基因Zm00001d040827在提高玉米产量中的应用的制作方法

本发明涉及基因zm00001d040827在提高玉米产量中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

玉米是粮、经、饲多元作物，在国民生产、生活中发挥着重要作用，因此持续提升玉米产量具有现实意义和战略前景。百粒重作为重要的产量构成因素，是玉米产量的形成的关键因子。随着分子生物学的快速发展，挖掘、验证控制百粒重的基因并整合在植物体内是一种简捷、快速、高效的育种策略。

当前，玉米百粒重的遗传解析主要集中在qtl初步定位，控制玉米百粒重相关基因的精细定位、克隆验证鲜有报道。

随着测序技术的进步，分子标记开发越来越便捷。基于此，关联作图(gwas)应运而生，其包括全基因组关联分析和候选基因关联分析。全基因组关联分析是以群体连锁不平衡衰退(ld)为依据，结合基因型和性状表型值，从而挖掘控制性状的显著标记，进而锚定候选基因。传统qtl定位结果为特定区段，而由于区段内的基因个数多，研究人员很难直接确定真正控制性状的基因。而全基因组关联分析能直接定位至基因，检测效率和准确度都大大提高。候选基因关联分析是指结合预测的候选基因在群体材料中的变异位点与表型值进行关联分析，从而鉴定显著变异位点或优异单倍型。因此，结合全基因组关联分析与候选基因关联分析能够更加准确地鉴定控制目标性状的基因。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供基因zm00001d040827在提高玉米产量中的应用，本发明确定了zm00001d040827基因与玉米产量的关系，验证了该基因在玉米产量提升中的重要性。

玉米zm00001d040827基因在改善玉米株系表型、提高玉米产量方面的应用。

进一步的，上述玉米株系表型包括叶片叶绿素含量、玉米百粒重、玉米单穗产量。

进一步的，上述应用中所述玉米zm00001d040827基因的序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种提高玉米产量的方法，所述方法包括：上调玉米zm00001d040827基因的表达。

进一步的，上述方法中所述上调玉米zm00001d040827基因的表达：将玉米zm00001d040827基因优异单倍型采用农杆菌侵染法遗传转化至玉米自交系18-599r幼胚中，对遗传世代进行纯合提高叶片叶绿素含量、提高玉米百粒重、提高玉米单穗产量，从而提高玉米产量，从而提高玉米产量。

培育一种高产玉米的方法，包括如下步骤：将玉米zm00001d040827基因优异单倍型转化至玉米幼胚中，通过共培养、抗性筛选、愈伤组织诱导、继代、分化，获得t0代转基因玉米，通过连续自交及目的基因pcr检测获得稳定的t2代纯合转基因株系，获得过量表达玉米zm00001d040827基因的玉米，获得高产玉米。

有益效果：

(1)首次明确了zm00001d040827基因与玉米产量的关系，验证了该基因在玉米产量提升中的重要性，为利用该基因在提高玉米产量的应用奠定了理论依据。

(2)zm00001d040827基因通过提高叶片叶绿素含量、提高玉米百粒重、提高玉米单穗产量，从而提高玉米产量。

(3)该基因属于玉米产量领域，具有广阔的应用前景，经济效益潜力巨大。

附图说明

图1控制百粒重的显著位点manhattan图。

图2基于zm00001d040827关联分析的单倍型分析结果。

图3基因zm00001d040827在t2代转基因株系灌浆期不同转化事件的功能叶相对表达量。

图4t2代转基因株系不同转化事件叶绿素含量。

图5t2代转基因株系不同转化事件百粒重。

图6t2代转基因株系不同转化事件单穗产量。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1采用全基因组关联分析鉴定控制玉米百粒重基因zm00001d040827

1-1关联分析群体种植及表型数据获取

将包含315份自交系的关联分析群体按照随机区组标准种植于四川洪雅、云南景洪、四川雅安三个环境，每一环境设置两次重复。每个自交系种植两行，行长3米，行间距离0.8米，每行种植14株，密度约为58000株/公顷。田间种植及管理于常规玉米种植相同。成熟期后收获、考种。每一个自交系随机选取100颗籽粒测定重量，测定三次取平均值作为该自交系的表型值。利用统计软件spss20.0评价群体性状表型，结果表明：群体表型值频次数呈典型正太分布；利用公式h²b＝σ²g/(σ²g+σ²ge/n+σ²/nb)(σ²g：遗传方差；σ²ge：基因环境互作方差；n：环境＝3；b：每一环境重复数＝2)计算性状广义遗传力，结果显示h²b＝0.81。以上表型分析结果表明百粒重主要受基因型控制，表型值符合数量遗传特性，适合进行关联分析。根据315份自交系群体结构划分结果，选取80份自交系进行关联分析。

1-280份材料亚群体基因型获取

采用重测序技术，对选取的80份自交系材料进行5×重测序，共获得5,018,897个标记。对基因型缺失率＞0.3、杂合率＞0.3、最小等位频率＜0.05的进行删除，共获得1,479,397个高质量标记。

1-3全基因组关联分析挖掘控制百粒重的候选基因

联合80份材料的百粒重表型值和1,479,397个标记，进行全基因组关联分析。为了更准确的锚定候选基因，关联作图采用了glm+q、farmcpu、mlm三种模型控制假阳性和假阴性。以p＝1×10^-4为阈值，三种模型分别检测到26、58、9个显著位点，其中标记s3-68158825能被三种模型共同检测到(图1)。图1中的a：一般线性模型(glm+q)检测到的显著位点；图1中的b：混合线性模型检测到的显著位点；图1中的c：farmcpu模型检测到的显著位点。标记s3-68158825为三种模型共同检测到的显著位点。s3-68158825落在基因zm00001d040827上。因此，该基因被初步确定为控制百粒重的候选基因。

