一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法与流程

本发明涉及多肽制备技术领域，尤其涉及一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法。

背景技术：

油茶（camelliaoleiferaabel）系山茶科山茶属多年生木本植物，是我国特有的木本油料树种，也是与油棕、橄榄和椰子齐名的四大木本油料之一，主要分布在我国南方如湖南、江西、广西、浙江、福建、安徽、贵州等省区。油茶籽粕是油茶籽提取茶油后的副产物，含有丰富的营养物质。据报道，油茶籽粕中含糖类30%~40%、粗蛋白12%~15%、粗脂肪1%~5%、粗纤维6%~39%、灰分2%~6%、茶皂素10%~15%、单宁1~2%，并且还含有多种无机微量元素如铁、铜、锰、锌、镁、钙等。随着茶油需求量、产出量的不断增加，加工副产物油茶籽粕也不断增加，但是目前大多数的油茶籽粕只是作为有机肥料或燃料来使用，其开发利用程度远远不够，造成了大量资源的浪费，因此油茶籽粕的综合加工利用研究具有重要意义。

油茶籽粕中蛋白质的氨基酸组成比较全面，富含17种氨基酸，其中苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸8种氨基酸是人体必需氨基酸，而且氨基酸的组成和含量均符合联合国粮食组织与世界卫生组织的推荐值，是一种优质的蛋白质资源。以油茶籽粕为原料直接提取蛋白，可以作为动物饲料、加工食品等的蛋白来源。蛋白质经过多种方法水解后，可得到多肽、氨基酸以及少量蛋白质的复合水解物，其中多肽不仅有利于机体消化吸收，还具有广泛的生物活性，例如免疫调节、激素调节、抗病毒、抗菌、抗氧化、降血压、降血脂、降低胆固醇等。因此将油茶籽粕中的蛋白质制备成活性多肽，可以为油茶籽粕蛋白资源的开发利用提供一条新的途径。

多肽的制备方法技术很多，不同的方法和使用不同的技术以及在同一技术中不同条件的选择，所获得多肽的品质和生化性质也大不一样。目前，制备多肽的方法主要有化学水解法、酶解法和微生物发酵法。化学水解法的工艺很难控制，生产的多肽分子分布不均，产品质量不稳定，产物生理功能差异大，同时氨基酸易发生破坏，产生有害产物，对环境污染较大，现已很少采用。酶解法是一种温和有效的方法，由于酶专一性好、效率高，能缩短水解时间，并能较好地控制水解度，使产物易于分离，非常适合工业化生产需求。但是随着酶解反应的深入研究，酶解法存在的局限也随之浮现。例如酶解法首先要提取原料中的蛋白，提取工艺较为复杂；提取的蛋白再经过酶解得到多肽，而酶制剂较为昂贵，因此生产成本较高，且不能够消除原料中的抗营养因子。而微生物发酵法可直接利用原料进行发酵，并且微生物能够产生多种酶，包括部分人类未能合成的酶，它们在特定的发酵条件下，把蛋白质酶解成了多肽以及氨基酸，不仅能降解原料中的抗营养因子还能简化生产步骤，相对于化学水解法污染低，几乎无毒害副产物生成；与酶解法相比，成本低、适用性较强，具有更广阔的应用前景。

微生物发酵法制备多肽可分为固态发酵和液态发酵两种。前者操作简单，所用的培养基含水量少，对无菌条件的要求不是很高，后处理简单且污染物少。但是固态发酵制备的多肽得率不高，且发酵周期很长。而液态发酵法微生物生长繁殖迅速，蛋白质能够充分降解，发酵过程也易于控制，虽然对无菌条件的要求相对较高，但是从多肽含量和多肽得率考虑，液态发酵法更具优势。

