多发性硬化和或者肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis，gpa)、显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis，mpa)和寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris，pv)。抗sirpα抗体还可提高另一种抗体在疾病中的效力，无论该后一种抗体是用于耗尽病原细胞还是受感染细胞。对于表达sirpα的肿瘤，包含野生型人fc的本发明的抗sirpα抗体可适合作为单一治疗。在一个实施方案中，本发明涉及包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的fc区的抗sirpα抗体，其用于治疗sirpα阳性人实体瘤和恶性血液病，优选肾细胞癌或恶性黑素瘤。优选地，与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的fc区是iga或igg同种型。更优选的是包含igg1、igg2、igg3或igg4同种型的fc区的抗sirpα抗体；甚至更优选的是igg1、igg2或igg4同种型。最优选的是包含igg1同种型的fc区的抗sirpα抗体。
[0145]
如上所述，其中优选地fc效应功能被部分或完全破坏的本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段可用于改善治疗性抗体的效应功能——例如如提高adcc。优选地，用本发明的这样的抗体或其抗原结合片段和治疗性抗体进行治疗的癌症不表达sirpα。这样的治疗方法优选地与一种或更多种另外的抗癌治疗组合。发现使用中性粒细胞作为效应细胞，包含经修饰fc区的抗sirpα抗体增强治疗性抗体的体外adcc，所述抗sirpα抗体当与包含野生型fc区的相同抗sirpα抗体相比时表现出与人fcα或fcγ受体的结合降低，如上文所述。使用杂合sirpα1/sirpα
bit
供体的中性粒细胞，实施例中提供的抗体1至13显示出体外adcc剂量依赖性提高。优选的抗体是使用中性粒细胞将体外adcc提高到最佳程度同时优选地使用t细胞增殖测定和/或il
‑
2elispot在体外不显示免疫原性迹象的抗体。最优选的是抗体1
至6、12和13，优选抗体6。
[0146]
优选地，治疗性抗体是由药品监管当局，例如欧洲药品管理局(ema)或食品和药物管理局(fda)批准的抗体。可查阅大多数监管当局的在线数据库以确定抗体是否获得批准。
[0147]
通常，与根据本发明的抗sirpα抗体(优选地具有与其fc区降低的结合)或其抗原结合片段组合使用的治疗性抗体是与选自以下的靶标结合的单特异性或双特异性抗体或者包含hcvr和lcvr中至少一个的抗体片段：膜联蛋白al、amhr2、axl、bcma、b7h3、b7h4、ca6、ca9、ca15
‑
3、ca19
‑
9、ca27
‑
29、ca125、ca242、ccr2、ccr4、ccr5、cd2、cd4、cd16、cd19、cd20、cd22、cd27、cd30、cd33、cd37、cd38、cd40、cd44、cd47、cd52、cd56、cd70、cd74、cd79、cd98、cd115、cd123、cd138、cd203c、cd303、cd333、cea、ceacam、clca
‑
1、cll
‑
1、c
‑
met、cripto、ctla
‑
4、dll3、egfl、egfr、epcam、eph(例如epha2或ephb3)、内皮素b受体(endothelin b receptor，etbr)、fap、fcrl5(cd307)、fgf、fgfr(例如fgfr3)、folr1、岩藻糖基
‑
gm1、gcc、gd2、gpnmb、gp100、her2、her3、hmw
‑
maa、整合素α(例如αvβ3和αvβ5)、igf1r、il1rap、κ骨髓瘤抗原、tm4sf1(或l6抗原)、路易斯a样碳水化合物、路易斯x、路易斯y、liv1、间皮素、muc1、muc16、napi2b、连接蛋白
‑
4、pd
‑
1、pd
‑
l1、催乳素受体、psma、ptk7、slc44a4、steap
‑
1、5t4抗原(或tpbg，滋养层糖蛋白(trophoblast glycoprotein))、tf(组织因子(tissue factor))、thomsen
‑
friedenreich抗原(tf
‑
ag)、tag72、tnf、tnfr、trop2、vegf、vegfr和vla。
[0148]
表达这样的靶标的癌症的一些非限制性实例是：(her2阳性)乳腺癌、(egfr阳性)结肠癌、(gd2阳性)神经母细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤、(cd20阳性)b细胞淋巴瘤、(cd38阳性)多发性骨髓瘤(cd52阳性)淋巴瘤和(cd33阳性)急性髓性白血病(aml)。
[0149]
优选的是单特异性治疗性抗体。更优选的是针对肿瘤细胞表面上的膜结合靶标的治疗性抗体。
[0150]
在一个优选实施方案中，针对肿瘤细胞表面上的膜结合靶标的治疗性抗体包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的人fc区。包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的人fc区的治疗性抗体通过与上文所述的这些活化fc受体结合，可诱导adcc和/或adcp。人igg、ige或iga同种型的治疗性抗体包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的人fc区。
[0151]
根据本发明使用的优选治疗性抗体是igg或iga同种型的治疗性抗体。更优选的是igg同种型的治疗性抗体，例如igg1、igg2、igg3和igg4抗体。甚至更优选的是igg1或igg2同种型的治疗性抗体。最优选的是igg1同种型的治疗性抗体。
[0152]
与根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段组合使用的合适的治疗性抗体包括阿仑单抗(alemtuzumab)(例如在多发性硬化的治疗中)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(例如在cll、fl的治疗中)、ofatuzumab(例如在mm的治疗中)、达雷木单抗(daratumumab)(例如在mm的治疗中)、曲妥珠单抗(例如在过表达her
‑
2的乳腺癌、胃癌、胃食管交界处腺癌的治疗中)、地努图希单抗(dinutuximab)(例如在儿科患者神经母细胞瘤的治疗中)、帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(例如在头颈癌、结直肠癌的治疗中)、利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)(例如在nhl、cll、fl、dlbcl的治疗中)、乌妥昔单抗(ublituximab)、马格妥昔单抗(margetuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、替伊莫单抗
(ibritumomab)、ifabotuzumab、法勒珠单抗(farletuzumab)、otiertuzumab、卡罗妥昔单抗(carotuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、英比利珠单抗(inebilizumab)、卢姆珠单抗(lumretuzumab)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、leukotuximab、伊沙妥昔单抗(isatuximab)、莫奥珠单抗(oportuzumab)、恩司昔单抗(ensituximab)、西米普利单抗(cemiplimab)、纳武单抗、派姆单抗、度伐单抗、阿维单抗、阿特珠单抗、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、西米普利单抗(cemiplimab)。这样的治疗性抗体也可作为抗体
‑
药物缀合物(antibody
‑
drug conjugate，adc)的一部分提供。与根据本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段组合使用的合适的adc包括但不限于曲妥珠单抗duocarmazine、曲妥珠单抗deruxtecan、曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、奥英妥珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、波妥珠单抗维多丁(polatuzumab veuxtimacin)、那妥昔单抗美坦新(naratuximab emtansine)、替伊莫单抗tiuxetan和本妥昔单抗维多丁(brentuximab vedotin)。
[0153]
