一种桔假丝酵母菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种桔假丝酵母菌及其应用。

背景技术：

马铃薯属于茄科茄属，一年生草本块茎植物，具有生长适应性强、产量高、营养丰富和药用价值高等特点，既可作为蔬菜食用，亦可作为主粮。马铃薯病害由多种病原菌造成，主要有以下几种：(1)马铃薯晚疫病是马铃薯产区发生最普遍、影响最严重的真菌性病害之一，是一种具有毁灭性的病害，严重时会造成马铃薯的绝产。晚疫病造成的危害性、防治难度及对社会影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病被视为国际第一大作物病害。马铃薯晚疫病的病原菌为致病疫霉(phytophthorainfesrans(mont)debary)主要危害马铃薯叶片，也能侵染茎和薯块，造成马铃薯减产和储藏期的腐烂。(2)马铃薯早疫病的病原菌为链格孢属茄链格孢，能够侵染块茎和叶片，叶片呈大小3-4mm的圆形或近圆形黑褐色病斑，具同心轮纹。湿度大时，病斑上生出黑色霉层病征，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。发病严重的叶片干枯脱落，田间植株成片枯黄。近年早疫病呈上升趋势，部分地区发病状况不亚于晚疫病。(3)马铃薯疮痂病的病原菌为疮痂链霉菌，主要危害块茎，表面出现木栓化疮痂状淡褐色病斑或斑块，近圆形或不定形，手摸质感粗糙，一般有两种病斑，分别是网纹状病斑和裂口状病斑。通常病斑虽然仅限于皮层，但被害薯块质量和产量仍可降低，不耐贮藏，且病薯外观不雅，商品品级大为下降，造成严重的经济损失。(4)马铃薯立枯丝核菌病的病原菌为立枯丝核菌，主要为害部位为幼芽、茎基部及块茎。幼芽染病常在出土前形成芽腐，造成缺苗现象。出土后染病初植株下部叶子发黄，茎基形成褐色凹陷斑，大小1-6cm。病斑上或茎基部常覆有紫色菌丝层，有时茎基部及块茎生出大小不等(1-5mm)形状各异的块状或片状、散生或聚生的小菌核、轻病株症状不明显，重病株可形成立枯或顶部萎蔫或叶片卷曲。

目前化学药剂防治是预防马铃薯病害的有效手段，也是广泛采用的措施之一，在病害防治中占主要位置。然而，由于长期频繁使用化学农药，使得病菌的抗药性逐渐增强，导致防治效果降低，甚至完全失效。运用生物防治技术来控制病害的发生逐渐成为人们关注的热点，开发能够有效抑制采后病害发生且难本没有危害的新型生物农药来逐步取代化学农药已经成为众多农业科研人员的目标。

技术实现要素：

为此，本发明的目的是提供一种桔假丝酵母菌(candidaquercitrusa)，菌株为cq-1，于2019年11月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno.18949。

本发明的桔假丝酵母菌(candidaquercitrusa)cq-1，从荔枝中分离得到的。

所述桔假丝酵母菌(candidaquercitrusa)cq-1的形态学特征为：菌体细胞呈圆形或椭圆形，有时不规则，较小，有假菌丝，经培养假菌丝中间或顶端可形成厚垣孢子；无性繁殖为多边出芽，产生1-4个子囊孢子，表面光滑的球形，半球形，同宗配合或异宗配合；在培养基上不产生色素，菌落为乳白色不透明，中央凸起，边缘整齐，菌落光滑。

所述桔假丝酵母菌(candidaquercitrusa)cq-1的生理生化特征为：多数为发酵或氧化代谢；同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木糖、山梨醇等。

