一种球等鞭金藻的扩繁方法与流程

本发明属于水产养殖饵料微藻培养技术领域，具体涉及一种球等鞭金藻扩繁的方法，能够有效提高球等鞭金藻最高繁殖密度以及平台期维持时间。

背景技术：

球等鞭金藻(isochrysisgalbana)体形小，富含多糖、胡萝卜素以及高能量的脂类物质，尤其是富含贝类生长发育所需的不饱和脂肪酸dha、epa等，是所有滩涂贝类苗种繁育过程中必不可少的开口饵料。

目前国内外对球等鞭金藻的培养影响因素研究聚焦于光照、盐度、温度等环境因素对球等鞭金藻生长等方面的影响，培养基均是针对微藻营养需求的有机和无机营养成分，但即使尽量控制适合的环境条件和营养条件，实际大规模露天繁殖过程中，微藻的最高繁殖密度依旧不够高，非常容易衰败，不能满足贝类规模化苗种繁育的饵料需求。

研究表明，藻际细菌对微藻扩繁有着重要的影响。例如，噬纤维菌(cytophagasp.)可通过直接攻击的方式抑制硅藻和鞭毛藻的扩繁(imaietal.,1993)，亚硫酸杆菌(sulfitobactersp.)却可以通过分泌吲哚乙酸来促进硅藻的繁殖(aminetal.,2015)。而目前实际微藻扩繁技术均没有考虑藻际细菌的影响。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种球等鞭金藻扩繁的方法，通过添加分离自球等鞭金藻中的一种藻际有益细菌来提高球等鞭金藻最高繁殖密度以及平台期维持时间，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的球等鞭金藻扩繁方法，是在球等鞭金藻培养过程中，在球等鞭金藻扩培液添加从球等鞭金藻中筛选的藻际有益细菌；

所述的藻际有益细菌，一种具体的菌株为交替单胞菌(alteromonassp.)nbu-a-0001菌株，其保藏编号为cctccm2020010，

本发明所提供的方法中所使用的扩培液，其一种组成如下：

50-200mg/lkno3、5-20mg/lkh2po4、1-5mg/lfe-citrate·5h2o、0.01-0.1g/l红糖、2-10μg/lvb1、0.01-0.1μg/lvb12。

作为优选，所述的扩培液的一种具体组成如下：

100mg/lkno3、10mg/lkh2po4、3mg/lfe-citrate·5h2o、0.06g/l红糖、6μg/lvb1、0.05μg/lvb12。

其中扩培液的一种制备方法如下：

1)将过滤的海水加入kno3、kh2po4fe-citrate·5h2o灭菌后备用；

2)将红糖在纯水中溶解，过0.22μm滤膜后，加入到步骤1)制备的灭菌溶液中；

3)将vb1、vb12在纯水中溶解，过0.22μm滤膜后，加入到步骤2)制备的灭菌溶液中完成新型藻菌扩培液的制备。

本发明方法使球等鞭金藻的繁殖速度远高于常规微藻营养液培养微藻的速度，而最高繁殖密度以及平台期维持时间远高于常规培养营养液，在同样水体条件下可以提供更多的微藻供应，同时由于平台期较常不容易衰败，非常利于实际贝类规模化生产过程中微藻量控制和生产管理。

附图说明

图1：本发明分离的各藻际细菌与球等鞭金藻共培养的结果图；

图2：本发明中不同培养方法对球等鞭金藻生长的影响图；

图3：不同培养基对球等鞭金藻的培养结果效果图，其中左图为本发明培养基、培养方法；右图为nmb3培养基；

图4：本发明中不同培养基对交替单胞菌生长的影响图。

具体实施方式

以下结合实施案例对本发明进行详细的描述。

实施例1：筛选藻际有益细菌

将无菌纯化的球等鞭金藻和从球等鞭金藻藻液中分离获得的藻际细菌分别培养至指数生长期。将球等鞭金藻藻液按每份50ml分装至100ml无菌锥形瓶中。将各扩摇菌液13000rpm，低温离心10min收集并用宁大三号海水培养基清洗三次以去除2216e液体培养基。按藻菌细胞密度比1:50的比例，向球等鞭金藻培养液中分别加入不同的藻际细菌，每组设置三个平行，添加宁大三号海水培养基作为对照组。以球等鞭金藻藻细胞密度为指标，分析各藻际细菌对球等鞭金藻生长的影响。共分离获得5株藻际细菌，各藻际细菌和球等鞭金藻共培养结果表明，交替单胞菌(alteromonassp.)对球等鞭金藻的生长具有明显的促进作用(图1)。

