含有N-甲基-D-葡糖胺单元的糖肽水凝胶、制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药或组织工程技术领域，特别是涉及一种含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶、制备方法及其应用。

背景技术：

糖类在自然界中有着举足轻重的地位，在很多生物功能中发挥着重要的作用，包括细胞-细胞识别、免疫反应、调控激素活性及炎症等。糖类分子与蛋白质分子共价结合形成的蛋白质为糖蛋白，这种糖基化修饰使蛋白质分子的性质和功能更为丰富和多样，尤其对于细胞信号的识别具有重要作用。将各种糖胺聚糖与不同的核心蛋白质结合也可形成一类糖复合体，为蛋白聚糖，其主要存在于高等动物的细胞外基质中，有些也存在于细胞膜中，是细胞的结构物质。人工合成的含糖聚合物能够在一定程度上模拟天然糖类或蛋白的一些功能，从而在生物医学以及生物技术领域获得广泛的应用，如药物运输载体、细胞培养基质、毒素抑制剂及病原体检测等。

感染、肿瘤和创伤所引起的人体组织缺损和退化一直是困扰人类的一大疾病。传统的治疗手段主要是自体或异体移植术，但是存在昂贵的治疗费用和排异反应等问题。在这种背景下，组织再生医学应运而生，其中的关键技术是开发新型细胞支架材料。在过去几十年里，由于具有良好的生物相容性、生物活性以及种类多样性，多肽及其衍生物广泛吸引着研究者的兴趣。目前多肽产品已广泛用于医药、保健品、化妆品、生物材料等众多领域。其中，在医药领域已开发的多肽药物分为治疗药物、诊断药物和预防药物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。研究人员发现，利用分子间氢键作用、疏水性作用和π-π堆积作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。由于在制备过程中无需加入化学交联剂，高含水量的多肽凝胶可以被直接注射到靶向位点，因此广泛应用于生物医药等领域。

技术实现要素：

本发明提供了一种含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶、制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明的目的之一是提供一种含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶，结构式如式ⅰ所示：

其中，n＝4、6或7；r为甲基、异丙基、异丁基或苄基。

本发明的目的之二是提供所述的含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用固相合成技术制备含疏水性端基的三肽，然后纯化，所述三肽的结构组成为1个缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸中的一种和2个甘氨酸，疏水性端基为软脂酸、硬脂酸或月桂酸；

(2)将纯化的三肽与n-甲基-d-葡糖胺缩合得到糖肽，然后纯化；

(3)将糖肽分散在磷酸盐缓冲溶液中，通过加热溶解-冷却法制备糖肽超分子水凝胶。

进一步的，固相合成技术所采用的树脂为2-氯三苯甲基氯树脂，肽链的合成为从c-端到n-端。

进一步的，合成糖肽的缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，有机溶剂为二甲基亚砜。

进一步的，含疏水性端基的三肽和糖肽采用粗产品用少量良溶剂溶解，然后在大量不良溶剂中沉降的方法纯化。

进一步的，良溶剂为三氟乙酸、二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。

进一步的，所述的不良溶剂为乙醚或水。

进一步的，所述的磷酸盐缓冲溶液的ph为7.4。

进一步的，通过加热溶解-冷却法制备糖肽水凝胶时，首先升高溶液温度至95℃使糖肽完全溶解，随后在室温下冷却。

本发明的目的之三是提供所述的含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶在细胞支架材料和抗生物膜试剂中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。通过分子间氢键作用、疏水性作用和π-π堆积作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液中自组装形成具有纳米纤维微观结构的水凝胶。由于在制备过程中无需加入化学交联剂，高含水量的多肽凝胶可以被直接注射到靶向位点，因此广泛应用于组织工程、药物控释等领域。本发明在多肽分子结构中引入葡糖胺单元，得到与核心蛋白多糖结构类似的糖肽。由于多肽及其衍生物具有良好的自组装性能，上述糖肽自组装得到糖肽水凝胶有望成为新型细胞支架材料和抑菌材料。

本发明制备了含有n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽分子胶凝剂在生理条件下自组装形成的超分子水凝胶。糖肽分子由天然脂肪酸、三肽和n-甲基-d-葡糖胺三种结构单元组成，其制备方法简单，具有良好的细胞相容性和抗细菌生物膜活性。所述糖肽水凝胶有望成为新型细胞支架材料和抗生物膜试剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine的hplc图；

图2为实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine的esi-ms图；

图3为实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine水凝胶动态力学测试图；

图4为l929细胞在实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine水凝胶表面培养1天、3天、5天后的细胞增殖情况；

