新属内生真菌TK815及其应用的制作方法

【
技术领域：
】本发明涉及微生物
技术领域：
，特别涉及新属内生真菌tk815及其应用。
背景技术：
：内生真菌(endophyticfungi)广泛存在于健康植物组织器官中，具有极其丰富的物种多样性和功能多样性。作为一类未被充分研究的微生物资源，内生真菌资源种类繁多，包括不少稀有、特殊(或新的分类单元)的菌株，其生态功能也逐渐被人们所发现和揭示。研究表明，内生真菌能与宿主互惠共生，赋予植物优良生长性状，能提高宿主的抗病虫能力及在胁迫环境中的抗逆性，从而可减少化肥、农药的使用。这类真菌具有生态分布广泛、宿主范围广及可分离纯培养的特性，这就决定了它们在农业可持续发展中将发挥越来越重要的作用，具有更为广阔的应用前景。申请人对内生真菌有很深入的研究，一直在不断探索新的内生真菌，例如，申请号为201410220964.7《一种dse菌株及其在甘蔗生产上的应用》的内生真菌，该真菌由申请人从广西北部湾红树植物分离而得，属于devriesia属，具有促进铁皮石斛生长的作用；申请号为201610652927.2《防治香蕉枯萎病的内生真菌l-14及其应用》的内生真菌，该真菌由申请人从土壤中诱捕分离获得，属于schizothecium属，具有防治香蕉枯萎病的作用；申请号为201410220965.1《dse菌株24l-4及其在铁皮石斛生产上的应用》的内生真菌，该真菌由申请人从茶花叶部组织分离获得，属于devriesia属；同时，行内含有很多其他申请人发现的内生真菌，例如申请号：201410220965.1《dse菌株24l-4及其在铁皮石斛生产上的应用》都公布了深色有个内生真菌在促进铁皮石斛生长上的应用，但是，201710833508.3中公布的微生物为平脐疣孢属的某个种(zasmidiumsp.)而201410220965.1中公布的微生物为德弗霉菌属的某个种(devriesiasp.)；由于内生真菌与宿主具有良好的互惠共生关系，目前对它的研究尚未停止，自然界中存在很多未被我们认识和发现的新种内生真菌，为了丰富内生真菌的种质资源，有必要进行本申请的研究。技术实现要素：鉴于上述内容，为了丰富内生真菌的种质资源，有必要对内生真菌进行筛选、分类、研究，申请人在此基础上发掘了一株新属内生真菌tk815，该菌株可与促进铁皮石斛进行共生。为达到上述目的，本发明筛选出一种新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815，其保藏编号为cgmccno:14346，该菌株于2017年06月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于：中国.北京.中国科学院微生物研究所。进一步的，所述菌株从土壤中通过植物诱捕法分离而得。进一步的，所述土壤采集自特殊生境的广西百色市乐业县大石围天坑群白洞天坑的原始森林。本发明还提供了所述的新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815在促进被子植物生长上的应用。进一步的，所述被子植物为铁皮石斛和/或甘蔗。进一步的，所述铁皮石斛为铁皮石斛组培苗和/或盆栽苗，所述甘蔗为甘蔗组培苗和/或盆栽苗。本发明还提供了一种分离所述新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815的方法，采用白菜为诱饵植物诱捕土样中的微生物，将白菜种子催芽后与土样与灭菌育苗基质混合培养，一个月后取出白菜根部洗净消毒后放入分离培养基平板上，待菌丝长出后转化到纯化培养基上纯化，获得所述菌株。进一步的，所述分离培养基为：1/2玉米粉培养基，其组分为：玉米粉琼脂8.5g，琼脂粉15g，补蒸馏水定容至1000ml。进一步的，所述纯化培养基为：cmmy培养基，其组分为：麦芽汁琼脂10g，玉米粉琼脂8.5g，酵母提取物2g，琼脂粉7.5g，补蒸馏水定容至1000ml。本发明还提供了一种应用所述新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815促进被子植物生长的方法，所述方法为：将菌株tk815接种到被子植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将被子植物的组培苗直接接种于含tk815菌株的培养基中。本发明具有以下有益效果：(1)本发明的内生真菌tk815是目前有别于现有技术的新菌种，发现于广西百色市乐业县大石围天坑群白洞天坑的土壤中，该菌株的亲缘关系与herpotrichiellaceae科很近。