一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于卵形鲳鲹性别技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

卵形鲳鲹(trachinotusovatus)，属鲈形目，鲹科，鲳鲹属，俗称金鲳、黄腊鲳、黄腊鲹。从2000年突破人工催产后，国内开始大规模养殖，目前已经发展成为我国重要的海水养殖品种，产量已超过10万吨，且该种具有生长迅速、抗病力强、喜湍流等特点，是将来深远海大规模养殖的最佳品种。虽然其养殖规模发展增大，但是育种工作却滞后，其中重要的限制因素是卵形鲳鲹无法从外形分辨性别，导致在人工选育中无法操控性别比例。卵形鲳鲹雌雄个体在早期胚胎发育和幼鱼阶段并不表现出形态学上的差异，从体型大小和生殖器官体表特征无法对其雌雄进行鉴定。虽然科学研究中可以通过解剖鉴定性别，但是解剖必然导致个体死亡，对于生产是没有意义的。而性别鉴定是遗传选育最关键的环节，无法活体鉴定卵形鲳鲹性别严重阻碍了遗传选育等育种工作的开展。

现有技术存在的问题是：

(1)在科研工作中，可以通过解剖等方式对卵形鲳鲹的生理性别进行鉴定，但解剖必然造成解剖个体的死亡，且该方式效率低下，无法实现大规模鉴定。

(2)生产实践中，无法通过表型鉴定卵形鲳鲹活体性别。

(3)目前没有通过生物技术手段进行活体性别鉴定的技术。

在当前技术条件下，可以通过开发性别特异性分子标记准确地鉴定卵形鲳鲹的性别。虽然分子标记类型有很多种，但是其是检测技术不同的表现形式，最根本的，基因组上决定性别的特异序列在各个物种中各不相同。可依据雌雄特异性序列的特征，选择合适的分子标记进行性别鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物及包括该引物的试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种卵形鲳鲹性别鉴定方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物或试剂盒在鉴定卵形鲳鲹性别方法。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，所述引物为引物p1，所述引物p1包括正向引物p1-f和反向引物p1-r，所述正向引物p1-f的碱基序列如seqidno：1所示，所述反向引物p1-r的碱基序列如seqidno：2所示。

具体的，引物p1的碱基序列如下：

正向引物p1-f：5’-aactctatgcaccgacctga-3’；

反向引物p1-r：5’-catgaacagacacgagcacc-3’。

本发明还提供了一种用于卵形鲳鲹性别鉴定的试剂盒，该试剂盒包括上述卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹性别鉴定方法，包括以下步骤：采用pcr扩增在雌雄个体的基因组dna中扩增出特异性片段，具体包括：合成上述引物，提取待测卵形鲳鲹的基因组dna，采用上述引物，以基因组dna为模板，进行pcr扩增，采用凝胶电泳法检测扩增产物，根据电泳结果鉴定雌雄个体，其中杂合峰型为雌性个体，纯合峰型为雄性个体。

在上述卵形鲳鲹性别鉴定方法中：

优选的，pcr扩增时采用的pcr反应体系为：20ng/μldna模板1.0μl，10×taqbuffer(mg²⁺free)2.5μl，浓度2.5mmdntps2.0μl，浓度25mmmgcl21.5μl，10mm正向引物和反向引物各0.5μl，5u/μltaq0.1μl，ddh2o补齐25.0μl。

优选的，pcr扩增时采用的pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min。

本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物或试剂盒在鉴定卵形鲳鲹性别方面的应用。

因此，本发明卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物的成功开发，突破了卵形鲳鲹活体鉴定性别的技术瓶颈，为卵形鲳鲹活体性别控制提供了工具。该技术的应用能够实现孵化早期对卵形鲳鲹苗种进行性别鉴定，提高培育效率、降低成本；能够实现对选育群体性别比例的控制，避免近交衰退；能够促进卵形鲳鲹性别决定、性别控制等研究工作的开展。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明设计的卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，特异性好，灵敏度好，准确度高，鉴定方法操作方便，简单易行，鉴定成功率最高可达100％；

(2)本发明方法可一次性快速批量准确鉴定卵形鲳鲹的性别；

(3)本发明方法实现了对于活体卵形鲳鲹物无实质性伤害，可用于活体鉴别卵形鲳鲹性别，应用于活体性别的鉴定，突破了活体无法鉴定性别的技术瓶颈；

(4)本发明引物、试剂盒和方法对于卵形鲳鲹性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1中利用p1引物对卵形鲳鲹个体进行毛细管电泳峰型的例图，测序采用正向引物p1-f，上：雌性个体杂合峰型；下：雄性个体纯合峰型。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

