猪13号染色体与二花脸猪产活仔数显著相关的SNP标记及其检测方法与应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及猪13号染色体与二花脸猪产活仔数显著相关的snp标记及其检测方法与应用。

背景技术：

对猪繁殖性状的持续选育一直是国内外育种专家关注的重点，直接关系到生产者的效益。产仔数是猪繁殖性状一个重要的经济性状，是与猪场经济效益关联较大的重要指标。产仔数由卵巢、子宫等组织内众多复杂的生理过程共同作用、影响，其遗传力仅有0.1左右。因此，选择现代分子育种手段提高产仔数已经成为目前畜禽培育的主要手段。分子标记辅助选择(mas)技术和全基因组选育(gs)技术有效克服了传统育种的局限性，提高了选择效率。如在低遗传力的繁殖性状，较难评定的抗病力性状，难以活体度量的品质性状等方面的选育发挥了重要的作用。

太湖流域地方猪普遍以性成熟早、产仔多、母性好而闻名于世，是研究猪产仔数性状的优质遗传资源。其中的一个品种二花脸猪保持着世界窝产仔数42头的最高产仔记录，平均15.69头。二花脸猪作为中国高产地方猪种的代表，对高繁殖力猪的选育具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，产活仔数的低遗传力，提供与母猪产活仔数相关的snp标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。

一种与二花脸母猪产活仔数性状相关的snp标记，所述snp标记位于猪13号染色体上钙同线蛋白2(clstn2)基因第10内含子处chr13_81429549位点，且存在t/c多态性，所述snp标记与二花脸母猪经产产活仔数和全部胎次的产活仔数(numberbornalive,nba)显著相关。

chr13_81429549位点具有tt基因型的二花脸个体母猪的全部胎次的产活仔数显著高于具有cc基因型的二花脸个体母猪的经产胎次和全部胎次的产活仔数。

一种基于本发明所述的snp开发分子标记的方法，以含有所述的snp标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使所述的snp标记转化为分子标记。

其中，所述的引物对序列优选为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3；所述的分子标记序列进一步优选如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第471位，存在t/c多态性。

一种用于检测所述的与二花脸母猪产活仔数显著相关的snp标记的引物对，上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3。

一种检测所述的snp标记的方法，包含pcr扩增二花脸母猪基因组中含有所述的snp标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的t/c多态性。

本发明所述的检测snp标记的方法，优选包括以下步骤：

(1)取每头二花脸母猪的耳组织样品并提取总dna；

(2)用已提取的二花脸母猪基因组dna为模板，使用权利要求5所述的引物进行pcr扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第471位的t/c多态性。

步骤(2)所述的pcr扩增进一步优选反应体系为：dna模板1μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1μl、pcrmix试剂22μl；其中所述dna模板浓度为30ng/μl，所述引物的浓度为10nm/μl，所述pcrmix试剂为南京擎科生物技术有限公司生产的1.1×t3superpcrmix试剂；pcr扩增的反应程序为：预变性98℃2min；变性98℃10s，退火60℃10s，延伸72℃15s，35个循环；延伸72℃2min。

本发明所述的snp标记、所述的分子标记、引物对在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。

一种筛选高产二花脸母猪品系的方法，包括检测二花脸母猪chr13_81429549核苷酸位点的基因型，在二花脸母猪群体中，选育chr13_81429549核苷酸位点的tt型个体作为种猪。

有益效果：

本发明提供的snp标记与二花脸母猪全部胎次和经产的产活仔数相关，因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选高产的二花脸母猪品系和包含二花脸配套系母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系和二花脸配套系母猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为使用本发明的引物扩增clstn2基因第10内含子部分片段的琼脂糖凝胶电泳图。

m:2000bpmarker，1、2、3、4、5、6、7和8为二花脸不同个体的目的片段，大小为1337bp.

图2为chr13_81429549突变位点不同基因型的测序结果峰图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1、实验动物来源

江苏常州焦溪二花脸猪专业合作社、常熟市二花脸猪保种场和苏州苏太企业有限公司。

计算307头二花脸母猪的育种值，计算模型为

使用dmu软件进行产活仔数育种值(ebvnba)的估计，模型如下：

yijklmno＝μ+hi+(hys)j+pak+pl+gm+an+bo+eijklmno

其中yijklmno为母猪产仔数的估计育种值；μ为总体均值，hi为场的固定效应，(hys)j为场年季的随机效应；pak为胎次的固定效应；pl为母猪的永久环境效应；gm为基因型的固定效应；an为个体的加性遗传效应；bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为残差。

2、提取基因组dna

采集307头母猪的耳组织样品，放置于装有75％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。

使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组dna，所需试剂包括：

裂解液(实验室配备)

蛋白酶k(德国merck生物科技有限公司)

tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)

tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)

氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)

无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)

3m乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)

具体步骤如下所述：

(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；

(2)加入裂解液(自己配备)800μl，及蛋白酶k30μl(20mg/ml)；

(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；

(4)加入tris饱和酚800μl，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；

(5)取650μl上清加tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

(6)取550μl上清，加氯仿800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

以下步骤换1.5ml的离心管

(7)取450μl上清，加无水乙醇800μl，3m乙酸钠40μl，混摇6min，4℃10000r/min离心8min；

(8)弃上清留下dna沉淀团，加入1000μl70％乙醇，混摇5min，4℃10000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；