目前油茶籽多肽的制备方法大多为酶解法，相关专利和文献较多，而采用发酵法制备油茶籽多肽的研究报道很少，并且常规的微生物发酵法普遍存在发酵效率低、蛋白利用率、多肽含量和得率低等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化与扩大培养：将纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的菌种分别接种于lb固体培养基和mrs固体培养基中，37℃培养24h使菌种活化；再从活化后的菌种斜面以无菌操作方式挑取2~3环菌种，转接于相应液体培养基中扩大培养，使菌体浓度达到10⁷~10⁸cfu/ml，制备成用于发酵的种子液；

2）液体发酵培养基制备：将油茶籽粕预处理后，按照以下配方制备发酵培养基：油茶籽粕100~150g/l，果糖5~15g/l，氯化钠6~14g/l，硫酸镁0.5~1.0g/l，硫酸锰0.02~0.06g/l，磷酸二氢钾3.5~6.5g/l，磷酸氢二钠0.8~2.0g/l，碳酸钙2.0~4.0g/l，聚乙二醇-2000.8~1.2g/l，初始ph为6.5~7.0，并进行灭菌处理；

3）磁场辅助发酵培养：取液体发酵培养基同时接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液，进行发酵培养，并在发酵培养全过程中施加低强度磁场；发酵温度为30~38℃，摇床转速为150~250r/min，发酵时间为24~48h；

4）发酵液处理：发酵结束后，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为油茶籽多肽粗提液。

步骤1）中，扩大培养的具体方法为：将纳豆芽孢杆菌转接于lb液体培养基中，在37℃、150~200r/min摇床培养12~18h；将干酪乳杆菌转接于mrs液体培养中，在37℃、150~200r/min摇床培养18~24h。

步骤2）中，油茶籽粕预处理的方法为：将机械压榨或低温冷榨油茶籽粕晾晒、烘干，用粉碎机粉碎，过60~80目筛网。

步骤2）中，灭菌处理的条件为115℃灭菌20~30min。

步骤3）中，纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的总接种量为8%~12%，接种比例为1:1。

步骤3）中，发酵温度优选为34℃，摇床转速优选为200r/min，发酵时间优选为36h。

步骤3）中，低强度磁场是指磁场强度为20~30ka/m的磁场。

步骤4）中，油茶籽多肽粗提液还需经过滤、真空浓缩、冷冻干燥、筛分等步骤得到油茶籽多肽产品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明选用纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌作为复合菌种，两种菌种均能产生较强活性的蛋白酶，且所产酶系不同，可以形成互补，与单一菌种发酵相比更能充分降解油茶籽粕中的大分子蛋白，生成具有生物活性的多肽。

（2）本发明通过对发酵培养基成分、发酵条件的优化明确了油茶籽粕液态发酵制备多肽的最优发酵工艺，并且本发明在整个发酵过程中施加低强度磁场，通过磁场辅助作用，可以有效促进菌种的生长代谢，提高其产酶能力，从而提升了菌种对培养基的转化效率，发酵后油茶籽多肽含量达到12.63mg/ml，多肽得率达到10.53%。

（3）本发明制备的油茶籽多肽分子量小，抗氧化活性强，对dpph自由基的清除率达到77.40%，对oh自由基的清除率达到89.25%。本发明技术方案无污染，成本低，产品安全、无毒、无副作用，具有较高的推广价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为油茶籽粕添加量对多肽含量的影响；

图2为聚乙二醇-200添加量对多肽含量的影响；

图3为接种量对多肽含量的影响；

图4为发酵温度对多肽含量的影响；

图5为发酵时间对多肽含量的影响。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

纳豆芽孢杆菌（bacillusnatto）由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，编号accc19833；干酪乳杆菌（lactobacilluscasei）由中国工业微生物菌种保藏中心提供，编号cicc20277；低温冷榨油茶籽粕，购于福建省天福油脂有限公司，其中粗蛋白含量为14.37%。

实施例1

一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化与扩大培养：将纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的菌种分别接种于lb固体培养基和mrs固体培养基中，37℃培养24h使菌种活化；再从活化后的菌种斜面以无菌操作方式挑取2~3环菌种，将纳豆芽孢杆菌转接于lb液体培养基中，在37℃、180r/min摇床培养18h；将干酪乳杆菌转接于mrs液体培养中，在37℃、180r/min摇床培养24h，使菌体浓度达到10⁷~10⁸cfu/ml，制备成用于发酵的种子液；