本发明的抗体或其抗原结合片段和治疗性抗体可在同一制剂中或可在不同的制剂中施用。施用可以是同时的或顺序的，并且以任一顺序都可以是有效的。
[0154]
因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段，其用于与包含与存在于人免疫效应细胞上的活化fc受体结合的人fc区的针对肿瘤细胞表面上的膜结合靶标的治疗性抗体组合用于治疗人实体瘤和恶性血液病，其中所述抗sirpα抗体包含经修饰fc区，当其与包含野生型fc区的相同抗sirpα抗体相比时表现出与人fcα或fcγ受体的结合降低，优选在选自以下的位置处包含一个或更多个氨基酸替换的经修饰人igg1fc区：l234、l235、g237、d265、d270、n297、a327、p328和p329(eu编号)。
[0155]
作为替代地或与任何其他实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物用于制备用于治疗其中cd47表达(优选过表达)的疾病、病症或适应证，特别是用于治疗癌症的药物的用途。对于根据本发明待治疗的说明性、非限制性癌症：参见上文。在一个优选实施方案中，本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物用于与如上所述的治疗性抗体同时或顺序施用。
[0156]
作为替代地或与任何其他实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物用于制备用于治疗表达sirpα的癌症，例如人肾细胞癌或黑素瘤的药物的用途。在一个优选实施方案中，本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物用于与如上所述的治疗性抗体同时或顺序施用。
[0157]
作为替代地或与任何其他实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症，特别是其中肿瘤细胞表达cd47或sirpα的癌症的方法，该方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。在一个具体实施方案中，所述癌症是特征在于肿瘤细胞表达cd47、可过表达cd47的癌症。对于根据本发明待治疗的说明性、非限制性、表达cd47的癌症：参见上文。在一个替代实施方案中，表达sirpα的癌症是人肾细胞癌或黑素瘤或神经母细胞瘤或急性髓性白血病(aml)。
[0158]
优选的是本发明的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或本发明的组合物当与治疗性
抗体组合使用时抑制表达cd47的肿瘤细胞的生长。“抑制表达cd47的肿瘤细胞的生长”或“生长抑制”是其中实现癌细胞(表达或过表达cd47)的可测量的生长抑制。如与合适的对照相比，优选的生长抑制性抗sirpα抗体将表达cd47的肿瘤细胞的生长抑制大于20％，优选约20％至约50％，并且甚至更优选大于50％(例如，约50％至约100％)，对照通常是未用待测试抗体处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，生长抑制可在细胞培养物中在约0.1至30mg/ml或约0.5nm至200nm的抗体浓度下测量，其中生长抑制在肿瘤细胞暴露于抗体之后1至10天确定。体内肿瘤细胞的生长抑制可通过多种方式确定，例如在ep2474557b1中所述。如果以约1mg/kg至约100mg/kg体重施用抗sirpα抗体导致肿瘤尺寸或肿瘤细胞增殖在自首次施用抗体之后约5天至3个月内，优选在约5至30天内降低，则该抗体在体内是生长抑制性的。
[0159]“诱导细胞死亡”的抗体是导致活细胞变得非活(non
‑
viable)的抗体。该细胞是表达cd47的细胞。可在不存在补体和免疫效应细胞的情况下测定体外细胞死亡以辨别由adcc诱导的细胞死亡。因此，可在不存在免疫效应细胞的情况下使用热灭活的血清(即，不存在补体)进行细胞死亡的测定。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，可相对于未经处理的细胞对如通过碘化丙啶(propidium iodide，pi)、台盼蓝(参见moore et al.cytotechnology 1995；17，1
‑
11)或7
‑
aad的摄取所评价的膜完整性损失进行评估，或者可对细胞生存力的损失进行评价(四唑还原、刃天青还原、蛋白酶标志物和atp检测)。
[0160]
表述“治疗有效量”意指在治疗如先前所限定的癌症方面有效的量；所述量可以是足以实现期望应答或改善例如转移性或原发性肿瘤进展、尺寸或生长的症状或体征的量。对于特定对象的治疗有效量可根据例如所治疗的病症，对象的整体健康状况，施用的方法、途径和剂量以及副作用的严重程度的因素而变化。已经描述了应答评价标准(recist；eisenhauer et al.european journal of cancer 2009；45，228
‑
247；schwartz et al.european journal of cancer 2016；62，138
‑
145；cheson et al.journal of clinical oncology 2003；21(24)，4642
‑
4649；moghbel et al.journal of nuclear medicine 2016，57(6)，928
‑
935；通过引用整体包括在内的参考文献)。优选地，该作用将导致肿瘤停滞(即没有减小而是维持现状)、病灶数量减少，或者与基线肿瘤尺寸相比，肿瘤尺寸降低至少约10％，优选至少20％、30％、50％、70％、或甚至90％或更多，优选地以基线总和直径为参考，靶病灶直径的总和降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。当组合时，治疗有效量与组分的组合成比例并且作用不限于单独的单个组分。治疗有效量将症状调节优选至少约10％；优选至少约20％；优选至少约30％；或更优选至少约50％。或者，迁移的调节意味着多种细胞类型的迁移或运输受到影响。这样将导致例如统计学上显著且可量化的受影响细胞数量变化。这可以是在一个时间段或靶区域内被吸引的靶细胞数量的减少。还可监测原发肿瘤进展、尺寸、扩散或生长的速率。
[0161]
在一个优选实施方案中，本发明涉及如上文所述的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者药物组合物，其用于与治疗性抗体组合使用并进一步与一种或更多种其他抗癌治疗组合来治疗表达cd47的疾病、病症或适应证，特别是癌症，更特别是人实体瘤或恶性血液病。合适的其他抗癌治疗包括但不限于手术、化学治疗、放射治疗、激素治疗和小分子靶向治疗，例如如血管生成抑制剂。如上文所述的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者药物组合物可与一种或更多种其他抗癌治疗组合使用用于同时或顺序用于治疗人实体瘤和恶性血
液病。特别地，如上所述的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者药物组合物可在使用一种或更多种其他抗癌治疗之后用于治疗人实体瘤和恶性血液病。
[0162]
优选地，本发明涉及如上所述的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者药物组合物，其用于与一种或更多种另外的抗癌治疗性化合物组合使用来治疗表达cd47的疾病、病症或适应证。本文中使用的“抗癌治疗性化合物”不旨在包括治疗性抗体。治疗性抗体如上文所限定。因此，优选地与如上限定的治疗性抗体组合的如上所述的抗sirpα抗体或其抗原结合片段或者药物组合物可在使用一种或更多种其他抗癌治疗性化合物之前、之后或与之同时用于治疗人实体瘤和恶性血液病。
[0163]
合适的抗癌治疗性化合物包括细胞毒剂，即抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括化学治疗剂，即可用于治疗癌症的化学化合物；放射治疗剂，例如放射性同位素；激素治疗剂；靶向治疗剂和免疫治疗剂。合适的化学治疗剂包括烷化剂，例如氮芥、亚硝基脲、四嗪类和氮丙啶类；抗代谢物类，例如抗叶酸、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫嘌呤；抗微管剂，例如长春花生物碱类和紫杉烷类；拓扑异构酶i和ii抑制剂；以及细胞毒性抗生素，例如蒽环类和博来霉素。例如，化学治疗方案可选自chop(环磷酰胺、多柔比星(也称为羟基柔红霉素)、长春新碱(也称为安可平(oncovin))和泼尼松)、ice(伊达比星、阿糖胞苷和依托泊苷)、米托蒽醌、阿糖胞苷、dvp(柔红霉素、长春新碱和泼尼松)、atra(全反式视黄酸)、伊达比星、hoelzer化学治疗方案、abvd(博来霉素、达卡巴嗪、多柔比星和长春新碱)、ceop(环磷酰胺、表柔比星、长春新碱和泼尼松龙)、2
‑
cda(2
‑
氯脱氧腺苷)、flag&ida(氟达拉滨、阿糖胞苷、非格司亭(filgastrim)和伊达比星)(具有或不具有随后的gcsf(粒细胞集落刺激因子(granulocyte
