本发明属于甘油磷脂酰胆碱的制备
技术领域：
，具体涉及一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法。
背景技术：
：α-甘油磷脂酰胆碱(α-glycerylphosphorylcholine，α-gpc)又称甘油磷酸胆碱、甘磷酸胆碱，是动物体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物，经口服后，能到达胆碱突触末梢并增加乙酰胆碱的合成和释放。α-gpc不仅可以作为保健品，促进大脑中乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的生物合成，提高人的记忆能力和认知能力，也能有效治疗老年痴呆类疾病如阿尔茨海默病，被医药界称为“大脑的防衰老营养素”。α-gpc还可以保护肝脏，抵抗高脂蛋白的脂肪渗透，起到抗类风湿、抗高血脂和抗动脉硬化的作用。另外α-gpc在一定程度上能够增强人体肌肉力量，提高反应敏捷度。目前，国内外有关α-gpc的制备主要有直接萃取法、化学合成法和甲醇钠催化醇解法。随着生物酶技术在医药工业和食品工业中的广泛应用，近年来出现了酶法制备α-gpc。近年来，虽然α-gpc的制备取得了不错的进展，但目前国内有关α-gpc制备的技术均不是十分成熟，仍普遍存在α-gpc的得率和转化率低、反应时间长等缺陷，难以满足大规模生产α-gpc的要求。由于医药、食品、保健品等领域对α-gpc都具有很大的需求，并且在未来将有更大的市场。所以研发适用于大规模生产α-gpc的新工艺，提高α-gpc的得率，并缩短其反应时间具有重要的意义。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，该方法不仅可以提高α-gpc的得率和转化率，而且可以大大缩短α-gpc的提取时间，适用于大规模工业生产中。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：本发明提供一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，包括以下步骤：s1、将大豆卵磷脂添加到水-有机溶剂混合体系中，经搅拌混匀后制备得到反应混合液a，所述有机溶剂为亲水性有机溶剂；s2、往反应混合液a中加入氯化钴和氯化锰，经均质处理后制备得到反应混合液b；s3、往反应混合液b中加入磷脂酶a1、磷脂酶a2和脂肪酶bakezymelfp，经混匀后制备得到反应混合液c；s4、将反应混合液c的ph调节至6.0-7.0，然后将其置于多频超声-微波协同处理下进行反应，最后经分离得到α-gpc。大豆卵磷脂中含有疏水性的脂肪酸链和亲水基团(磷酸基、胆碱式乙醇胺)，将水相介质与亲水性有机溶剂混合，可以增加底物的溶解度，有利于反应的平衡向产物合成方向移动，不仅可以缩短反应的时间，而且可以提高α-gpc的得率；脂肪酶bakezymelfp与磷脂酶a1、磷脂酶a2复配，可以提高脱酰基的效率，加快中间产物酰基转移的速率，从而缩短了反应体系所用的时间，并提高底物的利用率和产品的得率；氯化钴和氯化锰的加入可以提高酶的催化活性，加快反应的进度，从而缩短了反应体系所用的时间；采用多频超声-微波协同处理反应体系时，可以使体系迅速发生乳化，促进了底物的分散，迅速增大反应界面，从而促使反应速度加快，并提高α-gpc的得率。优选的，s1步骤中，所述有机溶剂在水-有机溶剂混合体系中的体积浓度为5％-20％。在该浓度范围的混合体系中，大豆卵磷脂可以得到充分的溶解，更有利于α-gpc的提取分离。优选的，s1步骤中，所述亲水性有机溶剂选自乙腈、丙酮、异丙醇、正丙醇、丙二醇和叔丁醇中的至少一种。上述亲水性有机溶剂均为低沸点有机溶剂，容易分离。优选的，s3步骤中，磷脂酶a1的添加量为10-13u/ml，磷脂酶a2的添加量为10-13u/ml，脂肪酶bakezymelfp的添加量为5-10u/ml。在该酶浓度下，可以使底物(大豆卵磷脂)得到彻底的酶解分离。优选的，s4步骤中，多频超声-微波协同处理的温度为45-55℃，多频超声采用20/50khz双频模式，超声功率为150-250w，超声的脉冲模式为10s，间隔5s，微波的功率为200-400w。在上述多频超声-微波协同处理条件下可以最大限度的增加底物的分散度，加快酶促反应的速度，缩短反应时间，节约生产成本。优选的，s2步骤中，氯化钴和氯化锰的添加量均为50-80ug/l。