(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；

(10)样品加100μl超纯水，轻微吹打至dna溶解，经过nanodrop-2000分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到30ng/μl于-20℃下保存备用。

3、目的片段pcr扩增与测序分析

用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增，扩增体系为：1.1×t3superpcrmix试剂22μl，dna模板1μl(30ng/μl)、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1μl(10nm/μl)；设置pcr扩增体系为：预变性98℃2min；变性98℃10s，退火60℃10s，延伸72℃15s，35个循环；延伸72℃2min。

4、以307头的二花脸群体对clstn2基因chr13_81429549位点进行分型验证，扩增序列的引物信息如表1所示。

表1.clstn2基因chr13_81429549位点目的片段引物序列信息

5、将pcr扩增产物进行一代测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪基因组片段序列比对、分析，用chromas软件进行位点分型，用sas软件(9.4版本)进行基因型与产仔数的影响效应分析。

利用sas软件的混合线性模型进行基因型与产仔数的关联性分析，模型如下：

yijklmno＝μ+hi+(hys)j+pak+pl+gm+an+bo+eijklmno

其中yijklmno为母猪的产仔数表型；μ为总体均值，hi为场的固定效应，(hys)j为场年季的随机效应；pak为胎次的固定效应；pl为母猪的永久环境效应；gm为基因型的固定效应；an为个体的加性遗传效应；bo为与配公猪的随机效应；eijklmno为残差。由于样本量相对较小且考虑的因素相对较多，可能会导致计算结果不会收敛，在这种情况下，可将与配公猪的随机效应剔除再进行计算；显著性的p值经过10000次的随机抽样校正。

表2是chr13_81429549t/c突变位点多态性与纯种二花脸群体产活仔数的影响效应分析。由表2可知：chr13_81429549位点多态性显著影响了二花脸猪经产胎次的nba(p＝0.0497)，与全部胎次的nba(p＝0.0383)显著相关。

在二花脸猪经产胎次的nba中，chr13_81429549位点tt基因型个体与cc型个体、ct型个体相比较：产仔数平均分别增加0.61头和1.00头(p<0.05)；全部胎次的nba中，chr13_81429549位点tt基因型个体与cc型个体、ct型个体相比较：产仔数平均分别增加0.63头和0.97头(p<0.05)；并且该位点多态性在二花脸猪产活仔数表现为tt>ct>cc基因型的加性效应。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育chr13_81429549位点的tt型个体可逐步提高二花脸母猪全部胎次的产活仔数，达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。

表2clstn2基因chr13_81429549位点多态性与二花脸母猪群体的产活仔数关联分析

序列表

<110>南京农业大学

南京农业大学淮安研究院

<120>猪13号染色体与二花脸猪产活仔数显著相关的snp标记及其检测方法与应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1337

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

accacctgcttatcaccaatcactgcaaatgatccttttccatccttagggcacaacagg60

caagaactagagcgctgtgtgacaagttaatgataagacacacaatttaccgtgcaccca120

ctgggggctattttaagttcattacccctactcctcacaacaaattaaatttatgaccct180

gtttcaggaataaggagattagggctcagggacttgtcaaaaataagtctaggctctttt240

tttcacaccaccatctcaggttagaaggcattcttggaattcctgctatggcacagtgga300

ttaagaagcagagtatggatacttgagctgggtgaccttgggcaaggtactttagtcctt360

taagcccccatggcttagattgctggcctagtgcagggggttaagaatctggtgttgccc420

ctttcctcagctaccgctaaggtgctcggtccttccgaggaagctaaggccactttgggg480

tgaggccctcacttcatctggctactagcaccacgccaggcagcccccacctaacattcg540

tccgcaccatggcctccatctcagagctcgcctgcatctactctgccctcatcctgcacg600

acaatgaggtgacagtcatggaggatatcaatgctctcattaaagcagcaggtgtaaatg660

ttgagccattctggccaggcttgtttgcaaagactctggccaatgtcaatatctggagcc720

tcatctgcaatgtggggactggaggacctgccctagcagctggtgctgcaccagcaggag780

gtcctgccccagccaccactgctgcccagctgaggagaagaaagtagaagcaaagaaaga840

agaatctgaggagtctgatgatgatatggtctttggtctttctgactaaacttctataac900

acattcaataataaaaagctgagctatttgctgaaaaaaaaaatctggtgttgctgcagc960

tgtagcatagatttcagctgcaattcggattccatccctggtccaggaacttccatatgc1020

catgggtgtggccaaaaaaaataaataagtcattcttgaaaattattaacactgcctcct1080

acctgccccacctcctttgtctctcatttcattttgactaatgactagtattctctgcac1140

tggctcctggccttcaccctcctctctggctagcctaaagtgagagcctcccatgattaa1200

ggaaatgtcttgtccaatcacagggccccatgccagttcctcttcttgcttgttttcccc1260

tggatcatgcatatttctggatatctttctagtatgtctggagtcattaaatggtcgagg1320

tggttgctgttatgtat1337

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accacctgcttatcaccaat20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atacataacagcaaccacc19