比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体GA3及其基因和应用的制作方法

文档序号：21693614发布日期：2020-07-31 22:19阅读：502来源：国知局

本发明涉及基因工程领域，具体涉及比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用。

背景技术：

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucanglucohydrolase,ec.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase),简称糖化酶。糖化酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业，是我国产量和用量最大的生物酶产品之一，具有很高的商业价值。

目前,能源短缺和环境污染极大限制了社会的发展进步，乙醇作为替代能源已逐步被人们所认识，被认为是解决上述问题的有效途径之一。目前通过淀粉生产乙醇的方法包括构建分泌葡萄糖淀粉酶的工程菌株。虽然国内外也有使用混合培养糖化和发酵菌株生产乙醇的发酵生产方式，但此工艺缺点在于菌株自身生长需要消耗大部分的淀粉底物，实际淀粉利用率和乙醇产率依然相当低。葡萄糖淀粉酶能够高效降解α-1,4、α-1,3、α-1,6-糖苷键，从淀粉非还原性末端释放葡萄糖,因此具有很高的商业价值。

糖化酶在工业生产中的应用非常广泛，在酒精工业中，糖化酶制剂可代替自制麸曲，简化生产工艺，提高生产效率，糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供葡萄糖淀粉酶突变体。

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖淀粉酶突变体编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖淀粉酶突变体的方法。

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖淀粉酶突变体的应用。

根据本发明的具体实施方式，本对从talaromycesleycettanusjcm12802菌株中得到了的葡萄糖淀粉酶tlga1931进行突变，得到比活和热稳定性提供的萄糖淀粉酶突变体，野生型葡萄糖淀粉酶tlga1931的氨基酸序列如seqidno:1所示：

根据本发明的具体实施方式：将葡萄糖淀粉酶tlga1931的氨基酸序列的第132位氨基酸由ser突变为cys、第492位氨基酸由tyr突变为cys、第548位氨基酸由leu突变为cys、第562位氨基酸由ala突变为cys得到葡萄糖淀粉酶突变体ga1，将葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga1的氨基酸序列的第108位氨基酸由gln突变为glu得到葡萄糖淀粉酶突变体ga2，将葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga2的氨基酸序列的第468、469、470位氨基酸由ala、tyr、ser突变为asp和pro得到葡萄糖淀粉酶突变体ga3。

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga1的氨基酸序列seqidno:2所示：

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga2的氨基酸序列如seqidno:3所示：

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga3的氨基酸序列如seqidno:4所示：

本发明提供了编码上述葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体的基因。

根据本发明的具体实施方式，野生型葡萄糖淀粉酶tlga193的基因序列如seqidno：5所示：

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga1的编码基因序列如seqidno:6所示：

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga2的编码基因序列如seqidno:7所示：

根据本发明的具体实施方式，葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga3的编码基因序列如seqidno:8所示：

本发明提供了包含上述化葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体编码基因的重组菌株，优选的菌株为毕赤酵母gs115，含葡萄糖淀粉酶突变体基因的重组菌株分别为重组赤酵母gs115/ga1，gs115/ga2，gs115/ga3。

根据本发明的具体实施方式，制备葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体的方法如下所述：

(1)用含有葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体表达；

(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶tlga1931突变体。

本发明的有益效果：

葡萄糖淀粉酶突变体ga1的比活力为806u/mg、葡萄糖淀粉酶ga2的比活力为1054u/mg、葡萄糖淀粉酶ga3的比活力为1540u/mg。分别较野生型葡萄糖淀粉酶tlga1931的比活力496u/mg分别提高：62.5％、112％和210％。在比活方面有较大幅度的提高。

70℃处理10min后野生型相对剩余酶活为14％，葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga3的剩余酶活分别为：70％、90％、86％。75℃处理2min后野生型相对剩余酶活为13％，突变体ga1、ga2、ga3的剩余酶活分别为：80％、95％、80％。且最适温度分别较野生型提高5℃、10℃、10℃。因此，葡萄糖淀粉酶突变体的热稳定获得明显提高。

从ga1到ga3，其比活力和热稳定性都有明显提升。本发明提供了多个葡萄糖淀粉酶突变体，具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，能够完全满足工业应用需求，可以很好的应用于食品、医药、纺织及饲料行业中，有着广阔的应用前景。