‑
colony stimulating factor))或gm
‑
csf治疗)、vad(长春新碱、多柔比星和地塞米松)、m&p(美法仑和泼尼松)、c(环磷酰胺)
‑
每周、abcm(阿霉素、博来霉素、环磷酰胺和丝裂霉素
‑
c)、mopp(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)和dhap(地塞米松、阿糖胞苷和顺铂)。优选的化学治疗方案是chop。合适的放射治疗剂包括放射性同位素，例如
131
i
‑
间碘苄胍(mibg)、
32
p作为磷酸钠、
223
ra氯化物、
89
sr氯化物和
153
sm二胺四亚甲基膦酸盐(edtmp)。用作激素治疗剂的合适药剂包括激素合成抑制剂，例如芳香酶抑制剂和gnrh类似物；以及激素受体拮抗剂，例如选择性雌激素受体调节剂和抗雄激素。本文中使用的靶向治疗剂是干扰参与肿瘤发生和增殖的特定蛋白质的治疗剂并且可以是小分子药物；或者肽或肽衍生物。靶向小分子药物的实例包括mtor抑制剂，例如依维莫司、替西罗莫司和雷帕霉素；激酶抑制剂，例如伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼；vegf抑制剂，例如索拉非尼和瑞戈非尼；以及egfr/her2抑制剂，例如吉非替尼、拉帕替尼和厄洛替尼。肽或肽衍生物靶向治疗剂的一些实例包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米和卡非佐米。免疫治疗剂包括诱导、增强或抑制免疫应答的药剂，例如细胞因子(il
‑
2和ifn
‑
α)；免疫调节性酰亚胺类药物，如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺；治疗性癌症疫苗，例如talimogene laherparepvec；基于细胞的免疫治疗剂，例如树突细胞疫苗、过继t细胞和嵌合抗原受体修饰的t细胞；或免疫毒素，例如moxetumomab pasudotox。
[0164]
上面描述的任何上述治疗方法可应用于需要这样的治疗的任何对象，包括例如哺乳动物，优选灵长类，包括例如非人灵长类，并且最优选人。
[0165]
在本文件及其权利要求书中，动词“包含/包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，意指包括在该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，除非上下文明确要
求存在一个且仅一个要素，否则通过不定冠词对要素的提及不排除存在多于一个要素的可能性。因此，未用数量词限定的名词通常是指“至少一个/种”。
[0166]
本说明书中引用的所有专利和文献参考均通过引用在此整体并入。
[0167]
提供以下实施例仅用于举例说明的目的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
[0168]
实施例
[0169]
1.抗体的瞬时表达
[0170]
a)cdna构建体和表达载体的制备
[0171]
将抗体的重链可变区(hcvr)氨基酸序列各自在n端与前导序列(对于抗体1至13为seq id no：28)连接，并在c端与根据seq id no：25的人igg1hc lala恒定结构域连接(计算机模拟)。将抗体12c4、12c4
‑
lala、29am4
‑5‑
lala或kwar23
‑
lala的hcvr氨基酸序列各自在n端与havt20前导序列(seq id no：27)连接，并在c端与根据seq id no：25的人igg1hc lala或野生型人igg1hc(seq id no：24)的恒定结构域连接。kwar23具有标准的阿达木单抗重链恒定结构域，但缺少lala突变。heflb重链是igg4，并如wo 2017/178653的seq id no：42所公开的使用。将所得氨基酸序列回译成经密码子优化以在人细胞(homo sapiens)中表达的cdna序列。类似地，通过以下获得构建体的lc(轻链可变区；lcvr)的cdna序列：将前导序列的序列(对于抗体1至13为seq id no：29，对于12c4、12c4
‑
lala、29am4
‑5‑
lala、kwar23、kwar23
‑
lala和(人源化)heflb为seq id no：27)在n端与抗体1至13、12c4、12c4
‑
lala、29am4
‑5‑
lala、kwar23、kwar23
‑
lala和(人源化)heflb的lcvr连接，并在c端与人抗体κ轻链恒定区(seq id no：26)连接。使用了根据表1a至c的hcvr和lcvr序列。抗sirpα抗体se5a5(小鼠igg1κ)从biolegend(san diego，美国；经纯化的抗人cd172a/b(sirpα/β抗体))获得。表1c中提供的比较抗sirpα抗体的cdna构建体和表达载体与表1d中提供的同种型对照以类似方法制备。
[0172]
表1a呈现了(i)包含在人源化抗sirpα抗体1至13中每一个中的重链和轻链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3氨基酸序列(seq id no)，以及(ii)包括人源化抗sirpα抗体1至13的cdr的hcvr和lcvr各自的氨基酸序列。
[0173]
[0174]
表1b呈现了对照抗体的hc和lc。
[0175]
参考抗体hc seq id no：lc seq id no：12c4(igg1)161729am4
‑5‑
lala(igg1)181912c4
‑
lala(igg1)2021kwar23
‑
lala(嵌合igg1，lala)2223kwar23(小鼠igg
2a
)4748heflb(人源化igg4)*4950
[0176]
*heflb是igg4抗体，因此重链可变结构域未与igg1骨架连接，而是与igg4fc序列连接(wo 2017/178653)。
[0177]
表1c呈现了另外的比较抗sirpα抗体的hc和lc的氨基酸序列。这些抗体选自wo2018/190719、wo2018/057669、wo2019/023347、wo2018/107058和wo01/40307。
[0178]
参考抗体hc seq id no：lc seq id no：说明1h957581h9人源化igg1‑
κ，hc
‑
n297a40a
‑
1596040avh2vl4人源化igg1‑
κ，hc
‑
n297a40a
‑
2616240avh2vl4人源化igg2‑
κ，hc
‑
a378sab3
‑
lala6364ab3鸡
‑
人嵌合igg1‑
κ，lala
[0179]
参考抗体hc seq id no：lc seq id no：说明ab25
‑
lala6566ab25人源化igg1‑
κ，lalaab115
‑
lala6768ab115人igg1‑
κ，lalaab119
‑
lala6970ab119人igg1‑
κ，lalaab136
‑
lala7172ab136人igg1‑
κ，lala3f9
‑
lala73743f9小鼠
‑
人嵌合igg1‑
κ，lala7h9
‑
lala75767h9小鼠
‑
人嵌合igg1‑
κ，lala
[0180]
所有参考抗体hc和lc序列包含seq id no：27的havt20前导序列作为前导序列。前导序列被表达并且对于转运出细胞是必需的，在此过程期间其被切下。
[0181]
表1d呈现了同种型对照抗体的列表
[0182]
参考抗体说明iso1
‑
lala人源化igg1‑
κ，lalaiso2人源化igg1‑
κ，hc
‑
n297aiso3人源化igg2‑
κ，hc
‑
a378siso4小鼠igg
2a
，wtiso5人源化igg4iso6人源化igg1[0183]
参考抗体说明iso7*经纯化小鼠igg1，κ，biolegendiso8人源化igg4‑
κ，hc
‑
s228p，l445p
[0184]
*iso7从biolegend(cat#400102)获得。
[0185]
b)载体构建和克隆策略
[0186]
为了表达抗体链，使用包含cmv：tkpa表达盒的哺乳动物表达载体(pcdna3.4；thermofisher)。将包含hc或lc表达盒的最终载体(分别为cmv：hc：tkpa和cmv：lc
‑
tkpa)转移至大肠杆菌(e.coli)neb 5
‑
α细胞并在其中扩增。使用maxi
‑
或megaprep试剂盒(qiagen)进行用于转染的最终表达载体的大规模生产。
[0187]
c)在哺乳动物细胞中的瞬时表达
[0188]
使用expifectamine转染剂根据制造商的说明如下用表达载体转染市售expi293f细胞(thermofisher)：将75x107个细胞接种在300ml forticho培养基中，将300μg表达载体与800μl expifectamine转染剂组合并添加至细胞。转染之后一天，将1.5ml增强剂1和15ml增强剂2添加至培养物。转染之后六天，通过以4,000g离心15分钟并通过pes瓶过滤器/mf75过滤器(nalgene)过滤澄清的收获物来收获细胞培养物上清液。通过亲和色谱纯化抗体。