2）液体发酵培养基制备：将低温冷榨油茶籽粕晾晒、烘干，用粉碎机粉碎，过60~80目筛网，按照以下配方制备发酵培养基：油茶籽粕120g/l，果糖10g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁0.75g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾5.0g/l，磷酸氢二钠1.4g/l，碳酸钙3.0g/l，聚乙二醇-2001.0g/l，初始ph为6.8，115℃灭菌20min；

3）磁场辅助发酵培养：取液体发酵培养基同时接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液，总接种量为10%，接种比例为1:1，进行发酵培养，并在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场；发酵温度为34℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为36h；

4）发酵液处理：发酵结束后，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为油茶籽多肽粗提液。

实施例2油茶籽粕液态发酵工艺的优化试验

多肽含量测定

标准曲线绘制：用5%tca（三氯乙酸）溶液依次配制质量浓度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4mg/ml的gly-gly-tyr-arg四肽标准溶液，然后各取6.0ml标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于波长540nm处测od值。以四肽质量浓度为横坐标x（mg/ml），od值为纵坐标y，制作标准曲线。

样品测定：取2ml样品溶液，加入2ml10%tca溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置30min，然后在10000r/min下离心10min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，用5%tca溶液定容至刻度，摇匀。取6ml上述溶液置于试管中，加入双缩脲试剂4ml，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定od值。与标准曲线对照得出样品溶液中的多肽含量。

2.1油茶籽粕添加量的选择

按照实施例1中的方法，以发酵培养基中油茶籽粕添加量为考察因素，分别制备油茶籽粕添加量为40g/l、80g/l、120g/l、160g/l、200g/l的发酵培养基，接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液后进行发酵培养，总接种量为10%，接种比例为1:1，发酵温度为34℃、摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场。发酵结束后取上清液测定多肽含量，结果见图1。

油茶籽粕是主要发酵底物，同时也是纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的氮源。由图1可以看出，随着油茶籽粕添加量的增加，粗提液中多肽含量先上升后下降，在油茶籽粕添加量为120g/l时，多肽含量达到最大值。当油茶籽粕添加量在40~120g/l之间，多肽含量逐渐增加，这是因为随着底物浓度的增加，蛋白含量提高，为菌体提供了充足的营养，有利于菌体的生长和代谢；当油茶籽粕添加量进一步的增大，会导致水分含量降低，发酵液变得粘稠，溶氧量降低，而纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌都是好氧菌，因此对菌体的生长和代谢有一定的负面影响，所以多肽含量又有所降低。

2.2聚乙二醇-200添加量的选择

按照实施例1中的方法，以发酵培养基中聚乙二醇-200添加量为考察因素，分别制备peg-200添加量为0、0.5g/l、1.0g/l、1.5g/l、2.0g/l、2.5g/l的发酵培养基，接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液后进行发酵培养，总接种量为10%，接种比例为1:1，发酵温度为34℃、摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场。发酵结束后取上清液测定多肽含量，结果见图2。

由图2可以看出，当peg-200添加量为1.0g/l时，粗提液中多肽含量达到最高，低于或高于这个添加量时都会使多肽含量降低。peg-200是一种非离子型表面活性剂，即在水溶液中不电离，不会产生离子。适量添加peg-200可以增加菌种细胞膜的通透性，促进菌种蛋白酶的分泌，有利于提高菌种对发酵底物的转化效率。

2.3接种量的选择

按照实施例1中的方法，以总接种量为考察因素，取液体发酵培养基同时接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液，接种比例为1:1不变，总接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%，发酵温度为34℃、摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场。发酵结束后取上清液测定多肽含量，结果见图3。

由图3可以看出，随着接种量的增加，粗提液中多肽含量呈上升趋势，在接种量为10%时多肽含量达到最大值，当接种量在10%~14%之间时，多肽含量呈现下降趋势，这是因为当接种量过大时，微生物大量生长繁殖，导致发酵后期培养基内营养不足，部分微生物死亡或利用酶解出的小分子多肽用于自身生长发育所致。因此，接种量以10%为最佳。