本发明筛选的共生菌株的鉴定主要涉及以下几个步骤：菌液pcr扩增、凝胶电泳及pcr产物割胶回收、pcr产物连接t载体及感受态细胞的转化、阳性菌落鉴定及测序。最终对所测得的16srdna序列进行同源性比较与系统发育学分析。在ncbi上进行blast比对，找到同源性序列并利用mega5软件建立系统发育树。根据blast比对和系统发育学分析结果，本发明的藻际有益细菌菌株属于变形菌门(proteobacteria)、γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)、交替单胞菌目(alteromonadales)、交替单胞菌科(alteromonadaceae)、交替单胞菌属(alteromonas)中的一种。命名为交替单胞菌(alteromonassp.)nbu-a-0001株，菌株nbu-a-0001的生物学特性如下：杆状，菌落呈圆形，不透明米白色，表面湿润光滑，挑起呈粘稠状。海水菌，细胞革兰氏染色呈阴性。

nbu-a-0001株的专利保藏编号为cctccm2020010，保藏日期为2020年1月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为武汉，武汉大学。

实施例2：扩繁方法

首先制备新型藻菌扩培液，其成分及配比如下：50-200mg/lkno3、5-20mg/lkh2po1-5mg/lfe-citrate·5h2o、0.01-0.1g/l红糖、2-10μg/lvb1、0.01-0.1μg/lvb12。

一种具体的藻菌扩培液的具体组成如下：

100mg/lkno3、10mg/lkh2po4、3mg/lfe-citrate·5h2o、0.06g/l红糖、6μg/lvb1、0.05μg/lvb12。

红糖可以选用市场中常用的品种，其一种具体的组成如下：

每100g红糖中含有96.6g蔗糖、0.8μg胡萝卜素、1.9μg视黄醇、0.01mg硫胺素、0.3mg烟酸、240mg钾、18.3mg钠、157mg钙、54mg镁、2.2mg铁、0.27mg锰、0.35mg锌、0.15mg铜、11mg磷、4.2μg硒。

藻菌扩培液具体制备方法如下：

(1)准备50ml过滤海水(盐度25‰)，加入5mgkno3、0.5mgkh2po4、0.15mgfe-citrate·5h2o灭菌后备用。

(2)取3g红糖于10ml纯水中溶解，过0.22μm滤膜后取10μl加入上述50ml已灭菌溶液中。

(3)取240μlvb1、1mlvb12于8.76ml纯水中溶解，过0.22μm滤膜后用无菌水稀释100倍，取50μl于上述50ml已灭菌溶液中完成新型藻菌扩培液的制备。

将筛选的交替单胞菌在2216e固体平板上进行活化，挑取单克隆至1ml2216e液体培养基中，置于28℃，200rpm摇床中培养4～6h。将活化后的菌液进一步培养至od600＝0.4～0.6。

在100ml玻璃锥形瓶中，加入50ml上述灭菌的新型藻菌扩培液，加入100μlod600＝0.4～0.6的活化后的交替单胞菌，接入1ml藻细胞密度为10⁶cell/ml的球等鞭金藻藻种，混合均匀后，置于25℃、光强4000lux、光照周期光/暗(12h/12h)的光照培养箱中培养。

为比较本发明扩繁方法扩繁的功效，在100ml玻璃锥形瓶中，分别使用本发明的培养液配方、常规微藻培养液(nmb3)以及非藻际分离的交替单胞菌进行培养，每一种培养液设三个平行，接种密度为2×10⁴cell/ml，每天用血球计数板对培养密度进行计数。培养结果表明(图2)，球等鞭金藻在用新型培养方法培养时，藻密度远高于nmb3培养液培养以及添加非藻际分离的交替单胞菌株培养的方法(图3)，且培养时间越长，促进扩繁的效果越明显，始终维持高密度培养。另外，新型培养基使藻细胞及菌都能更好的生长(图4)。可见，本发明提供的培养方法功效远优于nmb3培养液培养。因此，本发明培养方法具有很好的应用前景。