[0189]
2.抗体结合和特异性
[0190]
实验
[0191]
表面等离子体共振(spr)测定：在25℃下在表面等离子体共振装置(biacore
tm t200系统，ge life sciences)上通过单循环动力学分析进行亲和力分析。通过以下在适用于生物素化分子的芯片(sensor chip cap，ge life sciences)表面上捕获生物素化的sirp抗原(seq id no：51至56)：在以10μl/分钟注射20
×
稀释(在运行缓冲液中)的生物素捕获试剂(ge life sciences)持续60秒之后以10μl/分钟将5μg/ml sirp抗原注射到运行缓冲液(ph 7.4的10mm hepes缓冲液，含有150mm nacl，3mm edta和0.005％v/v单月桂酸聚氧乙烯(20)山梨醇酐酯(表面活性剂p20))中持续60秒。基线稳定设置为1分钟，之后注射在运行缓冲液中的5个递增浓度的抗sirp抗体。对于每个步骤，使用150秒的结合时间，然后仅在最高浓度之后使用600秒的解离时间，全部以30μl/分钟的流量。用6m胍
‑
hcl、0.25m naoh溶液(120秒，流量为30μl/分钟)进行再生。使用非抗sirp(空白)固定的参考流道和运行缓冲液注射对观察到的传感图进行双空白减法。对于所有测试的抗sirp抗体，传感图用1∶1朗缪尔模型(langmuir model)拟合。使用biacore
tm t200评价软件(v3.1)计算动力学参数(结合速率[k
a
]、解离速率[k
d
]和结合常数，也称为平衡解离常数或结合亲和力[k
d
])。
[0192]
流式细胞术测定：将内源性表达人sirpα
bit
抗原的u937细胞(人单核细胞系)以及来源于已从表达人sirpα1、sirpα
bit
或cysirpα抗原之一的cho
‑
s中国仓鼠卵巢细胞(expicho
‑
s)中筛选并分离的未经改造亚克隆的细胞(在96孔板中100,000个细胞/孔)用含有0.1％v/w bsa(sigma
‑
aldrich，st.louis，mo)和0.02％v/w nan3(sigma
‑
aldrich)的冰冷的facs缓冲液(1
×
pbs(lonza))洗涤3次，随后添加在冰冷的facs缓冲液中稀释的浓度范围的每种第一mab(50μl/孔)。在4℃下30分钟的孵育时间之后，将细胞用冰冷的facs缓冲液洗涤3次，并且50μl/孔的第二mab(对于人抗体，添加affinipure f(ab’)2片段山羊抗人igg
‑
apc，1∶6,000稀释，jackson immuno research，而对于小鼠抗体，添加affinipure fab片段山羊抗小鼠igg(h+l)
‑
alexa fluor 488，1∶1,000稀释，jackson immuno research)。在4℃下30分钟之后，将细胞洗涤两次并重悬于150μl facs缓冲液中。通过流式细胞术(bd facsverse，franklin lakes，nj)确定荧光强度，并且对于u937细胞表示为中位荧光强度(mfi
‑
中位)，而对于expicho
‑
s细胞表示为平均荧光强度(mfi
‑
平均)。在graphpad prism(windows版本7.02，graphpad，san diego，ca)中使用具有可变斜率的s型剂量响应方程(四
个参数)，通过非线性回归拟合曲线。当使用4参数逻辑拟合时，ec
50
值计算为以μg/ml计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。
[0193]
结果
[0194]
spr测定：抗体1至13和参考抗体与人sirpα1(husirpα1)、人sirpα
bit
(husirpα
bit
)、食蟹猴sirpα(cysirpα)、人sirpγ(husirpγ)、人sirpβ
1v1
(husirpβ
1v1
)和人sirpβ1
v2
(husirpβ
1v2
)结合的k
d
(即结合常数，也称为“平衡解离常数”或“结合亲和力”)值总结在表2中。抗体1至13与husirpα
bit
和husirpα1二者结合，但不与husirpγ结合。抗体1至13中的一些，例如抗体6，偶尔显示出与sirpγ的弱缔合但具有非常低的响应单位(ru)，这显示出是无关紧要的，如以下实施例中的细胞结合实验中所示。人源化heflb仅识别husirpα
bit
变体，而不识别husirpα1和husirpγ和cysirpα。kwar23、29am4
‑
5、se5a5和12c4抗体与所有sirp变体结合，包括husirpγ。
[0195]
表2.通过spr测量的抗sirpα抗体对人sirpα1、人sirpα
bit
、人sirpγ、人sirpβ
1v1
、人sirpβ
1v2
和食蟹猴sirpα的结合亲和力(以m计的k
d
)
[0196]
[0197]
husirpα1和husirpα
bit
的k
d
值是从1，56
‑
6.25
‑
25
‑
100
‑
400ng/ml的浓度系列中获得的。cysirpα、husirpγ、husirpβ
1v1
和husirpβ
1v2
的k
d
值是从6.25
‑
25
‑
100
‑
400
‑
1600ng/ml的浓度系列中获得的。n.r.：无应答或低于计算的r
max
的10个响应单位(ru)截止值。当给出的k
d
值＜1.0e
‑
11m时，样品无法准确确定，因为亲和力超出仪器范围，或者计算的k
d
为约1.0e
‑
11m，但可看到表面饱和。＜1.0e
‑
11m的k
d
值意味着高亲和力。#意指观察到对1∶1朗缪尔模型的次优拟合。
[0198]
流式细胞术测定：通过流式细胞术确定多种抗体与细胞上表达的husirpα1、husirpα
bit
和/或cysirpα的结合。结合表示为ec
50
值，即给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应的抗体浓度(以μg/ml计)，如表3中所示。抗体1至13与husirpα
bit
(在expicho
‑
s细胞中瞬时表达或在u937细胞中内源性表达)和husirpα1结合。抗体1至4、6、12、13在低μg/ml范围内与cysirpα结合。这些抗体还以相同的ec
50
值范围(低μg/ml)与内源性表达husirpα
bit
的u937细胞结合。参考抗体kwar23、kwar23huigg1lala、12c4huigg1lala、12chuigg1、29am4
‑
5huigg1lala和heflb显示出类似的与在u937细胞上表达的husirpα
bit
的结合。heflb不与husirpα1和cysirpα结合。
[0199]
表3.抗sirpα抗体与内源性表达人sirpα
bit
的u937细胞以及与用人sirpα1、人sirpα
bit
或食蟹猴sirpα瞬时转染的expicho
‑
s细胞的细胞结合
[0200]
[0201][0202]
3.人sirpγ结合
‑
t细胞facs染色
[0203]
实验
[0204]
流式细胞术测定：使用percoll梯度从健康个体的新鲜血液中分离外周单个核细胞(pbmc)。将细胞在hepes+缓冲液(132mm nacl、6mm kcl、1mm cacl2、1mm mgso4、1.2mm磷酸钾、20mm hepes、5.5mm葡萄糖和0.5％(w/v)人血清白蛋白，ph 7.4)中洗涤并以1x106/ml的浓度重悬于facs缓冲液(pbs+人白蛋白1％缓冲液w/v、人白蛋白200g/ml，sanquin plasma products b.v.，amsterdam，荷兰)中，离心并重悬于pbs+20％正常山羊血清(normal goat
‑
serum，ngs)中。随后将细胞(96孔板中200,000个细胞/孔)在存在测试抗体的情况下或仅使用二抗(第二山羊抗人igg alexa 633f(ab’)2片段，1∶1000稀释，jackson immuno research，以及第二山羊抗小鼠igg alexa 633 f(ab’)2片段，1∶250稀释，invitrogen)的对照条件下在冰上孵育30分钟。之后，将细胞用facs缓冲液洗涤并重悬于抗人cd3 fitc抗体(1∶100稀释，invitrogen)与相应二抗(抗人或抗小鼠)的混合物中，并在黑暗中在冰上孵育30分钟。之后将细胞用facs缓冲液洗涤并重悬于150μl facs缓冲液中，并通过流式细胞术(lsrii hts或lsrfortessa，bdbiosciences，ca，美国)确定荧光强度，并将其表示为中位荧光强度(mfi
‑
中位)和阳性细胞百分比。结果
[0205]
抗体与表达sirpγ的cd3
+
t细胞的结合示于图1中(平均荧光强度(图1a)；阳性细胞百分比(图1b))。除人源化heflb之外，所有参考抗体均显示出与sirpγ的结合。抗体1至13未显示与人cd3+t细胞的结合，表明在基于细胞的环境中不与sirpγ结合。
[0206]
4.比较抗sirpα抗体的表征
[0207]
实验
[0208]
流式细胞术测定：将内源性表达人sirpα
bit
抗原的u937细胞(人单核细胞系)以及来源于已从瞬时表达人sirpα1或sirpα
bit
抗原的cho
‑
