与OX40L非竞争结合的抗OX40抗体的制作方法
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及一种抗ox40抗体及其用途。
背景技术：
ox40是1型跨膜糖蛋白，近30年前作为一个激活的t细胞表达的细胞表面抗原得到报道。自发现以来，它被证实是t细胞和肿瘤坏死因子受体家族成员的共刺激分子，也称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员4”或cd134，基因的名称为tnfrsf4。
ox40的分子量为50kd，具有胞质尾、跨膜结构域和胞外区。目前ox40只有一个已知配体，即ox40l(cd252)，其表达在活化的apc细胞上，ox40与其配体的结合会共刺激t细胞增殖和细胞因子的产生。ox40对t细胞的刺激是通过胞浆内细胞信号传导实现的，如nf-κb以及t细胞活化核因子(nfat)的激活，后者可以提高如survivin、细胞周期蛋白依赖性激酶、bcl-2抗凋亡分子、细胞因子和细胞因子受体的表达。
ox40是长期t细胞免疫的共刺激分子，同时在cd4+t细胞应答和t细胞依赖b细胞增殖分化中起着积极的促进作用。发现ox40在小鼠t细胞表面的表达通常发生在同源抗原识别后的24小时和96小时之间。使用激活性的ox40抗体，直接促进了不同的效应t细胞亚群增加生存。
此外，ox40在肿瘤浸润淋巴细胞(til)的表达已经有了不同深入的研究，如在乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、头颈部肿瘤中。另外发现ox40在结肠癌肿瘤组织中高表达，在肠系膜淋巴结或在浸润性边缘淋巴的ox40的表达与整体生存率相关。
正是因为ox40对t细胞具有激活作用，其涉及多种疾病，并可应用于肿瘤免疫治疗及器官移植的抗排异等多个领域。因此，共刺激分子ox40属于下一代目前在肿瘤学早期临床试验中检测的免疫治疗靶点。
目前国内外已有一些公司或者机构针对ox40开始了一些研究，包括开发针对该靶点的激动剂，例如小分子及生物大分子抗体的药物开发。几种ox40单克隆抗体目前正在进行早期癌症临床试验。但是，目前的数据显示，此类激动剂大都和ox40l有对ox40结合的竞争关系，因此在此类激动剂激活ox40的同时也失去了天然配体对ox40的激活作用。例如，国际上现有的ox40抗体大都与ox40l竞争性结合ox40，即抗体与ox40的结合位点和ox40l与ox40的结合位点有部分重合，所以当抗体作为激动剂激活了ox40及其下游信号通路时，却失去了ox40l作为天然配体也同时激活ox40的功能。
因此，本领域仍然存在对新型抗ox40抗体的需要。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种新型抗ox40抗体，所述抗体对ox40具有高亲和力，能有效激活ox40蛋白及其下游的信号通路，同时所述抗体与ox40配体ox40l为非竞争结合关系，因此与ox40l具有协同激活作用，从而克服现有抗ox40抗体的不足。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种新型抗ox40抗体或其功能性片段，并基于该新型ox40抗体或片段，提供其用途。
本发明的技术方案如下：
本发明的发明人以ox40蛋白的胞外区与小鼠igg2afc标签构建的融合蛋白作为免疫原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选在分子水平和细胞水平上与ox40亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用ht1080-ox40稳转细胞在亲和力高的细胞株里采用elisa方法筛选激活功能最好的杂交瘤细胞株并测定抗体序列。
一方面，本发明提供一种能够特异性结合ox40的抗体，所述抗体与ox40的天然配体结合ox40的不同表位。换言之，本发明提供的抗体与ox40的天然配体ox40l没有与ox40结合的竞争关系，在结合、进而激活ox40时仍不影响天然配体对ox40的结合、激活作用。
检测本发明的抗体与ox40的结合，发现本发明的抗体以2-15nm、优选4-6nm的亲和力与ox40结合。所述亲和力通过本申请实施例9中所述的biacore实验测得。
所述抗体包含重(h)链和/或轻(l)链，其中：
所述重链在其重链可变区(vh)中包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，h-cdr1具有如seqidno:1、4、7或10所示的氨基酸序列，h-cdr2具有如seqidno:2、5、8或11所示的氨基酸序列，h-cdr3具有如seqidno:3、6、9或12所示的氨基酸序列；
和/或，
所述轻链在其轻链可变区(vl)中包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中l-cdr1具有如seqidno:13、16、19或22所示的氨基酸序列，l-cdr2具有如seqidno:14、17、20或23所示的氨基酸序列，l-cdr3具有如seqidno:15、18、21或24所示的氨基酸序列。
优选地，关于本发明的抗体：
所述重链在其重链可变区中包含选自以下的h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3的组合：
(1)具有如seqidno:1所示的氨基酸序列的h-cdr1、具有如seqidno:2所示的氨基酸序列的h-cdr2和具有如seqidno:3所示的氨基酸序列的h-cdr3；
(2)具有如seqidno:4所示的氨基酸序列的h-cdr1、具有如seqidno:5所示的氨基酸序列的h-cdr2和具有如seqidno:6所示的氨基酸序列的h-cdr3；