在herpotrichiellaceae科下选择各属代表物种的its+18s+28s序列与菌株tk815的相关序列一起构建系统发育树，结果显示，菌株tk815形成一个独立的分枝，并没有与任何已知种聚在一起；因此判定，tk815是herpotrichiellaceae科的一个新属，将该种命名为tiankengomelaniaguangxiense并选菌株tk815为该属的模式菌株。该新属微生物的发现丰富了内生真菌的可利用微生物资源，该菌株对铁皮石斛具有良好的促生效果，该菌株是该地域首次发现的对铁皮石斛具有明显促生效果的内生真菌，填补了目前相关领域研究的空白，对于后续该地区种植铁皮石斛起到一定的指导作用。tk815菌株为广西大石围天坑群白洞天坑原始森林的土壤内生真菌在铁皮石斛生产上的开发利用提供了资源保障。【附图说明】图1是菌株tk815基于its序列构建的系统发育树图2是tk815的菌株的形态形态观察图；其中，图a表示菌株的菌落形态；图b-i表示菌株的分生孢子和分生孢子梗；标尺：a＝3cm；b-i＝10μm。图3是平皿培养铁皮石斛苗接种tk815菌株后长势对照；其中，左侧表示对照的平皿苗；右侧表示接种tk815后的平皿苗；图4是盆栽铁皮石斛苗接种tk815菌株后长势对照，其中，左侧表示对照的盆栽苗；右侧表示接种tk815后的盆栽苗。【具体实施方式】本发明提供了一株新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815，其保藏编号为cgmccno:14346，该菌株于2017年06月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于：中国.北京.中国科学院微生物研究所。实施例1：对本发明所述的新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815进行形态鉴定和分子生物学鉴定，具体如下：(1)形态学鉴定：如图2的a部分所示，菌株菌落形态观察为：菌落在cmmy培养基(麦芽汁培养基)上生长缓慢，28℃下培养两周后菌落直径为12-15mm。菌落近圆形，深灰黑色，隆起，有辐射状沟纹。如图2的b-i部分所示，该菌株的菌丝光滑，有隔，浅褐绿色，宽1.6-3.4μm。分生孢子梗直立，有分隔，无分枝或1个分枝，比菌丝稍粗，浅褐绿色，有产孢痕，4.6-87.8×1.7-3μm。分生孢子棍棒状，表面粗糙，端部钝圆，基部平截，浅褐绿色，0-2个分隔，隔膜处缢缩，5.1-14.9×1.1-2.4μm。(2)分子生物学鉴定用测序得到的its、18s和28s序列在genbank数据库中进行dna序列blast，结果显示与菌株tk815的亲缘关系与herpotrichiellaceae科很近。在herpotrichiellaceae科下选择各属代表物种的its+18s+28s序列与菌株tk815的相关序列一起构建系统发育树，如图1所示，菌株tk815形成一个独立的分枝，并没有与任何已知种聚在一起。从形态特征上来看，菌株tk815具有短且很少分枝的产包梗，细长且只有0-2个分隔的分生孢子这些特征结合起来使其区别于该科下所有的已知种。由于在its+18s+28s三段分子片段联合构建的系统树上，菌株tk815形成一个独立的分枝，与其近缘物种存在很大的遗传距离，再结合形态上的差异，菌株tk815被鉴定为一个新属，定名为tiankengomelaniaguangxiense。因此，分子、形态上都能证明菌株tk815为herpotrichiellaceae科的一个新菌属菌种，该菌株的分类地位是herpotrichiellaceae科，将该种命名为tiankengomelaniaguangxiense并选菌株tk815为该属菌种的模式菌株。实施例2：实施例1菌株的分离方法如下：(1)取样在广西百色市乐业县大石围天坑群白洞天坑土壤(北纬24°49′2.95″，东经106°27′22.32″，海拔1175.7米)取样，用五点采样法采集大石围天坑群原始森林植物根际土壤，距土壤表面5-15cm取样。土样采集后尽快处理或置于4℃冰箱待用。s1：配置分离培养基和纯化培养基：本申请分离培养基(1/2玉米粉培养基)的配制方法为：称量玉米粉琼脂8.5g，琼脂粉15g，最后补蒸馏水定容至1000ml混匀；本申请纯化培养基(cmmy培养基)的配制方法为：称量麦芽汁琼脂10g，玉米粉琼脂8.5g，酵母提取物2g，琼脂粉7.5g，最后补蒸馏水定容至1000ml混匀；s2：采用白菜为诱饵植物诱捕土样中的内生真菌。白菜种子经表面消毒(75％酒精和1％次氯酸钠分别振荡消毒30s)后置于水琼脂培养基上催芽，将所采集的土样与灭菌育苗基质以2:1的比例混合后装入培养杯中，后将催好芽的白菜移栽至杯中培养。每处理4个重复，培养50d左右即可收获。