s中国仓鼠卵巢细胞(expicho
‑
s)中筛选并分离的未经改造亚克隆的细胞(在96孔板中100,000个细胞/孔)用含有0.1％v/w bsa(sigma
‑
aldrich，st.louis，mo)和0.02％v/w nan3(sigma
‑
aldrich)的冰冷的facs缓冲液(1
×
pbs(lonza))洗涤两次，随后添加在冰冷的facs缓冲液中稀释的浓度范围的每种一抗(50μl/孔)。在4℃下30分钟的孵育时间之后，将细胞用冰冷的facs缓冲液洗涤两次。然后，添加50μl/孔的第二mab(affinipure
tm f(ab’)2片段山羊抗人igg
‑
apc，1∶6,000稀释，jackson immuno research)。在4℃下30分钟之后，将细胞洗涤两次并重悬于150μl facs缓冲液中。用facsverse(bd biosciences)通过流式细胞术确定荧光强度，并且对于u937细胞表示为中位荧光强度(mfi
‑
中位)，而对于expicho
‑
s细胞表示为平均荧光强度(mfi
‑
平均)。在graphpad prism(windows版本7.02，graphpad，san diego，ca)中通过具有可变斜率(四个参数)的非线性回归拟合曲线。当使用4参数逻辑拟合时，ec
50
值计算为以μg/ml计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。
[0209]
表面等离子体共振(spr)测定：在25℃下在biacore
tm t200仪器(ge life sciences)上通过单循环动力学分析进行亲和力分析。使用生物素捕获试剂盒(ge life sciences)捕获avi标记的生物素化sirp抗原。通过注射生物素捕获试剂制备链霉亲和素表面。随后将生物素化的sirp变体注射到运行缓冲液(ph 7.4的10mm hepes缓冲液，含有150mm nacl、3mm edta和0.005％v/v表面活性剂p20)中至约40至50响应单位(ru)的捕获水平。在基线稳定1分钟之后，注射五个递增浓度的抗sirpα抗体，其中结合时间为150秒。均在30μl/分钟的流量下观察600秒的解离。在预期k
d
附近选择浓度范围。根据制造商的方案，用6m胍
‑
hcl、0.25m naoh溶液进行再生。使用(结合生物素捕获试剂的)参考流道和运行缓冲液注射对获得的传感图进行双参考减法。对于所有测试的抗sirp抗体，传感图用1∶1朗缪尔模型拟合。使用biacore
tm t200评价软件(v3.1)计算动力学参数(k
a
、k
d
和k
d
)。husirpβ
1v1
和husirpβ
1v2
以其单体形式进行测试。估计的k
d
在测试浓度范围内。当报告的k
d
值＜1.0e
‑
11
时，亲和力无法准确确定，因为动力学参数超出仪器规格。
[0210]
结果
[0211]
流式细胞术测定：通过流式细胞术确定与细胞上表达的husirpα1和husirpα
bit
结合的sirpα抗体的比较。在表4中结合表示为ec
50
值。此处测试的所有抗体均显示出与husirpα
bit
(在expi
‑
cho
‑
s细胞中瞬时表达或在u937细胞中内源性表达)和husirpα1结合。虽然大多数抗体显示出的ec
50
值在低μg/ml范围内，但ab115
‑
lala、3f9
‑
lala和7h9
‑
lala显示出与u937细胞结合的ec
50
值大于1μg/ml。另外，3f9
‑
lala与在expicho
‑
s细胞上表达的husirpα
bit
和husirpα1结合，其中ec
50
值大于1μg/ml。值得注意的是，相应的同种型对照未显示出与任何这些细胞的结合。
[0212]
表4.抗sirpα抗体与内源性表达人sirpα
bit
的u937细胞和用人sirpα1或人sirpα
bit
瞬时转染的expicho
‑
s细胞的细胞结合。
[0213][0214]
spr测定：使用spr进行sirpα抗体与人sirpβ变体β
1v1
和β
1v2
的选择性的比较，并将结果总结在表5中。除3f9
‑
lala之外，所有抗体都识别husirpβ
1v1
。所有测试抗体都结合husirpβ
1v2
，其中抗体6具有最高的k
d
，并因此具有最低的亲和力。值得注意的是，相应的同种型对照未显示出与husirpβ
1v1
和husirpβ
1v2
的结合。
[0215]
表5.通过spr测量的抗sirpα抗体对人sirpβ
1v1
和人sirpβ
1v2
的结合亲和力(以m计的k
d
)。
[0216]
[0217][0218]
5.抗sirpα抗体与原代细胞：粒细胞、单核细胞和t细胞的结合
[0219]
实验
[0220]
流式细胞术测定，全血染色：肝素化全血样品从健康供体(sanquin血库，nijmegen，荷兰)获得，并在室温下储存过夜。在室温下将全血样品用1x bd facs
tm
裂解液(349202，bd biosciences)裂解15分钟，并用facs缓冲液(含有0.1％bsa和2mm edta的pbs)洗涤。在4℃下在96孔微量滴定板(353910，falcon)中将每孔1.5x105个细胞用每孔50μl抗sirpα抗体(浓度范围从10μg/ml或90μg/ml开始，3.16x稀释)染色30分钟。在用facs缓冲液洗涤之后，将细胞与1∶800稀释的抗人cd3
‑
pb克隆ucht1(558117，bd biosciences)、1∶800
稀释的抗人cd14
‑
fitc克隆(345784，bd biosciences)和1∶6000稀释的apc标记的山羊抗人igg f(ab’)2二抗(109
‑
136
‑
098，jackson immunoresearch)的混合物在facs缓冲液中在4℃下孵育30分钟。在用facs缓冲液洗涤之后，将细胞通过涡旋混合以避免细胞聚集，并与50μl每孔的bd cytofix
tm
固定缓冲液(4，2％pfa)(554655，bd biosciences)在室温下孵育15分钟，并洗涤，然后进行分析。将样品用facsverse(bd biosciences)收集并在flowjo软件(bd biosciences)中分析。粒细胞基于fsc
‑
a/ssc
‑
a门控，然后是cd14
‑
门控。t细胞和单核细胞首先基于fsc
‑
a/ssc
‑
a门控。然后将t细胞鉴定为cd3
+
cd14
‑
细胞，并将单核细胞鉴定为cd14
+
cd3
‑
细胞。
[0221]
流式细胞术测定，与分离的t细胞结合：通过阴性选择(11344 dynabeads untouched人t细胞试剂盒，thermofisher scientific)从健康个体(sanquin血库nijmegen，荷兰)的外周血单个核细胞(pbmc)中分离t细胞。将细胞在hepes+缓冲液(132mm nacl、6mm kcl、1mm cacl2、1mm mgso4、1.2mm磷酸钾、20mm hepes、5.5mm葡萄糖和0.5％(w/v)人血清白蛋白，ph 7.4)中洗涤并以1x106/ml的浓度重悬于隔离缓冲液(pbs+人白蛋白1％缓冲液w/v、人白蛋白200g/ml，sanquin血浆制品b.v.，amsterdam，荷兰)中，离心并重悬于facs缓冲液(含有0.1％v/w bsa(sigma
‑
aldrich，st.louis，mo)和0.02％v/w nan3(sigma
‑
aldrich)的1xpbs(lonza))中。将细胞(96孔板中100,000个细胞/孔)用冰冷的facs缓冲液洗涤，随后添加在冰冷的facs缓冲液中稀释的浓度范围的每种第一mab(50μl/孔)。在4℃下30分钟的孵育时间之后，将细胞用冰冷的facs缓冲液洗涤两次；接下来添加50μl/孔的二抗(对于人抗体，affinipure
tm f(ab’)2片段山羊抗人igg
‑
apc，1∶6,000稀释，jackson immuno research；对于小鼠抗体，affinipure
tm fab片段山羊抗小鼠igg(h+l)
‑
alexa fluor 488，1∶1,000稀释，jackson immuno research)。在4℃下30分钟之后，将细胞洗涤两次并重悬于150μl facs缓冲液中。通过流式细胞术用facsverse(bd biosciences)确定荧光强度，并将其表示为平均荧光强度(mfi
‑
平均)。在graphpad prism(windows版本7.02，graphpad，san diego，ca)中通过具有可变斜率(四个参数)的非线性回归拟合曲线。当使用4参数逻辑拟合时，ec
50
值计算为以μg/ml计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。
[0222]
结果
[0223]
流式细胞术测定，全血染色：通过流式细胞术确定多种sirpα抗体与原代细胞的结合。图10a至d中示出了对于代表性健康杂合sirpα1/sirpα
bit
供体的剂量响应曲线。应注意的是，应答的确切高度不一定是sirpα抗体的特征，因为这也可取决于二抗。相反，ec
50
值与检测抗体无关，并因此应进行比较。ec
50
值的总结描述于表6中。所有抗体都显示出与杂合sirpα
bit