上述金属离子的添加可以加快酶促反应的速度，缩短反应时间，节约生产成本，并且所添加的金属离子均为人体所必需的微量元素，对人体无危害。优选的，s1步骤中，所述大豆卵磷脂在水-有机溶剂混合体系中的质量分数为10-20％。在该底物浓度下可以使α-gpc取得最佳的纯度和得率。优选的，为得到纯的α-gpc，s4步骤的反应结束后，反应混合液经旋转蒸发得到粗α-gpc，粗α-gpc经硅胶柱色谱纯化后得到纯α-gpc。优选的，为使大豆卵磷脂得到充分的溶解，s1步骤中，搅拌的速率为230-260r/min，时间为20-30min。优选的，为使金属离子均匀分散在底物中，s2步骤中，均质处理的转速为10000r/min，时间为3-7min。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，将大豆卵磷脂添加到水-有机溶剂混合体系中，然后加入氯化钴、氯化锰、磷脂酶a1、磷脂酶a2和脂肪酶bakezymelfp，混匀后置于多频超声-微波协同处理下经反应后制备得到，α-gpc得率和反应时间的统计实验表明，采用本发明方法制备α-gpc，α-gpc的得率和转化率均较高，而且反应时间短，可以大大缩短α-gpc的提取时间，本发明α-gpc的得率为97.5％-98.7％，比现有技术(96.25％)提高1.30％-2.55％，α-gpc的转化率为86.7％-89.1％,比现有技术(70.65％)提高22.72％-26.11％，反应时间为50-60min，比现有技术(90min)缩短33.33％-44.44％。可见，本发明方法不仅可以提高α-gpc的得率和转化率，而且可以大大缩短α-gpc的提取时间，适用于大规模工业生产中。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，包括以下步骤：s1、将大豆卵磷脂添加到水-异丙醇混合体系(异丙醇的体积浓度为12％)中，使大豆卵磷脂的质量分数为15％，以245r/min的速率搅拌混匀25min，制备得到反应混合液a；s2、往反应混合液a中加入氯化钴和氯化锰，氯化钴的添加量为225ug/l，氯化锰的添加量为225ug/l，以10000r/min的转速均质处理5min，制备得到反应混合液b；s3、往反应混合液b中加入磷脂酶a1(8000u/ml)、磷脂酶a2(9000u/ml)和脂肪酶bakezymelfp(2750u/g)，磷脂酶a1的添加量为11.5u/ml，磷脂酶a2的添加量为11.5u/ml，脂肪酶bakezymelfp的添加量为7.5u/ml，经混匀后制备得到反应混合液c；s4、将反应混合液c的ph调节至6.5，然后将其置于多频超声-微波协同处理下进行反应，多频超声-微波协同处理的温度为50℃，多频超声采用20/50khz双频模式，超声功率为200w，超声的脉冲模式为10s，间隔5s，微波的功率为300w，最后反应混合液经旋转蒸发后得到粗α-gpc。s5、粗α-gpc经硅胶柱色谱纯化得到纯α-gpc：硅胶柱sunfiretmprepsilica(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃，梯度洗脱，流动相a为甲醇，流动相b为水，流速1.0ml/min；进样量10μl。elsd检测器雾化温度65℃；压缩氮气流速1.6l/min；增益为1。以体积分数计，梯度洗脱的程序为：0-7min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱；7.1-13min，以75％的流动相a，25％流动相b进行洗脱；13.1-20min，以70％的流动相a，30％流动相b进行洗脱；20.1-25min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱。实施例2一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，包括以下步骤：s1、将大豆卵磷脂添加到水-异丙醇混合体系(异丙醇的体积浓度为5％)中，使大豆卵磷脂的质量分数为10％，以230r/min的速率搅拌混匀30min，制备得到反应混合液a；s2、往反应混合液a中加入氯化钴和氯化锰，氯化钴的添加量为200ug/l，氯化锰的添加量为200ug/l，以10000r/min的转速均质处理3min，制备得到反应混合液b；s3、往反应混合液b中加入磷脂酶a1(8000u/ml)、磷脂酶a2(9000u/ml)和脂肪酶bakezymelfp(2750u/g)，磷脂酶a1的添加量为10u/ml，磷脂酶a2的添加量为10u/ml，脂肪酶bakezymelfp的添加量为5u/ml，经混匀后制备得到反应混合液c；s4、将反应混合液c的ph调节至6.0，然后将其置于多频超声-微波协同处理下进行反应，多频超声-微波协同处理的温度为45℃，多频超声采用20/50khz双频模式，超声功率为150w，超声的脉冲模式为10s，间隔5s，微波的功率为200w，最后反应混合液经旋转蒸发后得到粗α-gpc。