本发明的目的还在于提供上述桔假丝酵母菌在防治植物病害或病原菌中的应用和在制备植物病害或病原菌抑制剂中的应用。

上述应用中，所述病原菌为致病疫霉菌、茄链格孢菌、疮痂链霉菌或立枯丝核菌。

上述应用中，所述植物病害为马铃薯晚疫病、早疫病、疮痂病、或立枯丝核菌病。

本发明的目的还在于提供了一种病原菌抑制剂，包括上述桔假丝酵母菌或其菌液。

上述病原菌抑制剂中，所述菌液的制备方法为：将桔假丝酵母菌活化后，进行扩大培养，然后用液体培养基稀释到所需浓度。

例如，可以用pda液体培养基稀释到所需浓度，得到菌液。

本发明的目的还在于提供了一种植物病害抑制剂，包括上述桔假丝酵母菌或其菌液。

上述植物病害抑制剂中，所述菌液的制备方法为：将桔假丝酵母菌活化后，进行扩大培养，然后用液体培养基稀释到所需浓度。

本发明有益效果为：

本发明的桔假丝酵母菌cq-1可以作为马铃薯晚疫病的高效生防菌，其对马铃薯晚疫病的抑制效果尤为显著，且对马铃薯生长发育不产生影响。在防治马铃薯晚疫病的同时，对马铃薯其他主要病害的病原菌也具有显著的抑制生长作用，例如茄链格孢菌、疮痂链霉菌及立枯丝核菌等。

生物材料保藏说明

分类命名：桔假丝酵母菌(candidaquercitrusa)；菌株编号：cq-1。

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：cgmcc；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2019年11月13日；

保藏中心登记入册编号：cgmccno.18949。

附图说明

图1为本发明的桔假丝酵母菌cq-1菌株平板生长图。

图2为不同浓度的桔假丝酵母菌cq-1对于致病疫霉菌的平板生长对峙实验结果；其中，ck为不接种酵母菌，仅ypd液体培养基；酵母菌cq-1浓度分别为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml。

图3为桔假丝酵母菌cq-1对致病疫霉在马铃薯块茎上的抑制作用；其中：ck为不接种酵母菌，仅ypd液体培养基，其他为酵母菌cq-1浓度为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml的菌液处理的马铃薯块茎。

图4为桔假丝酵母菌cq-1对致病疫霉在马铃薯离体叶片上的抑制作用；其中：ck为未经酵母菌处理。

图5为桔假丝酵母菌cq-1对致病疫霉在马铃薯植株上的抑制作用；其中：ck为未经酵母菌处理。

图6为桔假丝酵母菌cq-1对早疫病菌的平板生长对峙实验结果。

图7为桔假丝酵母菌cq-1对丝核菌ag的平板生长对峙实验结果；其中，ck为不接种酵母菌，仅ypd液体培养基；4、6、8分别指浓度为10⁴cfu/ml、10⁶cfu/ml和10⁸cfu/ml的酵母菌液处理。

图8为桔假丝酵母菌cq-1对疮痂链霉菌的平板生长对峙实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

实施例1菌株分离纯化

采集荔枝，分别称取10g病健交接和健康无病斑的两种荔枝表皮，同时加入含有90ml已灭菌的液体ypd培养基和3000单位链霉素的250ml三角瓶中，置于28℃、200rpm的摇床培养48h。

其中，ypd培养基的制备方法为：其配方为10g/l酵母粉，20g/l胰蛋白胨，20g/l葡萄糖，固体培养基加入20g/l琼脂粉，121℃高压湿热灭菌20min，即可得到菌种生长的培养基。

分别取浓度为10⁵、10⁶、10⁷cfu/ml的培养液100μl涂布于ypd培养皿上，每个稀释3皿，共9皿，置于28℃恒温培养箱，通过显微镜对形态特征各异的单菌落进行镜检，将分离鉴定出的酵母菌纯化，于4℃冷藏。

取一个含有30ml豆芽汁葡萄糖液体培养基的100ml三角瓶，灭菌后用无菌接种环接种一环菌龄2-3d的酵母菌，28℃培养3天。菌株经活化后，梯度稀释并均匀涂布于豆芽汁葡萄糖固体培养基，28℃培养，进菌落形态观察。