实施例2.候选基因zm00001d040827的关联分析及单倍型鉴定

采用ctab法分别提取关联分析群体中315材料的dna。根据基因zm00001d040827的dna序列及启动子区(2000bp)设计引物，进行pcr扩增。

扩增启动子区引物信息：

dna扩增序列体系：

pcr扩增程序如下：

扩增结果共发现205个标记，其中17个indels,188个snps变异位点。结合205个标记及百粒重表型进行候选基因关联分析(模型：mlm；p＝0.05)，结果显示三个标记：snp-3-68160672、snp-3-68159986、snp-3-68159004同时在四川洪雅、云南景洪、四川雅安及最佳线性无偏预测(blup)四种环境下呈显著。基于这三个显著标记，共鉴定到两种单倍型，分别为hapi(ccccgg)、hapii(ttttaa),hapii(ttttaa)为优异单倍型，如图2所示。图2中的a：hapi、hapii在blup中的百粒重；图2中的b：hapi、hapii在云南景洪中的百粒重；图2中的c：hapi、hapii在云四川洪雅中的百粒重；图2中的d：hapi、hapii在云四川雅安中的百粒重。表明：基因zm00001d040827在hapii材料中能起到较好的控制百粒重的作用。

实施例3.基因zm00001d040827优异单倍型在玉米中的遗传转化及纯合

3-1优异单倍型材料的rna提取及cdna获取

挑选优异单倍型材料籽粒饱满种子，均匀放于洗净的石英砂中，28℃培养箱中培养。待幼苗长到3叶期，取新鲜叶片提取rna。提取方法按照invitrogen公司trizol试剂盒手册进行。提取的rna利用takara公司的rtreagentkit(perfectrealtime)反转录为cdna，反应体系以及程序如下：

基因组dna的除去反应(totalrna用量：最大1μl)：

反转录反应体系：

3-2基因zm00001d040827的cds区扩增

(1)引物设计：根据候选基因的cds区序列在primer5.0设计引物。

扩增cds区引物信息：

(2)pcr扩增目的基因cds区体系如下：

(3)pcr扩增程序如下：

3-3表达载体与目的基因的连接

以ubi作为启动子、nos为终止子、bamhⅰ为酶切位点、bar为筛选标记、cub载体为骨架，采用同源重组法将zm00001d040827的cds区连接到ubi启动子和nos终止子之间，构建玉米中的过表达载体。

3-4农杆菌介导的玉米遗传转化

将过表达载体利用农杆菌侵染法转入玉米18-599r幼胚，通过共培养、抗性筛选、愈伤组织诱导、继代、分化等步骤，获得t0代转基因玉米。通过连续自交及目的基因pcr检测获得稳定的t2代纯合转基因株系。

实施例4.基因zm00001d040827转入玉米的证实

为了证实zm00001d040827是否整合在玉米基因组。随机选取三个不同转化事件进行实时荧光定量pcr(qpcr)分析，以野生型玉米18-599r为对照。

qrt-pcr引物信息：

qrt-pcr扩增体系：

反应程序为：95℃30s；95℃5s，tm(引物最适退火温度)30s，40cycles；95℃10s；65℃5s，65℃到95℃绘制融解曲线。

定量结果表明：三个转化事件中，zm00001d040827的相对表达量均显著高于野生型中基因的表达量(图3)，表明基因zm00001d040827稳定整合在玉米基因组中。

实施例5.玉米转基因株系的表型

对三个玉米转化事件进行了不同时期，不同叶片叶绿素含量测定。结果显示：在苗期、拔节期、灌浆期转化事件oe1、oe2、oe3叶片叶绿素均显著高于野生型(对照)(图4)。图4中的a：苗期不同转化事件叶绿素含量；图4中的b：拔节期不同转化事件叶绿素含量；图4中的c：成熟期不同转化事件叶绿素含量。进一步对百粒重、单穗产量进行分析测定，结果均表明三个转化事件在百粒重、单穗产量上均显著高于野生型(对照)(图5、图6)。图5中的a：不同转化事件百粒重表型；图5中的b：不同转化事件百粒重数据分析.图6表示不同转化事件单穗平均产量数据分析。以上结果表明：过量表达zm00001d040827能提高玉米百粒重，进而提高产量。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>四川农业大学

<120>基因zm00001d040827在提高玉米产量中的应用

<130>202020

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1096

<212>dna

<213>序列

<400>1

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ggctgcaccacagagtcctgttccctgaagcctgcgccgactgctcggccacctcgcctc180

cgctcgctcgccggccgggcgcctcttgtctgcgcctctctcgggatatctcatgataaa240

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ggtgttcttgggcgaatcatagctgagaagtggaaaaaggagcatccaagttgcaaagtt360

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tctggttcagatgattaccctagggatgtcagattggcagcatcaaattggactggtgaa540

ggatctttcctgtttacatcaagtacagctctgtatgattgcagtgacaacagcatgtgc600

aacgaggatgctgcctcccttgctgtagcaatcatgaaaaagggactgcggagtcgaata660

tttctgggttgtgacaacaagcccctttccaggcaagaaataatggatgctgttaacaat720

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agaatggagaattcaaaaactcgggctgagatcggttgggaaccaaagtatccaagcttc840

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ttgagctatgaaccagacagatgccaccccatcccatcggataatatatattgtcacgtg1080

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<212>prt

<213>序列

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metargalaalaalaalaalaserphehisleualaproalathrlys

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115120125

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130135140

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gluglyserpheleuphethrserserthralaleutyraspcysser

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lystyrproserphethrglupheleuglyileserser

260265