一种用于发酵豌豆纳豆的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于发酵豌豆纳豆的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

豌豆(pisumsativuml.)，又名寒豆、麦豆、荷兰豆。豌豆适应性强，地理分布广泛，我国是世界第二大豌豆生产国，产量占全世界的三分之一。豌豆营养价值高且均衡，碳水化合物约占60％，蛋白含量次之，含有8种人体必需氨基酸，其蛋白的生物价为48％-64％，功效比为0.6-1.2，高于大豆。此外，豌豆还富含膳食纤维、维生素和矿物质，而脂肪含量很低。中医认为，豌豆味甘、性平，归脾、胃经，具有益中气、止泻痢、调营卫、利小便、消痈肿、解乳石毒的功效。现代药理表明，豌豆具有增强机体免疫功能，抗癌防癌，促进肠道蠕动，抗菌消炎和保护视力等功效。因此豌豆的保健功效越来越受到关注。

纳豆是黄豆经纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisvar.natto)发酵制成的豆制品，起源于中国古代，距今有千年的食用历史，由唐朝鉴真东渡时期传入日本，并在日本得到发展。纳豆含有丰富的人体所需的多糖类、异黄酮、不饱和脂肪酸、叶酸、皂甙、卵磷脂、吡啶二羧酸、食物纤维、矿物质、维生素k2、γ-聚谷氨酸等，这些生理活性物质的集合，能够全面提高身体机能和免疫力。1987年日本科学家在纳豆中发现具有溶解和预防血栓形成的纳豆激酶，使得纳豆工业化生产快速发展，并且其含有的维生素k2可帮助成骨细胞分泌的初级骨钙素羧化，变成活性骨钙素，从而促进血液中的钙离子沉积入骨，是人体中不可缺少的重要维生素之一。

以豌豆为原料，结合传统的纳豆发酵工艺，使豌豆在保留原有营养物质基础上，生成特有的纳豆激酶、维生素k2等活性物质，增加产品功效，对预防便秘、腹泻等肠道疾病，提高骨密度、预防骨质疏松，预防心脑血管、癌症等疾病具有重要意义。

文献《豌豆纳豆的研制》(王世宽、冉燃、侯华，中国调味品，第九期，2008年9月)公开了豌豆纳豆的生产工艺，具体步骤包括：原料精选，选择富含可溶性糖的豌豆；浸泡：将清洗过后的豌豆，在室温(25℃)下，浸泡12h，豌豆：水为1：3；蒸煮：豌豆的蒸煮条件控制在121℃，0.1mpa，20min；接种：将蒸煮后的豌豆冷却到40-50℃左右接种，先将纳豆菌制成10³cfu/ml左右的菌悬液，每200g湿豌豆中加适量的菌悬液，并使之混匀；发酵：接好中的原料用消毒过的纱布盖好，放入恒温培养箱中，39℃下发酵；后熟：放入冰箱，控制温度在4-5℃，后熟24h，使产品风味更佳。该文献中对利用豌豆加工纳豆的工艺条件进行了探讨，认为制备的豌豆纳豆豌豆黏性适宜，香味浓郁，风味佳。目前国内外还未就豌豆纳豆展开进一步相关探讨，也未对豌豆纳豆中含有的纳豆激酶、维生素k2、益生菌等重要生物活性物质展开进一步研究。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于发酵豌豆纳豆的枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明从豆豉中筛选出高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌h16，采用本发明的菌株，可以得到具有高纳豆激酶活性、高维生素k2和益生菌含量的豌豆纳豆，该方法操作简单、周期短，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产，并以豌豆为原料，成本低、来源丰富，同时提高了豌豆的经济价值，将其作为功能性食品和保健食品进行开发应用，为纳豆生产提供了新的思路。

本发明采用的技术方案如下：

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)h16，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.19216，保藏日期：2019年12月17日。

上述枯草芽孢杆菌h16用于发酵生产纳豆。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌h16用于发酵生产豌豆纳豆。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌h16用于发酵生产豌豆纳豆，包括以下步骤：

(1)浸泡与蒸煮：将豌豆去除杂质，清洗干净，25-30℃浸泡4-8h，110-121℃蒸煮30min-60min，冷却至40-80℃，温度低于40℃不利于后续发酵过程；