2.4发酵温度的选择

按照实施例1中的方法，以发酵温度为考察因素，取液体发酵培养基同时接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液，接种比例为1:1，总接种量为10%，发酵温度分别为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场。发酵结束后取上清液测定多肽含量，结果见图4。

液态发酵过程中，温度是微生物生长以及产酶的主要因素之一，控制温度十分重要。由图4可以看出，随着发酵温度的增加，多肽含量趋势为先增后降，在34℃时发酵效果达到最佳。因为发酵温度较低时，菌种的代谢活动较弱，酶活力也较低；发酵温度过高，又将使菌种的生长受到抑制，酶活力同样不高。因此，发酵温度以34℃为最佳。

2.5发酵时间的选择

按照实施例1中的方法，以发酵时间为考察因素，取液体发酵培养基同时接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液进行发酵培养，接种比例为1:1，总接种量为10%，发酵温度为34℃，摇床转速为200r/min，在发酵培养全过程中施加磁场强度为20~30ka/m的低强度磁场，发酵时间72h，每隔12h取上清液测定多肽含量，结果见图5。

由图5可以看出，在12h~36h范围内，多肽含量随发酵时间的增加而逐渐升高，在发酵36h时多肽含量达到最大值。而随着发酵时间的继续延长，多肽含量呈下降趋势，其原因可能是当菌体数量积累到一定程度时，培养液中营养不足，微生物需要利用酶解出的小分子多肽用于生长繁殖，致使产物产量减少。因此，发酵时间以36h为最佳。

对比例1

一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化与扩大培养：将纳豆芽孢杆菌接种于lb固体培养基中，37℃培养24h使菌种活化；再从活化后的菌种斜面以无菌操作方式挑取2~3环菌种，转接于lb液体培养基中，在37℃、180r/min摇床培养18h，使菌体浓度达到10⁷~10⁸cfu/ml，制备成用于发酵的种子液；

2）液体发酵培养基制备：将低温冷榨油茶籽粕晾晒、烘干，用粉碎机粉碎，过60~80目筛网，按照以下配方制备发酵培养基：油茶籽粕120g/l，果糖10g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁0.75g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾5.0g/l，磷酸氢二钠1.4g/l，碳酸钙3.0g/l，聚乙二醇-2001.0g/l，初始ph为6.8，115℃灭菌20min；

3）发酵培养：取液体发酵培养基接入纳豆芽孢杆菌的种子液进行发酵培养，接种量为10%，发酵温度为34℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加低强度磁场，磁场强度为20~30ka/m；

4）发酵液处理：发酵结束后，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为油茶籽多肽粗提液。

对比例2

一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化与扩大培养：将干酪乳杆菌的菌种接种于mrs固体培养基中，37℃培养24h使菌种活化；再从活化后的菌种斜面以无菌操作方式挑取2~3环菌种，转接于mrs液体培养中，在37℃、180r/min摇床培养24h，使菌体浓度达到10⁷~10⁸cfu/ml，制备成用于发酵的种子液；

2）液体发酵培养基制备：将低温冷榨油茶籽粕晾晒、烘干，用粉碎机粉碎，过60~80目筛网，按照以下配方制备发酵培养基：油茶籽粕120g/l，果糖10g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁0.75g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾5.0g/l，磷酸氢二钠1.4g/l，碳酸钙3.0g/l，聚乙二醇-2001.0g/l，初始ph为6.8，115℃灭菌20min；

3）发酵培养：取液体发酵培养基接入干酪乳杆菌的种子液进行发酵培养，接种量为10%，发酵温度为34℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为36h，并在发酵培养全过程中施加低强度磁场，磁场强度为20~30ka/m；

