用于提取细胞核的液体及其应用的制作方法

本发明涉及细胞核提取领域。具体涉及用于提取细胞核的液体及其应用。

背景技术：

流式细胞仪在植物科学领域中主要用于植物细胞dna含量测定、染色体倍性分析和细胞周期分析等。获得高质量的样品细胞核提取物是测定关键。自从流式细胞术应用到植物学领域以来，已经筛选出多种配方用于提取不同来源植物材料的细胞核。由于植物种类繁多，不同植物组织结构和化学成份存在很大差异，现有的公开配方不能同时适用于多种植物材料。尤其是对于次生代谢物复杂的植物材料，现有用于提取细胞核的液体远不能满足测试要求，往往需要根据样品特性优化提取液成分以期获得最佳的提取效果。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为如何获得细胞核含量和质量高的植物细胞核提取物，尤其是如何从富含多糖多酚的植物材料中获得细胞核含量高和质量高的植物细胞核提取物，以用于流式细胞仪的检测。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于提取细胞核的液体。

本发明用于提取细胞核的液体由na3c6h5o7·2h2o、mgcl2、mops、nacl、edta-na2、tritonx-100、tween-20、β-巯基乙醇、pvpk12和水组成；所述na3c6h5o7·2h2o在所述液体的含量为30mmol/l、所述mgcl2在所述液体的含量为45mmol/l、所述mops在所述液体的含量为20mmol/l、所述nacl在所述液体的含量为20mmol/l、所述edta-na2在所述液体的含量为20mmol/l、所述tritonx-100在所述液体的体积百分含量为0.1％、所述tween-20在所述液体的体积百分含量为0.5％、所述β-巯基乙醇在所述液体的含量为2ul/ml和所述pvpk12在所述液体的体积百分含量为1％。

上述用于提取细胞核的液体的ph值为7.0。

本发明进一步提供了上述用于提取细胞核的液体在如下任一中的应用：

1)在制备植物细胞核提取物中的应用；

2)在提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量中的应用；

3)在制备提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量的产品中的应用；

4)在制备流式细胞仪检测样品中的应用。

本发明进一步提供了制备植物细胞核提取物的方法。

本发明制备植物细胞核提取物的方法，包括如下步骤：

将植物材料加入到用于提取细胞核的液体中，在所述液体中破碎植物材料，即得植物细胞核提取物。

上述方法中，所述植物材料与用于提取细胞核的液体的质量体积比为10-20mg：250ul。

上述方法中，所述植物材料为富含多糖和/或多酚的植物材料，如五味子。

上述方法中，所述植物材料为干燥材料或新鲜材料；具体的，所述干燥材料为硅胶干燥材料。

上述方法制备得到的植物细胞核提取物也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步还提供了上述植物细胞核提取物在流式细胞仪检测中的应用。

pvpk12或tween-20在提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量中的应用或在制备提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。

pvpk12和tween-20在提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量中的应用或在提高植物细胞核提取物中细胞核含量和/或质量的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明中细胞核质量高主要体现在流式细胞仪检测核dna时峰形对称，窄而高，前面的碎片峰低，变异系数cv小于5％。

本发明首次将用于提取细胞核的液体中常用试剂pvp40或pvpk15替换为pvpk12，并添加了利于细胞核从粘稠的次生代谢物中分离出来的tween-20，得到的用于提取细胞核的液体在极少用量和极短时间内能提取足够数量和质量的细胞核用于流式细胞仪检测中dna含量测定、染色体倍性分析。本发明用于提取细胞核的液体适用于包括富含多糖多酚类次生代谢物植物在内的多种植物材料细胞核的提取，尤其是适用于干燥样品细胞核的提取，在进行流式细胞仪检测时与新鲜材料检测结果一致，从而有效地避免破坏性采样和新鲜材料长途运输问题，极大降低了野外植物细胞dna含量测定、染色体倍性分析的工作难度。因此，本发明用于提取细胞核的液体具有广泛的适用性。

