一种体外培养膀胱癌类器官的方法与流程

本发明是涉及一种体外培养膀胱癌类器官的方法，属于类器官的体外培养技术领域。

背景技术：

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，近年来我国膀胱癌的发病率逐年升高。许多局部晚期或转移性膀胱癌患者的治疗效果不理想，部分患者会因无法承受化疗毒副反应而更换方案甚至停药。靶向治疗作为一种疗效确切且患者耐受性较好的新型治疗模式，已在实体恶性肿瘤的治疗中崭露头角。但是，目前膀胱癌靶向药的前期筛选工作尚缺乏高效、精确的药物筛选用体外模型。

肿瘤类器官是近年来兴起的一种体外三维肿瘤细胞培养技术，与传统的肿瘤细胞系及小鼠移植瘤模型相比，具有与肿瘤相似性高、培养周期短、耗资相对低等优势，为肿瘤患者高效筛选敏感药物开辟了新途径。

但针对不同来源的肿瘤，在体外进行类器官培养所需要的“微环境”各不相同，因此所需要的培养基及培养方法均具有差异。虽然目前已报道培养成功的肿瘤类器官来源包括乳腺癌、结肠癌、肺癌及食管癌等，其中乳腺癌及结肠癌类器官的培养成功率高达80％以上，但膀胱癌类器官培养成功的报道极少，且成功率不高(低于30％)。另外，现有的类器官培养技术虽然可以保持肿瘤样本的高度异质性，但是对于肿瘤微环境的保真度仍有所缺失，例如，现有肿瘤类器官中并不包含肿瘤微环境中的免疫细胞，导致培养出的类器官并不适用于肿瘤免疫类药物的筛选。因此，非常有必要研发一种成功率高、培养周期短、且能保留肿瘤内免疫细胞的膀胱癌类器官的体外培养方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种成功率高、培养周期短、且能保留肿瘤内免疫细胞的体外培养膀胱癌类器官的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种体外培养膀胱癌类器官的方法，包括如下步骤：

s1、制作气液交互培养系统，即：

s11、在transwell上室内的多孔培养膜的表面制作均匀平铺的鼠尾胶原支撑层；

s12、用鼠尾胶原溶液重悬新鲜离体的膀胱癌组织，并在混匀后一起加到鼠尾胶原支撑层上，然后放入37℃培养箱使其凝固，制得包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层；

s13、在transwell下室内加入类器官培养基，并使培养基液面低于包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层；

s2、传代和冻存，即：

s21、在首次种入样本2天后，将含类器官的鼠尾胶原移入细胞消化液中，置于37℃摇床内孵育20～50分钟，待鼠尾胶原被消化到肉眼不可见而释放出组织时，终止消化并用基础培养基洗涤，然后按1:3～1:5比例种入新制作的气液交互培养系统中传代；

s22、进行第一次传代后，依据样本类器官生长情况每隔3～10天进行一次传代；

s23、每次消化得到的已长成的类器官用冻存液重悬后冷冻保存。

一种实施方案，所述鼠尾胶原溶液的配制操作如下：

在冰浴下，向大鼠i型鼠尾胶原(rattailtypeicollagen)中先加入10x浓度的ham’sf-12培养基，然后加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、naoh、nahco3及双蒸水，使鼠尾胶原溶液的终浓度为2.5mg/ml。

一种实施方案，所述类器官培养基的组成包括：advanceddmem/f12培养基、primocin原代细胞抗生素100x稀释、glutamax细胞培养添加剂100x稀释、b27补充剂50x稀释、n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac)1mm、表皮生长因子(egf)5ng/ml、noggin重组蛋白100ng/ml、r-spondin-1重组蛋白250ng/ml、sb202190mapk抑制剂10μm、a83-01alk5抑制剂500nm、y-27632rock抑制剂10μm、烟酰胺(nicotinamide)10mm、成纤维细胞生长因子(fgf-10)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(fgf-basic)5ng/ml、人源heregulin-β1生长因子10ng/ml和前列腺素e21μm。

一种优选方案，所述类器官培养基的组成中还包括白介素-2、白介素-7、白介素-15各10ng/ml。

一种实施方案，所述新鲜离体的膀胱癌组织的处理，包括如下步骤：

将获得的新鲜离体膀胱癌组织，在修剪去除非肿瘤组织及明显的坏死组织后，先用预冷的含双抗的pbs冲洗若干遍，然后在无菌环境下切碎至直径小于0.1mm，即肉糜状，再用100μm细胞筛网过滤，弃掉较大块组织，滤出物离心后用基础培养基洗涤即得。

一种实施方案，所述基础培养基的组成包括：advanceddmem/f12培养基、primocin原代细胞抗生素、y-27632rock抑制剂和2.5％胎牛血清。

相较于现有技术，本发明具有如下有益技术效果：

1)本发明通过创造性地采用气液交互培养系统进行膀胱癌类器官的体外培养，使包裹在胶质里的肿瘤细胞充分接触空气，不仅避免了类器官在培养过程中容易缺氧的情况，而且明显提高了细胞活性，使膀胱癌类器官的培养成功率得到显著提高；