本实施例提供的卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，所述引物为引物p1，所述引物p1包括正向引物p1-f和反向引物p1-r，所述正向引物p1-f的碱基序列如seqidno：1所示，所述反向引物p1-r的碱基序列如seqidno：2所示。

具体的，引物p1的碱基序列如下：

正向引物p1-f：5’-aactctatgcaccgacctga-3’；

反向引物p1-r：5’-catgaacagacacgagcacc-3’。

采集卵形鲳鲹1个全同胞家系，包含2个亲本和100个子代个体，解剖后鉴定生理学性别。利用高通量测序以卵形鲳鲹基因组序列为参考序列对亲本和子代进行标记开发，利用连锁分析定位性别数量性状位点，定位到单个区间。将区间内显著与性别连锁的插入缺失开发为性别特异性标记。

利用primer3从卵形鲳鲹基因组序列中性别决定区间内的部分序列(卵形鲳鲹性别特异性分子标记)中设计引物，卵形鲳鲹性别特异性分子标记序列如下，

其中方框表示正向引物，下划线表示反向引物(正向序列，反向互补后即p1-r的碱基序列，方括号表示检测的目标变异，具体如序列表seqidno：3所示。

为了验证该引物的准确性，本实施例通过以下实施例2中的验证试验来进行进一步的说明，具体如下。

实施例2

本实施例提供的卵形鲳鲹雌雄鉴定的方法，包括以下步骤：采用pcr扩增在雌雄个体的基因组dna中扩增出特异性片段，具体包括：设计实施例1中的引物，按照实施例1中方法提取待测卵形鲳鲹的基因组dna，采用实施例1中的引物，以提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，采用凝胶电泳法(具体采用自动测序仪abi3730xl)检测扩增产物，根据电泳结果鉴定雌雄个体。

本实施例的实施对象是卵形鲳鲹，取47个雌性和47个雄性，性别通过解剖鉴定，然后来验证该引物的可行性。

(1)dna的提取

从卵形鲳鲹活体上剪取约1平方厘米鳍条(该过程对于卵形鲳鲹活体无实质性伤害，采样后卵形鲳鲹个体重新放回后经观察可健康生长，下同)，保存于95％酒精，采样后卵形鲳鲹个体重新放回。

利用市售dna提取试剂盒或者常规酚仿法等提取组织dna。

(2)卵形鲳鲹别特异性标记的扩增

以上述引物p1的正向引物p1-f(5’-aactctatgcaccgacctga-3’)和反向引物p1-r(5’-catgaacagacacgagcacc-3’)为扩增引物，以提取的卵形鲳鲹dna为模板，用普通的taq酶进行pcr扩增。

pcr的反应体系为：20ng/μldna模板1.0μl，10×taqbuffer(mg²⁺free)2.5μl，浓度2.5mmdntps2.0μl，浓度25mmmgcl21.5μl，10mm正向引物和反向引物各0.5μl，5u/μltaq0.1μl，ddh2o补齐25.0μl；

pcr反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min。

(3)性别特异性片段检测

将步骤(2)中的扩增产物利用正向引物p1-f在自动测序仪abi3730xl上进行碱基检测。

图1是利用p1-f引物对卵形鲳鲹个体进行毛细管电泳检测的峰型例图，测序采用正向引物p1-f，上：雌性个体杂合峰型；下：雄性个体纯合峰型，即杂合峰型为雌性个体，纯合峰型为雄性个体。

结果，47例跟图1中的杂合型一致，是雌性，47例峰型跟图1中的纯合型一致，是雄性，即结果中有47个雌性47个雄性，结果与解剖实验结果完全一致，因此，采用本发明中的引物和方法，雌雄鉴定的准确率为100％。

因此，进一步的，可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于卵形鲳鲹雌雄的鉴定中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、试剂盒及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>卵形鲳鲹(trachinotusovatus)

<400>1

aactctatgcaccgacctga20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>卵形鲳鲹(trachinotusovatus)

<400>2

catgaacagacacgagcacc20

<210>3

<211>359

<212>dna

<213>卵形鲳鲹(trachinotusovatus)

<400>3

aactctatgcaccgacctgatgccatataatttattcataaacacacagtttcacacaga60

tagaacaacagttttcccggaaatcaattcttcttctctgctctgaaacagtagcttaca120

caggaagttgtgctgtgcttgtggtaactactgttatagagaggtgaatgattgatttcc180

agtaaatatgtagcgttagccgttagcaaaatgtcagcaatttggcaacatgttacactg240

gaaagtccaaccaataaaaaggcgacgtgtacagtatgcaaggctttaatatggaggggt300

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