/sirpα1供体的粒细胞和单核细胞结合，但是确切的ec
50
值是变化的。除heflb之外，所有抗体还显示出与纯合sirpα1供体的粒细胞和cd14
+
单核细胞结合，ec
50
值波动。这些数据与表2和3的spr和细胞数据一致，其中heflb也缺乏与sirpα1的结合。人血液中的循环cd3
+
t细胞不表达sirpα或sirpβ，而仅表达sirpγ，并且因此cd3
+
t细胞结合可理解为sirpγ结合。虽然大多数抗体显示出与cd3
+
t细胞结合，但抗体6、ab3
‑
lala、3f9
‑
lala、7h9
‑
lala和heflb未显示出与cd3
+
t细胞结合。在该全血染色测定中，ab136
‑
lala在较高抗体浓度下显示出与t细胞结合。这显示出与wo2018/057669中的公开内容一致，即ab136与sirpγ结合，但具有低的kd。
[0224]
表6.抗sirpα抗体与健康杂合sirpα1/sirpα
bit
供体(α1/αbit)或纯合sirpα1/sirpα1供体(α1/α1)的全血中的粒细胞、cd14
+
单核细胞和cd3
+
t细胞的细胞结合。
[0225][0226][0227]
＞10＝ec
50
＞大于10μg/ml
[0228]
#＝排除，导致异常的结合谱
[0229]
^＝观察到剂量响应曲线；然而值低于同种型对照
[0230]
*＝不完整曲线(未达到饱和)
[0231]
～＝不明确的拟合
[0232]
流式细胞术测定，与分离的t细胞结合：为了确认使用另一种方法的多种抗体的sirpγ依赖性t细胞结合，将分离的原代t细胞(不存在sirpα或sirpβ阳性髓样细胞)用抗体
组进行染色。结果示于图11中。虽然大多数抗体与t细胞结合，但抗体6、ab3
‑
lala、3f9
‑
lala、7h9
‑
lala、se5a5和heflb未显示出与t细胞的结合。同样，ab136
‑
lala在高抗体浓度下显示出结合。
[0233]
因此，以上实施例显示出抗体6对husirpβ
1v2
的亲和力低于在上面列出的广泛组中测试的任何比较抗sirpα抗体的亲和力。此外，非t细胞结合抗体6对sirpβ
1v1
的亲和力与对sirpγ也具有低/无亲和力的ab136
‑
lala、7h9
‑
lala和heflb的亲和力相当，并且低于对sirpγ也具有低/无亲和力的ab3和se5a5的亲和力。
[0234]
总的来说，抗体6具有与两个sirpα等位基因结合的高效力，同时显示出与其他非抑制性sirp家族成员sirpβ
1v1
、sirpβ
1v2
和sirpγ的结合相对低或不存在。
[0235]
6.cd47阻断能力
[0236]
实验
[0237]
cd47阻断能力：为了评估抗sirpα抗体阻断sirpα1或sirpα
bit
与cd47结合的能力，将sirpα1或sirpα
bit
与抗sirpα抗体预孵育，并然后测试从捕获的cd47中的解离。简言之，使用生物素捕获试剂盒(ge life sciences)捕获avi标记的生物素化cd47
‑
fc。通过注射生物素捕获试剂制备链霉亲和素表面。随后，将生物素化cd47
‑
fc注射到运行缓冲液(ph 7.4的10mm hepes缓冲液，含有150mm nacl、3mm edta和0.005％v/v表面活性剂p20)中至约1000ru的捕获水平。将含有5倍摩尔过量抗体与10μg/ml sirpα1或10μg/ml sirpα
bit
的混合物在环境温度下预孵育30分钟，并以5μl/分钟注射到cd47
‑
fc表面持续120秒。根据制造商的说明，对解离观察300秒，然后用6m胍
‑
hcl、0.25m naoh(3∶1)进行再生。阻断/非阻断抗体的表征通过双参考减法之后的视觉评估来完成。结果
[0238]
cd47阻断能力：使用spr研究了sirpα靶向抗体阻断cd47结合的能力(表7)。虽然大多数抗体，包括抗体6，阻断cd47
‑
sirpα
bit
和cd47
‑
sirpα1相互作用，但ab3
‑
lala、ab136
‑
lala、3f9
‑
lala和7h9
‑
lala不阻断cd47
‑
sirpα
bit
和cd47
‑
sirpα1相互作用，并且因此是非阻断性的。另外，heflb仅阻断cd47
‑
sirpα
bit
的相互作用，而不阻断cd47
‑
sirpα1的相互作用，这符合heflb缺乏对sirpα1的识别。
[0239]
表7.对于阻断cd47
‑
sirpα
bit
和cd47
‑
sirpα1相互作用的sirpα抗体的表征。
[0240]
[0241][0242]
7.阻止shp
‑
1募集的能力
[0243]
实验
[0244]
使用来自的pathhunter酶片段互补技术分析sirpα
bit
信号传导。在该测定中，cd47缺陷型jurkat细胞经遗传改造以过表达用与信号蛋白shp
‑
1的sh2结构域融合的prolink(pk)和酶受体(ea)标记的sirpα
rit+
。当这些jurkat sirpα
bit
信号传导细胞与表达cd47的细胞(cd47配体细胞)一起孵育时，shp
‑
1和sirpα
bit
将相互作用，导致pk和ea的互补。这会产生活性β
‑
半乳糖苷酶，其可切割底物以产生化学发光信号。该系统可用于研究sirpα靶向抗体拮抗shp
‑
1向sirpα的募集的能力。jurkat sirpα
bit
信号传导细胞与与cd47配体细胞组合的浓度范围的抗sirpα抗体一起孵育。jurkat e6.1细胞用作cd47配体细胞，并且该测定以384孔板形式进行。首先，向每孔添加12.5μl jurkat sirpα
bit
信号传导细胞悬液(80万个细胞/ml)，随后添加2.5μl浓度范围的抗sirpα抗体溶液(11x浓缩)。通过添加12.5μl cd47配体细胞悬液在ec
80
(160万个jurkat e6.1细胞/ml)开始测定。将板在37℃和5％co2下孵育4小时。孵育之后，添加2μl 2x稀释的试剂a(discoverx检测试剂盒，在含有0.1％bsa的pbs中)。在室温下，在黑暗中将板在振荡器(300rpm)上孵育30分钟。然后，添加10μl 2x稀释的试剂b(discoverx检测试剂盒，在含有0.1％bsa的pbs中)。在室温下，在黑暗
中将板在振荡器(300rpm)上孵育1小时。用系统(perkin elmer)以0.1秒/孔的积分时间测量发光。所有细胞悬液均在细胞平板培养基(discoverx)中制备，抗体稀释液在含有0.1％bsa(sigma)的pbs中。在graphpad prism8软件中分析图表。如下确定最大信号的％：(相对发光单位(rlu)/最大刺激(无抗体)的rlu*100)。如下计算效力水平：100％
‑
3.3μg/ml化合物值的
‘
最大信号％’。
[0245]
结果
[0246]
sirpα的激活导致充分表征的抑制信号级联。与cd47结合之后，sirpα的胞质结构域基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)变得磷酸化，导致包含src同源区2结构域的磷酸酶
‑
1(shp
‑
1)的募集和激活。shp
‑
1通过特定底物(包括活化的fcγr)的蛋白质去磷酸化来介导抑制性信号传导。这导致免疫应答减弱。使用cd47缺陷型jurkat sirpα
bit
信号传导细胞研究了sirpα靶向抗体抑制sirpα介导的信号传导的能力。当这些细胞与含有cd47的jurkat e6.1细胞一起孵育时，shp
‑
1被募集至sirpα
bit
，导致化学发光信号。抗体6能够以剂量依赖性方式拮抗该信号(图12a)。以固定剂量(3.3μg/ml)测试其他sirpα靶向抗体拮抗sirpα
bit
信号传导的能力(图12b)。除se5a5之外，所有cd47
‑
sirpα阻断抗体抑制sirpα
bit
信号传导的效力是类似的(以白色条表示)。与阻断抗体相比，非阻断抗体ab3
‑
lala、ab136
‑
lala、3f9
‑
lala和7h9
‑
lala(以黑色条表示)显示出较低或没有信号抑制效力，并因此显示出较少或不能够拮抗sirpα介导的信号传导。
[0247]
总的来说，抗体6阻断了cd47与两个sirpα等位基因的结合，并且与非阻断抗体相反，这导致对下游信号传导的高度抑制。
[0248]
8.抗体依赖性细胞毒性(adcc)
[0249]
实验
[0250]
细胞毒性测定(非放射性测定)：根据zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347中的方法，分离并培养对于sirpα1和sirpα
bit
杂合的供体的中性粒细胞。将新鲜分离的中性粒细胞与人g
‑
csf(10ng/ml)和ifnγ(50ng/ml)一起培养过夜。使用非放射性铕tda(eutda)细胞毒性测定法(perkinelmer)确定抗体依赖性细胞毒性(adcc)。将skbr3(人her2阳性乳腺癌细胞系)细胞用作靶细胞并在37℃下用双(乙酰氧基甲基)2，2’：6’，2
”‑
三联吡啶
‑
6，6
”‑