s5、粗α-gpc经硅胶柱色谱纯化得到纯α-gpc：硅胶柱sunfiretmprepsilica(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃，梯度洗脱，流动相a为甲醇，流动相b为水，流速1.0ml/min；进样量10μl。elsd检测器雾化温度65℃；压缩氮气流速1.6l/min；增益为1。以体积分数计，梯度洗脱的程序为：0-7min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱；7.1-13min，以75％的流动相a，25％流动相b进行洗脱；13.1-20min，以70％的流动相a，30％流动相b进行洗脱；20.1-25min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱。实施例3一种从大豆卵磷脂中提取分离α-gpc的方法，包括以下步骤：s1、将大豆卵磷脂添加到水-异丙醇混合体系(异丙醇的体积浓度为20％)中，使大豆卵磷脂的质量分数为20％，以260r/min的速率搅拌混匀20min，制备得到反应混合液a；s2、往反应混合液a中加入氯化钴和氯化锰，氯化钴的添加量为250ug/l，氯化锰的添加量为250ug/l，以10000r/min的转速均质处理7min，制备得到反应混合液b；s3、往反应混合液b中加入磷脂酶a1(8000u/ml)、磷脂酶a2(9000u/ml)和脂肪酶bakezymelfp(2750u/g)，磷脂酶a1的添加量为13u/ml，磷脂酶a2的添加量为13u/ml，脂肪酶bakezymelfp的添加量为10u/ml，经混匀后制备得到反应混合液c；s4、将反应混合液c的ph调节至7.0，然后将其置于多频超声-微波协同处理下进行反应，多频超声-微波协同处理的温度为55℃，多频超声采用20/50khz双频模式，超声功率为250w，超声的脉冲模式为10s，间隔5s，微波的功率为400w，最后反应混合液经旋转蒸发后得到粗α-gpc。s5、粗α-gpc经硅胶柱色谱纯化得到纯α-gpc：硅胶柱sunfiretmprepsilica(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃，梯度洗脱，流动相a为甲醇，流动相b为水，流速1.0ml/min；进样量10μl。elsd检测器雾化温度65℃；压缩氮气流速1.6l/min；增益为1。以体积分数计，梯度洗脱的程序为：0-7min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱；7.1-13min，以75％的流动相a，25％流动相b进行洗脱；13.1-20min，以70％的流动相a，30％流动相b进行洗脱；20.1-25min，以85％的流动相a，15％流动相b进行洗脱。对比例1与实施例1的区别在于：步骤s1不同，对比例1采用水相体系进行提取，对比例1的步骤s1具体为：将大豆卵磷脂添加到水中，使大豆卵磷脂的质量分数为15％，以245r/min的速率搅拌混匀25min，制备得到反应混合液a。对比例2与实施例1的区别在于：步骤s1不同，对比例2采用有机溶剂体系进行提取，对比例2的步骤s1具体为：将大豆卵磷脂添加到异丙醇中，使大豆卵磷脂的质量分数为15％，以245r/min的速率搅拌混匀25min，制备得到反应混合液a。对比例3与实施例1的区别在于：步骤s1不同，对比例3中的有机溶剂在水-有机溶剂混合体系中的体积浓度不同，对比例3的步骤s1具体为：将大豆卵磷脂添加到水-异丙醇混合体系(异丙醇的体积浓度为30％)中，使大豆卵磷脂的质量分数为15％，以245r/min的速率搅拌混匀25min，制备得到反应混合液a。