(3)具有如seqidno:7所示的氨基酸序列的h-cdr1、具有如seqidno:8所示的氨基酸序列的h-cdr2和具有如seqidno:9所示的氨基酸序列的h-cdr3；和
(4)具有如seqidno:10所示的氨基酸序列的h-cdr1、具有如seqidno:11所示的氨基酸序列的h-cdr2和具有如seqidno:12所示的氨基酸序列的h-cdr3；
和/或
所述轻链在其轻链可变区中包含选自以下的l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3的组合：
(1)具有如seqidno:13所示的氨基酸序列的l-cdr1、具有如seqidno:14所示的氨基酸序列的l-cdr2和具有如seqidno:15所示的氨基酸序列的l-cdr3；
(2)具有如seqidno:16所示的氨基酸序列的l-cdr1、具有如seqidno:17所示的氨基酸序列的l-cdr2和具有如seqidno:18所示的氨基酸序列的l-cdr3；
(3)具有如seqidno:19所示的氨基酸序列的l-cdr1、具有如seqidno:20所示的氨基酸序列的l-cdr2和具有如seqidno:21所示的氨基酸序列的l-cdr3；和
(4)具有如seqidno:22所示的氨基酸序列的l-cdr1、具有如seqidno:23所示的氨基酸序列的l-cdr2和具有如seqidno:24所示的氨基酸序列的l-cdr3。
优选地，所述重链可变区包含如seqidno:25、26、27或28所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:25、26、27或28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
和/或
所述轻链可变区包含如seqidno:29、30、31或32所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:29、30、31或32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
更优选地，所述抗体包含选自以下的重链可变区和轻链可变区的组合：
(1)包含如seqidno:25所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:25所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如seqidno:29所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:29所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(2)包含如seqidno:26所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:26所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如seqidno:30所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:30所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
(3)包含如seqidno:27所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:27所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如seqidno:31所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:31所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区；以及
(4)包含如seqidno:28所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:28所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区；和
包含如seqidno:32所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:32所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
除了可变区之外，本发明的抗体在其重链中还包含小鼠源重链恒定区；和/或，在其轻链中还包含小鼠源轻链恒定区；
更优选地，所述抗体包含选自以下的重链和轻链的组合：
(1)包含如seqidno:33所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:33所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如seqidno:37所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:37所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(2)包含如seqidno:34所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:34所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如seqidno:38所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:38所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；