附图说明

图1为不同用于提取细胞核的液体提取新鲜蓝莓叶片的核dna效果的流式图。

图2为pvpk12-mgb2和piabsolutep提取草本植物新鲜叶片的核dna效果的流式图。

图3为pvpk12-mgb2和piabsolutep提取木本与藤本植物新鲜叶片的核dna效果的流式图。

图4为以新鲜番茄为内标测定新鲜无花果叶片核dna含量的流式图；其中，a：piabsolutep；b：pvpk12-mgb2用于提取细胞核的液体；p1：无花果叶片；p2：番茄叶片。

图5为以新鲜番茄为内标测定无花果硅胶干燥叶片核dna含量的流式图；其中，a：piabsolutep用于提取细胞核的液体提取的无花果硅胶干燥叶片核dna；b：pvpk12-mgb2用于提取细胞核的液体提取的无花果硅胶干燥叶片核dna；p1：番茄叶片；p2：无花果硅胶干燥叶片

图6为蓝莓染色体倍性分析的流式图；其中，a：野生型二倍体蓝莓新鲜叶片；b：野生型六倍体蓝莓新鲜叶片；c：野生型六倍体蓝莓硅胶干燥叶片；p1：二倍体；p2：六倍体；p3：六倍体。

图7为tween对细胞核提取影响的流式图；其中，a：不添加tween-20的对照组；b：0.1％tween-20组；c：0.5％tween-20组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中各原料的购买来源：

pvpk15购自tci，货号为tci-p0471-25g；

pvpk12和pvp70购自acros，货号为276142500--250gr和222271000-100gr；

pvp40购自sigma，货号为p5288-100g。

实施例1细胞核提取物的制备及核dna含量检测和染色体倍性分析

一、用于提取细胞核的液体

本实施例提供了如下用于提取细胞核的液体：pvp-mgb2、lb01、wps、tris-mgcl2和商品化的试剂盒piabsolutep，具体如下：

1、pvp-mgb2：

本步骤提供了如下4种用于提取细胞核的液体：pvpk12-mgb2、pvpk15-mgb2、pvp40-mgb2和pvp70-mgb2。具体如下：

1)pvpk12-mgb2由溶质和水组成，溶质中各组分及其含量为：na3c6h5o7·2h2o30mmol/l，mgcl245mmol/l，mops20mmol/l，nacl20mmol/l，edta-na220mmol/l，tritonx-1000.1％(v/v)，tween-200.5％(v/v)，β-巯基乙醇2ul/ml，pvpk121％(v/v)，ph＝7.0，4℃保存，v/v表示体积百分含量。

2)pvpk15-mgb2：将1)pvpk12-mgb2中pvpk12替换为pvpk15，其它组分及其浓度均相同。

3)pvp40-mgb2：将1)pvpk12-mgb2中pvpk12替换为pvp40，其它组分及其浓度均相同。

4)pvp70-mgb2：将1)pvpk12-mgb2中pvpk12替换为pvp70，其它组分及其浓度均相同。

2、lb01

lb01由溶质和水组成，溶质中各组分及其含量为：tris15mmol/l，na2edta·2h2o2mmol/l，四盐酸精胺0.5mmol/l，kcl80mmol/l，nacl20mmol/l，tritonx-1000.1％(v/v)，β-巯基乙醇15mmol/l，ph7.0～ph8.0，-20℃下保存；用时解冻，解冻后4℃下保存。

3、wps：

wps由溶质和水组成，溶质中各组分及其含量为：tris0.2mol/l，na2edta·2h2o2mmol/l，mgcl2·6h2o4mmol/l，nacl86mmol/l，焦亚硫酸钠10mmol/l，pvp-101％(v/v)，tritonx-1001％(v/v)，ph7.5，-20℃下保存；用时解冻，解冻后4℃下保存。

4、tris-mgcl2：

tris-mgcl2由溶质和水组成，溶质中各组分及其含量为：tris0.2mol/l，mgcl24mmol/l，trixonx-1000.5％(v/v)，ph7.5。

5、商品化的试剂盒piabsolutep，品牌：sysmex-partec，德国。

二、细胞核提取物的制备及核dna含量检测和染色体倍性分析

1、细胞核提取物的制备方法

取植物样品20mg，加250ul步骤一中用于提取细胞核的液体，用锋利刀片一次性切碎叶片(整个过程中材料均须浸没在用于提取细胞核的液体里)，以防细胞核破碎，得到细胞核提取物。