二羧酸盐)(batda试剂，delfia)标记5分钟。用pbs洗涤2次之后，在37℃和5％co2下，将在96孔u形底板中的每孔5x103个靶细胞在补充有10％(v/v)超低igg胎牛血清(foetal bovine serum，fbs，gibco)的imdm培养基中，在存在适当抗体的情况下，以效应物与靶细胞之比为50∶1与中性粒细胞一起孵育4小时。孵育之后，收获上清液并将其添加至铕溶液(delfia，perkinelmer)，并且使用分光荧光计(envision，perkinelmer)确定铕2，2’：6’，2
”‑
三联吡啶
‑
6，6
”‑
二羧酸(eutda)荧光。细胞毒性百分比计算为[(实验释放
‑
自发释放)/(总释放
‑
自发释放)]
×
100％。所有条件以一式两份和/或一式三份测量。
[0251]
51
cr释放测定(放射性测定)：
[0252]
根据zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347中的方法，分离对于sirpα1或sirpα
bit
纯合的供体的中性粒细胞。对于所有
51
cr释放测定实验(除了图2中示出的那些)，将新鲜分离的中性粒细胞与10ng/ml的人gm
‑
csf一起培养100分钟。使用
51
cr释放测定确定抗体依赖性细胞毒性(adcc)。将skbr3(人乳腺癌细胞系)细胞用作靶细胞，并在37℃下用100μ
ci
51
cr(perkin
‑
elmer)标记90分钟。用pbs洗涤2次之后，在37℃和5％co2下，将在96孔u形底板中的每孔5x103个靶细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清的imdm培养基中，在存在适当抗体的情况下，以效应物与靶细胞之比为50∶1与中性粒细胞一起孵育4小时。孵育之后，收获上清液并在γ计数器(wallac)中对其放射性进行分析。细胞毒性百分比计算为[(实验释放
‑
自发释放)/(总释放
‑
自发释放)]
×
100％。所有条件以一式两份和/或一式三份测量。
[0253]
结果
[0254]
12c4的人源化导致adcc的损失，这通过igg1恒定区的降低的效应功能恢复：
[0255]
图2示出了adcc测定的结果，以通过
51
cr释放测定测量的细胞毒性％计。使用来自纯合sirpα
bit
供体的中性粒细胞作为效应细胞测量skbr3细胞的细胞毒性％，并且单独的曲妥珠单抗低于与鼠12c4抗体(mu12c4)组合的曲妥珠单抗的细胞毒性％。与其中12c4可变区接枝到人igg1恒定区的抗体(12c4huigg1)组合的曲妥珠单抗在低浓度12c4huigg1下显示出与单独的曲妥珠单抗类似的细胞毒性％。在较高浓度的12c4huigg1下，观察到细胞毒性％降低。与其中12c4可变区接枝到包含氨基酸替换l234a和l235a的人igg1恒定区的抗体(12c4huigg1lala)组合的曲妥珠单抗显示出与单独曲妥珠单抗的细胞毒性％相比提高的细胞毒性％，以及与0.2μg/ml 12c4huigg1和曲妥珠单抗的组合相比提高的细胞毒性％。
[0256]
曲妥珠单抗介导的adcc的剂量依赖性提高：
[0257]
图3至9中示出了在多种浓度(μg/ml)的抗体1至13(具有包含氨基酸替换l234a和l235a(lala)的人igg1恒定区)存在的情况下，或在多种浓度的参考抗体(μg/ml)存在的情况下，曲妥珠单抗对srbr3her2阳性乳腺癌细胞的百分比adcc/细胞毒性(剂量响应曲线)。对于抗体1至13，adcc在杂合sirpα1/sirpα
bit
供体中剂量依赖性提高(图4和5)，而在杂合供体中，对于12c4huigg1看到剂量依赖性降低，对于人源化heflb未看到明显作用，对于kwar23huigg1和se5a5看到很小的作用，并且对于kwar23
‑
lala参考抗体看到剂量依赖性提高(图3)。还在纯合子sirpα1或sirpα
bit
背景上测试了抗体7至13和参考抗体(图6至9)。所有抗体似乎都显示出更可变的结果。
[0258]
9.免疫原性
[0259]
cd4
+
t细胞表位是体内免疫原性(抗药物抗体)的重要驱动因素。使用离体t细胞测定检测针对抗sirpα抗体6中t细胞表位的t细胞应答。将抗体6送去进行使用episcreen
tm
时间进程t细胞测定的免疫原性评估，以在abzena(cambridge，英国)得到其诱导cd4
+
t应答的能力。将来自代表欧洲和北美人群(基于hla同种异型)的50名健康供体组群的pbmc与测试样品一起孵育。使用增殖测定([3h]
‑
胸苷摄取)和细胞因子分泌测定(il
‑
2 elispot)测量t细胞应答。在t细胞增殖测定和il
‑
2 elispot的组合中发现抗体6没有免疫原性。
[0260]
10.抗体依赖性细胞毒性(adcc)；比较例
[0261]
实验
[0262]
根据zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347中的方法，分离对于sirpα1或sirpα
bit
纯合，或者对于两个等位基因杂合的供体的人中性粒细胞。然后将中性粒细胞用10ng/ml粒细胞
‑
单核细胞集落刺激因子(gm
‑
csf，peprotech)刺激30分钟。根据zhao et al.pnas 2011，108(45)，18342
‑
18347中的方法，使用
51
cr释放测定(perkinelmer)确定抗体依赖性细胞毒性(adcc)。简言之，将skbr3(人乳腺癌细胞系)或a431(皮肤表皮样癌细胞系)细胞用作靶细胞，并在37℃下用100μci
51
cr(perkin
‑
elmer)标记90分钟。用pbs洗涤2次之
后，在37℃和5％co2下，将在96孔u形底板中的每孔5x103个靶细胞用曲妥珠单抗(skbr3终浓度为10μg/ml)或西妥昔单抗(a431终浓度为5μg/ml)调理，并在补充有20％(v/v)低igg胎牛血清(fbs)的imdm培养基中，在存在图13至14中所示剂量响应范围的抗体的情况下，以效应物与靶细胞之比为50∶1与中性粒细胞一起孵育4小时。孵育之后，收获上清液，并将其转移至lumaplates(perkin elmer)并在microbeta计数器(perkin elmer)中对其放射性进行分析。细胞毒性百分比计算为[(实验释放
‑
自发释放)/(总释放
‑
自发释放)]
×
100％。所有条件以一式两份和/或一式三份测量。结果
[0263]
抗体依赖性细胞毒性(adcc)：在使用经gm
‑
csf活化的原代人中性粒细胞作为效应细胞以及癌症靶向治疗性抗体和肿瘤靶细胞的不同组合的adcc实验中测试了抗sirpα抗体的作用(图13a至b，14a至b)。所述肿瘤靶细胞包括与曲妥珠单抗组合的表达her2的skbr3乳腺癌细胞(图13)和与西妥昔单抗组合的表达egfr的a431癌细胞(图14)。结果表明，抗体6能够增强两种癌症靶向抗体
‑
靶癌细胞组合的中性粒细胞adcc。对于数种其他抗sirpα抗体获得了类似的发现，但对于例如40a
‑
1、40a
‑
2、3f9
‑
lala、7h9
‑
lala、12c4、29am4
‑5‑
lala、se5a5则没有获得类似的发现。
[0264]
总的来说，抗体6是对非抑制性sirp家族成员sirpβ
1v1
、sirpβ
1v2
和sirpγ具有相对低的亲和力或不存在亲和力的唯一抗体，其在功能测定中有效抑制下游信号传导，同时在sirpα
bit
和sirpα1基因型二者中显示出增强的adcc。
[0265]
序列表，抗体1至13在重链(hc)可变区(vr)和轻链(lc)可变区(vr)氨基酸序列中的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列具有下划线(vr残基根据kabat方法确定；序列编号是顺序的，而不是根据kabat的编号)
[0266]
seq id no：1(hcvr；mab 1)
[0267][0268]
seq id no：2(lcvr；mab 1，2，3，4，12，13)
[0269][0270]
seq id no：3(hcvr；mab 2)
[0271][0272]
seq id no：4(hcvr；mab 3)
[0273][0274]
seq id no：5(hcvr；mab 4)
[0275][0276]
seq id no：6(hcvr；mab 5，8)
[0277][0278]
seq id no：7(lcvr；mab 5，11)
[0279][0280]
seq id no：8(hcvr；mab 6)
[0281][0282]
seq id no：9(lcvr；mab 6，7，8，9，10)
[0283][0284]
seq id no：10(hcvr；mab 7)
[0285][0286]
seq id no：11(hcvr；mab 9)
[0287][0288]
seq id no：12(hcvr；mab 10)
[0289][0290]
seq id no：13(hcvr；mab 11)
[0291][0292]
seq id no：14(hcvr；mab 12)
[0293][0294]
seq id no：15(hcvr；mab 13)
[0295][0296]
seq id no：16(hc；12c4)
[0297][0298]
seq id no：17(lc；12c4)
[0299][0300]
seq id no：18(hc；29am4
‑5‑
lala)
[0301][0302][0303]