2)本发明所述方法在样品准备时不需要经过酶消化步骤，不仅简化了操作，而且极大地减少了消化过程中所不可避免的大量细胞损失，使肿瘤组织的利用率得到明显提高；

3)实验证明，采用本发明所述方法可培养获得保留有免疫细胞的膀胱癌类器官，对用于肿瘤免疫类药物筛选研究具有重要意义和价值。

附图说明

图1为实施例中所述的气液交互培养系统的结构示意图；图中：1为transwell上室内的多孔培养膜；2为类器官培养基；3为鼠尾胶原支撑层；4为包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层；5为肉糜状膀胱癌组织；6为气液交界面；

图2为采用本发明方法培养获得的膀胱癌类器官进行免疫荧光染色鉴定结果图，图中箭头指示部分为cd45+淋巴细胞，三角形指示部分为cd8+t细胞；

图3为同一例膀胱癌样本用本发明方法(a)和用现有基质胶方法(b)分别培养并传代后所得到的膀胱癌类器官的生长状态对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例及对比例对本发明的技术方案和效果做进一步详细描述。

实施例

1、处理新鲜离体的膀胱癌组织：

将获得的新鲜离体膀胱癌组织，在修剪去除非肿瘤组织及明显的坏死组织后，先用预冷的含2％双抗的pbs冲洗若干遍，然后在无菌环境下切碎至直径小于0.1mm，即肉糜状，再用100μm细胞筛网过滤，弃掉较大块组织，滤出物离心后用基础培养基洗涤2次；所述的基础培养基的组成为：advanceddmem/f12培养基、primocin原代细胞抗生素500倍稀释、10μmy-27632rock抑制剂(dihydrochloride)和2.5％胎牛血清；

2、制作气液交互培养系统，即：

21、配制鼠尾胶原溶液

在冰浴下，取1267μl大鼠i型鼠尾胶原(rattailtypeicollagen，3.79mg/ml)置于2mlep管内，然后加入200μl的10x浓度的ham’sf-12培养基，轻柔混匀避免气泡产生，再加入533μl含0.05nnaoh、200mmhepes和2.2gnahco3的混合水溶液，混匀后即得到终浓度为2.5mg/ml、溶液呈肉粉色的鼠尾胶原溶液；

22、将配制好的鼠尾胶原溶液缓慢注入transwell嵌套培养板的上层小室内，使其在transwell上室内的多孔培养膜的表面平铺均匀，然后放入37℃培养箱中使其凝固为凝胶状，得到鼠尾胶原支撑层；然后用鼠尾胶原溶液重悬一半新鲜离体的膀胱癌组织(另一半用于采用现有经典的基质胶培养法进行对比实验)，注意避免气泡产生，并在混匀后一起加到鼠尾胶原支撑层上，再放入37℃培养箱使其凝固，制得包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层；再在transwell下室内加入类器官培养基，并使培养基液面低于包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层，得到如图1所示的气液交互培养系统；

所述类器官培养基的组成为：advanceddmem/f12培养基、primocin原代细胞抗生素100x稀释、glutamax细胞培养添加剂100x稀释、b27补充剂50x稀释、n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac)1mm、表皮生长因子(egf)5ng/ml、noggin重组蛋白100ng/ml、r-spondin-1重组蛋白250ng/ml、sb202190mapk抑制剂10μm、a83-01alk5抑制剂500nm、y-27632rock抑制剂10μm、烟酰胺(nicotinamide)10mm、成纤维细胞生长因子(fgf-10)10ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子(fgf-basic)5ng/ml、人源heregulin-β1生长因子10ng/ml和前列腺素e21μm；还包括白介素-2、白介素-7、白介素-15各10ng/ml。

3、传代和冻存，即：

31、在首次种入样本2天后，将含类器官的鼠尾胶原移入accutase消化液中，置于37℃摇床内孵育20～50分钟，待鼠尾胶原被消化到肉眼不可见而释放出组织时，终止消化并用基础培养基洗涤，然后按1:3比例种入新制作的气液交互培养系统中传代培养；

32、进行第一次传代后，依据样本类器官生长情况每隔3～10天进行一次传代；

33、每次消化得到的已长成的类器官用cellbanker2冻存液重悬后放入-80℃冰箱长期保存。

4、在传代两次后培养三天，直接在原位进行免疫荧光染色：利用直标抗体alexa594anti-humancd45和alexa647anti-humancd8直接染色，用激光共聚焦显微镜观察，同时叠加明场照片显示类器官，实验结果表明：采用本发明方法进行培养获得的膀胱癌类器官在传代后依然有免疫细胞存在，详见图2所示；

另外，图3所示是采用现有经典的基质胶培养法【参见cn109679915a，一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法】对与实施例中相同的膀胱癌组织样本进行培养7天和传代1次后，与采用本发明实施例方法在培养7天和传代1次后获得的膀胱癌类器官进行比较的结果，由图3结果表明：利用经典基质胶培养法的肿瘤组织形成类器官很少，并且生长状态差，而采用本发明的培养方法可高成功率获得膀胱癌类器官，说明本发明相对于现有技术获得了显著性进步。

最后有必要在此指出的是：以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。