4）发酵液处理：发酵结束后，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为油茶籽多肽粗提液。

对比例3

一种油茶籽粕液态发酵制备活性多肽的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化与扩大培养：将纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的菌种分别接种于lb固体培养基和mrs固体培养基中，37℃培养24h使菌种活化；再从活化后的菌种斜面以无菌操作方式挑取2~3环菌种，将纳豆芽孢杆菌转接于lb液体培养基中，在37℃、180r/min摇床培养18h；将干酪乳杆菌转接于mrs液体培养中，在37℃、180r/min摇床培养24h，使菌体浓度达到10⁷~10⁸cfu/ml，制备成用于发酵的种子液；

2）液体发酵培养基制备：将低温冷榨油茶籽粕晾晒、烘干，用粉碎机粉碎，过60~80目筛网，按照以下配方制备发酵培养基：油茶籽粕120g/l，果糖10g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁0.75g/l，硫酸锰0.04g/l，磷酸二氢钾5.0g/l，磷酸氢二钠1.4g/l，碳酸钙3.0g/l，聚乙二醇-2001.0g/l，初始ph为6.8，115℃灭菌20min；

3）发酵培养：取液体发酵培养基接入纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的种子液进行发酵培养，总接种量为10%，接种比例为1:1，发酵温度为34℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为36h；

4）发酵液处理：发酵结束后，发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为油茶籽多肽粗提液。

实施例3

1、多肽含量与多肽得率的测定

多肽含量根据实施例2中方法测定；多肽得率根据以下公式计算：

多肽含量=（c×v）/m×100%

式中：c为发酵液中的多肽含量，mg/ml；v为发酵液的总体积，ml；m为油茶籽粕质量，mg。

2、多肽相对分子量分布的测定

采用高效凝胶过滤色谱法测定样品溶液的分子量分布，分析计算出多肽的相对分子量小于1000da所占质量分数。

3、多肽抗氧化活性的测定

dpph·清除能力测定：取样品溶液2ml，加入2ml0.1mmol/ldpph的95%乙醇溶液，混合摇匀，室温避光反应30min，用紫外分光光度计在517nm波长处测定吸光度。各实验重复3次，取平均值。样品对dpph·清除能力计算公式如下：

dpph·清除率（%）=[1-(a1-a2)/a3]×100%

式中：a1为样品吸光度；a2为空白组（用等量的95%乙醇溶液代替dpph溶液）吸光度；a3为对照组（用等量的95%乙醇溶液代替样品）吸光度。

·oh清除能力测定：取样品溶液1.0ml，依次加入2ml1.8mmol/lfeso4，1.5ml1.8mmol/l水杨酸-乙醇和0.1ml8.8mmol/lh2o2，37℃水浴30min，反应结束后用紫外分光光度计在510nm波长处测定吸光度。各实验重复3次，取平均值。样品对·oh清除能力计算公式如下：

·oh清除率（%）=(a0-ai)/a0×100%

式中：a0为对照组（以去离子水代替样品溶液）吸光度；ai为样品吸光度。

根据以上方法分别对实施例1、对比例1、对比例2和对比例3获得的油茶籽多肽粗提液进行测定，结果见表1。

从表1可以看出，实施例1与对比例1、对比例2、对比例3相比，无论是多肽含量、多肽得率还是dpph·清除率和·oh清除率均有显著提高，此外高活性多肽片段（相对分子量小于1000da）所占比例也显著上升，说明本发明采用的复合菌种发酵比单一菌种发酵具有更好的发酵效果，并且在发酵过程中施加低频磁场，对于发酵效果的提升也有显著作用。纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌均为好氧菌，适宜的生长温度接近，能够在一个体系中共生，两种菌种均能产生较强活性的蛋白酶，且所产酶系不同，可以形成互补，因此复合发酵可以充分降解油茶籽粕中的大分子蛋白，生成具有生物活性的多肽。磁场对微生物的生长代谢具有较大的影响，本发明在发酵过程中施加磁场强度在20~30ka/m的低频磁场，可以促进纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌的生长繁殖，提高其产酶活力，从而提高发酵产物的多肽含量与得率，并且对发酵产物多肽的抗氧化活性也有正向影响。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。