菌株活化培养：将酵母菌接种于ypd固体培养基活化，培养条件为28-30℃，培养12-24h。取已活化的酵母菌在ypd平板培养基上划线2-3条，在划线处上方盖上一个无菌盖玻片，置于28℃恒温培养箱培养数天后，将盖玻片取出并观察划线位置的两旁是否形成假菌丝及其形态。其菌株平板生长如图1所示，观察显示，酵母菌在不同培养平板上的菌落形态都较类似，单细胞为圆形或椭圆形，细胞为多极芽殖。在平板上形成的菌落呈卵圆形，表面光滑，菌落边缘较整齐，乳白色不透明。可以观察到有假菌丝生成。以上形态特征和文献中所描述的假丝酵母菌的特征相似。

提取酵母菌的dna，使用引物nl1和nl4以及its1和its4分别扩增26srdna的d1/d2结构域和its(包括5.8srdna)区,将pcr产物进行测序鉴定。其中，引物序列如下所示：

nl1：5’gcatatcaataagcggaggaaaag-3’；

nl4：5’ggtccgtctttcaagacg-3’；

its1：5’tccgtaggtgaacctgcgc-3’；

its4：5’tcctccgcttattgatatgc-3’。

结果显示，测序后的26srdna的序列和its的序列经ncbi比对后，发现其与candidaquercitrusastrain相似度为100％，判定其为桔假丝酵母菌。其中，26srdna部分序列如序列表中seqidno.1所示。its的序列如序列表中seqidno.2所示。

实施例2桔假丝酵母菌cq-1对致病疫霉菌的抑制

君主培养及发酵菌液的制备，其制备方法如下：

将菌株扩大培养：挑出其中单菌落于ypd液体培养基中，培养条件为28～30℃，180-220r/min，振荡培养20h，将培养液以2％(v/v)比例接种100mlypd液体培养基，28℃，220r/min振荡培养20h。

菌液为扩大培养后含有桔假丝酵母菌cq-1的培养液。

然后进行发酵菌液的制备：将培养获得的菌液，用ypd液体培养基稀释到所需浓度，即可得到发酵菌液。

一、酵母菌对致病疫霉菌的平板生长对峙实验

在直径为9cm的黑麦固体培养基中心接种直径9mm的致病疫霉菌21101菌丝块，在ypd平板中心均匀涂布浓度为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml的发酵菌液200μl，对扣培养。18℃培养箱黑暗培养。以ypd平板中心均匀涂布ypd液体培养基的平板作对照，培养10-12d观察致病疫霉菌的生长状态，每组处理3次重复。

在12天时观察致病疫霉菌长势，结果如图2所示，经过10⁸cfu/ml酵母菌处理的致病疫霉菌菌丝的生长完全被抑制，与对照比差异显著，其ec50值为68.23cfu/ml。

ec50值的计算方法为：以菌丝净生量计算不同浓度发酵菌液对各菌株生长的抑制率。计算公式如下：

通过dps软件，求得ec50值。

二、酵母菌菌液对致病疫霉在马铃薯块茎上的抑制作用

将马铃薯荷兰十五块茎消毒后在超净工作台内切成大小为3×3×1cm的小块，放置在直径为9cm的培养皿上，在马铃薯小块中心接种直径9mm的致病疫霉21101菌丝块。在ypd平板中心均匀涂布浓度为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml的发酵菌液200μl，对扣培养。18℃培养箱，16h光照/8h黑暗培养。以ypd平板中心均匀涂布ypd液体培养基的平板作对照，5-7d观察致病疫霉菌的侵染状态，每组处理3次重复。

6天后观察，结果如图3所示，对照组马铃薯块茎上的菌丝布满整个块茎，并且马铃薯有组织降解，而预先经过酵母菌预先处理的马铃薯块茎菌丝生长较少，马铃薯块茎组织完好，其浓度为10⁴cfu/ml时抑制率为43.43％，浓度为10⁶cfu/ml时抑制率为73.97％，浓度为10⁸cfu/ml时抑制率为86.77％。。

三、酵母菌菌液对致病疫霉在马铃薯离体叶片上的抑制作用

选择温室培养的马铃薯荷兰十五植株，苗龄约20天，在叶片上喷施浓度为10⁶cfu/ml的酵母菌菌液，24小时后，喷施浓度为4.5×10⁵个/ml致病疫霉21101孢子囊悬浮液，18℃，12h光照/12h黑暗培养。以没未经何处理的马铃薯植株为对照，5-7d观察致病疫霉菌的侵染状态，每组处理3次重复。