seq id no：19(lc；29am4
‑5‑
lala)
[0304][0305]
seq id no：20(hc；12c4
‑
lala)
[0306][0307]
seq id no：21(lc；12c4
‑
lala)
[0308][0309]
seq id no：22(hc；kwar23
‑
lala)
[0310][0311]
seq id no：23(lc；kwar23
‑
lala)
[0312][0313]
seq id no：24(人igg1抗体hc恒定区)
[0314][0315]
seq id no：25(人igg1抗体hc恒定区lala突变体(突变具有下划线))
[0316][0317][0318]
seq id no：26(人抗体lcκ恒定区)
[0319][0320]
seq id no：27(havt20前导序列12c4/12c4
‑
lala/29am4
‑
5lala/kwar23/kwar23
‑
lala/heflb)
[0321][0322]
seq id no：28(前导序列重链mab 1
‑
13)
[0323][0324]
seq id no：29(前导序列轻链mab 1
‑
13)
[0325][0326]
seq id no：30(hcdr1；mab 1，2，3，4，12和13)
[0327][0328]
seq id no：31(hcdr2；mab 1，2，3，4，12和13)
[0329][0330]
seq id no：32(hcdr3；mab 1，2，3，4，12和13)
[0331]
[0332]
seq id no：33(lcdr1；mab 1，2，3，4，12和13)
[0333][0334]
seq id no：34(lcdr2；mab 1，2，3，4，12和13)
[0335][0336]
seq id no：35(lcdr3；mab 1，2，3，4，12和13)
[0337][0338]
seq id no：36(hcdr1；mab 5
‑
11)
[0339][0340]
seq id no：37(hcdr2；mab 5，7，8，9，11)
[0341][0342]
seq id no：38(hcdr3；mab 5，7，8，9，11)
[0343][0344]
seq id no：39(lcdr1；mab 5
‑
11)
[0345][0346]
seq id no：40(lcdr2；mab 5
‑
11)
[0347][0348]
seq id no：41(lcdr3；mab 6
‑
10)
[0349][0350]
seq id no：42(hcdr2；mab 1o)
[0351][0352]
seq id no：43(hcdr3；mab 10)
[0353][0354]
seq id no：44(hcdr2；mab 6)
[0355][0356]
seq id no：45(hcdr3；mab 6)
[0357][0358]
seq id no：46(lcdr3；mab 5，11)
[0359][0360]
seq id no：47(hc；kwar23)
[0361][0362]
seq id no：48(lc；kwar23)
[0363][0364]
seq id no：49(hc；heflb)
[0365][0366]
seq id no：50(lc；heflb)
[0367][0368][0369]
seq id no：51(人sirpα1胞外结构域1
‑
370，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0370][0371]
seq id no：52(人sirpα
bit
，胞外结构域1
‑
370，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0372][0373]
seq id no：53(人sirpβ
1v1
，胞外结构域，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0374][0375][0376]
seq id no：54(人sirpβ
1v2
，胞外结构域，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0377][0378]
seq id no：55(人sirpγ，胞外结构域，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0379][0380]
seq id no：56(食蟹猴sirpα，胞外结构域，avi
‑
fxa
‑
fc标签)
[0381][0382]
seq id no：57(hc；1h9；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0383][0384]
seq id no：58(lc；1h9；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0385][0386]
seq id no：59(hc；40a
‑
1；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0387][0388][0389]
seq id no：60(lc；40a
‑
1；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0390][0391]
seq id no：61(hc；40a
‑
2；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0392][0393]
seq id no：62(lc；40a
‑
2；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0394][0395]
seq id no：63(hc；ab3
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0396][0397][0398]
seq id no：64(lc；ab3
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0399][0400]
seq id no：65(hc；ab25
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0401][0402]
seq id no：66(lc；ab25
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0403][0404]
seq id no：67(hc；ab115
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0405][0406][0407]
seq id no：68(lc；ab115
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0408][0409]
seq id no：69(hc；ab119
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0410][0411]
seq id no：70(lc；ab119
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0412][0413]
seq id no：71(hc；ab136
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0414][0415][0416]
seq id no：72(lc；ab136
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0417][0418]
seq id no：73(hc；3f9
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0419][0420]
seq id no：74(lc；3f9
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0421][0422]
seq id no：75(hc；7h9
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0423][0424]
seq id no：76(lc；7h9
‑
lala；包含前导序列[下划线]；恒定区[斜体])
[0425][0426]
表8.重链fr1中氨基酸残基替换的实例
[0427][0428]
表9.重链fr2中氨基酸残基替换的实例
[0429][0430]
表10.重链fr3中氨基酸残基替换的实例
[0431][0432]
表11.重链fr4中氨基酸残基替换的实例
[0433][0434]
表12.轻链fr1中氨基酸残基替换的实例
[0435][0436]
表13.轻链fr2中氨基酸残基替换的实例
[0437][0438]
表14.轻链fr4中氨基酸残基替换的实例
[0439]