2、核dna含量测定

将细胞核提取物用30μm滤网过滤到流式管中，加入pi染液(碘化丙啶)和rnase溶液，使其终质量浓度均达到50μg/ml，室温下置暗环境中处理15min，然后在lsrfortessa型流式细胞仪(美国bd公司)上进行测试，每个植物材料进行三次重复。测试5000-10000个细胞核，用流式细胞仪cellquestpro软件采集并处理数据。

3、染色体倍性分析

将细胞核提取物用30μm滤网过滤到流式管中，加入dapi染液，使其终质量浓度达到4μg/ml，然后在lsrfortessa型流式细胞仪(美国bd公司)上进行测试。每个植物材料进行三次重复。测试5000-10000个细胞核，用流式细胞仪cellquestpro软件采集并处理数据。

三、用于提取细胞核的液体的筛选

取蓝莓新鲜叶片，分别添加步骤一中不同的pvp-mgb2(即pvpk12-mgb2、pvpk15-mgb2、pvp40-mgb2和pvp70-mgb2)、wps、tris-mgcl2、lb01以及商品化的试剂盒piabsolutep，按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备蓝莓新鲜叶片的细胞核提取物，然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量，经过流式细胞仪分析检测结果如图1所示，结果显示pvp70-mgb2提取的细胞核提取物检测不到明显的dna峰，lb01、pvpk15-mgb2、tris-mgcl2以及pvp40-mgb2提取的细胞核二倍体峰左侧出现一个坡峰，推测是细胞核提取液对细胞核有破坏作用，产生大量的细胞碎片，wps提取的细胞核数量少，相同时间收集的细胞核数量远远低于其它细胞核提取液。商品化的试剂盒piabsolutep提取的细胞核提取物测试结果较好，pvpk12-mgb2提取的细胞核提取物测试效果最好，峰形呈现对称分布，峰形窄而高，左侧细胞碎片峰较低，即细胞核的质量和含量最好。

四、新鲜草本植物叶片用于提取细胞核的液体效果比较

分别用步骤一的pvpk12-mgb2和商品化的试剂盒piabsolutep按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备水稻、番茄、大豆的新鲜叶片的细胞核提取物，然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量，经过流式细胞仪分析检测结果如图2所示，结果显示，两种用于提取细胞核的液体均能提取出细胞核，峰形呈现对称分布，峰形窄而高，左侧细胞碎片峰较低。pvpk12-mgb2提取的核变异系数cv值小于等于5％，并且均优于商品化的试剂盒piabsolutep提取的核cv值，说明pvpk12-mgb2提取的细胞核的质量明显高于商品化的试剂盒piabsolutep。

五、新鲜木本和藤本植物叶片用于提取细胞核的液体效果比较

为了测试pvpk12-mgb2用于提取细胞核的液体的适用性，分别用步骤一的pvpk12-mgb2和商品化的试剂盒piabsolutep按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备金银花、皱叶荚蒾、南五味子的新鲜叶片的细胞核提取物，然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量。这三种植物叶片结构和化学成分各不相同：金银花叶片中含有大量的有机酸和黄酮类化合物；南五味子富含木质素、多糖等成分；皱叶荚蒾叶厚革质，表皮细胞壁厚，角质层发达。

经过流式细胞仪分析检测结果如图3示，结果显示，商品化的试剂盒piabsolutep制备的细胞核提取物检测不到南五味子叶片dna峰。而pvpk12-mgb2制备的细胞核提取物能够检测到dna峰。另外，pvpk12-mgb2和商品化的试剂盒piabsolutep制备的金银花、皱叶荚蒾细胞核提取物中均能检测到dna峰，峰形呈现对称分布，峰形窄而高，左侧细胞碎片峰较低。pvpk12-mgb2制备的金银花、皱叶荚蒾细胞核提取物中测定金银花、皱叶荚蒾核dna的变异系数cv值均小于5％，并且均优于商品化的试剂盒piabsolutep的提取效果。说明pvpk12-mgb2对于细胞核的提取具有广泛的适用性，能够用于不同植物物种的细胞核提取。