结果如图4所示，未经过酵母菌处理的对照组马铃薯叶片有大面褐色病斑的生成；经过酵母菌处理的马铃薯叶片可以极大程度上抑制致病疫霉菌的侵染，马铃薯叶片正反面均完好。

四、酵母菌菌液对致病疫霉在马铃薯植株上的抑制作用

选择温室培养的马铃薯荷兰十五植株，苗龄约20天，在植株上喷施浓度为10⁶cfu/ml的酵母菌菌液，24小时后，喷施浓度为4.5×10⁵个/ml致病疫霉21101孢子悬浮液，18℃，16h光照/8h黑暗培养。以没未经何处理的马铃薯植株为对照，5-7d观察致病疫霉菌的侵染状态，每组处理3次重复。

结果如图5所示，未经过酵母菌处理的对照组马铃薯叶片有大面积水渍状病斑的生成，叶片表面布满白色菌丝，其病情指数为87.8％；经过酵母菌处理的马铃薯叶片可以很大程度上抑制致病疫霉菌的侵染，马铃薯叶片完好，其病情指数为48.5％，经过梯度实验发现在酵母菌浓度为10⁶cfu/ml时发酵菌液，仍然能较好地抑制晚疫病在马铃薯植株上的发病。

实施例3桔假丝酵母菌cq-1对早疫病菌的抑制酵母菌对早疫病菌的平板生长对峙试验

在直径为9cm的pda培养基中心接种直径9mm茄链格孢菌菌丝块，在直径为9cm的ypd平板中心均匀涂布浓度梯度为为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml的发酵菌液200ul，对扣培养，25℃恒温培养箱中黑暗培养。以ypd平板中心均匀涂布ypd液体培养基的平板作对照，5d观察茄链格孢菌的生长情况，每组处理3次重复。

结果如图6所示，对照组茄链格孢菌菌丝几乎长满整个平板，经过酵母菌处理的茄链格孢菌菌丝扩展直径显著小于对照，对早疫病菌有显著的抑制效果，其ec50值为8.5×10⁵cfu/ml。

实施例4桔假丝酵母菌cq-1对立枯丝核菌的抑制

在直径为9cm的pda培养基中心接种直径9mm丝核菌ag6菌碟，在直径为9cm的ypd平板中心分别均匀涂布浓度为10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml的发酵菌液200ul，对扣培养，25℃恒温培养箱中黑暗培养。以ypd平板中心均匀涂布ypd液体培养基的平板作对照，5d观察立枯丝核菌ag6的生长情况，每组处理3次重复。的生长状态，每组处理3次重复。

结果如图7所示，对照组立枯丝核菌菌丝几乎长满整个平板，而经过酵母菌处理的立枯丝核菌菌丝扩展直径明显小与对照，并随着浓度的增大其，抑制效果逐渐明显，最终ec50测定为1.6×10⁴cfu/ml。

实施例5桔假丝酵母菌cq-1对疮痂链霉菌的抑制

在直径为9cm的yme培养基(1升酵母麦芽精琼脂培养基(yme)：酵母提取物4.0g，麦芽浸粉10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂20.0g，ph值调到7.0～7.2，121℃灭菌20min。)中心均匀涂布浓度为10⁸cfu/ml疮痂链霉菌菌液200μl，在直径为9cm的ypd平板中心均匀涂布浓度为10⁸cfu/ml的发酵菌液200μl，对扣培养，28℃恒温培养箱中黑暗培养。以未做酵母菌处理的疮痂链霉菌平板作对照，5-7d观察疮痂链霉菌的生长情况，每组处理3次重复。

结果如图8所示，培养7d后，对照培养基上疮痂链霉菌生长量增加并伴有黑色素产生，酵母菌处理后的培养基上，疮痂链霉菌生长量未见变化，仍保持接种时的状态且无黑色素产生。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种桔假丝酵母菌及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>572

<212>dna

<213>candidaquercitrusa

<400>1

ttgccttagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcactttcagtg60

tccgagttgtaatttgaagaaggtaactttggagttggcccttgtctatgttccttggaa120

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