(2)接种与发酵：将枯草芽孢杆菌h16接种到lb液体发酵培养基中，35-38℃，180-220rpm振荡培养10-14h，4500-5500rpm离心4-6min，收集菌体，后用无菌水稀释至菌液浓度为(0.5-1.5)×10³cfu/ml；向步骤(1)冷却后的豌豆中接种质量百分比为2-6％的菌株h16，平铺于灭菌的锡箔纸上，厚度为15-25mm，将灭菌的湿纱布覆盖于豌豆上部，置于恒温培养箱，35-39℃恒温发酵15-20h，制得发酵豌豆纳豆；

(3)后熟：将步骤(2)制得的发酵豌豆纳豆置于0-4℃中静置10-18h，制得成品豌豆纳豆。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，豌豆含水量控制为52％。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中豌豆平铺厚度为20mm。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中发酵豌豆纳豆放置于4℃冰箱中过夜14h。

本发明利用枯草芽孢杆菌h16制备的豌豆纳豆具有高纳豆激酶活性、高维生素k2和益生菌含量，上述豌豆纳豆中纳豆激酶含量为3736-5078iu/g，维生素k2为8.68-9.89ng/g，益生菌的数量为(1.08-1.27)×10⁸个/g，具有很好的营养保健协调作用，可用于制备降血脂、溶栓药物。

本发明技术方案的有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16来源于豆豉，未经过基因工程与遗传工程改造，作为发酵食品和保健品菌株安全性高。

(2)本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16能发酵生产豌豆纳豆，该豌豆纳豆中纳豆激酶活性高，维生素k2含量高，并富含益生菌，开发了新型纳豆食品和保健品。

(3)本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16发酵生产豌豆纳豆方法操作简单、周期短，并以豌豆为原料，成本低、来源丰富，同时所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。

附图说明

图1为尿激酶标准曲线；

图2为本发明涉及枯草芽孢杆菌h16发酵豌豆纤溶活性测定平板照片；

图3为本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16制备的豌豆纳豆照片；

图4为枯草芽孢杆菌cicc10456制备的豌豆纳豆照片；

图5为枯草芽孢杆菌cicc10260制备的豌豆纳豆照片。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的阐述，但保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的内容，按本领域现有技术进行。

plantvk2elisakit购自上海江莱生物科技有限公司。

一种用于发酵豌豆纳豆的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)h16，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：cgmccno.19216，保藏日期：2019年12月17日。

枯草芽孢杆菌h16来源于豆豉，未经过基因工程与遗传工程改造，作为发酵食品和保健品菌株安全性高。

实施例1

上述枯草芽孢杆菌h16制备豌豆纳豆的方法，包括以下步骤

(1)取成熟饱满、色泽好、无虫蛀和鼠咬的市售豌豆100g加入200ml25℃清水浸泡4h，115℃40min蒸熟，冷却至50℃，豌豆含水量控制为50％。

(2)将枯草芽孢杆菌h16接种到lb液体发酵培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h，5000rpm离心5min，收集菌体，用无菌水将菌体稀释至菌液浓度为0.5×10³cfu/ml，作为接种液；向步骤(1)制得的豌豆中接种2％的接种液，将接种后的豌豆平铺于灭菌的锡箔纸上，厚度为15mm，将灭菌的四层湿纱布覆盖于豌豆上部，置37℃培养16h，制得发酵豌豆纳豆。

(3)将步骤(2)制得的发酵豌豆纳豆放置于4℃冰箱中过夜10h，制得成品豌豆纳豆。

实施例2

上述枯草芽孢杆菌h16制备豌豆纳豆的方法，包括以下步骤

(1)取成熟饱满、色泽好、无虫蛀和鼠咬的市售豌豆100g加入300ml28℃清水浸泡6h，115℃45min蒸熟；冷却至55℃，豌豆含水量控制为52％。

(2)将枯草芽孢杆菌h16接种到lb液体发酵培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h，5000rpm离心5min，收集菌体，用无菌水将菌体稀释至菌液浓度为1.2×10³cfu/ml，作为接种液，向步骤(1)制得的豌豆中接种4％的接种液，将接种后的豌豆平铺于灭菌的锡箔纸上，厚度为20mm，将灭菌的四层湿纱布覆盖于豌豆上部，置37℃培养18h，制得发酵豌豆纳豆。