收集白菜幼苗根部进行清洗和表面消毒(分别用0.005％吐温20和无菌水震荡消毒三次，每次1min)后置于1/2玉米粉培养基上，25℃下培养，待有菌丝从根段部位长出后及时转接至cmmy培养基。实施例3：菌株tk815对植物的促生长情况研究(一)促进铁皮石斛生长的情况检测：(1)tk815对铁皮石斛组培苗的促生长试验：将菌株tk815活化后接种于3个燕麦培养基上(oma，g/l，燕麦粉10.0，琼脂14.0，mgso4·7h2o1.0，kh2po41.5，nano31.0)，3个水平，每个分别命名为：tk815-1、tk815-2、tk815-3，每皿接种3个菌块，待菌落长大后备用。选择株高和茁壮程度基本一致的无菌铁皮石斛幼苗移栽至菌落上，在每个菌落上分别移栽1株无菌铁皮石斛幼苗，每皿3株，将培养皿放入组培瓶中，于26℃，光照强度180μmol/m2·s2，光照时间16h/d的人工气候箱中培养。接种45d后测量干重指标(测试结果如表1所示)。表1tk815对铁皮石斛组培苗生长的影响处理干重(mg)tk815-1141.2tk815-2151.2tk815-3251.6ck112.3由上表可见，接种45d后，tk815的3组平皿培养出来的铁皮石斛其干重远远大于ck组，tk815处理组与对照组相比平均干重的增加量为61.47％。如图3所示，图3的左边为ck组铁皮石斛组培苗的生长情况，图3的右边为接种了tk815平皿的铁皮石斛组培苗的生长情况，明显的，tk815组要优于ck组的长势。(2)tk815对铁皮石斛盆栽苗的促生长试验：s1：组培苗种植、管理：选用的组培苗品种为：广西农业科学院花卉研究所提供，编号为784，s2：施菌方法：选取生长较一致的苗，3株/杯，铁皮石斛苗种植后一个月开始浇菌。设置4个重复，每个重复12杯(每个重复分别命名为tk815-1、tk815-2、tk815-3和tk815-4)；施菌方法：菌液制作方法为在pdb中接入菌丝块，于26℃转速为100rpm摇床中振荡培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为5×105cfu/ml的菌液。每丛铁皮石斛苗灌根30ml菌液，每隔15d灌根一次，总共灌根3次，。另以未浇菌液为对照处理；测定指标：第一次浇菌6个月后，测定铁皮石斛苗的株高、茎径、干重，具体情况如表2所示：表2tk815对铁皮石斛盆栽苗生长的影响处理株高(cm)茎径(cm)干重(mg)tk815-17.46.7456.6tk815-28.27.6393.3tk815-36.66.9430.4tk815-45.77.0345.6对照4.45.4228.2由上表可见，接种6个月后，tk815的4组盆栽铁皮石斛其干重、株高、茎径均远远大于ck组，45d后，tk815处理组与对照组相比平均株高的增加量为58.52％；茎径评价增加量为30.56％；干重平均增加量为78.12％。如图4所示，图4的左列为ck组铁皮石斛盆栽苗的生长情况，图4的右列为接种了tk815平皿的铁皮石斛盆栽苗的生长情况，接种tk815的铁皮石斛长势要明显优于无接种的对照组。(二)tk815对甘蔗盆栽苗的促生长试验：s1：甘蔗苗为广西农业科学院甘蔗研究所提供的新台糖22号。s2：甘蔗组培苗在沙地中炼苗长至5-7叶后，选取长势一致的甘蔗苗，修剪叶片待种。将甘蔗苗移栽至宽20cm高19cm的塑料花盆中，每盆种植3株甘蔗苗，培养基质为1:3(v/v)的泥炭和细河沙，浇定根水后用塑料膜覆盖保湿7天。移栽10d定殖后浇菌液。设置3个重复，每个重复12杯(每个重复分别命名为tk815-1、tk815-2和tk815-3)。在马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)中接入菌丝块，于25℃转速为100rpm摇床中振荡培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为5×105cfu/ml的菌液。每株甘蔗苗灌根50ml菌液，每隔15d灌根一次，总共灌根3次，灌根结束后2个月调查结果。以未浇菌液的处理为对照，每个处理4盆共12株苗。测试结果如表3所示：表3tk815对甘蔗盆栽苗的影响处理干重(mg)tk815-16.5tk815-27.2tk815-37.1ck5.1由上表可见接种2个月后，tk815的3组盆栽培养出来的甘蔗其干重远远大于ck组，tk815处理组与对照组相比平均干重的增加量为35.95％。综上所述，本申请的新属菌株tiankengomelaniaguangxiensetk815属于新菌株，能对植物起到显著的促生长作用，是一种性能良好的作物促生微生物。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12