(3)包含如seqidno:35所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如seqidno:39所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:39所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；以及
(4)包含如seqidno:36所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:35所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链；和
包含如seqidno:40所示的氨基酸序列或者包含与如seqidno:40所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、进一步优选至少90％、甚至优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链。
本发明的抗体是单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体；
更优选地，所述抗体是免疫球蛋白，优选为iga、igd、ige、igg或igm，更优选为igg1；
具体地，所述抗体选自抗体i3e3、h1e6、161b3和h1k1。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和/或轻链；
优选地，所述核酸分子包含如seqidno:41、42、43、44、45、46、47或48所示的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此又一方面，本发明还提供一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞，用于保存或抗体表达等目的。因此，还一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明提供的抗体可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体的任选其他结构域组装成抗体；或者，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体的重链和/或轻链以组装成所述抗体的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
本发明提供的抗体、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
再一方面，本发明还提供所述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
另一方面，本发明还提供一种预防或治疗疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
并且，本发明还提供一种增强t细胞免疫应答的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
其中，所述增强t细胞免疫应答包括增强t细胞的细胞因子产生；优选地，细胞因子包括il-8和/或ifn-γ。
在本发明的上述方法中，还可以联合施用其他药物，例如所述方法还包括给受试者施用至少一种选自下述的药物：tlr9拮抗剂例如cpg、ido1抑制剂、pd1、pdl1、ctla4等抑制剂类药物，以及肿瘤疫苗类药物。
再一方面，本发明还提供所述抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于诊断疾病的试剂中的用途，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤。
另一方面，本发明还提供一种诊断疾病的方法，所述方法包括使本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物与来自受试者的样品相接触，所述疾病包括肿瘤或癌症，例如黑色素瘤、肺癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、喉癌、口腔癌、耳部眼部肿瘤、胆道癌、胆囊癌、肾上腺癌、生殖系统肿瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或药物组合物。所述试剂盒可以用于治疗或诊断用途。
与现有技术相比，本发明提供了一种新型的能够特异性结合ox40的抗体。本发明的抗体如下进行筛选和制备：以ox40蛋白的胞外区与小鼠igg2afc标签构建的融合蛋白作为免疫原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术，筛选在分子水平和细胞水平上与ox40亲和力最好的杂交瘤细胞株，利用ht1080-ox40稳转细胞在亲和力高的细胞株里采用elisa方法筛选激活功能最好的杂交瘤细胞株并测定抗体序列。最终，本发明筛选出具有出乎意料的高ox40亲和力和t细胞活化能力的抗体，例如抗体i3e3、h1e6、161b3和h1k1。
与现有抗ox40抗体相比，本发明的抗体具有以下特点：
本发明的抗ox40抗体对人源ox40蛋白具有高亲和力，能有效激活ox40蛋白及其下游的信号通路，同时本发明的抗ox40抗体与ox40l非竞争地结合，因此并不影响ox40与其配体ox40l的结合。因此，本发明的抗ox40抗体能够与ox40l协同激活ox40蛋白及其下游的信号通路，从而与下游蛋白traf2和traf5的相互作用而激活nf-κb，同时促进凋亡抑制剂bcl2和bcl2ll1/bcl2-xl的表达，从而抑制t细胞凋亡，达到长期刺激t细胞免疫的功能。因此该ox40抗体能够运用于治疗肿瘤疾病药物的制备中。另外，本发明的抗ox40抗体还可作为诊断试剂，用于诊断涉及ox40蛋白表达的疾病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了本发明的抗体与抗原ox40结合的elisa检测结果。