(3)将步骤(2)制得的发酵豌豆纳豆放置于4℃冰箱中过夜14h，制得成品豌豆纳豆，见图3。

实施例3

上述枯草芽孢杆菌h16制备豌豆纳豆的方法，包括以下步骤

(1)取成熟饱满、色泽好、无虫蛀和鼠咬的市售豌豆100g加入400ml28℃清水浸泡8h，115℃50min蒸熟；冷却至55℃，豌豆含水量控制约55％。

(2)将枯草芽孢杆菌h16接种到lb液体发酵培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h，5000rpm离心5min，收集菌体，用无菌水将菌体稀释至菌液浓度为0.8×10³cfu/ml，作为接种液，向步骤(1)制得的豌豆中接种6％的接种液，将接种后的豌豆平铺于灭菌的锡箔纸上，厚度为25mm，将灭菌的四层湿纱布覆盖于豌豆上部，置37℃培养20h，制得发酵豌豆纳豆；

(3)将步骤(2)制得的发酵豌豆纳豆放置于4℃冰箱中过夜18h，制得成品豌豆纳豆。

对比例1

与实施例2相比，不同之处在于，豌豆纳豆的制备过程不使用枯草芽孢杆菌h16，而是使用枯草芽孢杆菌cicc10456，最终制得成品豌豆纳豆见图4。

对比例2

与实施例2相比，不同之处在于，豌豆纳豆的制备过程不使用枯草芽孢杆菌h16，而是使用枯草芽孢杆菌cicc10260，最终制得成品豌豆纳豆见图5。

对比例3

与实施例2相比，不同之处在于，不使用豌豆，而是使用黄豆，最终制得成品黄豆纳豆。

对比例4

与实施例2相比，不同之处在于，不使用豌豆，而是使用黄豆，不使用枯草芽孢杆菌h16，而是使用枯草芽孢杆菌cicc10456，最终制得成品黄豆纳豆。

对比例5

与实施例2相比，不同之处在于，不使用豌豆，而是使用黄豆，不使用枯草芽孢杆菌h16，而是使用枯草芽孢杆菌cicc10260，最终制得成品黄豆纳豆。

效果例

实施例1-3与对比例1-5制备的纳豆成品的感官评价及其相关指标的检测，检测结果见表1。

维生素k2使用plantvk2elisakit进行测定。

本发明的枯草芽孢杆菌制备的豌豆纳豆中纳豆激酶活性测定，按照下述步骤进行：

采用改良后的琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性：将成熟纳豆和生理盐水以1:1(m：v，单位kg/l)的比例充分混合，200rpm振荡2h后，静止2h，上清液即为纳豆激酶粗提液。10ml1.2％的琼脂糖原溶液于45℃水浴保温30min，1％的纤维蛋白原溶于10mlpbs缓冲液，40℃水浴保温5min，二者迅速混匀，并加入200μl100u/ml凝血酶，快速导入无菌培养皿中，室温水平放置1h，打孔备用。取纳豆激酶粗提液10μl，37℃恒温反应18h后取出，测量溶纤圈的两垂直直径，根据标准曲线计算纳豆激酶活力，以尿激酶标准品的单位数为横坐标，尿激酶标准品溶纤圈两垂直直径的乘积为纵坐标，绘制标准曲线如图1。

表1

本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16发酵获得的纳豆，具有拉丝强韧，口感爽滑，氨味低，并且含有的纳豆激酶、维生素k2等营养品质明显高于其它枯草芽孢杆菌发酵生产的纳豆；本发明涉及的枯草芽孢杆菌16在相同条件下发酵的豌豆纳豆和黄豆纳豆，豌豆纳豆含有的纳豆激酶、维生素k2含量高于黄豆纳豆；其它枯草芽孢杆菌在相同条件下发酵的豌豆纳豆和黄豆纳豆，豌豆纳豆含有的纳豆激酶、维生素k2含量底于和黄豆纳豆；由此说明本发明涉及的枯草芽孢杆菌h16用于发酵豌豆纳豆具有显著的特异性。