对比例4与实施例1的区别在于：步骤s2不同，对比例4中使用的催化剂不同，对比例4的步骤s2具体为：往反应混合液a中加入氯化钙和氯化锌，氯化钙的添加量为225ug/l，氯化锌的添加量为225ug/l，以10000r/min的转速均质处理5min，制备得到反应混合液b。对比例5与实施例1的区别在于：步骤s4不同，对比例5中缺少多频超声-微波协同处理，对比例5的步骤s4具体为：将反应混合液c的ph调节至6.5，然后将其置于50℃下进行反应，最后经旋转蒸发得到α-gpc。对比例6与实施例1的区别在于：步骤s4不同，对比例6采用单独的多频超声处理，对比例6的步骤s4具体为：将反应混合液c的ph调节至6.5，然后将其置于多频超声处理下进行反应，多频超声处理的温度为50℃，多频超声采用20/50khz双频模式，超声功率为200w，超声的脉冲模式为10s，间隔5s，最后经旋转蒸发得到α-gpc。对比例7与实施例1的区别在于：步骤s4不同，对比例7中多频超声-微波协同处理的条件不同，对比例7的步骤s4具体为：将反应混合液c的ph调节至6.5，然后将其置于多频超声-微波协同处理下进行反应，多频超声-微波协同处理的温度为60℃，多频超声采用30/40khz双频模式，超声功率为300w，超声的脉冲模式为15s，间隔8s，微波的功率为500w，最后反应混合液经旋转蒸发后得到粗α-gpc。实验例1α-gpc得率和反应时间的统计分别按实施例1-3和对比例1-7的方法制备α-gpc，反应结束后，硅胶柱色谱纯化前，测量α-gpc的得率和α-gpc的转化率，并统计反应所需的时间(以α-gpc得率趋于稳定为标准)。α-gpc得率和α-gpc的转化率的测量方法为：取反应后的反应混合液1.5ml，用甲醇稀释一定倍数，取1.5ml离心10min，用hplc-elsd检测α-gpc和pc(磷脂酰胆碱)，根据α-gpc的峰面积计算其含量，按照下列公式计算α-gpc的得率和α-gpc的转化率：(1)α-gpc的理论产量＝大豆卵磷脂的质量×原料中pc的含量×α-gpc的相对分子质量/pc的相对分子质量；(2)α-gpc的得率＝反应后混合液中α-gpc的质量/α-gpc的理论产量×100％式中：pc的平均相对分子质量为782，gpc的相对分子质量为258。(3)α-gpc转化率的计算为：α-gpc转化率＝(cα-gpc×v)/mα-gpc×100％，式中：cα-gpc为进样样品中α-gpc的质量浓度，mg/ml；v为样品溶解体积，ml；mα-gpc为理论产生gpc的量。如表1的结果所示，采用本发明方法制备α-gpc，α-gpc的得率和转化率均得到了很大程度的提高，而且反应时间短，可以大大缩短α-gpc的提取时间；从对比例1-2可以看出，采用水-有机溶剂混合体系作为溶剂有助于提高α-gpc得率，缩短反应时间，原因是大豆卵磷脂中含有疏水性的脂肪酸链和亲水基团(磷酸基、胆碱式乙醇胺)，将水相介质与亲水性有机溶剂混合，可以增加底物的溶解度，有利于反应的平衡向产物合成方向移动，从而缩短反应时间，并提高α-gpc的得率；从对比例3可以看出，有机溶剂在水-有机溶剂混合体系中的体积浓度对本发明的制备过程也有重要的影响，5-20％的有机溶剂(体积浓度)可以使大豆卵磷脂得到最佳的溶解程度，可以有效促进反应向产物合成方向进行；从对比例4可以看出，采用氯化钴和氯化锰作为催化剂更有助于提高α-gpc得率和转化率，缩短反应时间，原因是氯化钴和氯化锰可以更有效的激活磷脂酶a1、磷脂酶a2和脂肪酶bakezymelfp之间的酶活性，加强它们之间的协同酶解作用；从对比例5-6可以看出，反应过程中采用多频超声-微波协同处理更有助于提高α-gpc得率，缩短反应时间，原因是多频超声-微波协同处理反应体系时，可以使体系迅速发生乳化，促进了底物的分散，迅速增大反应界面，从而促使反应速度加快，并提高α-gpc的得率；从对比例7可以看出，采用本发明的多频超声-微波协同处理条件能使本发明获得较佳的酶解效果，因为不同的多频超声-微波协同处理会影响底物的分散度，从而影响反应的程度。表1各实验组的α-gpc得率、转化率及反应时间组别α-gpc得率(％)α-gpc转化率(％)反应时间(min)实施例198.789.150实施例297.588.555实施例398.386.760对比例171.370.385对比例280.675.888对比例385.478.291对比例488.577.381对比例588.673.5110对比例691.274.6100对比例786.776.883以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。当前第1页12