图2显示了本发明的抗体与抗原ox40结合的facs检测结果。
图3显示了本发明的抗体刺激ox40稳转细胞产生il-8的elisa检测结果。
图4显示了本发明的抗体与ox40l非竞争地结合ox40的facs检测结果。
图5显示了本发明的抗体与抗原ox40结合的biacore检测结果。
图6显示了本发明的抗体增强okt3激活原代t细胞释放ifn-γ的检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1本发明杂交瘤细胞的制备
用包含ox40蛋白(来自genbank登记号nm_003327.3)的胞外区(seqidno:49)与小鼠igg2a-fc(来自genbank登记号aah31470.1)的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，5只小鼠皮下免疫，5只小鼠肌肉免疫，佐剂采用quickantibody5w水溶性佐剂，加强免疫以后2周测效价，选取效价高的两只小鼠进行免疫冲击，3天之后进行下文所述的细胞融合。
取准备融合的两只小鼠，取血清，然后解剖后，取脾脏，分离脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行融合，铺96孔板，同时加入选择性培养基进行筛选，7天后换液，10天后进行elisa检测，选择od值大于阴性对照10倍以上的再进行流式细胞仪检测。
挑选双阳的细胞，通过细胞有限稀释法进行亚克隆铺板，挑选单克隆细胞。将挑选出的单克隆细胞，取培养上清，进行elisa检测及流式细胞仪检测，挑选双阳的细胞扩大培养。
实施例2本发明杂交瘤细胞的培养上清与ox40结合的elisa检测
用包含ox40蛋白(来自genbank登记号nm_003327.3)的胞外区(seqidno:49)与人的igg1-fc(来自genbank登记号cac20454.1)用包被液稀释至1-2μg/ml，然后以50-100μl/孔加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。每孔加入200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。用洗涤液洗3次，此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
向每孔中加入50-100μl待检杂交瘤细胞的培养上清，同时设立阳性对照(加入融合小鼠的血清)、阴性对照(加入正常小鼠的血清)和空白对照(加入培养基)。在37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。然后向每孔中加入酶标二抗，为1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igg(sigma，货号a9044-2ml)，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。向每孔中加入新鲜配制的底物显色液tmb50-100μl，37℃孵育10-30分钟。
加入2mol/lh2so4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取od值。
结果判定：以p/n>2:1(p代表阳性数值，n代表正常小鼠血清数值)为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
实施例3本发明杂交瘤细胞的培养上清与ox40结合的facs检测
将ox40蛋白(来自genbank登记号nm_003327.3)的胞外区(seqidno:49)构建到plvx病毒包装载体(clontech，viruspackagemix，货号631275)，转染293t细胞包装病毒，用该病毒感染hek293细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染ox40的hek293。然后将hek293-ox40细胞在含2％fbs的pbs中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入50μl待检杂交瘤细胞的培养上清，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入培养上清和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入培养上清，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μlpe标记的抗人fc标签的二抗(biolegend，货号409304)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。
实施例4本发明杂交瘤细胞的培养上清刺激ox40稳转细胞产生il-8的检测
用ox40蛋白(来自genbank登记号nm_003327.3)的胞外区(seqidno:49)构建到plvx病毒包装载体(clontech，viruspackagemix，货号631275)，转染293t细胞包装病毒，用该病毒感染ht1080细胞，加药嘌呤霉素(puromycin)筛选得到耐药细胞株即稳定转染ox40的ht1080。然后收集处于对数生长期的ht1080-ox40细胞，在补充10％fbs的1640培养基中制备成细胞浓度为1x106个细胞/ml的细胞悬液。
将100μl细胞悬液加入96孔板中，细胞培养箱中孵育过夜。然后弃去96孔板中的培养基，用pbs洗涤一次。加入50μl～100μl待检杂交瘤细胞的培养上清，培养箱中孵育6小时后收集上清。