图5为sd大鼠骨髓间质干细胞在实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine水凝胶表面培养1周后的细胞成骨分化情况；

图6为实施例1制备的糖肽分子pal-val-gly-gly-meglumine水凝胶对金黄色葡萄球菌生物膜的清除作用。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

(1)含疏水性脂肪酸的三肽制备

以2-氯三苯甲基氯树脂(树脂上有效氯的取代度为1.01mmol/g)为固相载体，使用多肽固相合成管制备。肽链在树脂上从c-端到n-端延长。具体的合成步骤如下：2-氯三苯甲基氯树脂(2g，有效氯的取代度为2mmol)用10ml二氯甲烷(dcm)洗涤2次。抽去dcm，加入溶有fmoc-gly-oh(3mmol)、n,n-二异丙基乙胺(diea，990μl)的dcm溶液到树脂中，于室温下振荡50分钟。抽去反应液，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂3次后加入20ml体积比为1/4的哌啶/dmf混合液(即脱保护液)到树脂中，于室温下振荡30分钟，脱去fmoc保护基。抽去反应液，用dmf洗涤树脂3次后加入溶有fmoc-gly-oh(6mmol)、diea(1.98ml)、苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu，6mmol)的dmf溶液到树脂中，于室温下振荡2小时。抽走反应液，用dmf洗涤树脂3次后加入脱保护液到树脂中，于室温下振荡30分钟，脱去fmoc保护基。抽去反应液，用dmf洗涤树脂洗涤3次后加入溶有fmoc-val-oh(6mmol)、diea(1.98ml)、hbtu(6mmol)的dmf溶液到树脂中，于室温下振荡2小时。抽走反应液，用dmf洗涤树脂3次后加入脱保护液到树脂中，于室温下振荡30分钟，脱去fmoc保护基。抽去反应液，用dmf洗涤树脂三次后加入溶有月桂酸(6mmol)、diea(1.98ml)、hbtu(6mmol)的dmf溶液到树脂中，于室温下振荡2小时。抽走反应液，分别用dmf和dcm洗涤树脂3次后，加入切落剂(体积比为38/1的三氟乙酸/水)将产品从树脂上切落，收集滤液并浓缩。加入乙醚或水沉淀出产品，过滤并多次洗涤，真空干燥产品。

(2)含n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽合成

将上述合成的三肽(1mmol)、edc(1.2mmol)和nhs(1.2mmol)溶于二甲基亚砜中，于室温下搅拌30分钟。加入n-甲基-d-葡糖胺(1.2mmol)，于室温下搅拌1小时。加入大量水沉降出产品，过滤或离心收集并用水多次洗涤，真空干燥产品。

(3)糖肽水凝胶的制备

将糖肽分散在磷酸缓冲溶液中，加热至95℃让其溶解成澄清溶液(浓度为20mg/ml)。缓慢降低溶液温度至室温，糖肽分子可自组装形成超分子水凝胶，本实施例得到含n-甲基-d-葡糖胺单元的糖肽水凝胶的结构式如式ⅱ所示，

(4)糖肽水凝胶的细胞相容性评价

将上述糖肽水凝胶转移至96孔细胞培养板中用紫外光照射除菌。将含有l929成纤维细胞的dmem培养液加入到糖肽水凝胶的表面。待细胞培养一段时间(1天、3天、5天)后，加入cck-8溶液到糖肽水凝胶表面，37℃孵育2小时后，用酶标仪读取450nm吸光度。检测结果表明：该糖肽水凝胶有助于促进细胞的粘附和增殖。

(5)糖肽水凝胶的细胞成骨分化评价

将上述糖肽水凝胶转移至48孔细胞培养板中用紫外光照射除菌。将含有sd大鼠骨髓间质干细胞(bmscs)的dmem培养液加入到糖肽水凝胶的表面。待细胞培养7天后，用试剂盒检测碱性磷酸酶(alp)活性。检测结果表明：该糖肽水凝胶有利于细胞成骨分化。

(6)糖肽水凝胶的细菌生物膜清除活性评价

将含有金黄色葡萄球菌的tsb培养基转移至96孔细胞培养板中。待细菌培养1天后，轻轻洗去上清液中的浮游细菌。将不同浓度的糖肽组装体溶液加入到细菌生物膜中。待孵育1天后，轻轻吸掉糖肽组装体溶液。孔板置于55℃烘箱内干燥1小时。每个孔内加入结晶紫溶液(1mg/ml)于37℃染色15分钟。用水洗去过量的结晶紫溶液。每个孔内加入体积比为30/70的乙酸/水溶液，用酶标仪读取550nm吸光度。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。