六、新鲜材料的核dna含量测定准确性的比较

分别用pvpk12-mgb2和商品化的试剂盒piabsolutep按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备无花果新鲜叶片的的细胞核提取物，然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量。以新鲜的番茄叶片作为内对照，已知番茄基因组值为739mb。

经过流式细胞仪分析检测结果如图4所示，结果显示：两种用于提取细胞核的液体提取的核dna含量类似。但是pvpk12-mgb2获得的核dna，其测定的变异系数cv值小于商品化的试剂盒piabsolutep，说明用pvpk12-mgb2获得的细胞核进行dna含量测定的准确性更高，即细胞核的含量和质量均较高。

七、硅胶干燥材料核dna含量测定准确性的比较

取无花果的新鲜叶片，放入装有硅胶的自封袋中，室温放置，经12-24小时材料完全干燥，得到无花果的干燥叶片，备用。

分别用步骤一的pvpk12-mgb2和商品化的试剂盒piabsolutep按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备无花果干燥叶片和新鲜叶片的细胞核提取物，然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量。以新鲜的番茄叶片作为内对照，已知番茄基因组值为739mb。

经过流式细胞仪分析检测结果如图5示，结果显示，两种细胞核提取液提取干燥叶片的核dna，样品g1峰荧光均值与内对照样品g1峰荧光均值位置比值接近，经过换算显示dna含量测定基本一致，并且与无花果新鲜叶片的测量结果没有显著差别，都在280mb左右(表1)。

表1不同植物细胞提取液测定无花果不同材料的核dna含量结果

八、硅胶干燥材料染色体倍性分析

取蓝莓野生型6倍体的新鲜叶片，放入装有硅胶的自封袋中，室温放置，经12-24小时材料完全干燥，得到蓝莓野生型6倍体的干燥叶片，备用。

用步骤一的pvpk12-mgb2按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备蓝莓野生型2倍体新鲜叶片、蓝莓野生型6倍体新鲜叶片、蓝莓野生型6倍体干燥叶片的细胞核提取物，然后按照步骤二所述染色体倍性分析测定染色体倍性。

经过流式细胞仪分析检测结果如图6所示，结果显示，硅胶干燥叶片和新鲜叶片细胞核dnag1峰荧光均值均处于相同位置，染色体倍性分析为6倍体。说明pvpk12-mgb2用于提取细胞核的液体获得的硅胶干燥叶片的细胞核倍性测定结果，与用新鲜叶片细胞核测定的一致。因此，硅胶干燥样品在使用该专利的pvpk12-mgb2用于提取细胞核的液体时，可以用于染色体倍性分析。

九、tween对细胞核提取的影响

取番茄的新鲜叶片，放入装有硅胶的自封袋中，室温放置，经12-24小时材料完全干燥，得到番茄的干燥叶片，备用。

为了优化用于提取细胞核的液体，设置三种实验，即不添加tween-20的对照组、0.1％tween-20组和0.5％tween-20组。

对照组中用不添加tween-20的用于提取细胞核的液体(即将步骤一中pvpk12-mgb2的tween-20去除溶质中其它组分比例不变得到的液体)按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备番茄的干燥叶片的细胞核提取物；0.1％tween-20组中用tween-20的添加比例为0.1％(v/v)的用于提取细胞核的液体(即将步骤一中pvpk12-mgb2的tween-20的添加比例设置为0.1％(v/v)，溶质中其它组分的比例不变得到的液体)按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备番茄的干燥叶片的细胞核提取物；0.5％tween-20组中用将tween-20的添加比例为0.5％(v/v)的用于提取细胞核的液体(即步骤一中的pvpk12-mgb2)按照步骤二所述细胞核提取物的制备方法制备番茄的干燥叶片的细胞核提取物；然后按照步骤二所述核dna含量测定的方法测定核dna含量。

经过流式细胞仪分析检测结果如图7结果所示，结果显示：对照组的峰形较宽，变异系数cv较大，而0.5％tween-20组获得的荧光峰形对称，窄而高，变异系数cv均小于不加tween-20的对照组和0.1％tween-20组。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。