用eilsa试剂盒检测上清中il-8含量。基于检测到的il-8含量，选择相应的单克隆细胞，提rna，再反转录cdna，连入测序载体中进行测序分析。示例性抗体示于下表1。
表1
对于测序得到的针对ox40靶点的抗体dna序列，重新设计引物，合成基因，连入真核表达载体中，转化dh5a感受态细胞，37℃恒温培养箱培养过夜，挑单克隆菌株送公司测序鉴定。挑选序列正确的菌株，摇菌，大提质粒，转染哺乳动物表达细胞293f，置于37℃、5％co2的培养箱中，表达培养7天。
收取表达上清，离心，过滤，选择proteing亲和层析柱，进行纯化，纯化的抗体通过sds-page电泳检测纯度，用bca蛋白检测试剂盒检测抗体浓度，分装，保存于-80℃冰箱中备用。
实施例5本发明的抗体与ox40结合的elisa检测
实验过程参照实施例2，不同之处在于，向包被板的每孔中加入待检抗体、阳性参考抗体(ref；genetech，1a7抗体，参见us2015/307617a1)，和阴性参考抗体(higg1)，浓度参见图1。
实验结果见图1。
实施例6本发明的抗体与ox40结合的facs检测
实验过程参照实施例3，不同之处在于，向每个流式管中放入50μl细胞悬液之后，加入待检抗体、阳性参考抗体(ref；genetech，1a7抗体，参见us2015/307617a1)，和阴性参考抗体(higg1)，浓度参见图2。同时设置对照管1(不加入抗体和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
实验结果见图2。
实施例7本发明的抗体刺激ox40稳转细胞产生il-8的检测
实验过程参照实施例4，不同之处在于，向96孔板的每孔中加入待检抗体、阳性参考抗体(ref；genetech，1a7抗体，参见us2015/307617a1)，和阴性参考抗体(higg1)，浓度参见图3。
实验结果见图3。
实施例8本发明的抗体与ox40l非竞争关系的facs检测
将hek293-ox40细胞在含2％fbs的pbs中制备成细胞浓度为107个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后加入ox40l-hfc融合蛋白(sinobiologicalinc，货号13127-h01h-50)和不同的20μg/ml本发明的抗体或阳性参考抗体(ref；genetech，1a7抗体，参见us2015/307617a1)，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入抗体、融合蛋白和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体和融合蛋白，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μlpe标记的抗人fc二抗(biolegend，货号：409304)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。
实验结果见图4。结果表明，抗体i3e3、h1e6、161b3和h1k1在5μg/ml的浓度下均与ox40l同时结合ox40，由此证明抗体i3e3、h1e6、161b3和h1k1与ox40l均非竞争地结合ox40。
实施例9本发明表达纯化后的抗体与ox40结合的亲和力检测
将实施例1中的融合蛋白在pbs缓冲溶液中制备成最高浓度为30nm的溶液，并3倍稀释为6个浓度并设0浓度对照。将本发明的抗体在pbs中制备为20nm的溶液。
用biacoret200测定抗体抗原的亲和力。使用cm5芯片捕获本发明的抗体之后，将抗原ox40小鼠igg2afc标签蛋白流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。
实验结果见图5。结果表明，i3e3的kd值为4.4nm，h1k1的kd值为11nm，h1e6的kd值为5.1nm。
实施例10本发明的抗体增强okt3激活原代t细胞释放ifn-γ的检测
采用常规方法制备pmbc，然后在rpmi-1640培养基中制备成细胞浓度为5x107个细胞/ml的细胞悬液，取2ml置于5ml流式管中。然后向每ml细胞悬液中加入50μlcd4+t细胞富集混合物(cellenrichmentcocktail)，混匀置于室温孵育10分钟。
每ml细胞悬液中加入100μleasyseptmd磁珠，混匀，置于室温孵育5分钟。然后补加rpmi-1640培养基至总体积2.5ml，混匀，然后将流式管置于磁铁中5分钟。颠倒磁铁和流式管，将混合物导入新的5ml流式管中。对于待分离的cd4+t细胞，按照2x106个细胞/ml的浓度加入5μg/mlpha及20u/mlil2，激活48小时。
用1μg/ml抗小鼠fc抗体(sigma，货号m3534)包被96孔板12小时。然后每孔加入105个/40μl上文激活的cd4+t细胞，再加入10μl10μg/mlokt3抗体。
之后，以20μg/ml起始以10x梯度在pbs中稀释待检抗体、阳性参考抗体(ref；genetech，1a7抗体，参见us2015/307617a1)和阴性参考抗体(higg1)，加入50μl抗体稀释液，混匀，继续培养72小时。收集上清，用inf-gammaelisa试剂盒检测抗体对t细胞的激活作用。
实验结果见图6。结果表明，抗体i3e3、h1e6、161b3和h1k1在不同浓度下均可刺激产生ifn-γ，在2μg/ml浓度左右达到最大刺激。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110>康源博创生物科技（北京）有限公司
<120>与ox40l非竞争结合的抗ox40抗体
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