附图说明

图1显示葡萄糖淀粉酶ga1至ga3的70℃热稳定性分析结果；

图2显示葡萄糖淀粉酶ga1至ga3的75℃热稳定性分析结果；

图3显示葡萄糖淀粉酶ga1至ga3的最适温度的分析结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(pichiapastorisgs115)、毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115。

2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自invitrogen公司，定点突变试剂盒购自全式金公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％nacl，ph7.o)。

(2)bmgy培养基；1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。

(3)bmmy培养基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1葡萄糖淀粉酶的定点突变

以葡萄糖淀粉酶tlga1931的质粒ppic9-tlga1931序列为模板将葡萄糖淀粉酶tlga1931的氨基酸序列的第132位碱基由ser突变为cys、第492位碱基由tyr突变为cys、第548位碱基由leu突变为cys、第562位碱基由ala突变为cys得到葡萄糖淀粉酶突变体ga1，将葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga1的氨基酸序列的第108位碱基由gln突变为glu得到葡萄糖淀粉酶突变体ga2，将葡萄糖淀粉酶tlga1931的突变体ga2的氨基酸序列的第468、469、470位碱基由ala、tyr、ser突变为asp和pro得到葡萄糖淀粉酶突变体ga3。每轮定点突变的引物如下表所示：

表1本实验所需的引物

实施例2葡萄糖淀粉酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以葡萄糖淀粉酶重组质粒ppic9-tlga1931为模板，利用定点突变试剂扩增突变体。经核酸胶验证后，将pcr产物中加入1μldmt酶，混匀后于37℃孵育1h。取2-5μldmt酶消化的pcr产物，热击转化至感受态细胞dmt。挑取阳性转化子进行dna测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶bglii进行线性化表达质粒载体dna，电击转化酵母gs115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在md平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。然后通过mm平板的显色反应筛选葡萄糖淀粉酶阳性克隆子菌株，依次为：gs115/ga1、ga2、ga3。

实施例3重组葡萄糖淀粉酶的制备

(1)葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mlbmgy液体培养基的1l三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，弃上清，再向菌体加入200ml含有0.5％甲醇的bmmy液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行sds-page蛋白电泳分析。

(2)重组葡萄糖淀粉酶的纯化

收集摇瓶发酵培养的重组葡萄糖淀粉酶上清液，利用10kda膜包进行发酵液的浓缩，同时用ph6.310mm磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液置换其中的培养基，然后通过阴离子交换柱来进行纯化。

实施例4测定纯化的葡萄糖淀粉酶突变体的酶学性质

采用dns法对本发明的葡萄糖淀粉酶进行活性分析。具体方法如下：在各突变体最适ph和温度的条件下(最适ph均为4.5，最适温度分别为ga1-70℃、ga2、ga、3-75℃)，1ml的反应体系包括l00μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应30min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。葡萄糖淀粉酶活性单位定义：在对应最适温度、最适ph条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(u)。

测定葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3三个突变体及本发明的各个突变体的酶活性和热稳定性：

1、测定葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3三个突变体的酶活性。将本发明的纯化的葡萄糖淀粉酶各个突变体在ph4.5、70℃、75℃下进行酶促反应以测定其酶活性。

葡萄糖淀粉酶ga1的比活力为806u/mg、葡萄糖淀粉酶ga2的比活力为1054u/mg、葡萄糖淀粉酶ga3的比活力为1540u/mg.分别较野生型葡萄糖淀粉酶tlga1931的比活力496u/mg分别提高：62.5％、112％和210％。

2、测定葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3三个突变体在70℃及75℃下的稳定性：

在0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph6.3)缓冲液体系中，葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3分别于70℃下处理0、2、5、10、20、30、60min，75℃下处理0、2、5、10、20、30、60min，再在分别对应的最适温度测定相对剩余酶活。

如图1所示，70℃处理10min后野生型相对剩余酶活为14％，接近失活，改造后葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga3的剩余酶活分别为：70％、90％、86％。

如图2所示，75℃处理2min后野生型相对剩余酶活为13％，接近失活，改造后葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga3的剩余酶活分别为：80％、95％、80％。

3.测定的最适温度：

葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3三个突变体分别在20、30、40、50、55、60、65、70、80、85、90℃，ph4.5的条件下测定其酶活性性。如图3所示，葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3的最适温度分别为70℃、75℃、75℃。

3、经测定葡萄糖淀粉酶ga1、ga2、ga3三个突变体的最适ph与ph稳定性与野生型基本一致。

序列表

<110>山东隆科特酶制剂有限公司

<120>比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体g3及其基因和应用

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